CN116622576B - 一株马斯利亚农业菌、复合菌剂及其应用 - Google Patents
一株马斯利亚农业菌、复合菌剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株马斯利亚农业菌、复合菌剂及其应用，所述马斯利亚农业菌为马斯利亚农业菌(Massiliaagristrain)MSLYNYJ，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2023292，保藏日期为2023年3月13日。本发明可增加基质中的有效磷含量，最终提高水稻在缺磷条件下的产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株马斯利亚农业菌株、复合菌剂及其应用。
背景技术
磷是仅次于氮的重要营养元素，在植物的生长发育过程中起重要作用。植物体内磷含量约占其干重的0.2％，是ATP、核酸和含磷蛋白质的重要组成部分。同时，磷还参与植物体内的信号转导、大分子生物合成、光合作用、呼吸作用、能量转移等生理活动。在植物生长过程中磷的主要来源是土壤，充足的磷供应不仅是保证植物正常生长发育的前提，同时也是保证作物产量的重要因素。土壤中总磷含量为400-1000mg/kg，然而只有1.00-2.50％可供植物吸收，其余的磷以矿物和有机形式存在。
在缺磷土壤中，农作物生长受限，直接影响农业发展。提高土壤中难溶态磷的利用效率将是未来作物磷肥吸收利用研究中的关注焦点。因此，只有充分挖掘土壤本身的生物学潜能，不断提高作物磷素利用率，高效、安全、节约、绿色"的现代农业发展之路有深远意义。
因此，如何筛选、利用解磷微生物获取组合，以将土壤中存在的难溶态磷转化为可被植物直接吸收利用的有效磷，不断提高解磷效果是亟待解决的问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一株马斯利亚农业菌、复合菌剂及其应用，其可增加基质中的有效磷含量，最终提高水稻在缺磷条件下的产量。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一方面，提供了一株马斯利亚农业菌，所述马斯利亚农业菌为马斯利亚农业菌(Massiliaagristrain)MSLYNYJ，且保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为：CCTCCNO:M2023292，保藏日期为2023年3月13日。
还提供一种上述马斯利亚农业菌MSLYNYJ在提高植物生长基质磷含量中的应用。
还提供一种上述马斯利亚农业菌MSLYNYJ在改善植物生长指标中的应用。
优选的，所述植物生长指标包括株高、叶面积、地上部干重和分蘖数中的一种或几种。
还提供一种上述马斯利亚农业菌MSLYNYJ在提高植物光合效率指标中的应用。
还提供一种上述马斯利亚农业菌MSLYNYJ在提高植物根和/或茎和/或叶的磷含量中的应用。
还提供一种上述马斯利亚农业菌MSLYNYJ在提高水稻产量中的应用。
还提供一种复合菌剂，其包括上述MSLYNYJ以及一株巨大普里斯特氏菌，所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌(Priestiamegaterium)WSH002，且保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为：CCTCCM2023293，保藏日期为2023年3月13日。
优选的，所述复合菌剂由上述MSLYNYJ菌液以及WSH002菌液按照体积比1:1配制而成。
优选的，每mlMSLYNYJ菌液中，MSLYNYJ菌株的菌种含量为3*108～8*108CFU，每mlWSH002菌液中，WSH002菌株的菌种含量为2*108～6*108CFU。
还提供一种上述复合菌剂在提高植物生长基质磷含量中的应用。
还提供一种上述复合菌剂在改善植物生长指标中的应用。
还提供一种上述复合菌剂在提高植物光合效率指标中的应用。
还提供一种上述复合菌剂在提高植物根和/或茎和/或叶的磷含量中的应用。
还提供一种上述复合菌剂在提高水稻产量中的应用。
优选的，上述植物包含水稻，所述植物生长基质包括土壤，特别优选为土壤根际土，所述植物光合效率指标包括净光合速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和蒸腾速率中的一种或几种，所述植物生长指标包括株高、叶面积、地上部干重和分蘖数中的一种或几种。
本发明至少具备以下有益效果：
本发明可通过单独添加MSLYNYJ和WSH002菌种以及添加二者配制而成的复合菌剂来使难溶性的磷酸盐溶解，增加有效磷含量，并提高酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶的活性，从而促进有机磷的矿化，使其分解为植物可直接吸收利用的有效磷。进一步改善水稻的光合作用，最终提高水稻在缺磷条件下的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的马斯利亚农业菌MSLYNYJ的菌落形态；
图2为本发明的马斯利亚农业菌MSLYNYJ的生长曲线；
图3为本发明的巨大普里斯特氏菌WSH002的菌落形态；
图4为本发明的巨大普里斯特氏菌WSH002的生长曲线；
图5为本发明中，单独添加MSLYNYJ菌株和WSH002菌株，以及添加复合菌剂后所分泌的有机酸类型鉴定结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供了一株马斯利亚农业菌，所述马斯利亚农业菌为马斯利亚农业菌(Massiliaagristrain)MSLYNYJ(以下简称“MSLYNYJ”)，且保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为：CCTCCNO:M2023292，保藏日期为2023年3月13日。
上述MSLYNYJ菌株信息如下：
1、菌株来源
上述MSLYNYJ菌株分离自有效磷含量3.64mg/kg(即缺磷条件)的水稻根际土，具体分离过程包括如下步骤：
S1、按照土水比1:10(质量比)，用灭菌超纯水对水稻根际土进行重悬，然后稀释10倍，以得到稀释液；
S2、将稀释液分别涂布于含不同浓度镉的固体筛选培养基上，将培养基上生长的菌落用LB液体培养基进行扩繁，连续传代3次；
S3、挑选扩繁后的菌种，运用16srRNA通用引物27f和1492r进行菌液PCR，获得的产物进行测序，以获取如SEQNO.1所示的测序结果；
S4、将测序结果在NCBI数据库进行比对，结果显示，其与Massiliaagristrain K-3-1的序列同源性为96％(登录号NR_157781.1)。由此得到一株马斯利亚农业菌(Massiliaagristrain)MSLYNYJ。
2、形态学特征
将MSLYNYJ菌株接种于LB固体培养基上，于30℃条件下培养24h，然后观察菌落形态。如图1所示，该菌落较小，呈淡黄色、圆型，且菌落不透明、较湿润，周围无突起。
3、生长曲线
将MSLYNYJ菌株接种于LB液体培养基中，在30℃、180rpm条件下进行震荡培养，每隔1h取样一次，并测定菌液OD值，绘制生长曲线。如图2所示，通过生长曲线发现该菌株在前9h处于延缓期，9h后进入对数期，14h后进入稳定期。同时，培养基的pH在第9h后开始急剧下降，从pH6.9显著下降至pH6.15左右，然后小幅回升，最终稳定在pH6.3左右。
同时，本实施例提供了一株巨大普里斯特氏菌(Priestiamegaterium)WSH002(以下简称为“WSH002”)，且保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为：CCTCCM2023293，保藏日期为2023年3月13日。
上述WSH002菌株信息如下：
1、菌株来源
上述WSH002菌株分离自水稻根际土，具体分离过程包括如下步骤：
S1、按照土水比1:10(质量比)，用灭菌超纯水对水稻根际土进行重悬，然后稀释10倍，以得到稀释液；
S2、将稀释液分别涂布于含不同浓度镉的固体筛选培养基上，将培养基上生长的菌落用LB液体培养基进行扩繁，连续传代3次；
S3、挑选扩繁后的菌种，运用16srRNA通用引物27f和1492r进行菌液PCR，获得的产物进行测序，以获取如SEQNO.2所示的测序结果；
S4、将测序结果在NCBI数据库进行比对，结果显示，其与PriestiamegateriumWSH-002的序列同源性为99.54％(登录号NC_017139.1)。由此得到一株巨大普里斯特氏菌(Priestiamegaterium)(以下简称为“WSH002”)。
2、形态学特征
将WSH002菌株接种于LB固体培养基上，于30℃条件下培养24h，然后观察菌落形态。如图3所示，该菌落较小，呈淡黄色、圆型，且菌落不透明、较湿润，周围无突起，中间具有白点。
3、生长曲线
将WSH002菌株接种于LB液体培养基中，在30℃、180rpm条件下进行震荡培养，每隔1h取样一次，并测定菌液OD值，绘制生长曲线。如图4所示，通过生长曲线发现该菌株延缓期较长，约12小时，12h后进入对数期，17h后进入稳定期。
解磷能力鉴定
取若干体积(50ml)、配比相同的无机解磷菌鉴定液体培养基，培养基配方如下：葡萄糖10g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸粉0.5g/L，氯化钾0.3g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸钾0.3g/L，硫酸亚铁0.03g/L，磷酸钙5.0g/L，pH值7.0-7.5。分成未加菌株组(即“CK”)、加MSLYNYJ菌株组(即“MSLYNYJ”组)以及加复合菌剂组(即“MSLYNYJ+WSH002”组)；
其中，向MSLYNYJ组培养基中加入1％(以液体培养基体积计)的MSLYNYJ菌液(此时每ml菌液中，MSLYNYJ菌株的菌种含量为3*108～8*108CFU，优选为5*108CFU)，向WSH002组培养基中加入1％(以液体培养基体积计)的WSH002菌液(此时每ml菌液中，WSH002菌株的菌种含量为2*108～6*108CFU，优选为4*108CFU)以及向MSLYNYJ+WSH002组培养基中加入1％(以液体培养基体积计)的复合菌剂，所述复合菌剂菌液由上述MSLYNYJ菌液以及WSH002菌液按照体积比1:1配制而成；
然后将4种处理的培养基均置于30℃、180rpm条件下培养24小时，然后分别测定4种处理培养基中的磷含量，其结果如表1所示。
表1细菌解磷能力鉴定
从表1中可以看出，仅添加MSLYNYJ和WSH002菌株的培养基中，磷含量从14.32mg/kg分别增加到了205.63mg/kg和156.35mg/kg，分别增加了1335.96％和991.83％，而同时添加MSLYNYJ、WSH002菌株后，培养基中的磷含量从14.32mg/kg增加到了398.56mg/kg，增加了2683.24％，由此可见，WSH002菌株和MSLYNYJ菌株配合使用进一步增强了解磷能力。
分泌有机酸种类鉴定
上述“解磷能力鉴定”部分中的4种培养基培养24小时后，提取各组液体培养基样品，于13000r/min条件下离心10min，然后取上清液，将上清液用0.22μm滤膜过滤，然后采用高效液相色谱HPLC测定上清液中有机酸的种类和含量。结果如图5所示。
从图5中可以看出，相对于CK组而言，仅添加MSLYNYJ菌株和WSH002菌株的培养基中，莽草酸和琥珀酸两种有机酸的含量均显著增加，而同时添加MSLYNYJ、WSH002菌株后，莽草酸和琥珀酸的含量相对MSLYNYJ组和WSH002组均进一步增加。MSLYNYJ菌株和WSH002菌株的解磷机制为通过分泌有机酸将环境中固定的磷进行释放，从而增加基质中的有效磷含量，同时添加WSH002菌株和MSLYNYJ菌株后，培养基中的莽草酸和琥珀酸进一步增加，说明了以上两种菌株配合使用可以通过增强有机酸的释放来提高解磷能力。
实施例2：
本实施例提供了实施例1中所述MSLYNYJ菌株、WSH002菌株以及复合菌剂在水稻种植中的应用。
准备若干花盆，且每一花盆中添加相同重量(如4kg)、相同性质的基质(如土壤)，所述基质中有效磷含量为4.5-4.7mg/kg(该磷含量极低，可认为是缺磷条件)；
再将花盆分为不添加磷肥以及任何菌株对照组-P+CK、不添加磷肥但添加MSLYNYJ菌株实验组-P+MSLYNYJ、不添加磷肥但添加WSH002菌株实验组-P+WSH002、不添加磷肥但添加复合菌剂实验组-P+MSLYNYJ+WSH002；以及，添加磷肥但不添加任何菌株对照组+P+CK、添加磷肥及MSLYNYJ菌株实验组+P+MSLYNYJ、添加磷肥及WSH002菌株实验组+P+WSH002、添加磷肥及复合菌剂实验组+P+MSLYNYJ+WSH002，每组三个重复；
其中，-P+CK组、-P+MSLYNYJ组、-P+WSH002组、-P+MSLYNYJ+WSH002组的土壤中均不添加额外的磷肥，-P+MSLYNYJ组、-P+WSH002组、-P+MSLYNYJ+WSH002组中均按照50ml/1000g基质的比例对应添加MSLYNYJ菌液、WSH002菌液以及复合菌剂，其中，MSLYNYJ菌液、WSH002菌液以及复合菌剂与“解磷能力鉴定”部分相同；
+P+CK组、+P+MSLYNYJ组、+P+WSH002组、+P+MSLYNYJ+WSH002组的基质中均按照(40mgP2O5/kg基质)添加额外的磷肥(以mg计)，-P+MSLYNYJ组、-P+WSH002组、-P+MSLYNYJ+WSH002组中均按照50ml/1000g基质的比例对应添加MSLYNYJ菌液、WSH002菌液以及复合菌剂，同样的，MSLYNYJ菌液、WSH002菌液以及复合菌剂与“解磷能力鉴定”部分相同。
每个花盆中移栽3株生长至两叶一心的水稻幼苗，本实施例中，水稻品种为日本晴。
水稻农艺性状测定
水稻生长30天后取样，分别测定各处理组水稻的农艺性状，包括株高、叶面积、地上部干重和分蘖数，结果如表2所示。
表2水稻农艺性状
从表2中可以看出，在缺磷条件下，在基质中单独添加MSLYNYJ菌株、WSH002菌株均可以提高水稻的株高、叶面积、地上部干重和分蘖数；进一步的，添加含有MSLYNYJ菌株、WSH002菌株的复合菌剂后，上述各项指标进一步显著提高，其原因在于，MSLYNYJ菌株和WSH002菌株同样具有解磷作用，在土壤中同时接种两种细菌后，通过增加有机酸的释放，进一步增强了对土壤中固定态磷的释放作用，从而增加了水稻的生长。
同时，WSH002菌株还具有降低基质中的重金属离子(如镉)毒害的作用，在酸性条件下，重金属离子会从结合态转化成具有毒害作用的离子状态，从而抑制土壤生物和植物的生长。本实施例中，同时添加MSLYNYJ菌株和WSH002菌株后，WSH002菌株可缓解重金属对MSLYNYJ菌株生长的抑制作用，从而促进MSLYNYJ菌株生长，增强其解磷能力，进一步促进水稻生长。
光合效率测定
水稻生长30天后对完全展开的倒二叶用LI-6400XT光合仪进行光合效率检测。检测结果如表3所示。
表3水稻光合作用
如表3所示，在缺磷条件下，在土壤中接种MSLYNYJ菌株和WSH002菌株均显著提高水稻的净光合速率、胞间二氧化碳浓度、蒸腾速率和气孔导度；类似的，同时接种MSLYNYJ和WSH002菌株后，其相对于单独添加MSLYNYJ菌株/WSH002菌株而言，两者菌株的共同使用可进一步改善水稻光合作用相关指标。
水稻植株磷含量测定
水稻生长30天后采样，测定根茎叶中的磷含量。检测结果如表4所示。
表4水稻植株磷含量
从表4中可以看出，在缺磷条件下，在基质中添加MSLYNYJ菌株后，水稻根、茎、叶中的磷含量分别增加了5.95％、7.77％和15.89％，在基质中添加WSH002菌株后，水稻水稻根、茎、叶中的磷含量分别增加了4.86％、6.31％和18.69％，同时添加MSLYNYJ和WSH002菌株后，水稻根、茎、叶中的磷含量进一步提高，分别增加15.68％、14.56％和23.36％，说明复合菌剂的添加可进一步促进基质中有效磷的释放，从而提高了水稻植株体内的磷含量。
基质磷含量测定
水稻生长30天后，对各处理组中的基质进行采样，测定有效磷和微生物量磷含量。检测结果如表5所示。
表5基质有效磷和微生物量磷含量
基质中的有效磷是可被植物直接吸收利用的磷，其含量的高低直接关系到植物对磷的吸收。如表5所示，在缺磷条件下，单独接种MSLYNYJ菌株和WSH002菌株均显著提高基质中的有效磷含量，分别提高了331.30％和303.79％，接种复合菌剂后，基质中的有效磷含量增加了571.25％。以上结果说明MSLYNYJ菌株和WSH002菌株均可通过解磷作用提高土壤有效磷含量，两者同时接种后其解磷效果可以进一步增强。
基质中的微生物量磷是基质磷最活跃的部分，也是基质有效磷的“源”和“库”。同时，微生物磷含量从一个侧面反映了基质中微生物的丰富程度，微生物磷含量的增加可以增加土壤中的有效磷含量。类似的，缺磷条件下，在基质中单独接种MSLYNYJ菌株和WSH002菌株后，可将基质中的微生物量磷含量分别提高56.46％和45.09％，接种M复合菌剂后，微生物量磷含量增加103.00％。以上结果说明MSLYNYJ菌株和WSH002菌株均可提高微生物磷含量，两者同时接种后微生物磷含量的增加效果可进一步增强，从而为转化为有效磷打下基础。
基质酶含量测定
水稻生长30后，对各处理组中的基质进行采样，测定酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶的活性。检测结果如表6所示。
表6基质中酸/碱性磷酸酶和植酸酶活性
磷酸酶主要通过磷脂的去磷酸化或有机物中的磷脂键水解释放磷素，植酸酶通过对植酸磷的释放，从而起到溶磷作用，最终提高基质中的有效磷含量。
如表6所示，在缺磷条件下，单独添加MSLYNYJ菌株、WSH002菌株后，基质中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶活性分别对应提高24.46％、130.06％、17.52％以及13.71％、52.33％、14.33％。添加复合菌剂后，三种酶的活性分别增加45.93％、181.39％和38.53％，说明MSLYNYJ菌株和WSH002菌株的联合使用可进一步提高解磷相关酶的活性，从而促进基质中有效磷的释放，进一步增强解磷能力。
水稻产量测定
水稻生长100天后到达成熟期，采集稻穗，测定每株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重和产量。检测结果如表7所示。
表7成熟期水稻产量及产量构成因子
对水稻考种后发现，在缺磷条件下，单独添加MSLYNYJ菌株和WSH002菌株以及复合菌剂均显著提高水稻的每株穗数、每穗粒数和结实率，从而提高水稻的产量；在土壤中同时接种MSLYNYJ和WSH002进一步提高了水稻的每株穗数、每穗粒数和结实率，从而提高水稻的产量。
综上所述，本发明中的MSLYNYJ和WSH002菌种单独作用下均可通过生命代谢活动产生有机酸，降低基质的pH值，与铁、铝、钙、镁等离子结合，从而使难溶性的磷酸盐溶解，增加有效磷含量，并提高酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶的活性，从而促进有机磷的矿化，使其分解为植物可直接吸收利用的有效磷。
进一步的，两种菌种配制为复合菌剂使用后，可进一步提高固定态磷的释放效率，从而增加有效磷含量，并改善水稻的光合作用，最终提高水稻在缺磷条件下的产量。
上述实施例1-2中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本申请的保护范围。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (8)
1.一株马斯利亚农业菌，其特征在于，所述马斯利亚农业菌为马斯利亚农业菌MSLYNYJ，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2023292，保藏日期为2023年3月13日。
2.如权利要求1所述的马斯利亚农业菌在提高植物生长基质有效磷含量中的应用。
3.如权利要求1所述的马斯利亚农业菌在提高植物根和/或茎和/或叶的磷含量中的应用，所述植物为水稻。
4.如权利要求1所述的马斯利亚农业菌在提高水稻产量中的应用。
5.一种复合菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的马斯利亚农业菌以及一株巨大普里斯特氏菌，所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌WSH002，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2023293，保藏日期为2023年3月13日；
所述复合菌剂由MSLYNYJ菌液以及WSH002菌液按照体积比1:1配制而成，且每毫升MSLYNYJ菌液中，MSLYNYJ菌株的菌种含量为3*108～8*108CFU，每毫升WSH002菌液中，WSH002菌株的菌种含量为2*108～6*108CFU。
6.如权利要求5所述的复合菌剂在提高植物根和/或茎和/或叶的磷含量中的应用，所述植物为水稻。
7.如权利要求5所述的复合菌剂在提高植物生长基质有效磷含量中的应用。
8.如权利要求5所述的复合菌剂在提高水稻产量中的应用。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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