CN112175868B - 一种具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用。本发明对分离自碱蓬叶片组织的解淀粉芽孢杆菌wxy‑b3(保藏编号为CGMCC No.20041)进行了抗菌活性测定，发现其发酵产物对小麦赤霉病病原菌、马铃薯干腐病病原菌、苹果腐烂霉及大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌具有抑制作用，并且发酵产生的抗菌脂肽的产量高，可以用于制备抗菌剂，防止农作物因病害减产。

Description

一种具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其应用。
背景技术
内生菌作为植物体内微生物生态的组成部分，对植物体的稳定发挥了重要作用，其一般占据有利的生态位并广泛的存在于植物体内，多数内生菌可分泌具有不同功能作用的代谢产物，从而促进植物生长、拮抗植物病原微生物、昆虫和线虫，以及与植物联合修复环境，以提高植物抗逆性。内生芽孢杆菌是植物内生菌中研究较多的一类菌种，在农作物生物防治、天然药物开发、环境修复等方面发挥重要作用。
随着从土壤等环境中分离到新种或具有一定生理功能的菌株变得越来越困难，植物内生菌的分离逐渐成为热点。Imen等人分离出的内生解淀粉芽孢杆菌CEIZ-11具有广谱抗植物病原真菌活性。Jin等人从药用植物黄姜(Dioscorea zingiberensis)中分离的枯草芽孢杆菌SWB8，能够分泌具有广谱抑菌活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶。凌红利等人发现一株解淀粉芽孢杆菌VB1264的发酵液具有抗病原真菌活性，但对于细菌没有抑制作用。还有报道应用植物内生解淀粉芽孢杆菌CC09开发出两种防治小麦白粉病的解淀粉芽孢杆菌制剂，即以细胞为主体的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂(≥100亿芽孢/g)和以抗真菌成分Iturin A为主体的15％水剂。
碱蓬是生长于高盐碱土壤中的一种植物，具有抗盐碱、耐贫瘠、抗病虫害，及可以适应高温高湿环境等特点。碱蓬可以降低土壤含盐量，增加土壤有机质含量，加速潮滩土壤化过程。大量研究表明，碱蓬植物内生菌丰富多样，是产生天然活性物质的重要微生物资源。芽孢杆菌是碱蓬内生菌中的优势菌群，研究最为广泛的菌种包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。中国专利CN109749974A公开了一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用，该专利从碱蓬根际土壤分离出解淀粉芽孢杆菌YB1701，可以有效拮抗玉米黑束病菌(Acremoniumstrictum)、黄色镰孢病菌(Fusarium culmorum)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsiciLeonian)、甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)等16种植物病原真菌，对水稻幼苗生长有显著促进作用。
对于已经报道的芽胞杆菌属，特别是解淀粉芽孢杆菌菌株，一方面其针对于粮食作物、经济作物生长发育中常见病原菌的拮抗作用适用范围有限，另一方面，其产生的抗菌物质脂肽的产量低，且分离成本高，不利于活菌制剂或者以菌体产生的活性物质为主体的制剂的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株具体为解淀粉芽孢杆菌wxy-b3(简称菌株wxy-b3或b3)，菌株wxy-b3的保藏编号为CGMCC No.20041。
上述解淀粉芽孢杆菌wxy-b3可以用于制备抗菌剂。
优选的，所述抗菌剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌wxy-b3或解淀粉芽孢杆菌wxy-b3的发酵液，或者所述抗菌剂的活性成分是采用解淀粉芽孢杆菌wxy-b3的发酵液制成的。
优选的，所述抗菌剂对引起小麦赤霉病、马铃薯干腐病、苹果腐烂病的病原真菌，以及对蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌均具有抑制作用。
优选的，所述发酵液或所述发酵液的提取物(例如，发酵液过滤除菌得到的滤液)的组分包括Surfactin、Fengycin A、Fengycin B等抗菌脂肽。
上述抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将解淀粉芽孢杆菌wxy-b3的种子液接入培养基后进行发酵，得到发酵液；
2)将发酵液过滤除菌，得到含有发酵液抗菌组分的滤液。
优选的，所述种子液是将保存的解淀粉芽孢杆菌wxy-b3接种于LB液体培养基中进行活化而得到的，活化的条件为：32～37℃、150～220rpm下培养12～18h。
优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：将所述种子液按1％～3％的比例接种于LB液体培养基中，然后于32～37℃、150～220rpm下发酵培养48～72h。
本发明的有益效果体现在：
本发明分离及鉴定了一株命名为解淀粉芽孢杆菌wxy-b3的内生芽胞杆菌菌株(分离于盐碱地植物碱蓬，属于中度嗜盐菌，保藏编号CGMCC No.20041)。经抑菌实验发现，该菌株的发酵液及其中含有的抗菌组分(例如，抗菌脂肽等)对大肠杆菌及蜡样芽孢杆菌均有抑制作用，并具有针对重要粮食作物和经济作物的抗植物病原真菌抑菌谱，可以用于制备抑制食源性致病细菌及植物病原真菌的生物制剂，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌wxy-b3在LB固体培养基中的菌落形态图。
图2为解淀粉芽孢杆菌wxy-b3的电镜图。
图3为解淀粉芽孢杆菌wxy-b3的系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，而不是对本发明保护范围的限制。
(一)菌种的分离鉴定
1.样品的采集与预处理
取从陕西省榆林市盐碱地采集到的新鲜的碱蓬叶片组织1g，先用75％乙醇表面消毒3min，再用5％的次氯酸钠表面消毒5min，最后用无菌水冲洗三遍。将表面消毒好的叶片与3mL无菌水于研钵内充分研磨，所得研磨液在8000r/min离心5min，取上清液备用。
2.解淀粉芽孢杆菌wxy-b3的分离，具体步骤如下：
用移液枪吸取0.1mL上清液，分别均匀涂布于不同盐(NaCl)浓度(0％、3％、5％、10％)的细菌培养基平板(LB固体培养基)内，置于37℃培养至菌落长成。分别挑取具有不同颜色、形态的菌落于相应盐浓度的细菌培养基平板上进行划线培养，直至长成单菌落后，转接于甘油冻存管中，-80℃保存。
因为分离样本是取自耐盐植物碱蓬，所以本步骤中采用不同盐浓度进行筛选，结果共分离出21株细菌和24株真菌，其中菌株wxy-b3是在3％盐浓度下分离得到的。
3.菌株形态学特征观察及生理生化特征实验
对在含NaCl浓度为3％的LB固体培养基上采用划线法培养分离出来的单菌株(37℃培养3d)，观察形成的菌落形态特征。其中，菌株wxy-b3的培养结果如图1所示，菌株wxy-b3在LB固体培养基上呈白色菌落，边缘较平整，菌落表面粗糙、不透明，符合解淀粉芽孢杆菌的形态学特征。
菌株wxy-b3的生理生化特征实验结果如下：过氧化氢酶活性实验、脲酶活性实验、明胶水解实验、MR实验均呈阴性；氧化酶活性实验、淀粉酶活性实验、酯酶活性实验(吐温20、吐温80)、酪素水解实验、吲哚产生、硫化氢产生、VP实验、硝酸盐还原实验均呈阳性。这些结果表明，菌株wxy-b3具有芽孢杆菌属的生理生化特征。
4.菌株扫描电镜观察
将活化的菌株于LB液体培养基中培养10～12h，得到生长至对数期的菌体，并复接于100mL LB液体培养基中，37℃、220rpm下培养18h；吸取适量菌液于离心管中，6000rpm、4℃下离心5min，弃去上清，在沉淀中加入15mL 2.5％戊二醛试剂，4℃静置过夜后于6000rpm、4℃下离心5min，弃上清，得菌体沉淀；用pH 7.2的磷酸盐缓冲液冲洗菌体沉淀3次，6000rpm、4℃下离心5min，弃去上清，再依次用30％、50％、70％、80％和100％的乙醇浸泡菌体沉淀8min后6000rpm、4℃下离心5min，弃上清并用乙酸异戊酯浸泡沉淀30min，然后6000rpm、4℃下离心5min，弃上清，并将沉淀于通风橱内风干2h后再在50℃烘箱内干燥1h；移取适量干燥后的样品，置于表面贴覆有导电胶的载物台上进行喷金，然后进行电镜观察。其中，菌株wxy-b3的观察结果如图2所示，菌株wxy-b3的菌体呈杆状，大小为0.6～0.7μm×3～4μm。
5.菌株分子生物学鉴定
5.1引物合成及菌株16S rDNA PCR扩增
16S rDNA引物序列为：
上游引物:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
下游引物：3'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-5'。
PCR反应体系为20μL：DNA模板2μL(100ng/μL)、上游引物1μL(10.74nmol)、下游引物1μL(10.69nmol)、Mix酶10μL，及ddH2O 6μL。其中，DNA模板为提取的菌株基因组DNA。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃复性60s，72℃延伸30s，循环30次；72C延伸10min。
5.2菌株16S rDNA测序
所得PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验，菌株wxy-b3的16S rDNA序列长度为949bp，分离目标片段送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
5.3测序结果同源比对，构建系统发育树，确定菌株的种属关系
在NCBI中利用BLAST进行同源性检索，与Gen Bank数据进行对比分析，同源性分析结果表明，菌株wxy-b3与解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为100％(图3)。结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定菌株wxy-b3属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
所述菌株wxy-b3于2018年10月在陕西省西安市首次分离，菌株wxy-b3已于2020年06月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.20041，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
(二)抗菌活性测定
发酵液制备：将保存的菌株wxy-b3接种于30mL LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养12h，得到活化的种子液。将所得种子液按3％的比例(v/v)接种于含100mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、200rpm下培养48h，得到发酵液(脂肽产量为60～80mg/L)，发酵液中含有的抗菌脂肽包括Surfactin、Fengycin A、Fengycin B等。
发酵液经0.45μm孔径的细菌滤器过滤，得待测样品，采用琼脂扩散法测定待测样品的抗菌活性。
所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，及蒸馏水1L，pH＝7.0。
抑菌试验：100mL营养琼脂培养基中混入30mL指示菌菌液，倾倒平板，冷却后用直径6.8mm的无菌打孔器打取平板上的琼脂块，取待测样品(滤液)60μL注入琼脂孔中，指示菌在相应的培养条件下培养后，通过游标卡尺测定抑菌圈直径，以抑菌圈的直径表示对应菌株发酵液的抗菌活性。
表1.解淀粉芽孢杆菌菌株wxy-b3的抑菌效果统计
Figure BDA0002713385950000051
参见表1，菌株wxy-b3的发酵液对多种真菌，以及革兰氏阴性、阳性细菌具有抑制作用，符合广谱抗菌的要求。其中小麦赤霉病病原菌、马铃薯干腐病病原菌及苹果腐烂霉均为菌株wxy-b3特有的抗菌对象，为首次在芽孢杆菌抗菌谱中被提及。
基于菌株wxy-b3针对植物病原真菌的抑制作用，结合其发酵能力(例如，脂肽产量)和活性物质提取工艺，表明通过菌株wxy-b3发酵而制备获得的活菌制剂或者以发酵产生的活性物质为主体的制剂具有在农业上防止小麦、马铃薯、苹果等农作物因病害减产的潜力，并适于进行工业化生产。

Claims (9)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株，其特征在于：该菌株的保藏编号为CGMCC No.20041。
2.一种抗菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株的种子液接入培养基后进行发酵，得到发酵液；所述菌株的保藏编号为CGMCC No.20041；
2)将发酵液过滤除菌。
3.根据权利要求2所述一种抗菌剂的制备方法，其特征在于：所述种子液是将所述菌株接种于LB液体培养基中进行活化而得到的。
4.根据权利要求3所述一种抗菌剂的制备方法，其特征在于：所述活化的条件为：32～37℃、150～220rpm下培养12～18h。
5.根据权利要求2所述一种抗菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：将所述种子液按1％～3％的比例接种于LB液体培养基中，然后于32～37℃、150～220rpm下培养48～72h。
6.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株在制备抗菌剂中的应用，其特征在于：所述抗菌剂对引起小麦赤霉病、马铃薯干腐病、苹果腐烂病的病原真菌，以及对蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌具有抑制作用。
7.一种抗菌剂，其特征在于：该抗菌剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株，或者为所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株的发酵液，或者为所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株通过发酵产生的发酵液抗菌组分，或者为含有所述抗菌组分的发酵液的提取物；所述菌株的保藏编号为CGMCC No.20041。
8.根据权利要求7所述一种抗菌剂，其特征在于：所述发酵液的抗菌组分包括脂肽。
9.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株在制备抗菌脂肽中的应用。
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