CN113832074B - 一种放线菌及其生防菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种放线菌及其生防菌剂和应用，涉及微生物学技术领域。本发明的放线菌菌株为晶体链霉菌(Streptomyces crystallinus)，命名为XG4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20076。该菌种XG4分离自草莓根际土壤中，能与土壤生态和谐相容，该菌株制成的生防菌剂能够抑制草莓根腐病、草莓炭疽病、榕树炭疽病、蜜柚黑点病、蜜柚黑斑病、多肉黑斑病、香蕉枯萎病、辣椒枯萎病、番茄叶霉病、多肉细菌性斑点病、虎皮兰细菌性斑点病等病原菌的生长，尤其对草莓根腐病的防治效果显著。

Description

一种放线菌及其生防菌剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物学技术领域，具体是涉及一种放线菌及其生防菌剂和应用。

背景技术

草莓根腐病是由真菌侵染引起的典型土传根部病害，发生范围广，易爆发流行，对草莓的产量和品质影响巨大。引起草莓根腐病的病原菌已达20种之多，主要有丝核菌属（Rhizoctonia sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）、疫霉属（Phytophthora sp.）、链格孢属（Alternaria sp.）、柱孢属（Cylindrocarpon sp.）、茎点霉属（Phoma sp.）等，此外，病原线虫与病原真菌复合侵染也能引起草莓根腐病，防治难度较大。目前，对草莓根腐病的防治以抗性品种选育和化学杀菌剂的使用为主，由此带来了严重的病菌抗药性与环境污染问题，限制其长期大量使用。

生物防治具有无毒、无残留、可利用资源丰富等优点，已成为解决土传病害的有效途径。利用拮抗微生物防治植物病害已成为生物防治的重要方向，迄今为止，已生产应用的生防菌主要有假单胞菌、芽孢杆菌、菌根真菌和少数放线菌。放线菌是一类具有重要经济价值和广泛应用前景的微生物资源，其抗生素、酶、抑制剂等代谢物产物种类丰富，在农林生产领域有重要的应用价值。土壤拮抗放线菌具有对环境友好、效果持久、针对性强等优点，展现出良好的应用前景。因此，研发新型高效生物农药用于草莓根腐病病害的防治，是农作物绿色可持续发展的必然方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种放线菌及其生防菌剂和应用，该放线菌为晶体链霉菌XG4，是从草莓根际土壤中分离获得的草莓根腐病拮抗放线菌，与土壤生态和谐相容，该菌株制成的生防菌剂能够抑制草莓根腐病、草莓炭疽病、榕树炭疽病、蜜柚黑点病、蜜柚黑斑病、多肉黑斑病、香蕉枯萎病、辣椒枯萎病、番茄叶霉病、多肉细菌性斑点病、虎皮兰细菌性斑点病等病原菌的生长，尤其对草莓根腐病的防治效果显著。

为实现上述目的，本发明提供一种放线菌菌株，其特征在于，所述放线菌菌株为晶体链霉菌（Streptomyces crystallinus），命名为XG4，所述放线菌XG4已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年6月15日，保藏编号为CGMCCNo.20076。该放线菌菌株是从草莓根际土壤中分离获得的草莓根腐病拮抗放线菌，与土壤生态和谐相容性好，用于草莓重要病害，防治效果好。

本发明还提供一种生防菌剂，包含有保藏编号为CGMCC No.20076的XG4。

本发明由放线菌XG4制成的生防菌剂，可抑制草莓根腐病、草莓炭疽病、榕树炭疽病、蜜柚黑点病、蜜柚黑斑病、多肉黑斑病、香蕉枯萎病、辣椒枯萎病、番茄叶霉病、多肉细菌性斑点病、虎皮兰细菌性斑点病等病原菌的生长，尤其对草莓根腐病有很好的防治效果，可用于新型生物制剂和生物农药的研发，防治草莓重要病害。

对于上文所述技术方案中，进一步地，所述生防菌剂包括发酵液菌剂，或固体发酵菌剂中的任一种。

本发明还提供一种由上述的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）生防放线菌种子液制备：将放线菌菌株XG4接种于高氏一号液体培养基中，26-30℃，160-200 rpm，培养2-3 d，制成种子液；

（2）将步骤（1）所述种子液制备成生防菌剂，其中，

所述发酵液菌剂的制备方法为：将种子液按10%接种量接种于发酵培养基中，26-30℃，160-200 rpm，发酵培养6-8 d，制成浓度为10⁸ cfu/mL的XG4菌株发酵液；

所述固体发酵菌剂的制备方法为：将种子液按10%接种量接种于固体发酵基质中，28℃培养7-10 d，待瓶壁及固体发酵基质长满灰白色菌丝，并散发出典型的“土腥味”，镜检，发现大量分生孢子，取样计数，发酵结束后，制成菌含量为10⁸ cfu/g的XG4固体发酵菌剂。

对于上文所述技术方案中，进一步地，步骤（2）中，所述发酵培养基的配方以质量百分比计包括：麦芽糖1.4-1.6%，黄豆粉2.4-2.6%，CaCO₃ 0.05-0.15%，K₂HPO₄ 0.04-0.06%，MgSO₄·7H₂O 0.04-0.06%，海盐0.8-1.2%；和/或将所述发酵培养基调节pH为7.8-8.2。

对于上文所述技术方案中，进一步地，步骤（3）中，所述固体发酵基质的制备方法为：将麦粒泡水22-26 h，滤干水分，取麦粒与鸡粪按质量比为0.8-1.2:1，搅拌混匀，控制料水比9-11:8，调节基质pH为7.2-7.5，以20%装瓶量装入500 mL的广口瓶中，121℃，灭菌20min，冷却，即得。

本发明还提供一种由上述生防菌剂在草莓根腐病、草莓炭疽病、榕树炭疽病、蜜柚黑点病、蜜柚黑斑病、多肉黑斑病、香蕉枯萎病、辣椒枯萎病、番茄叶霉病、多肉细菌性斑点病或虎皮兰细菌性斑点病防治中的应用。

对于上文所述技术方案中，进一步地，所述生防菌剂应用于草莓根腐病的防治。

本发明还提供一种由上述生防菌剂防治草莓根腐病的使用方法，在草莓苗移栽3d后，将所述发酵液菌剂灌根使用；和/或在草莓移栽时，将所述固体发酵菌剂直接拌入土壤使用。具体地，发酵液菌剂使用时，在草莓苗移栽3 d后灌根使用，每株50 mL，连续使用2-3次，每次间隔5-7 d；固体发酵菌剂使用时，生防菌剂与草莓连作土质量比为1:100搅拌均匀，在移栽时直接使用。

本发明的有益效果：

1、本发明筛选出的生防放线菌XG4从草莓根际土壤中获得，能与土壤生态和谐相容，使用时有利于充分发挥菌株的优势。

2、本发明含有XG4的生防菌剂是微生物制剂，对环境污染小，对减少农业污染具有重要的作用，是一种新型的绿色农业杀菌剂，在微生物农药、微生物制剂等领域有良好的应用前景。

3、本发明的生防菌剂能够抑制草莓根腐病、草莓炭疽病、榕树炭疽病、蜜柚黑点病、蜜柚黑斑病、多肉黑斑病、香蕉枯萎病、辣椒枯萎病、番茄叶霉病、多肉细菌性斑点病、虎皮兰细菌性斑点病等多种病原菌的生长，尤其是对草莓根腐病表现出良好的防治效果。从盆栽试验结果可以看出，该生防菌株对草莓根腐病的防治效果显著，发酵液菌剂防效达64.66%，固体发酵菌剂的防效达72.10%。

4、本发明的生防菌剂适用于草莓重要病害防治中，尤其适用于草莓根腐病的有效防治，对环境污染小，有利于草莓的绿色生产。

附图说明

图1为本发明菌株XG4的培养特征示意图；

图2为本发明菌株XG4的孢子链和孢子电镜观察图；

图3为本发明菌株XG4的孢子丝电镜观察图；

图4为本发明菌株XG4的16S rDNA系统发育树；

图5为本发明菌株XG4对草莓根腐病的温室盆栽防效生长情况图；其中，a为清水对照；b为施用XG4固体发酵菌剂；c为施用XG4发酵液菌剂。

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

为了更好地阐述本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。所用试剂或仪器设备未注明生产商者，均为常规产品。

本发明的上述各项技术特征和在下文（如实施案例）中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。

实施例1：拮抗放线菌的筛选

1、土壤样品采集

于福建省漳州市颜厝镇草莓种植基地选取多株周围植株均发病的健康草莓，连根带土挖取植株，抖落收集根系周围的土壤带回实验室，待自然阴干后分离。

2、放线菌的分离

采用平板稀释法进行分离。称取10 g土样加入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，于28℃、150 rpm振荡30 min，即为10^-1土壤菌悬液。吸取土壤菌悬液1 mL于盛有9 mL无菌水的试管中，涡旋，即为10^-2土壤稀释液；依此类推，得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的土壤稀释液。取0.1mL不同稀释度的土壤稀释液涂布在高氏一号培养基上，每个稀释度重复3次，28℃培养3-7d，待平板上长出菌落后，根据菌落形态、气生菌丝生长状况等培养特征挑选较为典型的放线菌单菌落再次培养。经过2-3次的分离纯化，挑取出培养特征相异的单菌落，培养7-10 d，4℃保存备用。共分离获得45株放线菌。

3、拮抗放线菌的筛选

采用平板对峙法对分离得到的放线菌进行抑菌活性的筛选。将放线菌菌种接种于高氏一号液体培养基中，28℃、180 rpm振荡培养7 d，即为发酵液。将圆形滤纸片（d=5 mm）用发酵液浸湿，放置在PDA平板的两端，平板中央放置病原菌，重复3次，于28℃恒温培养5-7d。结果有11株放线菌对不同作物重要病害的病原菌具有不同程度的抑制作用；其中XG4的抑菌效果最好，对不同作物重要病害的病原菌均有不同程度的抑制作用，抑制效果如表1所示。

表1 XG4对不同作物重要病害病原菌的抑制效果

注：同列不同大写字母表示数值差异极显著（p<0.01），小写字母表示数值差异显著（p<0.05）。

实施例2：菌株XG4的鉴定

1、形态特征的鉴定

采用插片法进行形态学观察：将菌株XG4接种于高氏一号培养基，其中XG4培养特征示意图如图1所示；同时将无菌盖玻片（0.5 cm×0.5 cm）以45°角斜插入平板，使菌丝沿着盖玻片生长，形成气生菌丝，并分化形成孢子丝。28℃培养7-10 d后，取出盖玻片，在光学显微镜下观察不同拮抗菌株孢子丝形态，待孢子丝形成后，进行扫描电镜样品加工处理，样品用2.5%戊二醛固定在多孔板里，用扫描电镜拍摄孢子丝和分生孢子形态，如图2和图3所示。

2、培养特征观察

依据Waksman的《放线菌分类系统》并参照《链霉菌鉴定手册》（中国科学院微生物研究所放线菌分类组，1975）中推荐的部分培养基和方法进行形态和生理生化鉴定。将菌株XG4接种于不同培养基，于28℃培养7-10 d后观察菌体生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素，如表2所示。

表2 菌株XG4在不同培养基上的培养特征

将菌株XG4接种于不同的碳源和氮源利用培养基，于28℃培养7-10 d，观察菌株是否生长，若能正常生长说明菌株可以利用此类碳源或氮源，若不能生长，说明不能利用此种碳源或氮源；将菌株XG4接种于明胶、牛奶、柴斯纳和硝酸盐还原培养基，观察XG4是否能使明胶液化，牛奶凝固和冻化，是否能使硝酸盐还原和产H₂S，生理生化特征如表3所示。

表3放线菌XG4菌株生理生化特征

注：“+”为正反应；“-”为负反应。

结果表明：XG4菌株能利用半乳糖、麦芽糖、葡萄糖、阿拉伯糖、肌醇等5种碳源，不能利用蔗糖、果糖、鼠李糖、甘露醇；能利用色氨酸、甘氨酸、酪氨酸、组氨酸、氯化铵等5种氮源，不能利用精氨酸和硝酸钾；能使明胶液化，牛奶凝固和冻化，能使硝酸盐还原和产H₂S。

3、16S rDNA序列分析

将菌株XG4接种在高氏一号固体培养基上，28℃培养7-8 d，送至生工生物工程（上海）股份有限公司，进行菌种鉴定。提取基因组DNA，采用通用引物7F（SEQ ID No.1）: 5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’和1540R（SEQ ID No.2）: 5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，进行16SrDNA的PCR扩增。使用凝胶纯化试剂盒（AXYGEN）纯化回收目的DNA片段，并完成测序，获得全长1452 bp的序列，如SEQ ID No.3所示。测序结果于NCBI网站上进行BLAST序列比对，应用软件MEGA 7.0，采用邻接法（neighborjoining）构建16S rDNA系统发育树，如图4所示。结果表明，菌株XG4与Streptomyces crystallinus属于同一分支，相似性为99.93%，结合形态学特征和培养特征，将菌株XG4鉴定为晶体链霉菌（Streptomyces crystallinus）。

实施例3 菌株XG4生防菌剂制备

种子液制备：将XG4菌株接种于高氏一号液体培养基中，28℃、180 rpm振荡培养2-3 d，制成种子液。

发酵液菌剂制备：按10%接种量将种子液接种于发酵培养基中，28℃，180 rpm，发酵培养7 d，制成浓度为10⁸ cfu/mL的XG4菌株发酵液，即为发酵液菌剂；其中，发酵培养基配方为：麦芽糖1.5%，黄豆粉2.5%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，海盐1.0%，pH 7.8-8.2。

固体发酵菌剂制备：按10%接种量接入种子液，28℃培养8 d，待瓶壁及固体发酵基质长满灰白色菌丝，并散发出典型的“土腥味”，镜检，发现大量分生孢子，取样计数，发酵结束后，制成菌含量10⁸ cfu/g的XG4菌剂，即为固体发酵菌剂；其中，固体发酵基质配方为：麦粒泡水22-26 h，滤干水分，取麦粒与鸡粪按质量比为1:1，搅拌混匀，控制料水比10:8，调节基质pH 7.2-7.5，按20%的量装入500 mL的广口瓶中，121℃，灭菌20 min。

实施例4 菌株XG4盆栽防效试验

选取长势良好，且大小一致的健康幼苗（白草莓），移栽到装有1.5 kg基质土的盆钵中，每盆1株，26℃温室中常规管理。试验设置3个处理：

1）固体发酵菌剂处理：1%（质量分数）XG4固体发酵菌剂提前与盆栽土混合拌匀装入盆钵中，草莓苗移栽2 d后每株灌根10⁷ cfu/mL尖孢镰刀菌菌液10 mL；

2）发酵液菌剂处理：草莓苗移栽3 d后，每株灌注50 mL的XG4发酵液菌剂，2d后每株灌根10⁷ cfu/mL尖孢镰刀菌菌液10 mL；

3）清水对照：草莓苗移栽3 d后，每株灌注50 mL清水，2 d后每株灌根10⁷ cfu/mL尖孢镰刀菌菌液10 mL。

每个处理9株，每处理3次重复。定期观察记录草莓生长情况，统计发病率、死亡率和病情指数，至对照发病率达到90%以上结束实验，其中草莓生长情况如图5所示。

病情指数分级标准如下：

0级：根系发病率≤20%，根系未发病；

1级：20%≤根系发病率≤40%，叶片正常，根系少许发病；

2级：40%≤根系发病率≤60%，叶片正常，，根系发生病变，根尖变为褐色；

3级：60%≤根系发病率≤80%，叶片变黄，主根变为深褐色；

4级：80%≤根系发病率≤100%，叶片枯萎，根系变黑甚至整株死亡。

草莓植株各个处理的发病率、病情指数及防治效果的计算公式如下所示：

发病率=（该处理发病植株总数／该处理植株总数）/100%

病情指数=[∑（病级株数×代表数值）/（株数总和×发病最重级的代表数值）]×100%

防治效果=[（对照病情指数–处理病情指数）/对照病情指数]×100%

表4 放线菌XG4对草莓根腐病的盆栽防治效果

注：同列不同大写字母表示数值差异极显著（p<0.01），小写字母表示数值差异显著（p<0.05）。

试验结果表明，放线菌XG4菌剂能够显著降低草莓根腐病的病情指数，XG4固体发酵菌剂的防治效果达72.10%，XG4发酵液菌剂的防治效果达64.66%。XG4生防菌剂能够有效防治草莓根腐病，且对环境污染小，是一种新型的绿色农业杀菌剂，在微生物农药、微生物制剂等领域有良好的应用前景。

最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 漳州市农业科学研究所

<120> 一种放线菌及其生防菌剂和应用

<130> 2021.10.15

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cagagtttga tcctggct 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aggaggtgat ccagccgca 19

<210> 3

<211> 1452

<212> DNA

<213> Streptomyces crystallinus

<400> 3

tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gaacgatgaa gcccttcggg 60

gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc tgcccttcac tctgggacaa 120

gccctggaaa cggggtctaa taccggatac gacctggaaa ggcatctctg cgggtggaaa 180

gctccggcgg tgaaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac 240

caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg 360

cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga 420

agcgaaagtg acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt 540

gtcacgtcgg atgtgaaagc ccggggctta accccgggtc tgcattcgat acgggctagc 600

tagagtgtgg taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 660

aggaacaccg gtggcgaagg cggatctctg ggccattact gacgctgagg agcgaaagcg 720

tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgttg ggaactaggt 780

gttggcgaca ttccacgtcg tcggtgccgc agctaacgca ttaagttccc cgcctgggga 840

gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cagcggagca 900

tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatat accggaaagc 960

attagagata gtgcccccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttct gtgttgccag 1080

catgcccttc ggggtgatgg ggactcacag gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt 1140

ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc tgcacacgtg ctacaatggc 1200

cggtacaatg agctgcgatg ccgtgaggcg gagcgaatct caaaaagccg gtctcagttc 1260

ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gtcggagttg ctagtaatcg cagatcagca 1320

ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacgtc acgaaagtcg 1380

gtaacacccg aagccggtgg cccaacccct tgtgggaggg agctgtcgaa ggtgggactg 1440

gcgattggga cg 1452

Claims (9)

1.一种放线菌菌株，其特征在于，所述放线菌菌株为晶体链霉菌（Streptomyces crystallinus），命名为XG4，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20076。

2.一种生防菌剂，其特征在于，包含有保藏编号为CGMCC No.20076的晶体链霉菌XG4。

3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂为发酵液菌剂或固体发酵菌剂中的任一种。

4.权利要求2或3任一项所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）生防放线菌种子液制备：将放线菌菌株XG4接种于高氏一号液体培养基中，26-30℃，160-200 rpm，培养2-3 d，制成种子液；

（2）将步骤（1）所述种子液制备成生防菌剂，其中，

所述发酵液菌剂的制备方法为：将种子液按10%接种量接种于发酵培养基中，26-30℃，160-200 rpm，发酵培养6-8 d，制成浓度为10⁸ cfu/mL的XG4菌株发酵液；

所述固体发酵菌剂的制备方法为：将种子液按10%接种量接种于固体发酵基质中，28℃培养7-10 d，待瓶壁及固体发酵基质长满灰白色菌丝，并散发出典型的“土腥味”，镜检，发现大量分生孢子，取样计数，发酵结束后，制成菌含量为10⁸ cfu/g的XG4固体发酵菌剂。

5.根据权利要求4所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基的配方以质量百分比计由以下成分组成：麦芽糖1.4-1.6%，黄豆粉2.4-2.6%，CaCO₃0.05-0.15%，K₂HPO₄ 0.04-0.06%，MgSO₄·7H₂O 0.04-0.06%，海盐0.8-1.2%；和/或将所述发酵培养基调节pH为7.8-8.2。

6.根据权利要求4所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述固体发酵基质的制备方法为：将麦粒泡水22-26 h，滤干水分，取麦粒与鸡粪按质量比为0.8-1.2:1，搅拌混匀，控制料水比9-11:8，调节基质pH为7.2-7.5，以20%装瓶量装入500 mL的广口瓶中，121℃，灭菌20 min，冷却，即得。

7.权利要求2或3任一项所述生防菌剂或由权利要求4-6任一项所述制备方法制备的生防菌剂在草莓根腐病、草莓炭疽病、榕树炭疽病、蜜柚黑点病、蜜柚黑斑病、多肉黑斑病、香蕉枯萎病、辣椒枯萎病、番茄叶霉病、虎皮兰细菌性斑点病防治中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生防菌剂应用于草莓根腐病的防治。

9.一种由权利要求2或3所述生防菌剂或权利要求4-6任一项所述制备方法制备的生防菌剂防治草莓根腐病的使用方法，其特征在于，在草莓苗移栽3 d后，将所述发酵液菌剂灌根使用；和/或在草莓移栽时，将所述固体发酵菌剂直接拌入土壤使用。

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