CN1443729A - 竹林生物肥 - Google Patents

Abstract

可供无公害绿色竹笋和有机竹笋生产中对生物有机肥的需求，以减少或替代化肥使用的一种竹林生物肥，是由基质和竹类植物根际联合固氮菌构成，所述的竹类植物根际联合固氮菌是从竹类植物根际分离的能固定大气中分子态氮的竹类植物根际联合固氮菌，该联合固氮菌是多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG－1菌株、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG－2菌株、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis Chester)WG－3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG－4菌株中的任意一菌株或任意两种或两种以上菌株的组合。本发明的肥料可用于竹林培育。

Description

竹林生物肥

                        技术领域

本发明涉及含有微生物的肥料，特别是竹林生物肥料。

                        背景技术

化学肥料使用方便，肥效快，能提供作物生长的必需元素，对解决人类温饱问题起了关键作用。但是，化学肥料也有许多弊端，如：生产时消耗大量能源，生产成本高；生产和使用中会对水和大气产生污染，流失率高，植物利用率低；过量施用氮素化肥后植物体内积累的亚硝酸盐对人体健康有害；由于化学肥料元素单一，互相搭配时难以合理配比，使农产品营养价值和风味降低；施用化学肥料，相应地减少有机肥使用随之带来土壤中有机质含量降低，使土壤板结、地力下降。因此，人们一直试图寻找其它肥源。

自从Dbereiner(1976)报道了含脂刚螺菌与玉米根系具有联合固氮作用以来，引起了国际上的普遍重视，世界各国对许多禾本科农作物及牧草进行固氮能力测定及固氮菌分离，证实禾本科植物普遍具有联合固氮作用，为利用生物固氮解决禾本科作物的氮素供应找到了希望。目前国际上正从菌株筛选、菌剂应用、菌株的基因工程改良以及植物根系的微生物生态学等诸多领域对此进行研究，研制了许多适合禾本科农作物的联合固氮菌肥。

目前的研究认为，联合固氮是介于自生固氮和共生固氮之间的一种固氮形式，联合固氮和自生固氮之间并无明确界限；联合固氮菌是一类定殖于植物根际、与植物间有较密切关系，在植物根上不形成特异化结构的固氮菌；在植物根际根系分泌的大量有机碳源物质，为联合固氮菌的生长、繁殖和固氮提供了碳源和能源，且联合固氮菌固定的氮素又很容易被植物利用，联合固氮菌和植物之间呈互惠互利关系；据研究联合固氮菌具有一定的宿主专一性和同源性，在和其宿主植物联合时固氮效率非常高，且宿主对其固定氮的利用率也非常高，而联合固氮菌在自生条件下虽然也能固氮，但固氮效率随环境条件变化很大，如在人工培养基上合适的温湿条件下，联合固氮菌的固氮效率也非常高，但在自然土壤中联合固氮菌的固氮效率一般来说就比较低。

竹类植物属禾本科，是我国热带、亚热带地区的重要森林植物，也是世界许多国家尤其是东南亚各国重要的森林资源。由于其特殊的生长优势和重要的经济价值，故越来越受到世界各国的重视，但对其生物固氮研究却未见报道。1994年本发明人在国际上首次提出竹类植物作为禾本科植物的一大成员应该具有联合固氮特性的观点。经过多年研究，不仅证实竹类植物和其它禾本科农作物一样确实具有联合固氮作用，并从多种竹类植物根际分离到大量联合固氮菌，对这些联合固氮菌进行进一步研究后，筛选到几株固氮活性较高具有研究利用价值的菌株，用它们对毛竹实生苗、麻竹组培苗及多种笋用竹林进行接种和施用后，证明具明显提高竹子根系及竹林土壤固氮强度，增加竹子叶片含氮量，促进竹子生长尤其是根系生长，提高笋产量和苗木成活率等作用，并且混合菌种的接种效果优于单一菌种。

目前在我国已基本解决温饱问题后，环境和食品安全问题已得到广泛重视，顺应国际发展潮流，我国对无公害食品、绿色食品、有机食品的需求越来越高。目前各地发展的无公害竹笋、绿色竹笋及有机竹笋，急需高效生物肥、有机肥和生物有机复合肥等，以部分或完全取代化肥，同时在大面积材用竹林中施用生物肥或有机肥替代化肥，也可以减少水源和环境污染。因此，研制以竹子根际联合固氮菌作为主要固氮菌种，并配合其它措施生产的竹林生物肥，具有重要意义。竹林生物肥不仅包含了自竹类植物根际分离筛选的联合固氮菌，而且可以和其它种类的微生物和/或各种有机质(肥)和/或无机肥和/或其它成分复合或混配，形成一类可以满足不同竹类植物、不同生产目的、不同质量要求的竹林生物肥。

在禾本科农作物上联合固氮菌肥的应用一般是通过种子包衣或菌剂拌种等方式，使种子和固氮菌密切接触，种子发芽生根时联合固氮菌首先占据根系有利位置，在根际形成优势。由于竹子为多年生植物，而且竹子很少用种子播种，再加上竹类植物根系地下结构的复杂性，给竹子联合固氮菌肥的施用带来困难，联合固氮菌很难直接施入根表和土著菌争夺有利位置形成优势菌群，当进入土壤后，接触到根系的固氮菌才有可能和土著菌竞争并进行联合固氮，而接触不到根系的联合固氮菌如果缺少碳源物质及其它养分的供应时将处于休眠状态或很快死亡。根据这种情况本发明人提出，竹林施用联合固氮菌肥时，首先要设法保证联合固氮菌在土壤中自生条件下的充分存活和旺盛繁殖，在此基础上才能使固氮菌有可能慢慢地向整个根系渗透并最终占据根际优势位置进行联合固氮。因此竹林联合固氮菌施肥时最好同时配合有机碳源物质及磷钾元素和多种植物和微生物必须的中微量元素，其中有机碳源物质是关键因素，所谓的有机碳源物质包括富含纤维素、半纤维素及各种糖类的有机质或有机肥，这些物质在土壤中经纤维素分解菌分解后可为固氮菌提供丰富的葡萄糖等低分子碳源，因为有充足的有机碳源和矿质元素的供应，且有机质施入土壤后使土壤的保水性增强，使联合固氮菌进入土壤后可先适应环境在自生条件下生长繁殖并固氮，最终将慢慢地在竹子根际形成优势菌群和土著菌进行竞争争夺根际位置进行联合固氮。这种竹林生物肥不仅具有联合固氮作用，而且首先也具有自生固氮作用。同时竹林生物肥中也可以配合解磷菌、解钾菌等各种土壤有益微生物，提高植物和固氮菌对磷钾元素及有机碳源物质的利用率，因此，在联合固氮菌的基础上也可复合磷细菌和钾细菌。

                          发明内容

本发明所要解决的技术问题是：减少或替代竹类植物氮素化肥的使用，提高竹笋品质，适应无公害绿色竹笋和有机竹笋生产时对生物肥料的需求，避免笋用竹林和材用竹林泛用化肥对环境的污染而提供一种竹林生物肥，这种生物肥可以通过生物固氮为竹子提供氮素，当配合其它成分如磷细菌、钾细菌及有机肥和无机肥时也兼有提高肥料和土壤中磷钾利用率，进一步改良土壤、改善微生物的微生态环境等作用。

本发明竹林生物肥采用的技术方案其特殊之处是由基质和竹类植物根际联合固氮菌构成，所述的竹类植物根际联合固氮菌是从竹类植物根际分离的能固定大气中分子态氮的竹类植物根际联合固氮菌，该联合固氮菌是多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG-2菌株、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis Chester)WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株中的任意一菌株或任意两种或两种以上菌株的组合。

所述的从竹类植物根际分离的联合固氮菌多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa mace)WG-2菌株、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformisChester)WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株已于2002年3月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心保藏。该中心地址：北京中国林业科学研究院内，保藏编号：多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxamace)WG-1菌株为CFCC 1252，多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxamace)WG-2菌株为CFCC 1253，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformisChester)WG-3菌株为CFCC 1251，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株为CFCC 1254。

本发明的竹林生物肥，还可以包含磷细菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，菌种保藏号为：ACCC 10010)和钾细菌胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus，菌种保藏号为：ACCC10013)。

所述的基质为所述菌种生存的液体介质、吸附剂、有机物料、无机物料之一种或数种；

所述的生物肥为：a)液体生物肥，b)固体菌剂，c)生物有机肥和d)生物有机无机肥之任何一种，其中：

a)液体生物肥是所述的菌种经液体发酵培养基发酵后形成的液体生物肥，其中菌种生存的液体介质，包括水、细菌代谢产物和部分营养物质；

b)固体菌剂是所述的液体生物肥经吸附剂吸附后形成的固体菌剂或经冻干后形成的冻干菌剂；

c)生物有机肥是所述的液体生物肥或固体菌剂和所述的有机物料构成的生物有机肥；

d)生物有机无机肥是所述的液体生物肥或固体菌剂和所述的有机物料、无机物料构成的生物有机无机肥；

所述的吸附剂为物料：草炭、泥炭、蛭石、轻质碳酸钙、高岭土、塘泥、膨润土、腐植质中的一种或两种及两种以上物料的混合物；

所述的有机物料为：作物秸秆、木屑、动物粪便、城市垃圾、污泥、工农业生产中的有机废弃物(酒糟、菇渣、糖厂的蔗渣等)等物料中的一种或一种以上物料的混合物；

所述的无机物料为市场上销售的各种含有大量元素及中微量元素的化学肥料等。

所述的从竹类植物根际分离的联合固氮菌其分离方法为：将竹根顺竹兜连土挖起，带回无菌实验室后抖掉浮土，再用自来水冲净泥土；挑选健壮活根剪成小于1cm的根段，用无菌水冲洗6次，然后用70％酒精浸泡5min，再用无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸去根段多余水分；分别称取1g鲜根段放入装有2ml修改的Dbereiner无氮半固体培养基的青霉素小瓶中，虚盖瓶盖(不密封)，于无菌培养箱中30℃培养24小时；盖好瓶盖(橡胶瓶盖)，用蜡封口，注入0.7ml乙炔，继续培养一小时后，测定乙炔还原活性；从中挑选有活性且活性较高的瓶装样品，用接种针挑取培养液在修改的Dbereiner无氮固体平板上划线分离，然后挑取单菌落并多次纯化；纯化后的菌，再接入装有修改的Dbereiner无氮半固体培养基的青霉素瓶中，测定乙炔还原活性(固氮活性)；对具较高乙炔还原活性的细菌进行进一步研究和鉴定。

所述的分离竹子根际联合固氮菌的经修改的Dbereiner无氮固体和半固体培养基，其配方为：称取葡萄糖5.0g，蔗糖5.0g，苹果酸5.0g，KH₂PO₄ 0.4g，K₂HPO₄.3H₂O 0.1g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl₂.2H₂O 0.02g，FeCl₃.3H₂O 0.01g，Na₂MoO₄.2H₂O0.002g，依次放入烧杯中用水溶解，再加入KOH 4g，搅拌溶化后用pH试纸测定溶液pH，用KOH稀溶液调节其pH至7.2左右，再加入酵母浸膏0.4g，搅拌，溶解，定容至1升。配置固体培养基时加入2％琼脂，配制半固体培养基时加入0.2％琼脂，灭菌后备用。

所述的从竹类植物根际分离的四株联合固氮菌其基本形态和生理生化特征是：

WG-1菌株[多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)]的基本特征为：细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为0.7-0.8μm×3.0-3.5μm，具端生到亚端生椭圆形芽孢，孢囊膨大，胞内无PHB颗粒；菌落小，突起，光滑，点状，乳酪色1-2mm；能产乙酰甲基甲醇(V-P反应阳性)；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖产酸并产气；具接触酶和淀粉酶；氧化酶和卵磷脂酶阴性，但能分解酪朊；硝酸盐能还原到亚硝酸盐；在7％NaCl中不生长，能生长于pH5.7；抗溶菌酶；能在厌氧培养基上生长；二羟基丙酮(甘油)阳性；在无氮培养基上生长好，能固定分子态氮；定名为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxamace)，但是Ash等(Ash Priest & Collins，Int.J.Syst.Bacteriol 44：812-826)已于1994年将多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)转入多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。

WG-2菌株[多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)]的基本特征为：细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为0.7-0.8μm×3.0-3.5μm，具端生到亚端生椭圆形芽孢，孢囊膨大，胞内无PHB颗粒；菌落呈圆形，光滑，透明，低凸，薄，大小为2-3mm；能产乙酰甲基甲醇(V-P反应阳性)；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖产酸并产气；具接触酶和淀粉酶；氧化酶和卵磷脂酶阴性，但能分解酪朊；硝酸盐能还原到亚硝酸盐；在7％NaCl中不生长，能生长于pH5.7；抗溶菌酶；能在厌氧培养基上生长；二羟基丙酮(甘油)阳性；在无氮培养基上生长好，能固定分子态氮；定名为多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa mace)，但是Ash等(Ash Priest & Collins，Int.J.Syst.Bacteriol 44：812-826)已于1994年将多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)转入多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。

WG-3菌株[地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis Chester)]的基本特征为：细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为0.8μm×2.2-3.0μm；具中生椭圆形芽孢，孢囊稍膨大到不膨大；胞内无PHB颗粒；在7％NaCl、pH5.7和溶菌酶中均能生长；石蕊牛奶胨化，不产酸；V-P反应阳性(产乙酰甲基甲醇)；氧化酶、接触酶和淀粉酶均阳性；不产卵磷脂酶，而能分解酪朊；能在厌氧培养基上生长；对葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇均产酸；二羟基丙酮(甘油)阴性等特征；在无氮培养基上生长好，能固定分子态氮；定名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis Chester)。

WG-4菌株[肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)]的基本特征为：细胞呈革兰氏阴性，杆状，大小为0.8-1.0μm×1.8-2.0μm；发酵葡萄糖产酸产气；在无氮培养基上生长好，能固定分子态氮；按革兰氏阴性杆菌编码鉴定结果为：

ONPG试验	精氨酸双水解酶	赖氨酸脱羧酶	鸟氨酸脱羧酶	柠檬酸盐利用	硫化氢产生	尿素分解	色氨酸脱氨酶	SIM(吲哚)	V|P反应	明胶液化	葡萄糖产酸	甘露醇产酸	肌醇产酸	山梨醇产酸	鼠李糖产酸	蔗糖产酸	蜜二糖产酸	苦杏仁苷产酸	阿拉伯糖产酸	氧化酶
																					+	-	+	-	+	-	+	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+	+	-	+	-

WG-4菌株定名为：肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiellapneumoniae subsp.pneumoniae)。

所述的竹林生物肥中还可包含磷细菌和钾细菌，所述的磷细菌指巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)，菌种保藏号为：ACCC10010；所述的钾细菌指胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，菌种保藏号为：ACCC 10013，可从中国微生物菌种管理委员会农业微生物菌种保藏中心获得。

本发明的竹林生物肥，其制造方法主要为：

a)液体生物肥——

①发酵培养多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株，制成多粘芽孢杆菌WG-1菌株液体生物肥。

②发酵培养多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG-2菌株，制成多粘芽孢杆菌WG-2菌株液体生物肥。

③发酵培养地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis Chester)WG-3菌株，制成多地衣芽孢杆菌WG-3菌株液体生物肥。

④发酵培养肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株，制成肺炎克雷伯氏菌WG-4菌株液体生物肥。

⑤将所述①、②、③、④四种液体生物肥中的任意两种或两种以上按需要的体积比混合，便成为各种混合联合固氮菌液体生物肥。

⑥将多粘芽孢杆菌WG-1菌株、多粘芽孢杆菌WG-2菌株、地衣芽孢杆菌WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌WG-4菌株中的任意两株或两株以上菌按需要的体积比接种，混合发酵，成为各种混合联合固氮菌液体生物肥。

⑦分别发酵培养磷细菌巨大芽孢杆菌ACCC 10010菌株和钾细菌胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013菌株，制成巨大芽孢杆菌ACCC10010发酵液和胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013发酵液，将这两种发酵液和上述①、②、③、④、⑤、⑥中的任意一种联合固氮菌液体生物肥混配，成为各种含有联合固氮菌、磷细菌、钾细菌的混合液体生物肥。

竹类植物根际联合固氮菌的发酵条件可使用公知的固氮菌的一般发酵条件，本发明中WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株均可采用以下优化条件：接种量10％，培养温度30-35℃，pH6.8-7.2，搅拌速度200转/分，培养时间20～30小时，通气量0.5～1∶1立方米/1000升。

竹类植物根际联合固氮菌的试管固体斜面培养基，可采用一般固氮菌常用培养基，本发明中的优化培养基配方为：葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，KH₂PO₄ 0.04％，K₂HPO₄.3H₂O 0.01％，MgSO₄.7H₂O0.02％，NaCl 0.01％，CaCl₂.2H₂O 0.002％，FeCl₃.3H₂O 0.001％，Na₂MoO₄.2H₂O 0.0005％，K₂SO₄0.15％，酵母浸膏0.06％，琼脂2％，pH6.8-7.2。

多种培养基都可用于所述的竹类植物联合固氮菌的摇床培养和发酵生产，本发明中所述竹类植物联合固氮菌的摇床培养和发酵罐发酵的优化培养基为：葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，玉米粉1％，K₂SO₄ 0.15％，KH₂PO₄ 0.04％，K₂HPO₄.3H₂O 0.01％，NH₄(SO₄)₂ 0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.02％，NaCl 0.01％，CaCl₂.2H₂O 0.002％，FeCl₃.3H₂O0.001％，Na₂MoO₄.2H₂O 0.0005％，蛋白胨0.1％，酵母浸膏0.08％。

磷细菌巨大芽孢杆菌的培养及发酵条件按公知的方法进行(陈廷伟等，《磷细菌》，农业出版社，1959年，北京)。磷细菌大量培养的发酵培养基可用公知的配方：淀粉2％，豆饼粉2％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾1％，酵母粉0.1％，碳酸钙0.01％，蛋白胨0.1％，pH7.2-7.4。其它发酵条件和竹类植物联合固氮菌相同。

钾细菌胶冻样芽孢杆菌的培养及发酵条件按公知的方法进行(陈廷伟等，《磷细菌》，农业出版社，1959年，北京)。钾细菌大量培养的发酵培养基可用公知的配方：淀粉10％，蔗糖0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.05％，三氯化铁0.002％，碳酸钙0.05％，酵母粉0.1％，豆饼粉5％，pH7.2-7.4。其它发酵条件和竹类植物联合固氮菌相同。

上述菌的具体培养和发酵方法可按常规方法进行，优化的方法为：采用通常的微生物提纯复壮技术，分别对上述三大类菌的各菌株进行提纯复壮处理，再分别将提纯复壮后的菌株移接到三大类菌的新鲜固体斜面试管培养基上，在30-32℃分别培养24小时，待表面生长饱满后进入摇床培养阶段。以上述摇床培养基及上述发酵条件对各菌株在三角瓶中摇床上30-32℃培养20-30小时，细菌数达到20亿/毫升时以10％的接种量接入一级种子罐，待菌数达到18-20亿/毫升时，以10％的接种量接入二级种子罐，再接入三级种子罐，以上述同样方法进行培养，对于芽孢杆菌，在培养后期可提高温度，促使细菌生长芽孢，镜检菌数达18-20亿/毫升，芽孢达80-100％时放罐，成为各种液体生物肥，将它们按所需比例混配便成为各种混合菌株液体生物肥。

b)固体菌剂——

将所述的吸附剂粉碎、灭菌后，加入所需要的上述①、②、③、④、⑤、⑥、⑦的液体生物肥(一种或数种)拌和后，使功能菌的数量和含水量控制在肥料要求的范围，便形成各种固体菌剂。

吸附剂的粉碎和灭菌可采用各种方法，粉碎后的物料应过80目筛，灭菌后的物料杂菌数控制在总菌数的5％以下，并无致病菌。对高湿物料可采用搅拌式高湿物料滚筒烘干机组，控制气流温度在600-750℃，烘干灭菌时间15-25分钟；对普通物料可采用热风滚筒烘干机200℃热风烘干灭菌；灭菌后物料冷却到室温。

吸附剂和液体生物肥的比例无严格限制，可根据原料情况进行调整。但所述的固体菌剂的质量标准最好能够优化到：不含磷细菌和钾细菌时，联合固氮菌的有效活菌数最好≥5亿个/克；含磷细菌、钾细菌时，联合固氮菌、磷细菌、钾细菌三者之和的有效活菌数最好≥6亿个/克，且联合固氮菌、磷细菌、钾细菌三者的有效活菌数最好分别≥2亿个/克，含水量小于30％。

c)生物有机肥——

将发酵好的前述的有机物料粉碎、灭菌后，加入所需要的一种上述a)或b)的液体生物肥或固体菌剂均匀混合，使氮、磷、钾各种功能菌的数量及含水量控制在肥料要求的范围，如果水分含量过高可以经低温干燥处理，制成生物有机肥。

d)生物有机无机肥——

将发酵好的前述的有机物料粉碎、灭菌后，根据需要加入少量的经粉碎的化肥，拌匀，再加入所需要的一种上述a)或b)的液体生物肥或固体菌剂，并混合均匀，使氮、磷、钾各种功能菌的数量及含水量控制在肥料要求的范围，如果水分含量过高可以经低温干燥处理，制成生物有机无机肥。

所述的生物有机肥或生物有机无机肥还可以通过下述方法生产：将前述的有机物料粉碎，接入所需要的一种上述a)或b)的液体生物肥或固体菌剂，采用目前公知的各种发酵方法，将联合固氮菌或联合固氮菌、磷细菌、钾细菌和有机原料共同发酵，形成生物有机肥；在此生物有机肥中加入适量化肥，便形成生物有机无机肥。由于所述生产竹林生物肥的菌种基本为芽孢杆菌属细菌，在发酵温度高时菌种便形成芽孢进入休眠状态，在发酵温度适宜时菌种又开始生长繁殖并在发酵的同时固氮，提高有机肥的含氮量。

有机物料的粉碎和灭菌可采用各种方法，粉碎后的物料应过80筛，灭菌后的物料杂菌数控制在5％以下，并无致病菌。对高湿物料可采用搅拌式高湿物料滚筒烘干机组，控制气流温度在600-750℃，烘干灭菌时间15-25分钟；对普通物料可采用热风滚筒烘干机200℃热风烘干灭菌；灭菌后物料冷却到室温。

有机物料和无机物料的量可根据所生产的肥料种类、种植的植物种类、作物的品质要求、施用地的土壤养分状况等进行调整，这是本专业人员可以做到的，但是作为生物有机肥或生物有机无机肥，其有机质的含量最好大于50％，而化肥的量不宜太高，作为生产有机食品的肥料时最好不含化肥，或含量不超过6％。

有机质发酵可采用目前公知的各种发酵方法和发酵设备，在水分含量50-70％的条件下通气发酵。

所述的生物有机肥或生物有机无机肥中的联合固氮菌有效活菌数，在不含磷细菌或钾细菌时一般应≥0.3亿个/克；含磷细菌、钾细菌时，联合固氮菌、磷细菌、钾细菌三者之和的有效活菌数最好应≥0.6亿个/克，且联合固氮菌、磷细菌、钾细菌三者的有效活菌数最好分别应≥0.2亿个/克；含水率一般在8-12％范围内。

所述制成的生物有机肥或生物有机无机肥，还可进一步造粒，制成颗粒肥。

造粒可采用各种方法，一般用成球盘造粒机，喷加20％的水分滚动制成直径3-5毫米颗粒，再经低温风力干燥制成，如有机质粘结力不够，可加入10-20％的粘土等作为粘结剂。

本发明的特点和有益效果：

1、竹类植物根际联合固氮是由本发明人在国际上率先提出并开展的一项研究。

2、多年研究证明，自竹类植物根际分离的所述的联合固氮菌株，具明显提高竹子根系和竹林土壤固氮强度，增加竹子叶片含氮量，促进竹子生长尤其是根系生长，提高笋产量和苗木成活率等作用。用所述的竹类植物根际联合固氮菌生产的竹林生物肥在笋用竹林施用后，次年可提高笋产量20％以上。

3、由于联合固氮具有一定的宿主专一性和同源性，因此在竹林栽培和经营中以竹子根际分离的联合固氮菌生产的竹林生物肥其作用是其它类型生物肥所不能替代的。

4、以竹子根际联合固氮菌为主要菌种生产的竹林生物肥在配合了解磷菌、解钾菌及其它土壤有益微生物和有机肥后，不仅可以减少或替代化肥使用，而且还具有改善土壤微生态环境，提高土壤保水保肥性能，全面提供竹类植物生长所需的各种养分等多种功效，对于绿色竹笋和有机竹笋的生产及环境保护具有重要意义。

5、目前市场上的生物肥料品种繁多，但是，适地适树适作物的专用生物肥却不多。由于生物肥料中含有活的微生物，而任何生物对自然界的适应性都是有局限的，因此用某种微生物肥料作用于所有植物、所有土壤类型、所有气候条件是不可能的，而适地适树适植物选择的微生物及生产的专用生物肥对某种植物会具有更强的针对性，也更具有研究应用前景。

6、除了联合固氮作用以外，本发明所使用的菌种还具有一些不明确的对植物的促生作用，如可分泌生长激素类物质及抗病类物质等。

                          具体实施方式

实施例1

1、配制固氮菌试管固体斜面培养基，其配方为：葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，KH₂PO₄ 0.04％，K₂HPO₄.3H₂O 0.01％，MgSO₄.7H₂O0.02％，NaCl 0.01％，CaCl₂.2H₂O 0.002％，FeCl₃.3H₂O 0.001％，Na₂MoO₄.2H₂O 0.0005％，K₂SO₄ 0.15％，酵母浸膏0.06％，琼脂2％，pH6.8-7.2。灭菌后，分别接入所述的四株自竹类植物根际分离的联合固氮菌WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株，30～32℃培养，使其表面生长饱满。

2、配制固氮菌的摇床培养培养基，其配方为：葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，玉米粉1％，K₂SO₄ 0.15％，KH₂PO₄ 0.04％，K₂HPO₄.3H₂O0.01％，NH₄(SO₄)₂ 0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.02％，NaCl 0.01％，CaCl₂.2H₂O 0.002％，FeCl₃.3H₂O 0.001％，Na₂MoO₄.2H₂O 0.0005％，蛋白胨0.1％，酵母浸膏0.08％，pH6.8-7.2。装入1000毫升三角瓶中，灭菌后，分别接入所述的四株自竹类植物根际分离的联合固氮菌WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株，30～32℃，摇床震荡培养，使细菌数达到20亿/毫升。

3、配制固氮菌的发酵培养基于发酵罐中，优化的培养基配方同2，灭菌。

4-1分别接入所述的四株自竹类植物根际分离的联合固氮菌(WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株)于不同的发酵罐中，接种量10％，发酵温度30-35℃，pH6.8-7.2，搅拌速度200转/分，通气量0.5～1∶1立方米/1000升，培养时间20～30小时，使细菌数达到20亿/毫升，便分别制成四种联合固氮菌液体生物肥或生物肥接种剂；用四株菌的液体培养物等体积混合，便成为一种混合联合固氮菌液体生物肥。

4-2将所述的四株自竹类植物根际分离的联合固氮菌(WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株)等体积共同接入同一发酵罐中发酵，接种量10％，发酵温度30-35℃，pH6.8-7.2，搅拌速度200转/分，通气量0.5～1∶1立方米/1000升，培养时间20～30小时，使细菌数达到20亿/毫升，制成混合菌株液体生物肥。

5、按前述的磷细菌培养基和本实施例1、2、3、4-1中同样的方法培养和发酵磷细菌，制成液体磷细菌生物肥。

6、按前述的钾细菌培养基和本实施例1、2、3、4-1中同样的方法培养和发酵钾细菌，制成液体钾细菌生物肥。

7、将本实施例4方法制备的混合联合固氮菌液体生物肥和液体磷细菌生物肥及液体钾细菌生物肥等体积混合，便制成含有联合固氮菌、磷细菌、钾细菌的混合液体生物肥。

实施例2

实施例1中以自竹类植物根际分离的4株联合固氮菌为例，进行竹林液体生物肥的生产。实际生产中也可以仅用四株菌中的任意一株菌或任意两株菌或任意三株菌，以上述同样方法进行竹林液体生物肥的生产。

实施例3

1、将草炭粉碎，过80目筛，用200℃热风滚筒烘干灭菌，冷却到室温。

2、将以实施例1方法制成的各种液体生物肥(包括单一菌种和混合菌种)分别用草炭吸附，使其功能菌的活菌数达到要求的标准，并使含水量＜30％(如含水量过高，可以经低温风力干燥处理)便制成各种含有单一菌株或混合菌株的固体菌剂。

实施例4

将发酵好的动物粪便，如猪粪，风干后粉碎，过80目筛；将粘土风干后粉碎，过80目筛；再将两种基质分别经200℃热风滚筒烘干杀灭病菌和虫卵后冷却；将按实施例3方法生产的固体菌剂和有机肥基质以及粘土以1∶8∶1的比例混配拌匀，使各功能菌的有效活菌数达到要求的标准，加入20％的水，在成球盘上滚动制成直径3～5mm颗粒，低温干燥，制成生物有机肥。

实施例5

将发酵好的动物粪便，如猪粪，风干后粉碎，过80目筛；再经200℃热风滚筒烘干，杀灭病菌和虫卵后冷却；用锤式粉碎机分别将氯化钾和尿素粉碎，再用钙镁磷肥、氯化钾、尿素调整有机肥养分含量，使全N≥2％，全P₂O₅≥2％，全K₂O≥2％；再将按实施例1中第7步骤制成的联合固氮菌、磷细菌、钾细菌混合液体生物肥，喷撒到已发酵好的干燥的动物粪便中，在成球盘上滚动制成直径3～5mm颗粒，低温干燥，使每克干肥料中联合固氮菌、磷细菌、钾细菌三者之和的有效活菌数≥0.6亿个/克，且联合固氮菌、磷细菌、钾细菌三者的有效活菌数分别≥0.2亿个/克，制成生物有机无机肥。

实施例6

将植物秸秆粉碎，1∶1和猪粪混配，再将按实施例1或实施例2两种方法生产的各种液体生物肥的一种，按重量10％接入到其中，使含水量为60％，在固体发酵装置中通气搅拌发酵7天，使每克肥料中的功能菌活菌数达到要求的标准，制成生物有机肥。

实施例7

将植物秸秆粉碎，1∶1和猪粪混配，再将按实施例1或实施例2两种方法生产的各种液体生物肥的一种，按重量10％接入到其中，使含水量为60％，在固体发酵装置中通气搅拌发酵7天，出罐后用钙镁磷肥、氯化钾、尿素调整养分含量，使全N≥2％，全P₂O₅≥3％，全K₂O≥3％，并使每克肥料中的功能菌活菌数达到要求的标准，制成生物有机无机肥。

Claims (3)

1、竹林生物肥，其特征是由基质和竹类植物根际联合固氮菌构成，所述的竹类植物根际联合固氮菌是从竹类植物根际分离的能固定大气中分子态氮的竹类植物根际联合固氮菌，该联合固氮菌是多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa mace)WG-2菌株、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis Chester)WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株中的任意一菌株或任意两种或两种以上菌株的组合。

2、如权利要求1所述的竹林生物肥，其特征是该肥料还包含磷细菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium，菌种保藏号为：ACCC10010)和钾细菌胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus，菌种保藏号为：ACCC 10013)。

3、如权利要求1或2所述的竹林生物肥，其特征是所述的基质为所述菌种生存的液体介质、吸附剂、有机物料、无机物料之一种或数种；

所述的生物肥为：a)液体生物肥，b)固体菌剂，c)生物有机肥和d)生物有机无机肥之任何一种；

所述的液体生物肥是所述的菌种经液体发酵培养基发酵后形成的液体生物肥；

所述的固体菌剂是所述的液体生物肥经吸附剂吸附后形成的固体菌剂或经冻干后形成的冻干菌剂；

所述的生物有机肥是所述的液体生物肥或固体菌剂和所述的有机物料构成的生物有机肥；

所述的生物有机无机肥是所述的液体生物肥或固体菌剂和所述的有机物料、无机物料构成的生物有机无机肥；

所述的吸附剂为物料：草炭、泥炭、蛭石、轻质碳酸钙、高岭土、塘泥、膨润土、腐植质中的一种或两种及两种以上物料的混合物；

所述的有机物料为：作物秸秆、木屑、动物粪便、城市垃圾、污泥、工农业生产中的有机废弃物中的一种物料或两种及两种以上物料的混合物；

所述的无机物料为化学肥料。