CN110438037A - 一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌p5及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物根际促生菌技术领域，具体公开了一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌P5及其应用。所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。本发明从小麦根际土壤中分离得到一株溶磷菌P5，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，鉴定其为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)。该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶磷，可大幅度的增加土壤中速效磷的含量，提高植物对土壤中磷的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量，在农业生产上具有重要意义。

Description

一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌P5及其应用
技术领域
本发明涉及植物根际促生菌技术领域，具体地，涉及一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌 P5及其应用。
背景技术
磷是植物进行生长和代谢活动所必需的营养元素，对农作物高产起到了关键作用。相关文献表明，我国有74％的耕地土壤缺磷，土壤中95％的磷和钙、铝、铁等离子结合形成难于溶解的化合物，植物很难吸收利用。在农业生产中多采取施用高水溶性磷肥以补充植物对磷的需求，但磷肥施入土壤后易形成难溶性的磷酸盐并迅速被土壤矿物吸附固定或被微生物固持，利用率较低，仅为35％左右。增施磷肥不仅造成了磷资源的大量浪费，还加重了环境污染问题。因此，减少化肥使用，提高土壤中磷的利用率，对作物高产和土壤生态维护等方面都具有非常重要的意义。
溶磷微生物在土壤磷的转化中起关键作用，能将难溶磷转化为植物可利用的有效磷，能提高磷肥利用率，减少磷肥施用。此外，溶磷微生物不仅能通过活化土壤中的营养元素，增强植物对磷的吸收，并且部分微生物还能合成和分泌对植物生长有促进作用的物质，如吲哚-3-乙酸(IAA)、铁载体及1-氨基环丙烷-羧酸(ACC)脱氨酶等，从而促进植物的生长和发育。因此，筛选相关的功能微生物并研究它们对植物的促生作用，对减少化肥使用、提高作物产量方面有重要意义。
据不完全统计，目前全世界共筛选出30属89种溶磷微生物，其中真菌27个种，细菌58个种，放线菌4个种。不同溶磷菌对多种难溶性磷酸盐的溶解能力存在着明显差异。如申请号为CN201610155718.7的中国专利公开了一种能促进白三叶地上组织生长的高效解磷菌及其应用，具体是采集白三叶根际土壤，利用PKO选择培养基从样本中分离纯化出一种溶磷细菌，经鉴定为阴沟肠杆菌(Enteuobactor cloacae)，该菌株在PKO培养基上能形成较大的溶磷圈。将该菌接种到白三叶上之后，宿主植物的生物量有大幅度的增加。
虽然现有技术中已有多种溶磷菌，但筛选新的植物根际溶磷菌并研究其对植物的促生作用仍然具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌P5，本发明从小麦根际土壤中分离得到一株新的溶磷菌P5，对小麦的适应性较好，能在小麦根际定殖并促进小麦生长。
本发明的另一目的在于提供上述克雷伯氏菌P5在溶解植物根际土壤难溶磷中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述克雷伯氏菌P5在提高植物根际土壤速效磷含量中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述克雷伯氏菌P5在制备促进植物生长的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物株高的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物干重的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物氮含量的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物磷含量的制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明从小麦根际土壤中分离得到一株溶磷菌P5，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，16S rDNA鉴定结果验证其为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)。通过对磷含量进行测定，结果表明该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶磷，可大幅度的增加土壤中速效磷的含量，提高植物对土壤中磷的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量。
因此，本发明请求保护一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌P5，所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5具有如下形态和生理生化特性：
所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5在LB培养基上培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，直径2～3mm，菌落乳白色且中心略带淡黄色；在显微镜下，革兰氏染色呈阴性，细胞呈短杆状，不产生芽孢。该菌株能以葡萄糖、枸橼酸、丙二酸盐和乳糖作为碳源生长，吲哚试验和甲基红试验呈阴性，VP反应呈阳性，能产生淀粉酶和脲酶。
所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还请求保护上述克雷伯氏菌P5在溶解植物根际土壤难溶磷中的应用。
优选地，所述难溶磷为无机磷和/或有机磷。
本发明还请求保护上述克雷伯氏菌P5在提高植物根际土壤速效磷含量中的应用。
本发明还请求保护上述克雷伯氏菌P5在制备促进植物生长的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物株高的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物干重的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物氮含量的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述克雷伯氏菌P5在制备提高植物磷含量的制剂中的应用。
更优选地，所述植物为小麦。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从小麦根际土壤中分离得到一株溶磷菌P5，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，鉴定其为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)。该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶磷，可大幅度的增加土壤中速效磷的含量，提高植物对土壤中磷的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量，在农业生产上具有重要意义。
附图说明
图1为菌株P5形成的溶磷圈。
图2为菌株P5的系统发育树。
图3为小麦接种菌株P5后株高、干重、氮含量和磷含量的变化情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
PKO无机磷培养基：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，(NH4)SO4 0.5g，NaCl 0.2g，KCl0.2g， MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，酵母膏0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml， pH值6.8～7.0。
LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，水1000mL。
LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，水1000mL。
Salkowski显色液：0.5M FeCl3 1mL，H2SO4 30mL，蒸馏水50mL。
蒙金娜有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，卵磷脂0.2g，CaCO3 5g，酵母膏0.4g，琼脂15g，蒸馏水l000mL，pH值7.0～7.2。
Ashby培养基：葡萄糖10g，K2HPO4 0.2g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2SO40.2g， CaCO3 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
实施例1溶磷菌的筛选
1、溶磷菌初筛
2017年9月从陕西省杨凌区的农田中采集生长7个月左右的小麦植株，用力抖落小麦根部松散结合的土壤。将植株根剪下放入10mL灭菌的离心管中，注入5mL无菌水后进行超声波处理，使与植株根部紧密结合的根际土溶于水中。所采集的土样为黄壤土，样品速效磷24.03mg/kg、速效钾126.17mg/kg、碱解氮56.28mg/kg、有机质21.06g/kg、pH＝8.27。
将水溶液作一系列10倍稀释，分别取5μL稀释度为10-5、10-6和10-7的土壤悬液涂布于PKO无机磷培养基上，于28℃培养5天。将能产生透明溶磷圈的菌株转接到LB固体培养基上保存备用。
2、溶解无机磷能力测定
将上述有溶磷圈的菌株纯化后重新接种于PKO无机磷培养基上，测定溶磷圈直径D和菌落直径d。挑取D/d大于2的菌落于LB液体培养基中，于28℃下培养24h。吸取1mL 上述菌悬液到50mL解磷培养基(NBRIP培养基)中，以1mL LB培养基代替菌悬液作为对照，各处理设3个重复。在28℃、200rpm条件下培养5天后，将5mL的培养液于10000rpm 条件下离心，取1mL的上述上清液并加入5mL钼锑抗试剂，用超纯水定容到50mL后反应20min，测定OD650并计算磷含量。
试验结果表明编号为P5(即CCNWSX1902)的菌株溶磷圈和发酵液中可溶性磷的含量较大，分别为2.56和231.68mg/L。菌株P5形成的溶磷圈如图1所示。
3、P5产IAA能力测定
将具有溶磷能力的P5菌株接种到装有20mL的LB液体培养基锥形瓶中，在28℃条件下，150r/min振荡培养48h。用移液器吸取50μL培养液到白色陶瓷板上，再加入50μL的Salkowski显色液，以50μL 50mg/L的IAA标准溶液作阳性对照，室温下避光反应30min 后观察颜色。
结果表明菌株P5菌悬液与显色液反应变红，说明该菌株能产生IAA。
4、溶解有机磷
将P5菌株按1％接种于LB液体培养基振荡培养24h，取5μL菌悬液滴加到蒙金娜有机磷培养基上，于28℃培养5天。
结果显示在菌落周围出现了透明的溶磷圈，说明菌株P5也能溶解有机磷。
5、固氮能力检测
将菌株P5接种于LB培养基上培养24h，挑去菌落溶于无菌水制备P5菌悬液，用移液器取5μL菌悬液滴加到Ashby培养基上，于28℃培养3天。
结果表明菌株能够在Ashby无氮培养基上正常生长，表明该菌株具备一定的固氮能力。
实施例2菌株P5的鉴定
1、形态特征
将P5菌株制备成菌悬液并稀释后涂布于LB固体培养基上，于28℃培养24h后观察菌落和菌体形态。
结果显示该菌革兰氏染色呈阴性，细胞呈短杆状，不产生芽孢；在LB培养基上培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，直径2～3mm，菌落乳白色且中心略带淡黄色。
2、生理生化特征
参照细菌鉴定手册对菌株P5的VP反应、碳源利用、吲哚试验等生理生化特性进行测定，其结果显示该菌株能以葡萄糖、枸橼酸、丙二酸盐和乳糖作为碳源生长，吲哚试验和甲基红试验呈阴性，VP反应呈阳性，能产生淀粉酶和脲酶。
3、16S rDNA测序
采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株P5的基因组DNA，用细菌通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16S rDNA，经电泳检测后送公司测序，序列在NCBI数据库中进行比对。菌株P5的16S rDNA 序列如SEQ ID NO:1所示。
鉴定结果：菌株P5在分类上归属于克雷伯氏菌，与Klebsiella quasivariicola相似度为 99.85％，菌株P5的系统发育树如图2所示。
将克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。保藏地址为中国. 武汉.武汉大学。
实施例3小麦促生试验
挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次，最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，每盆种6颗，表面覆盖约1cm土壤。试验设2个处理，处理1每个植株接1mL无菌培养基，处理2每个植株接种P5菌液(约108个/mL)1mL，每个处理3个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25℃/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，60天后测定植物株高、鲜重、干重、氮磷钾含量。
结果如表1和图3所示，由表1可以看出，接种溶磷菌的小麦对氮磷的吸收要明显高于未接菌对照组，植物的长势更好。接菌植物株高、干重、氮含量和磷含量分别比空白对照组提高了20.2％、55.3％、31.8％和51.2％。
表1小麦接种P5菌液前后植物株高、干重、氮含量和磷含量的变化
株高(cm) 植物氮含量(g/kg) 植物干重(g) 植物磷含量(g/kg)
对照 21.12 8.57 0.94 2.44
接菌处理 25.39 11.3 1.46 3.69
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌P5及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1313
<212> DNA
<213> 克雷伯氏菌(Klebsiella quasivariicola)
<400> 1
acgggtgagt aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg ataactactg gaaacggtag 60
ctaataccgc ataacgtcgc aagaccaaag tgggggacct tcgggcctca tgccatcaga 120
tgtgcccaga tgggattagc tggtaggtgg ggtaacggct cacctaggcg acgatcccta 180
gctggtctga gaggatgacc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg 240
aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgtg 300
tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagcgggga ggaaggcggt gaggttaata 360
acctcatcga ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 420
ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg 480
tctgtcaagt cggatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcattc gaaactggca 540
ggctagagtc ttgtagaggg gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc 600
tggaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa 660
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gctgtaaacg atgtcgattt 720
ggaggttgtg cccttgaggc gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg 780
agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 840
atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc cacagaactt 900
tccagagatg gattggtgcc ttcgggaact gtgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 960
ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc 1020
cagcggttag gccgggaact caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggga 1080
tgacgtcaag tcatcatggc ccttacgacc agggctacac acgtgctaca atggcatata 1140
caaagagaag cgacctcgcg agagcaagcg gacctcataa agtatgtcgt agtccggatt 1200
ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat cagaatgcta 1260
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtg 1313

Claims (10)

1.一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌P5，其特征在于，所述克雷伯氏菌(Klebsiellasp.CCNWSX1902)P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。
2.权利要求1所述克雷伯氏菌P5在溶解植物根际土壤难溶磷中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述难溶磷为无机磷和/或有机磷。
4.权利要求1所述克雷伯氏菌P5在提高植物根际土壤速效磷含量中的应用。
5.权利要求1所述克雷伯氏菌P5在制备促进植物生长的制剂中的应用。
6.权利要求1所述克雷伯氏菌P5在制备提高植物株高的制剂中的应用。
7.权利要求1所述克雷伯氏菌P5在制备提高植物干重的制剂中的应用。
8.权利要求1所述克雷伯氏菌P5在制备提高植物氮含量的制剂中的应用。
9.权利要求1所述克雷伯氏菌P5在制备提高植物磷含量的制剂中的应用。
10.根据权利要求2至9任一项所述应用，其特征在于，所述植物为小麦。
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