CN108977373B - 一种兵马俑芽胞杆菌hmd9161及其菌剂和应用 - Google Patents

一种兵马俑芽胞杆菌hmd9161及其菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兵马俑芽胞杆菌HMD9161及其菌剂和应用，该菌株已于2017年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：60269。该菌株及其菌剂可以在盐碱地环境生长很好改良盐碱地的微生态，与有机肥配合使用对盐碱地的改良相关效果明显，能够降低土壤盐度、pH值，提高作物产量。

Description

一种兵马俑芽胞杆菌HMD9161及其菌剂和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种兵马俑芽胞杆菌HMD9161及其菌剂和应用。
背景技术
良好土壤质量作为保障农业丰收的重要手段，在农业生产中发挥着重要的作用。大量化学肥料使用存在的主要问题是化学肥料不合理使用、土壤中营养严重失衡、土壤生态环境恶化，造成作物长势下降、减产等问题。微生物修复是利用特定微生物体的代谢吸收、转化、降解盐碱离子成分，实现土壤生态平衡、生态效应恢复的生物措施。具有高效经济、无二次污染等特点。该技术已应用于各类土壤修复领域，表现出了较高的应用价值，国内外有关行业部门专家认为生物修复技术是生态环境保护领域最有价值和最具生命力的处理技术，是农业土壤修复的主要发展方向，也是解决农业次生盐渍化土壤生态修复的有效手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能用于盐碱地土壤修复的兵马俑芽胞杆菌(Bacillusbingmayongensis)，该菌株可用于盐碱地土壤修复，提高盐碱地种植作物产量。同时本发明还提供了兵马俑芽胞杆菌的菌剂及其应用。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供的一种用于修复盐碱地的兵马俑芽胞杆菌(Bacillusbingmayongensis)HMD9161，该菌株已进行保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏日期：2017年11月6日，保藏编号：GDMCC No：60269。
本发明兵马俑芽胞杆菌HMD9161主要生物学特性为革兰氏染色阳性(G+)，细胞形状为杆状，细胞大小为长1.6-3.3μm、宽1.1-1.8μm，需氧，产孢，运动。在TSA平板上生长的菌落呈灰白色，边缘波浪状，生长温度范围15-45℃，氧化酶和过氧化氢酶阳性，能水解淀粉。细胞壁肽聚糖含有二氨基庚酸，主要的甲基萘醌为MK-7，主要的脂肪酸组分有iso-C15:0和C17:0。DNA的G+C含量为36.5mol％。
本发明兵马俑芽胞杆菌HMD9161的16S rRNA序列为：SEQ ID NO：1。
本发明的另一个目的在于提供上述兵马俑芽胞杆菌HMD9161或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂。
一种能用于盐碱地土壤修复的菌种制剂，所述的菌种制剂为兵马俑芽胞杆菌HMD9161菌粉(即固体菌剂)，与有机肥或农家肥按质量比1.5～3:1000混合使用。
该固体菌剂在使用时以3～10千克/亩的标准底施或追施，使用过程中避免与杀虫剂一起使用。
本发明的另一技术方案，一种能用于盐碱地土壤修复的菌种制剂，所述的菌种制剂为兵马俑芽胞杆菌HMD9161的菌悬液或其培养液或其发酵液与有机肥或农家肥按体积比15～30:1000使用。
上述液体菌剂在使用时以30～100升/亩底施或追施。
所述的有机肥为市场上销售的普通有机肥产品，所述的农家肥为羊粪、猪粪和牛粪等。
上述含有兵马俑芽胞杆菌HMD9161固体菌剂有效活菌数为10亿cfu/g；液体菌剂有效活菌数为2亿cfu/g。
本发明还提供了所述的兵马俑芽胞杆菌HMD9161在修复盐碱地土壤方面的应用，具体为将兵马俑芽胞杆菌HMD9161的菌悬液或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂与有机肥或农家肥混合后底施或追施来实现。
同时上述含有兵马俑芽胞杆菌HMD9161的菌种制剂在修复盐碱地土壤方面的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果为：
由于盐碱地土壤的高盐和碱性特点，许多作物不能在盐碱地上种植或生长不好，需要进行修复改良，需要进行排水、灌溉洗盐、培肥改良、平整土地和化学改良等，然后种植作物。其中，微生物和有机肥的利用对于改良作用很大，但可以应用于盐碱地改良的耐盐微生物不多。本发明从盐碱地分离到一种能够耐盐能力很强的兵马俑芽胞杆菌HMD9161，其菌剂可以在盐碱地环境生长很好改良盐碱地的微生态，与有机肥配合使用对盐碱地的改良相关效果明显，能够降低土壤盐度、pH值，提高作物产量。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例中，对本发明实技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1兵马俑芽胞杆菌HMD9161的分离与鉴定
1)兵马俑芽胞杆菌HMD9161的分离
本实施例分离土壤采自山东德州陵县中国农业科学院实验基地的盐渍土壤(37°34'N 116°49'E)。采用五点取样法，即先确定对角线的中点作为中心抽样点，再在对角线上选择四个与中心样点距离相等的点作为样点。对地块1000m2的改良耕作土壤小区进行采样，取距地面15-20cm的表层土壤进行检测。将采集到的土样分装于样品袋中并记录，及时送回实验室。
称取土壤5g，加入到盛有45ml无菌生理盐水的三角瓶中(含玻璃珠)，30℃，180rpm恒温摇床中振荡20min使土壤分散均匀。在无菌操作台中依次制备不同稀释浓度的土壤溶液，如10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7g/ml。吸取10-3-10-7稀释度的土壤溶液0.1ml，用涂布棒均匀涂布到NA固体培养基平板上，每个样品设置3-5个重复，倒置于恒温培养箱中培养，NA培养基于30℃，2-5天中观察平板上菌体生长情况，记录平板表面菌落数量和生长情况，将平板上生长的单菌落四区划线法接种于新的平板上，直至菌株为纯菌。
2)兵马俑芽胞杆菌HMD9161的鉴定
分离纯化的菌株，经过16S rRNA基因扩增以及PCR扩增，经由测序公司进行测序拼接，结果在Ezbiocloud网站上比对鉴定得到菌株的种属名为Bacillus bingmayongensis。将分离得到的菌株在显微镜下观察，革兰氏染色阳性(G+)，细胞形状为杆状，细胞大小为长1.6-3.3μm、宽1.1-1.8μm。产孢。在TSA平板上生长的菌落呈灰白色，边缘波浪状，生长温度范围15-45℃。将菌株穿刺接种到牛肉膏蛋白胨半固体培养基，得到该菌株为需氧、运动型。
对菌株进行接触酶试验，牛肉膏蛋白胨培养基斜面，37度培养24h，滴3％过氧化氢，观察气泡产生情况，结果为过氧化氢酶阳性。氧化酶试验按照《伯杰细菌鉴定手册》进行，表明氧化酶阳性。
菌株的淀粉水解情况，在淀粉培养基的平板上划线接种，37℃培养24h，加入少量Lugol's碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察菌苔周围是否有透明圈出现。结果为水解淀粉。
细胞壁成分分析，收集细胞，水浴灭活，分离肽聚糖，然后测定糖成分和脂肪酸成分。结果显示细胞壁肽聚糖含有二氨基庚酸，主要的甲基萘醌为MK-7，主要的脂肪酸组分有iso-C15:0和C17:0。
耐逆性测定，接种到不同PH值、不同浓度NaCl，以及不同浓度的PEG6000的牛肉膏蛋白胨培养基，得到生长范围为4.0到10.0，最适生长pH值为7.0；对NaCl(w/v)的耐受范围0-6％，最适的NaCl(w/v)生长浓度为0.5％；能够在含有30％的PEG6000的培养基中良好生长。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，该菌株16S rRNA基因扩增片段大小约为1332bp，测得的序列如SEQ ID NO：1所示，系统发育分析显示菌株HMD9161和Bacillus bingmayongensis相似度99.55％。基于该菌的理化性质和16S rRNA基因系统发育树，可以确定该菌为兵马俑芽孢杆菌。
基于以上特征，将菌株HMD9161鉴定为兵马俑芽孢杆菌(Bacillusbingmayongensis)。该菌株于2017年11月6日寄存于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No.60269。
实施例2
本发明提供的含有兵马俑芽胞杆菌HMD9161的菌种制剂，可用于盐碱地土壤修复，提高盐碱地种植作物产量。方法为：本品菌粉(1000亿cfu/g)与有机肥或农家肥按质量比1.5～3:1000比率混合，3～10千克/亩底施或追施(使用过程中避免与杀虫剂一起使用)。本品发酵液按体积质量比15～30:1000比率混合，30～100升/亩底施或追施。可改良盐碱地土壤，降低盐度、降低pH值，提高作物产量和品质。
表1 粉剂与有机肥混合有效活菌数检测
Figure GDA0001805171420000061
表2 发酵液与有机肥混合有效活菌数检测
Figure GDA0001805171420000062
Figure GDA0001805171420000071
由表1和表2菌剂与有机肥混合有效活菌数检测结果表明，粉剂/有机肥和发酵液/有机肥分别为在1.5:1000和15:1000的比例以上有效活菌数均可达到1亿cfu/g。
实施例3粉剂与有机肥混合使用对盐碱地土壤和玉米作物产量等的影响
本实施例在盐碱地土壤施用本发明菌剂，以玉米作为作为研究对象，并用化肥作为对照，说明本发明菌剂对土壤的修复效果和对玉米的产量及质量的影响。具体的施肥方法：
对照组：每亩底肥尿素30kg，硫酸钾复合肥40kg；中期追肥复合肥10kg；
实验组1：每亩施粉剂3千克+有机肥1.0吨，尿素20kg，硫酸钾复合肥30kg；中期追肥复合肥10kg；
实验组2：每亩施粉剂5千克+有机肥1.5吨，尿素20kg，硫酸钾复合肥30kg；中期追肥复合肥10kg；
实验组3：每亩施粉剂10千克+有机肥2.5吨，尿素20kg，硫酸钾复合肥30kg；中期追肥复合肥10kg。
表3 粉剂与有机肥混合使用对盐碱地土壤和玉米作物产量等的影响
Figure GDA0001805171420000072
Figure GDA0001805171420000081
结果表明：兵马俑芽胞杆菌粉剂与有机肥混合使用，可应用于对海南盐碱地修复，能够明显降低土壤盐度、pH值，提高玉米作物产量。
实施例4发酵液与有机肥混合使用对盐碱地土壤和玉米作物产量等的影响
本实施例在盐碱地土壤施用本发明菌剂，以玉米作为作为研究对象，并用化肥作为对照，说明本发明菌剂对土壤的修复效果和对玉米的产量及质量的影响。具体的施肥方法：
对照组：每亩底肥尿素30kg，硫酸钾复合肥40kg；中期追肥复合肥10kg；
实验组1：每亩底施发酵液30升+有机肥1.0吨，尿素20kg，硫酸钾复合肥30kg；中期追肥复合肥10kg；
实验组2：每亩施发酵液50升+有机肥1.5吨，尿素20kg，硫酸钾复合肥30kg；中期追肥复合肥10kg；
实验组3：每亩发酵液100升+有机肥2.5吨，尿素20kg，硫酸钾复合肥30kg；中期追肥复合肥10kg。
表4 发酵液与有机肥混合使用对盐碱地土壤和玉米作物产量等的影响
Figure GDA0001805171420000082
结果表明：兵马俑芽胞杆菌发酵液与有机肥混合使用，可应用于对海南盐碱地修复，能够明显降低土壤盐度、pH值，提高玉米作物产量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 一种兵马俑芽胞杆菌HMD9161及其菌剂和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1332
<212> DNA
<213> 兵马俑芽胞杆菌(Bacillus bingmayongensis)
<400> 1
cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 60
agcgattcca gcttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aacggtttta 120
tgagattagc tccacctcgc ggtcttgcag ctctttgtac cgtccattgt agcacgtgtg 180
tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 240
accggcagtc accttagagt gcccaactta atgatggcaa ctaagatcaa gggttgcgct 300
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 360
tcactctgcc cccgaagggg aagccctatc tctagggttg tcagaggatg tcaagacctg 420
gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 480
gtcaattcct ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt 540
taacttcagc actaaagggc ggaaaccctc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg 600
gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcgcctcag tgtcagttac 660
agaccagaaa gtcgccttcg ccactggtgt tcctccatat ctctacgcat ttcaccgcta 720
cacatggaat tccactttcc tcttctgcac tcaagtctcc cagtttccaa tgaccctcca 780
cggttgagcc gtgggctttc acatcagact taagaaacca cctgcgcgcg ctttacgccc 840
aataattccg gataacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 900
cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt gccagcttat tcaactagca cttgttcttc 960
cctaacaaca gagttttacg acccgaaagc cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca 1020
gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt 1080
ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgtcg ccttggtgag 1140
ccgttacctc accaactagc taatgcgacg cgggtccatc cataagtgac agccgaagcc 1200
gcctttcaat ttcgcaccat gaggtgcaaa atattatccg gtattagccc cggtttcccg 1260
gagttatccc agtcttatgg gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc gccgctaact 1320
tcataagagt ca 1332

Claims (7)

1.一种用于修复盐碱地的兵马俑芽胞杆菌（Bacillus bingmayongensis）HMD9161，其特征在于，该菌株已于2017年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo. 60269。
2.权利要求1所述的兵马俑芽胞杆菌HMD9161的制剂，其特征在于，所述的制剂为兵马俑芽胞杆菌HMD9161菌粉，有效活菌数为10亿cfu/g。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述的制剂在使用时以3～10千克/亩的标准底施或追施，与有机肥或农家肥按质量比1.5～3:1000混合使用。
4.权利要求1所述的兵马俑芽胞杆菌HMD9161的制剂，其特征在于，所述的制剂为兵马俑芽胞杆菌HMD9161的菌悬液或其培养液或其发酵液，有效活菌数为2亿cfu/g。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述的制剂在使用时以30～100升/亩底施或追施，与有机肥或农家肥按体积比15～30:1000混合使用。
6.权利要求1所述的兵马俑芽胞杆菌HMD9161在修复盐碱地土壤方面的应用。
7.权利要求2~5中任一项所述的制剂在修复盐碱地土壤方面的应用。
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