CN109182228A - 一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂及其制备方法。该复合微生物菌剂重量份组成为：暹罗芽孢杆菌制剂20～30份，地衣芽孢杆菌制剂40～60份，黑曲霉菌粉制剂10～20份。将上述菌剂混合均匀后，即得复合微生物菌剂。本发明制得的用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂，适用于农业生产中的产生的废弃资源畜禽粪便和秸秆的无害化以及资源化处理；缩短发酵周期，提高了处理效率；彻底杀灭病原菌和寄生虫卵，提高肥料腐熟度。除去发酵过程中粪便臭味，减小发酵对周围环境的影响。

Description

一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌 剂及其制备方法
技术领域
本发明具体涉及一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
我国是传统的农业大国，养殖业正向规模化、集约化快速发展，同时产生了大量畜禽粪便。据统计，全国畜禽粪便的产生量高达38亿吨，有效利用率不到50％。畜禽粪便引发的环境问题日益严重。由于畜禽粪便处理不当会引发多种环境问题，因此对其进行无害化处理意义重大。目前畜禽粪便无害化处理的方法主要包括肥料化、能源化等。高温堆制是粪便在微生物的作用下，使有机物矿质化、腐殖化和无害化而变成肥力更好的腐熟肥料的过程。在此过程中，蛋白质的氮、磷被分解成可被植物利用的有效态氮、磷，且产生腐殖质，增加土壤肥力。堆肥能杀灭畜禽粪便中的病原菌、寄生虫卵、杂草种子等，同时减小粪便体积和降低臭味，便于运输。堆肥过程受含水量、温度、碳氮比(C/N)、微生物等多种因素影响。同时，我国还是粮食生产大国，每年生成的秸秆超过8亿吨，其中2亿吨被就地焚烧，既浪费了资源，又污染了环境。大量秸秆成为农村面源污染的新源头，不仅成为农村环境保护的瓶颈问题，甚至成为殃及城市环境的罪魁祸首。秸秆作为有机肥生产的良好原料，由于缺乏成熟、高效的转化技术，一直没有充分利用。
中国专利文献CN 104609933A公开了一种以秸秆和畜禽粪便制备的优质有机肥及其方法。该有机肥主要由秸秆和畜禽粪便发酵制得，重量比为秸秆25-35％，畜禽粪便50-60％，还包括重量比10-20％的草木灰，0.5-1％的无机肥料，0.1-0.2％的发酵菌剂。有机肥的制备方法包括发酵菌剂的制备，将秸秆晒干、粉碎，再与畜禽粪便、草木灰、无机肥料、发酵菌剂按一定比例混合、搅拌均匀,将混合后的原料堆成条状，适时翻堆搅拌，2-3周完成腐熟，得到有机肥料。
中国专利文献CN 104513071A公开了一种屎肠球菌复合菌群发酵粪便生产有机肥料的工艺。其特征在于：鲜湿粪便、屎肠球菌Anp01原液和酵母菌原液的重量比为8000～12000:1:1。屎肠球菌Anp01原液含有的活菌数不低于2×108CFU/g，酵母菌原液含有的活菌数不低于5×108CFU/g。
中国专利文献CN 103664259A公开了一种利用鸭粪便发酵生产生物有机肥料的方法。其特征在于：取等量的枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、光合细菌、放线菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌，混合后进行扩培，扩培至菌体密度达到109个/ml，在温度37℃条件下发酵12h，得到发酵剂。鸭粪便原材料接入其重量2％的发酵剂，加水后装入窑炉式固体发酵隧道内堆制发酵垛，15-35天后一次发酵腐熟完成；将一次发酵腐熟的鸭粪便自然堆置，至常温则二次发酵完成；二次发酵的鸭粪便采用回转圆筒干燥机直火烘干。
中国专利文献CN 102887775A公开了一种禽类粪便与作物秸秆混合发酵有机肥的制造方法。步骤为：①粉碎秸秆至200-250目，②将禽类粪便与秸秆搅拌，加入石灰粉调整到酸碱度为7-8，再加入益生菌搅拌均匀；③经过翻抛，使水分保持在65％-70％；④发酵后进行造粒、烘干、封装。
以上利用秸秆和畜禽粪便制做有机肥的专利文献，均存在发酵温度较低，无法彻底杀灭病原菌和寄生虫卵的问题，同时发酵周期长，效率较低。并且上述专利文献仅仅利用简单的扩培技术进行菌种扩繁，没有发挥出菌种在高温发酵粪便和秸秆中的作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂及其制备方法。
本发明技术方案如下：
一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂，重量份组成如下：
暹罗芽孢杆菌制剂20～30份，地衣芽孢杆菌制剂40～60份，黑曲霉菌粉制剂10～20份。
所述暹罗芽孢杆菌制剂中暹罗芽孢杆菌芽孢含量不低于1.0×1010个/克；
所述地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌芽孢含量不低于1.0×1010个/克；
所述黑曲霉菌粉制剂中黑曲霉孢子含量不低于1.0×1010个/克；
进一步优选的，所述暹罗芽孢杆菌制剂中暹罗芽孢杆菌芽孢含量为1.0×1010个/克～1.3×1010个/克；所述地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌芽孢含量为1.0×1010个/克～1.5×1010个/克；所述黑曲霉菌粉制剂中黑曲霉孢子含量为1.0×1010个/克～1.2×1010个/克；
将上述菌剂按比例混合均匀后，即得复合微生物菌剂。
根据本发明优选的，所述用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂，重量份组成如下：暹罗芽孢杆菌制剂25份，地衣芽孢杆菌制剂55份，黑曲霉菌粉制剂20份。
根据本发明优选的，所述的暹罗芽孢杆菌为申请人筛选、分离、鉴定，定名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)HT01，在2017年05月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种编号：CGMCC 14115。
根据本发明优选的，所述的地衣芽孢杆菌为申请人筛选、分离、鉴定，定名为(Bacillus licheniformis)SDZD02，在2015年04月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种编号：CGMCC 10682。
根据本发明优选的，所述的黑曲霉为申请人筛选、分离、鉴定，定名为(Aspergillus niger)YF2501，在2018年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种编号：CGMCC 15882。
上述用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)取暹罗芽孢杆菌，接种于种子培养基中，经摇瓶培养，制得暹罗芽孢杆菌一级种子；然后将暹罗芽孢杆菌一级种子接种于液体培养基I中进行扩大培养得暹罗芽孢杆菌二级种子培养液；再转接于发酵培养基I中，将暹罗芽孢杆菌发酵培养液经喷雾干燥制得芽孢含量不低于1.5×1011个/克的暹罗芽孢杆菌原粉，用载体稀释暹罗芽孢杆菌原粉，制得芽孢含量不低于1.0×1010个/克暹罗芽孢杆菌制剂；
(2)取地衣芽孢杆菌，接种于种子培养基中，经摇瓶培养，制得地衣芽孢杆菌一级种子；然后将地衣芽孢杆菌一级种子接种于液体培养基I中进行扩大培养得地衣芽孢杆菌二级种子培养液；再转接于发酵培养基II中，将地衣芽孢杆菌发酵培养液经喷雾干燥制得芽孢含量不低于2.0×1011个/克的地衣芽孢杆菌原粉，用载体稀释地衣芽孢杆菌原粉，制得芽孢含量不低于1.0×1010个/克地衣芽孢杆菌制剂；
(3)取黑曲霉，接种于马铃薯固体培养基中，经斜面培养，制得黑曲霉一级种子；然后将黑曲霉一级种子接种于液体培养基II中进行扩大培养得黑曲霉二级种子培养液；再转接于发酵培养基III中，经发酵培养、闪蒸干燥、粉碎，制得孢子粉含量不低于3.0×1010个/克的黑曲霉原粉；用载体稀释黑曲霉原粉，制得孢子含量不低于1.0×1010个/克的黑曲霉制剂；
(4)将步骤(1)制得的暹罗芽孢杆菌制剂、步骤(2)制得的地衣芽孢杆菌制剂和步骤(3)制得的黑曲霉制剂按比例混合后，制得复合微生物菌剂。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中摇瓶培养条件为：36～38℃，培养12～15h，摇床转速160～190rpm，制得暹罗芽孢杆菌一级种子。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中扩大培养步骤如下：
将暹罗芽孢杆一级种子按照体积百分比为0.1～0.2％的接种量接种于液体培养基I中，温度36～38℃、通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·min计为1∶1.0～1.3、罐压0.02MPa，搅拌速度为160～220rpm，培养6～8h，制得暹罗芽孢杆菌二级种子培养液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中发酵培养步骤如下：
将暹罗芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比2～5％的接种量接种于发酵培养基I中，温度36～38℃，通风量为1∶1.3～1.5，罐压为0.02MPa，搅拌速度为120～180rpm，培养18～26h，制得暹罗芽孢杆菌发酵培养液。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，地衣芽孢杆菌摇瓶培养条件为：36～38℃，培养15～20h，摇床转速180～200rpm，制得地衣芽孢杆菌一级种子。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中扩大培养步骤如下：
将地衣芽孢杆菌一级种子按照重量百分比为0.1～0.2％的接种量接种于液体培养基I中，温度35～38℃、通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·min计为1∶1.1～1.3、罐压0.02MPa，搅拌速度为220～260rpm，培养10～14h，制得地衣芽孢杆菌二级种子培养液。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中发酵培养步骤如下：
将地衣芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比1～5％的接种量接种于发酵培养基II中，温度36～38℃，通风量为1∶1.3～1.6，罐压为0.02MPa，搅拌速度为140～200rpm，培养28～36h，芽孢率达到90％以上，停止培养，制得地衣芽孢杆菌发酵培养液。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中固体斜面培养条件为：28～30℃，培养72～100h至产生孢子，摇床转速100～120rpm。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中扩大培养步骤如下：
将黑曲霉一级种子用无菌生理盐水冲洗孢子粉，按照体积百分比为1～3％的接种量接种于液体培养基II中，温度28～30℃、通风比为1∶1、罐压0.02MPa，搅拌速度为50～80rpm，培养36～48h，制得黑曲霉二级种子培养液。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中发酵培养步骤如下：
将黑曲霉二级种子培养液按照体积百分比15～20％的接种量接种于发酵培养基III中，采用曲盘法发酵，料层厚度10～15cm，控制温度28～30℃，相对湿度70～80％，培养7-10d，至表层和内层均产生大量分生孢子，制得黑曲霉发酵培养液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)、(2)、(3)中稀释原粉所用的载体为轻质碳酸钙。
上述培养基组分如下，均为重量份：
种子培养基：蛋白胨10份，酵母膏5份，氯化钠10份，用蒸馏水定容至100份，121℃灭菌20min；
马铃薯固体培养基：马铃薯汁20份，葡萄糖20份，琼脂20份，用蒸馏水定容至100份。116℃灭菌30min；其中，所述马铃薯汁是将去皮洗净的马铃薯20份切成小块，水中煮沸20min，四层纱布过滤，得马铃薯汁，用水补充至20份；
液体培养基I：蛋白胨10份，酵母膏5份，氯化钠10份，用纯净水定容至100份，121℃灭菌20min；
液体培养基II：马铃薯汁20份，葡萄糖20份，用纯净水定容至100份，116℃灭菌30min；其中，所述马铃薯汁是将去皮洗净的马铃薯20份切成小块，水中煮沸20min，四层纱布过滤，得马铃薯汁，用水补充至20份；
发酵培养基I：玉米粉2～4份、豆饼粉2～5份、麸皮粉0.5～3份、氯化钠0.01～0.2份、氯化镁0.01～0.2份、硫酸锰0.01～0.5份，水87.1～95.47份；
发酵培养基II：玉米粉3～5份、豆饼粉2～6份、氯化钠0.01～0.2份、氯化镁0.01～0.2份、硫酸锰0.01～0.5份，水88.1～94.97份；
发酵培养基III：麸皮15～25份，豆饼粉5-10份、蔗糖1～5份、硫酸铵0.1～0.5份、磷酸二氢钾0.1～0.5份，水79.8～59份。
上述培养基中的原料均为本领域常用配制培养基原料，均可市场购得。
本发明中，暹罗芽孢杆菌可以明显促进畜禽粪便和秸秆的前期堆肥的起温速度，延长高温持续时间，促进堆肥过程中有机质含量的增加；地衣芽孢杆菌能够分泌杀菌物质，对畜禽粪便和秸秆中存在的有害病菌有较好的抑制和杀灭效果；黑曲霉孢子在萌发生长过程中产生高活性的纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、和蛋白酶，在发酵过程中对畜禽粪便和秸秆中的纤维素具有转化效果。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明制得的用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂，适用于农业生产中的产生的废弃资源畜禽粪便和秸秆的无害化以及资源化处理。
2.本发明制得的用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂可以调节畜禽粪便和秸秆的菌群结构，利用微生物快速分解畜禽粪便和秸秆中有机质产生热能进行高温发酵，物料温度可达70～90℃，能够彻底杀灭病原菌和寄生虫卵，提高肥料腐熟度。
3.本发明制得的用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂可以使堆肥发酵处理时间由1个月以上缩减至9～15天，大大提高了处理效率，同时每吨物料用量为200～1000克，是一种高效快速低成本的生物治污产品。
4.使用本发明复合微生物菌剂高温发酵堆制有机肥料，可以除去发酵过程中粪便臭味，减小发酵对周围环境的影响。
附图说明
图1是牛粪和玉米秸秆堆肥发酵15天物料温度变化。
图2是鸡粪和蔬菜秸秆堆肥发酵9天物料温度变化。
图3是猪粪和水稻秸秆堆肥发酵11天物料温度变化。
具体实施方式：
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中，所述畜禽粪便的种类没有特别限制，例如，所述畜禽粪便可以为猪、牛、羊、鸡、鸭等家禽家畜粪便的一种或几种；所述秸秆的种类没有特别限制，例如，所述秸秆可以为玉米秸秆或蔬菜秸秆等秸秆的一种或几种。
实施例1
暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)HT01，来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC 14115。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02，来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC 10682。
黑曲霉(Aspergillus niger)YF2501，来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC 15882。
一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)取暹罗芽孢杆菌，接种于种子培养基中，经37℃，12h，摇床转速为180rpm的摇瓶培养，制得暹罗芽孢杆菌一级种子；然后将暹罗芽孢杆一级种子按照重量百分比为0.1％的接种量接种于罐容500L装量300L液体培养基I中，温度37℃、通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·min计为1∶1.0、罐压0.02MPa，搅拌速度为160rpm，培养6h，制得暹罗芽孢杆菌二级种子培养液；再将暹罗芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比5％的接种量接种于罐容10吨装量6吨发酵培养基I中，温度37℃，通风量为1∶1.3，罐压为0.02MPa，搅拌速度为140rpm，培养18h，菌体成芽孢率95％以上，停止培养，制得暹罗芽孢杆菌发酵培养液；将暹罗芽孢杆菌发酵培养液经喷雾干燥制得芽孢含量1.56×1011个/克的暹罗芽孢杆菌原粉，用轻质碳酸钙稀释暹罗芽孢杆菌原粉，制得芽孢含量为1.0×1010个/克暹罗芽孢杆菌制剂；
(2)取地衣芽孢杆菌，接种于种子培养基中，经37℃，15h，摇床转速为180rpm的摇瓶培养，制得地衣芽孢杆菌一级种子；然后将地衣芽孢杆菌一级种子按照重量百分比为0.1％的接种量接种于罐容500L装量300L液体培养基I中，温度37℃、通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·min计为1∶1.1、罐压0.02MPa，搅拌速度为220rpm，培养10h，制得地衣芽孢杆菌二级种子培养液；再将地衣芽孢杆菌二级种子液按照体积百分比1％的接种量接种于罐容10吨装量6吨发酵培养基II中，温度37℃，通风量为1∶1.4，罐压为0.02MPa，搅拌速度为140rpm，培养30h，菌体成芽孢率95％，停止培养，制得地衣芽孢杆菌发酵培养液；将地衣芽孢杆菌发酵培养液经喷雾干燥制得芽孢含量2.3×1011个/克的地衣芽孢杆菌原粉，用轻质碳酸钙稀释地衣芽孢杆菌原粉，制得芽孢含量为1.0×1010个/克地衣芽孢杆菌制剂；
(3)取黑曲霉，接种于马固体培养基中，斜面培养，28℃，72h，产生孢子，制得黑曲霉一级种子；然后将将黑曲霉一级种子用无菌生理盐水冲洗孢子粉，按照体积百分比为1％的接种量接种于100L液体培养基II中，温度30℃、通风比为1∶1、罐压0.02MPa，搅拌速度为80rpm，培养36h，制得黑曲霉二级种子培养液；再将黑曲霉二级种子液按照体积百分比15％的接种量接种于发酵培养基III中，采用曲盘法发酵，料层厚度12cm，控制温度28℃，相对湿度75％，培养7d，至表层和内层均产生大量分生孢子，制得黑曲霉发酵培养液。将黑曲霉发酵培养液经闪蒸干燥、粉碎，制得孢子粉含量3.47×1010个/克的黑曲霉原粉；用轻质碳酸钙稀释黑曲霉原粉，制得孢子粉含量为1.0×1010个/克的黑曲霉制剂；
(4)将步骤(1)制得的暹罗芽孢杆菌制剂25份，步骤(2)制得的地衣芽孢杆菌制剂55份，步骤(3)制得的黑曲霉制剂20份，均匀混合后，制得复合微生物菌剂。用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料。
上述培养基组分如下，均为重量份：
摇瓶培养基：蛋白胨10份，酵母膏5份，氯化钠10份，用蒸馏水定容至100份，121℃灭菌20min；
液体培养基I：蛋白胨10份，酵母膏5份，氯化钠10份，用纯净水定容至100份，121℃灭菌20min；
马铃薯固体培养基：马铃薯汁20份，葡萄糖20份，琼脂20份，用蒸馏水定容至100份。116℃灭菌30min；其中，所述马铃薯汁是将去皮洗净的马铃薯20份切成小块，水中煮沸20min，四层纱布过滤，得马铃薯汁，用水补充至20份；
液体培养基II：马铃薯汁20份，葡萄糖20份，用纯净水定容至100份，116℃灭菌30min；其中，所述马铃薯汁是将去皮洗净的马铃薯20份切成小块，水中煮沸20min，四层纱布过滤，得马铃薯汁，用水补充至20份。
发酵培养基I：玉米粉3份、豆饼粉4份、麸皮粉1份、氯化钠0.05份、氯化镁0.01份、硫酸锰0.01份，水91.93份。
发酵培养基II：玉米粉3份、豆饼粉3份、、氯化钠0.1份、氯化镁0.01份、硫酸锰0.01份，水93.88份。
发酵培养基III：麸皮20份，豆饼粉10份、蔗糖2份、硫酸铵0.1份、磷酸二氢钾0.1份，水77.8份。
上述培养基中的原料均为本领域常用配制培养基原料，均可市场购得
实施例2
如实施例1所述的一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂制备方法，不同之处在于：
所述步骤(1)中，发酵培养步骤如下：
暹罗芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比2％的接种量接种于罐容10吨装量6吨发酵培养基I中，温度37℃，通风量为1∶1.5，罐压为0.02MPa，搅拌速度140rpm，培养20h。菌体成芽孢率95％，停止培养，制得暹罗芽孢杆菌发酵培养液。
所述的发酵培养基I组分如下，均为重量份：
玉米粉4份、豆饼粉5.5份、麸皮粉2份、氯化钠0.05份、氯化镁0.01份、硫酸锰0.01份，水88.44份。
所述步骤(2)中，发酵培养步骤如下：
地衣芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比4％的接种量接种于罐容10吨装量6吨发酵培养基II中，温度38℃，通风量为1∶1.6，罐压为0.02MPa，搅拌速度为140rpm，培养30h。菌体成芽孢率95％以上，停止培养，制得将地衣芽孢杆菌发酵培养液。
所述的发酵培养基II组分如下，均为重量份：
玉米粉4份、豆饼粉5份、氯化钠0.1份、氯化镁0.05份、硫酸锰0.06份，水90.79份。
所述步骤(3)中，发酵培养步骤如下：
黑曲霉种子液按照体积百分比18％的接种量接种于发酵培养基III中，采用曲盘法发酵，料层厚度15cm，温度28℃，相对湿度80％，培养10d至表层和内层均产生大量分生孢子，制得黑曲霉发酵培养液。
所述的发酵培养基III组分如下，均为重量份：
麸皮15份，豆饼粉8份、蔗糖1份、硫酸铵0.2份、磷酸二氢钾0.2份，水75.6份。
实施例3
如实施例1所述的一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂制备方法，不同之处在于：
所述步骤(1)中，发酵培养步骤如下：
暹罗芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比4％的接种量接种于罐容10吨装量6吨发酵培养基I中，温度38℃，通风量为1∶1.4，罐压为0.02MPa，搅拌速度160rpm，培养24h。菌体成芽孢率90％，停止培养，制得暹罗芽孢杆菌发酵培养液。
所述的发酵培养基I组分如下，均为重量份：
玉米粉4份、豆饼粉5份、麸皮粉2.5份、氯化钠0.04份、氯化镁0.01份、硫酸锰0.02份，水88.44份。
所述步骤(2)中，发酵培养步骤如下：
地衣芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比3％的接种量接种于罐容10吨装量6吨发酵培养基II中，温度36℃，通风量为1∶1.6，罐压为0.02MPa，搅拌速度为180rpm，培养32h。菌体成芽孢率95％以上，停止培养，制得将地衣芽孢杆菌发酵培养液。
所述的发酵培养基II组分如下，均为重量份：
玉米粉3份、豆饼粉6份、氯化钠0.15份、氯化镁0.05份、硫酸锰0.06份，水90.74份。
所述步骤(3)中，发酵培养步骤如下：
黑曲霉种子液按照体积百分比20％的接种量接种于发酵培养基III中，采用曲盘法发酵，料层厚度10cm，温度30℃，相对湿度70％，培养8d至表层和内层均产生大量分生孢子，制得黑曲霉发酵培养液。
所述的发酵培养基III组分如下，均为重量份：
麸皮20份，豆饼粉7份、蔗糖1份、硫酸铵0.2份、磷酸二氢钾0.2份，水71.6份。
对比例
按照中国专利文献CN 104513071A实施例1中的记载，将鲜湿猪粪便和发酵好的屎肠球菌Anp01原液稀释液、酵母菌原液稀释液混匀后发酵11个月，制得有机肥料。
实验例1
取实施例1中制得的复合微生物菌剂，用于牛粪和玉米秸秆发酵，每吨物料添加量为500克。
采用槽式发酵工艺，所用物料为新鲜牛粪和玉米秸秆粉。玉米秸秆粉碎到小于2cm。牛粪与玉米秸秆粉的比例(w/w)为30∶70，水分含量为56％，牛粪、玉米秸秆粉与复合微生物菌剂充分混匀，使用布料机输送至发酵槽中。发酵槽宽度6米，长度90米，物料高度1.2米。温度升高到60℃后，每2天翻抛物料，每天曝气8小时，温度下降到50℃停止翻抛与曝气，共15天，有机肥料制备完成。
在发酵过程中，每天上午9:00～10:00测定发酵槽物料温度，同时记录周围环境的平均温度。发酵温度曲线图如图1所示，结果表明，发酵第3天物料温度达到62.1℃，开始翻抛，之后温度持续升高，第8天达最高温度78.7℃，之后缓慢下降，第11天温度下降到53.7℃，停止翻抛。第15天物料温度低于40℃，堆制结束。试验期间通过感观和仪器相结合的方法评定氨气和臭气产生情况，每天观察并记录氨气和臭气变化，发酵第一天，物料无恶臭味和氨味，第二天具有发酵清香气味。曝气开始后，清香味渐淡，开始有淡的氨味，但没有臭味。通过H2S探头检测，H2S的含量范围为0～0.1mg/m3；通过NH3探头检测，NH3的含量范围为0.43～0.56mg/m3。
实验例2
取实施例2中制得的复合微生物菌剂，用于鸡粪和蔬菜秸秆发酵，每吨物料添加量为600克。
采用槽式发酵工艺，所用物料为新鲜鸡粪和蔬菜秸秆。蔬菜秸秆切碎到小于4cm。鸡粪与蔬菜秸秆的比例(w/w)为45∶55，水分含量为51％。复合微生物菌剂600克均匀撒于秸秆粉输送带，随生产工艺与鸡粪拌匀，使用布料机输送至发酵槽中，发酵槽同实验例1。温度升高到50～60℃时，每2天翻抛物料，每天曝气8小时，温度下降到50℃停止翻抛与曝气。时间11月21日～11月29日，共9天，有机肥料制备完成。
在发酵过程中，每天上午9:00～10:00测定发酵物料表层下方20cm处的温度，并。同时记录周围环境的平均温度。发酵温度曲线如图2所示，结果表明，物料发酵24小时物料温度升到55℃，48小时料温达到67℃，之后按常规工艺曝气翻抛，物料温度在第5天达到75℃，之后开始下降，到第9天，料温降至42℃，堆制结束。试验期间通过感观和仪器相结合的方法评定氨气和臭气产生情况，每天观察并记录氨气和臭气变化，发酵第一天，物料无恶臭味和氨味，第二天具有发酵清香气味。曝气开始后，清香味渐淡，开始有淡的氨味，但没有臭味。通过H2S探头检测，H2S的含量范围为0～0.15mg/m3；通过NH3探头检测，NH3的含量范围为0.58～0.62mg/m3。
实验例3
取实施例3中制得的复合微生物菌剂，用于猪粪和蔬菜秸秆发酵，每吨物料添加量为700克。
采用槽式发酵工艺，所用物料为新鲜猪粪和水稻秸秆。水稻秸秆切碎到小于4cm。猪粪与水稻秸秆的比例(w/w)为50∶50，水分含量为51％。猪粪和水稻秸秆与复合微生物菌剂充分混匀，使用布料机输送至发酵槽中，发酵槽同实验例1。温度升高到50～60℃时，每2天翻抛物料，每天曝气12小时，温度下降到50℃停止翻抛与曝气。共11天，有机肥料制备完成。
在发酵过程中，每天上午9:00～10:00测定发酵物料表层下方20cm处的温度，并。发酵温度曲线如图3所示，结果表明，发酵3天物料温度升到54.5℃，之后按常规工艺曝气翻抛，物料温度在第6天达到77.8℃，之后开始下降，到第11天，料温降至32.5℃，堆制结束。试验期间通过感观和仪器相结合的方法评定氨气和臭气产生情况，每天观察并记录氨气和臭气变化，发酵期间自始至终没有氨味和臭气散发。通过H2S探头检测，H2S的含量范围为0～0.10mg/m3；通过NH3探头检测，NH3的含量范围为0.32～0..48mg/m3。
将实验例1-3制备和对比例的有机肥按国家NY525-2012有机肥标准检测样品的有机质、氮磷钾和重金属含量等各项指标，
表1：NY525-2012有机肥标准检测结果
检测项目 实验例1 实验例2 实验例3 对比例
物料有机质含量 53.8％ 65.3％ 62.7％ 37.5％
总氮的质量分数(以烘干计) 2.81％ 4.01％ 3.59％ 1.05％
P<sub>2</sub>O<sub>5</sub>的质量分数(以烘干计) 1.35％ 1.37％ 1.41％ 0.89％
K<sub>2</sub>O的质量分数(以烘干计) 1.26％ 1.14％ 1.05％ 0.65％
总养分(全氮、P<sub>2</sub>O<sub>5</sub>、K<sub>2</sub>O)含量 5.42％ 6.52％ 6.05％ 2.59％
总铅(Pb) 23mg/Kg 19mg/Kg 22mg/Kg 45.4mg/Kg
总砷(As) 5.28mg/Kg 4.37mg/Kg 5.11mg/Kg 7.9mg/Kg
总汞(Hg) 1.14mg/Kg 0.73mg/Kg 0.98mg/Kg 1.67mg/Kg
总镉(Cd) 0.11mg/Kg 0.67mg/Kg 0.59mg/Kg 0.89mg/Kg
总铬(Cr) 23mg/Kg 18mg/Kg 22mg/Kg 54mg/Kg
粪大肠杆菌数 0个/克 0个/克 0个/克 93个/克
蛔虫卵死亡率 100％ 100％ 100％ 96％
水分(％) 28.5 27.3 28.2 62.4
酸碱度(无量纲) 7.7 7.4 7.6 5.6
表2：NY525-2012有机肥标准
有机质的质量分数(以烘干基计)/(％)≥45
总养分(氮+五氧化二磷+氧化钾)的质量分数(以烘干基计)/(％)≥5.0
水分(鲜样)的质量分数/(％)≤30
酸碱度(pH)5.5—8.5
总砷(As)(以烘干基计)/(mg/kg)≤15
总汞(Hg)(以烘干基计)/(mg/kg)≤2
总铅(Pb)(以烘干基计)/(mg/kg)≤50
总镉(Cd)(以烘干基计)/(mg/kg)≤3
总铬(Cr)(以烘干基计)/(mg/kg)≤150
粪大肠杆菌数(个/g)≤100
蛔虫卵死亡率(％)≥95％
通过以上结果可知，采用本发明制备的复合微生物菌剂对畜禽粪便和秸秆进行高温堆制的有机肥料各项指标均优于国家标准，由于本发明制备的复合微生物菌剂能够促进高温发酵，因此实验例1-3制得的有机肥粪大肠杆菌数均远低于国家标准，蛔虫卵死亡率均远高于国家标准。并且实施例在腐熟发酵天数、有机质含量、总养分含量、水分含量和大肠杆菌数等方面明显优于对比例。

Claims (10)

1.一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂，其特征在于，重量份组成如下：暹罗芽孢杆菌制剂20～30份，地衣芽孢杆菌制剂40～60份，黑曲霉菌粉制剂10～20份；
所述暹罗芽孢杆菌制剂中暹罗芽孢杆菌芽孢含量不低于1.0×1010个/克；
所述地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌芽孢含量不低于1.0×1010个/克；
所述黑曲霉菌粉制剂中黑曲霉孢子含量不低于1.0×1010个/克；
进一步优选的，所述暹罗芽孢杆菌制剂中暹罗芽孢杆菌芽孢含量为1.0×1010个/克～1.3×1010个/克；所述地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌芽孢含量为1.0×1010个/克～1.5×1010个/克；所述黑曲霉菌粉制剂中黑曲霉孢子含量为1.0×1010个/克～1.2×1010个/克；
将上述菌剂混合均匀后，即得复合微生物菌剂。
2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，重量份组成如下：暹罗芽孢杆菌制剂25份，地衣芽孢杆菌制剂55份，黑曲霉菌粉制剂20份。
3.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)HT01，2017年05月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号：CGMCC 14115。
4.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌为(Bacillus licheniformis)SDZD02，2015年04月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号：CGMCC 10682。
5.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述的黑曲霉为(Aspergillusniger)YF2501，2018年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号：CGMCC 15882。
6.如权利要求1-5任一项所述的一种用于畜禽粪便和秸秆高温堆制有机肥料的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取暹罗芽孢杆菌，接种于种子培养基中，经摇瓶培养，制得暹罗芽孢杆菌一级种子；然后将暹罗芽孢杆菌一级种子接种于液体培养基I中进行扩大培养得暹罗芽孢杆菌二级种子培养液；再转接于发酵培养基I中，将暹罗芽孢杆菌发酵培养液经喷雾干燥制得芽孢含量不低于1.5×1011个/克的暹罗芽孢杆菌原粉，用载体稀释暹罗芽孢杆菌原粉制得芽孢含量不低于1.0×1010个/克暹罗芽孢杆菌制剂；
(2)取地衣芽孢杆菌，接种于种子培养基中，经摇瓶培养，制得地衣芽孢杆菌一级种子；然后将地衣芽孢杆菌一级种子接种于液体培养基I中进行扩大培养得地衣芽孢杆菌二级种子培养液；再转接于发酵培养基II中，将地衣芽孢杆菌发酵培养液经喷雾干燥制得芽孢含量不低于2.0×1011个/克的地衣芽孢杆菌原粉，用载体稀释地衣芽孢杆菌原粉制得芽孢含量不低于1.0×1010个/克地衣芽孢杆菌制剂；
(3)取黑曲霉，接种于马铃薯固体培养基中，经斜面培养，制得黑曲霉一级种子；然后将黑曲霉一级种子接种于液体培养基II中进行扩大培养得黑曲霉二级种子培养液；再转接于发酵培养基III中，经发酵培养、闪蒸干燥、粉碎，制得孢子粉含量不低于3.0×1010个/克的黑曲霉原粉；用载体稀释黑曲霉原粉制得孢子含量不低于1.0×1010个/克的黑曲霉制剂；
(4)将步骤(1)制得的暹罗芽孢杆菌制剂、步骤(2)制得的地衣芽孢杆菌制剂和步骤(3)制得的黑曲霉制剂按比例混合后，制得复合微生物菌剂；
优选的，所述步骤(1)、(2)、(3)中稀释原粉所用的载体为轻质碳酸钙。
7.如权利要求6所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述摇瓶培养条件为：36～38℃，培养12～15h，制得暹罗芽孢杆菌一级种子；
所述扩大培养为：将暹罗芽孢杆一级种子按照体积百分比为0.1～0.2％的接种量接种于液体培养基I中，温度36～38℃、通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·min计为1∶1.0～1.3、罐压0.02MPa，搅拌速度为160～220rpm，培养6～8h，制得暹罗芽孢杆菌二级种子培养液；
所述发酵培养为：将暹罗芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比2～5％的接种量接种于发酵培养基I中，温度36～38℃，通风量为1∶1.3～1.5，罐压为0.02MPa，搅拌速度为120～180rpm，培养18～26h，制得暹罗芽孢杆菌发酵培养液。
8.如权利要求6所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述地衣芽孢杆菌摇瓶培养条件为：36～38℃，培养15～20h，制得地衣芽孢杆菌一级种子；
所述扩大培养为：将地衣芽孢杆菌一级种子按照重量百分比为0.1～0.2％的接种量接种于液体培养基I中，温度35～38℃、通气量以发酵液体积m3/空气体积m3·min计为1∶1.1～1.3、罐压0.02MPa，搅拌速度为220～260rpm，培养10～14h，制得地衣芽孢杆菌二级种子培养液；
所述发酵培养为：将地衣芽孢杆菌二级种子培养液按照体积百分比1～5％的接种量接种于发酵培养基II中，温度36～38℃，通风量为1∶1.3～1.6，罐压为0.02MPa，搅拌速度为140～200rpm，培养28～36h，芽孢率达到90％以上，停止培养，制得地衣芽孢杆菌发酵培养液。
9.如权利要求6所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述固体斜面培养条件为：28～30℃，培养72～100h至产生孢子；
所述扩大培养为：将黑曲霉一级种子用无菌生理盐水冲洗孢子粉，按照体积百分比为1～3％的接种量接种于液体培养基II中，温度28～30℃、通风比为1∶1、罐压0.02MPa，搅拌速度为50～80rpm，培养36～48h，制得黑曲霉二级种子培养液；
所述发酵培养为：将黑曲霉二级种子培养液按照体积百分比15～20％的接种量接种于发酵培养基III中，采用曲盘法发酵，料层厚度10～15cm，控制温度28～30℃，相对湿度70～80％，培养7-10天，至表层和内层均产生大量分生孢子，制得黑曲霉发酵培养液。
10.如权利要求6所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：
所述种子培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨10份，酵母膏5份，氯化钠10份，用蒸馏水定容至100份，121℃灭菌20min；
所述马铃薯固体培养基组分如下，均为重量份：马铃薯汁20份，葡萄糖20份，琼脂20份，用蒸馏水定容至100份。116℃灭菌30min；
所述液体培养基I组分如下，均为重量份：蛋白胨10份，酵母膏5份，氯化钠10份，用纯净水定容至100份，121℃灭菌20min；
所述液体培养基II组分如下，均为重量份：马铃薯汁20份，葡萄糖20份，用纯净水定容至100份，116℃灭菌30min；
所述发酵培养基I组分如下，均为重量份：玉米粉2～4份、豆饼粉2～5份、麸皮粉0.5～3份、氯化钠0.01～0.2份、氯化镁0.01～0.2份、硫酸锰0.01～0.5份，水87.1～95.47份；
所述发酵培养基II组分如下，均为重量份：玉米粉3～5份、豆饼粉2～6份、氯化钠0.01～0.2份、氯化镁0.01～0.2份、硫酸锰0.01～0.5份，水88.1～94.97份；
所述发酵培养基III组分如下，均为重量份：麸皮15～25份，豆饼粉5-10份、蔗糖1～5份、硫酸铵0.1～0.5份、磷酸二氢钾0.1～0.5份，水79.8～59份。
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