CN111057666B - 一株韩国假单胞菌及其筛选方法与应用 - Google Patents

一株韩国假单胞菌及其筛选方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）菌株，命名为P623‑9，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼邮编：510070，保藏编号GDMCC NO.60806，保藏日期2019年10月14日；并公开了该株韩国假单胞菌在提高设施蔬菜土壤磷利用率和促生长中的应用。本发明提供的韩国假单胞菌菌株P623‑9溶磷量高达496mg/L，具有良好溶磷能力，可将土壤中的固定态磷等难溶性磷酸盐磷转化为易于蔬菜吸收利用的可溶性磷，减少磷肥的施入量，促进蔬菜的生长，在应用过程中使产量提高15%以上，并节约种植成本，减轻污染问题。

Description

一株韩国假单胞菌及其筛选方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及韩国假单胞菌及其筛选方法与应用。
背景技术
土壤是农业可持续发展的物质基础，是作物生长的重要营养源泉，磷是植物生长的重要营养元素之一，我国74%的耕地土壤中缺磷，而施入土壤的磷肥只有5%﹣25%的利用率，大部分磷都成了不能吸收的难溶性磷酸盐，不易为植物直接吸收利用，为了从土壤中筛选出能够将难溶性磷酸盐转化为植物能吸收的可溶性磷的优良解磷菌株，科研人员利用生物技术手段，通过选育溶磷微生物来提高土壤磷对植物的有效性。目前，多数研究是利用传统的菌种筛选技术，筛选出来的菌株溶磷效果不尽如人意。因而筛选出一株或几株具有解磷能力强、应用于一种或几种作物解磷效果好等优点的优良菌种，并将其添加到有机肥中，两者协同作用，改善植物磷元素供应尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明主要是克服了现有技术的缺陷，提供了一株韩国假单胞菌及其筛选方法与解磷能力的应用。该韩国假单胞菌是在作物定植同时加入诱导剂，使作物土壤中的溶磷菌得到富集，经过溶磷圈筛选得到，具有高效的解磷能力，为溶磷菌菌剂开发微生物肥料奠定基础。
本发明的目的之一在于提供了一株韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis），命名为P623-9，从番茄植株土壤中分离筛选得到。
本发明的另一目的在于提供该株韩国假单胞菌的筛选方法。
本发明的第三目的在于提供了该株韩国假单胞菌在提高设施蔬菜土壤磷利用率和促生长中的应用。
本发明的技术方案如下：
一株韩国假单胞菌，该韩国假单胞菌为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis，命名为P623-9，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼 邮编：510070，保藏编号GDMCC20191015（60806），保藏日期2019年10月14日。
上述韩国假单胞菌的16S rDNA序列如下：
ACGCTGGCGG CAGGCCTAAC ACATGCAAGT CGAGCGGATG AAAGGAGCTT GTAGTGGGGGACAACGTTTC GAAAGGAACG CTAATACCGC ATACGTCCTA CGGGAGAAAG CAGGGGACCT TCGGGCCTTGCGCTATCAGA TGAGCCTAGG TCGGATTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG ACGATCCGTAACTGGTCTGA GAGGATGATC AGTCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA CTCCTACGGG AGGCAGCAGTGGGGAATATT GGACAATGGG CGAAAGCCTG ATCCAGCCAT GCCGCGTGTG TGAAGAAGGT CTTCGGATTGTAAAGCACTT TAAGTTGGGA GGAAGGGTTG TAGATTAATA CTCTGCAATT TTGACGTTAC CGACAGAATAAGCACCGGCT AACTCTGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACAG AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AATTACTGGGCGTAAAGCGC GCGTAGGTGG TTCGTTAAGT TGGATGTGAA ATCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATCCAAAACTGGCG AGCTAGAGTA TGGTAGAGGG TGGTGGAATT TCCTGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGATATAGGAAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACCAC CTGGACTGAT ACTGACACTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGTCAACTA GCCGTTGGGA GCCTTGAGCTCTTAGTGGCG CAGCTAACGC ATTAAGTTGA CCGCCTGGGG AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGAATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGGCCTTGACATC CAATGAACTT TCCAGAGATG GATTGGTGCC TTCGGGAGCA TTGAGACAGG TGCTGCATGGCTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GTAACGAGCG CAACCCTTGT CCTTAGTTACCAGCACGTTA TGGTGGGCAC TCTAAGGAGA CTGCCGGTGA CAAACCGGAG GAAGGTGGGG ATGACGTCAAGTCATCATGG CCCTTACGGC CTGGGCTACA CACGTGCTAC AATGGTCGGT ACAAAGGGTT GCCAAGCCGCGAGGTGGAGC TAATCCCATA AAACCGATCG TAGTCCGGAT CGCAGTCTGC AACTCGACTG CGTGAAGTCGGAATCGCTAG TAATCGCGAA TCAGAATGTC GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTCACACCATGGG AGTGGGTTGC ACCAGAAGTA GCTAGTCTAA CCTTCGGGAG GACGGTTACC ACGGTGTGATTCATGACTGG G。
P623-9由宝生物（大连）有限公司测定16SrRNA序列，并将16S rRNA序列在GenBank中序列分析及同源性比较，通过比对菌株P623-9与韩国假单胞菌的相似性为99％，同时通过制作进化树并进行了分析，经过对菌株的形态学鉴定，确定菌株P623-9为韩国假单胞菌。
该株韩国假单胞菌的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1、番茄育苗及移栽: 30℃恒温催芽，待胚根伸长到2mm左右时进行点播，两片真叶展开后进行土壤移栽，番茄苗移栽3d后，向土壤中添加液体肥料，继续栽培一个月左右；
步骤2、菌种诱导:在栽培土壤中添加磷灰石粉、草粉及胺类制剂，将番茄苗移栽至栽培土壤；
步骤3、解磷菌分离筛选:对番茄根际、根表士壤样品及番茄植株的根部进行取样，分别加入到富集液体培养基中，震荡培养；
步骤4、将步骤3得到的富集培养液梯度稀释后，涂布于固体筛选培养基平板上，静置培养后，选取单菌落。
优选的，所述液体肥料为1%葡萄糖液和尿素液。
优选的，所述磷灰石粉需提前洗涤，尽量去除其中的速效磷。
优选的，所述步骤2中，诱导番茄根际解磷菌的大量繁殖。
优选的，所述步骤3中，番茄根际、根表士壤样品及番茄植株的根部分别取样，样品与富集液体培养基的比例为1g:100ml。
优选的，所述步骤3中，震荡培养温度为28--30℃，震荡培养时间为48h。
优选的，所述步骤4中，选取单菌落的条件为：长势好、溶磷圈大。
上述韩国假单胞菌在提高设施蔬菜土壤磷利用率和促生长中的应用。
上述应用中，具体为将韩国假单胞菌活化培养、接种发酵培养基培养后得培养液，然后将培养液设施蔬菜土壤中应用，提高磷转化和利用效率。
优选的，上述培养液的制备方法，包括以下步骤：韩国假单胞菌试管斜面保存菌种活化培养24小时，按1%接菌量接种于发酵培养基中，培养48小时，得到培养液。
优选的，上述活化培养基：(NH4)2SO4 0.1g，KCL0.2g，MgSO47H20 0.25g，NaCl 0.5g，葡萄糖10g，磷矿粉5g，定容至1000ml。
优选地，上述发酵培养基：葡萄糖10.0，硫酸铵0.5，氯化钠0.3，硫酸镁0.3，磷矿粉1.0，硫酸亚铁(1％)1m」硫酸锰(1％)1ml，蒸馏水1000ml。
上述培养液使用方法：
当植株定植7天时施入韩国假单胞菌培养液的5倍稀释液。
同时观察或测定测定植株生长过程中根系、作物茎叶干重、产量等相关指标。
优选的，所述植株包括但不限于番茄植株、辣椒、黄瓜、角瓜等。
韩国假单胞菌在提高番茄磷利用率、促生长、提高番茄产量中的应用。
本发明具有以下有益效果。
（1）本发明首次发现韩国假单胞菌P623-9。
（2）本发明提供的韩国假单胞菌P623-9溶磷量高达496mg/L，具有良好溶磷能力，可应用于磷肥过少的设施蔬菜土壤中。
（3）将本发明提供的韩国假单胞菌应用于设施蔬菜土壤中，可将土壤中的固定态磷等难溶性磷酸盐磷转化为易于蔬菜吸收利用的可溶性磷，减少磷肥的施入量，促进蔬菜的生长，在应用过程中使产量提高15%以上，并节约种植成本。
（4）将本发明提供的韩国假单胞菌应用于磷肥过量的设施蔬菜土壤中，减轻污染问题。
（5）将本发明提供的韩国假单胞菌应用于植物促生中，可提高蔬菜根系生长。
（6）本发明提到的土壤中加入底物进行动态诱导的筛选方法与常规富集培养方法相比，能得到更多的高溶磷量的菌株。
附图说明
图1为韩国假单胞P623-9分离筛选（定性解磷效果测试）图。
图2为韩国假单胞P623-9对作物根系的作用图。
图3为作物产量及解磷能力测定图。
具体实施方式
磷细菌P623-9是由辽宁省微生物科学研究自行分离筛选的菌种，经鉴定为韩国假单胞菌（Pseudomonas korensis），在实验室30℃震荡培养五天溶磷量能达到496mg/L 。经过田间试验结果表明，韩国假单胞菌P623-9施用于设施蔬菜番茄时具有很强的解磷能力，优于辣椒、黄瓜和角瓜等其他设施作物，同时可大幅度增加作物产量。
该株韩国假单胞菌的筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤1、番茄育苗及移栽: 30℃恒温催芽，待胚根伸长到2mm左右时点播在营养钵中，两片真叶展开后（40天左右），移栽到花盆中，每盆使用土壤600g，一个月左右开始进行菌种分离；
步骤2、番茄苗移栽到3d后，向花盆中添加1%葡萄糖液和尿素液，促进土壤中磷细菌富集；
步骤3、菌种诱导:在栽培土壤中添加磷灰石粉(矿石粉提前洗涤，尽量去除其中的速效磷)草粉及胺类制剂，移栽番茄苗，诱导番茄根际解磷菌的大量繁殖；
步骤4、解磷菌分离筛选:取经过富集过的番茄根际、根表士壤样品及番茄植株的根部，分别加入到100ml富集液体培养基中(样品分别取1克)，28-30℃震荡培养48h；
步骤5、将步骤4得到的富集培养液梯度稀释后，涂布于固体筛选培养基平板上（溶磷圈法），静置培养后，挑取长好的单菌落；
步骤6、将步骤5中挑取得到的单菌落保藏并做16S rDNA鉴定，鉴定结果为韩国假单胞菌。
实施例1 韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）的筛选及鉴定。
1. 韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）P623-9的筛选：
本发明所述的拮抗菌韩国假单胞菌P623-9从连作番茄育苗根际土壤中筛选得到。
1.1假单胞菌培养基的配制。
1.1.1磷细菌富集培养基:称取下列各组分：(NH4)2SO0.5g，NaC1 0.5g，KC1 0.3g，MgSO47H20 0.3g，Ca(PO4)210g，FeS047H2O 0.03g，MnSO44H20 0.03g，磷矿粉1.0g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml，调节pH7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min，备用。
1.1.2分离筛选固体培养基:(NH4)2SO4 0.1g，KCL0.2g，MgSO47H20 0.25g，NaCl0.5g，葡萄糖10g，磷矿粉5g，琼脂粉18g，定容至1000ml，调节pH7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min，稍凉后迅速倒入平皿中，冷却凝固后备用。
1.2假单胞菌的分离培养。
1.2.1番茄育苗及移栽: 30℃恒温催芽，待胚根伸长到2mm左右时点播在营养钵中，两片真叶展开后（大约40天左右），移栽到花盆中，每盆使用土壤600g，其中番茄苗移栽到3d时，向花盆中添加1%葡萄糖液和尿素液，促进土壤中的假单胞菌富集，一个月左右开始进行菌株分离。
1.2.2假单胞菌的诱导:在栽培土壤中添加磷灰石粉(矿石粉提前洗涤，尽量去除其中的速效磷)草粉及胺类制剂，移栽番茄苗，诱导番茄根际解磷菌的大量繁殖。
1.2.3假单胞菌的富集:取经过诱导过的番茄根际、根表士壤样品10g分别加入到90ml富集液体培养基中，30℃震荡培养48h，得到富集培养液。
1.2.4将富集培养液梯度稀释后，涂布于分离筛选固体培养基上，静置培养后，根据菌落数量、形态、颜色、表面状况等特征，观察菌落生长情况，选取长势好、溶磷圈大的单菌落接种于磷细菌液体富集培养基（成分如前述）中28--30℃，进行震荡培养，同时接种于分离筛选固体培养基（成分如前述）进行斜面培养并保存备用，并将该菌株进行了保藏，保藏编号为GDMCC20191015。
2. 韩国假单胞菌P623-9的鉴定。
（1）菌株P623-9的微生物学形态特征
菌株P623-9为专性需氧的革兰氏染色阴性，显微镜下呈杆状或略弯，在解磷培养基上菌落为不规则圆形，菌落成扁平，湿润，具有微黄色。正常生长pH在6.0-8.0，具有很强的解磷能力。
（2）菌株P623-9的分子鉴定
采用16S rDNA基因扩增技术对菌株P623-9进行分子鉴定。将筛选出的具有很强解磷能力的菌株P623-9（保藏编号为GDMCC20191015）保存菌种转接至5mlLB液体培养基中，进行30℃震荡培养24h涂平板，30℃培养30h ,挑取单菌落接种于LB固体试管斜面培养基上，培养48h，送至宝生物（大连）有限公司进行序列测定，然后采取BLAST工具与NCBI数据库进行比对分析，序列如SEQ.ID.NO.1所示，分子生物学鉴定该解磷菌为韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis），保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号GDMCC20191015（60806）。
实施例2 韩国假单胞菌P623-9解磷能力实验。
（1）定性解磷效果测试（初筛）：固体培养条件下溶磷能力测定：采用溶磷圈法。挑取经纯化的菌种，点接到固体培养基培养皿中，每个处理重复三次，置于28 ℃培养箱中培养7 d，测量溶磷圈直径与菌落直径的比值（D/d），确定各个菌株解磷能力的强弱，如图1所示。
（2）定量解磷能力测试（钼锑抗比色法）：挑取定性解磷效果测试中溶磷圈较大的，菌落长势好的菌株分别接种到100 mL 无机磷液体培养基中（如前述），30 ℃160～180 r/min 振荡培养5d，测定菌株培养液中有效磷含量，结果对磷矿粉的溶磷量为496mg/L，高于信健等溶磷量对磷酸钙为449.03mg/L，对植酸钙为208.27mg/L；孙海等461mg/L等等。
实施例3韩国假单胞菌P623-9对于设施蔬菜番茄的解磷能力对比实验。
1、试验样品：韩国假单胞菌P623-9 。
2、田间试验作物：
设施蔬菜：番茄 辣椒 黄瓜 角瓜。
3、试验方法及步骤。
（1）菌种活化及菌液制备
挑取韩国假单胞菌P623-9平板上单菌落接种于5ml液体LB培养基中，30 ℃震荡培养24h再分别接种于100ml液体LB培养基中，30 ℃震荡培养24h，得到培养液，计数（菌数为1.1×108CFU/ml），备用。
（2）田间试验
在这四种作物定植后第二片真叶展开时分别加入5倍后稀释的菌液于根部，分别设置对照进行比较，在一个生长季结束时（约4个月）收取根际土壤样品进行解磷能力测试，测量各种作物的产量，并对作物的根系进行比较（见图2），从图2中可以看出韩国假单胞菌P623-9施用后与CK即空白对照相比，韩国假单胞菌P623-9对植株根系的发育具有良好的促进作用。从结果看出，番茄根际土壤的解磷能力最强，达到5526mg/L，最差为角瓜3008mg/L；产量增长率分别为番茄15%、黄瓜10%、辣椒8%、角瓜5.5%。（见图3）。
<110> 辽宁省微生物科学研究院
<120> 一株韩国假单胞菌及其筛选方法与应用
<160> 1
<170>
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> Pseudomonas sp.
<400> 1
ACGCTGGCGG CAGGCCTAAC ACATGCAAGT CGAGCGGATG AAAGGAGCTT 50
GCTCCTGGAT TCAGCGGCGG ACGGGTGAGT AATGCCTAGG AATCTGCCTG 100
GTAGTGGGGG ACAACGTTTC GAAAGGAACG CTAATACCGC ATACGTCCTA 150
CGGGAGAAAG CAGGGGACCT TCGGGCCTTG CGCTATCAGA TGAGCCTAGG 200
TCGGATTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG ACGATCCGTA 250
ACTGGTCTGA GAGGATGATC AGTCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA 300
CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG CGAAAGCCTG 350
ATCCAGCCAT GCCGCGTGTG TGAAGAAGGT CTTCGGATTG TAAAGCACTT 400
TAAGTTGGGA GGAAGGGTTG TAGATTAATA CTCTGCAATT TTGACGTTAC 450
CGACAGAATA AGCACCGGCT AACTCTGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACAG 500
AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AATTACTGGG CGTAAAGCGC GCGTAGGTGG 550
TTCGTTAAGT TGGATGTGAA ATCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATCC 600
AAAACTGGCG AGCTAGAGTA TGGTAGAGGG TGGTGGAATT TCCTGTGTAG 650
CGGTGAAATG CGTAGATATA GGAAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACCAC 700
CTGGACTGAT ACTGACACTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT 750
TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGTCAACTA GCCGTTGGGA 800
GCCTTGAGCT CTTAGTGGCG CAGCTAACGC ATTAAGTTGA CCGCCTGGGG 850
AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA 900
GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG 950
CCTTGACATC CAATGAACTT TCCAGAGATG GATTGGTGCC TTCGGGAGCA 1000
TTGAGACAGG TGCTGCATGG CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG 1050
GTTAAGTCCC GTAACGAGCG CAACCCTTGT CCTTAGTTAC CAGCACGTTA 1100
TGGTGGGCAC TCTAAGGAGA CTGCCGGTGA CAAACCGGAG GAAGGTGGGG 1150
ATGACGTCAA GTCATCATGG CCCTTACGGC CTGGGCTACA CACGTGCTAC 1200
AATGGTCGGT ACAAAGGGTT GCCAAGCCGC GAGGTGGAGC TAATCCCATA 1250
AAACCGATCG TAGTCCGGAT CGCAGTCTGC AACTCGACTG CGTGAAGTCG 1300
GAATCGCTAG TAATCGCGAA TCAGAATGTC GCGGTGAATA CGTTCCCGGG 1350
CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCATGGG AGTGGGTTGC ACCAGAAGTA 1400
GCTAGTCTAA CCTTCGGGAG GACGGTTACC ACGGTGTGAT TCATGACTGG 1450
G 1451

Claims (5)

1.一株韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）菌株，其特征在于，命名为P623-9，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼邮编：510070，保藏编号GDMCC NO:60806，保藏日期为2019年10月14日。
2.根据权利要求1所述的一株韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）菌株在提高设施蔬菜土壤磷利用率和促生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蔬菜为番茄、辣椒、黄瓜、角瓜。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为将韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）菌株活化培养、接种发酵培养基培养后得培养液，然后将培养液在设施蔬菜土壤中应用，提高磷转化和利用效率。
5.权利要求1所述的一株韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）菌株的培养液制备方法，其特征在于，所述菌株的培养液的制备方法包括以下步骤：将所述韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）菌株试管斜面保存菌种活化培养24小时，按1%接菌量接种于发酵培养基中，培养48小时，得到培养液。
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