CN105063126B - 一种花生壳制备细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生壳制备细菌纤维素的方法，包括配制发酵培养基、接种菌株和静态发酵步骤。具体步骤如下：将花生壳干燥粉碎后，加入稀硫酸酸解，过滤后加入氢氧化钙进行脱毒，再次过滤，加入活性炭进行脱色、过滤即得花生壳酸解液，将花生壳酸解液配制成培养基，高温灭菌，冷却后过滤得发酵培养基，再次高温灭菌，接入木醋杆菌种子液，动态培养得到细菌纤维素。本发明利用廉价的农作物的副产物花生壳做原料，用生物发酵的方法制备出了高附加值的细菌纤维素，制备过程简单，后处理过程相对简单，不仅扩大了花生壳再利用的范围，而且能为工业化生产提供良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于细菌纤维素的制备技术领域，特别涉及一种花生壳制备细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素是由微生物合成的一种生物纳米材料。与植物纤维相比，细菌纤维素具有纯度高、结晶度高、持水量高、良好的生物相容性和可生物降解等优良特点，因此在造纸、食品工业、膜材料、化妆品及医用敷料等领域有着广阔的应用。但是细菌纤维素的高生产成本限制了它的工业规模，因此降低细菌纤维素的成本是当前大规模生产的一个亟待解决的问题。降低培养基中氮源的成本是降低细菌纤维素高成本的一个主要方法。
花生壳是农作物的副产品，我国该类副产物约有2.4亿吨，花生壳成分是纤维素、半纤维素、木质素和粗蛋白质，其中粗蛋白质的含量接近10％。在高酸度条件下，纤维素可以水解成葡萄糖，半纤维素可以水解成戊糖和己糖；而在低酸浓度条件下，粗蛋白质则可以水解成氨基酸，水解产物中的氨基酸可以被醋酸杆菌利用来生成细菌纤维素。但是由纤维素水解成糖类需要的酸浓度较大，使得酸解液的处理过程较为麻烦，加大废液后处理的费用。因此，必须降低在酸解过程中的酸用量，将花生壳在发酵过程中以氮源的形式加以利用，以扩大花生壳再利用的范围。目前花生壳的利用形式有很多，比较普遍的有制备吸附剂、平菇培养基、活性炭，制备酸解液用于发酵的报道很少。目前国内外也没有用其酸解液用作氮源培养细菌纤维素的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用花生壳作为氮源、制备细菌纤维素的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种花生壳制备细菌纤维素的方法，包括配制发酵培养基、接种菌株和静态发酵步骤，其中，配制发酵培养基时加入花生壳酸解液。
所述的花生壳酸解液的制备过程如下：首先将花生壳干燥后粉碎，然后在花生壳粉末中加入稀硫酸，117℃～123℃下酸解1～2h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至10～11进行脱毒1～2h，然后过滤，调节滤液pH至5～6，最后脱色并过滤，即得花生壳酸解液，其中，花生壳粉末与稀硫酸的质量体积比为1：10～12，稀硫酸的体积分数为1.4％～1.6％。
所述花生壳粉末的细度为30目以上。
所述脱色为活性炭脱色。
所述的发酵培养基的配制如下：在花生壳酸解液中加入葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾和乳酸钙，高温灭菌，冷却后过滤即得发酵培养基，其中，葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾、乳酸钙与花生壳酸解液的质量体积比分别为2.5％、2.7％、0.05％、0.06％、0.6％和0.02％。
所述的菌株接种与动态培养为将发酵培养基再次高温灭菌后，接入木醋杆菌种子液，动态培养5～6d，其中木醋杆菌种子液的体积为发酵培养基的8％～12％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)以通常焚烧或丢弃处理的农作物副产物——花生壳为原料，不仅减少了环境污染，而且以花生壳作为一种廉价氮源，有利于工业化低成本规模生产细菌纤维素；(2)以低浓度硫酸酸解花生壳，避免了现有技术中高浓度硫酸的使用，简化了制备工艺和废液处理过程；(3)采用的酸解原料是预处理后的花生壳，直接酸解，无需经过离子液体预处理，在保持原料的疏松结构的同时，有利于稀酸的接触，节省工序，节约了人力和财力；(4)相比于以硫酸铵、蛋白胨和酵母浸粉为单独的氮源，花生壳酸解液培养得到的细菌纤维素的产量最高，且结晶度较低。
附图说明
图1是本发明花生壳制备细菌纤维素的流程图。
图2是实施例1制备的细菌纤维素的外观形态。
图3是实施例1制备的细菌纤维素的红外图。
图4是实施例2制备的细菌纤维素的X-射线衍射图。
图5是实施例3制备的细菌纤维素的扫描电镜图。
图6是实施例8制备的细菌纤维素的产量对比图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面结合具体实施方式及附图对本发明作进一步说明。
结合图1，本发明的一种花生壳制备细菌纤维素的方法，具体步骤如下：
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将花生壳置于125℃烘箱中干燥10～12min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，按花生壳粉末与稀硫酸的质量体积比为1:10～12加入体积分数为1.4％～1.6％的稀硫酸，117℃～123℃下酸解1～2h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至10～11进行脱毒1～2h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至5～6，最后脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：按与花生壳酸解液的质量体积比分别为2.5％、2.7％、0.05％、0.06％、0.6％和0.02％加入葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾和乳酸钙，配置成培养基，高温灭菌，冷却后过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的8％～12％的种子液，动态培养5～6d，即得细菌纤维素。
下面结合具体实施例对本发明作详细说明。
实施例1
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥10min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到200mL体积分数为1.6％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入117℃的烘箱中酸解1h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至11进行脱毒1h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至6，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的10％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养5天，即得细菌纤维素。
所得细菌纤维素如图2所示。用傅里叶变换红外光谱仪对所制得的细菌纤维素扫描测定，实验结果见图3。红外光谱结果显示用花生壳酸解液培养木醋杆菌制备得到的细菌纤维素和纯纤维素基本一致。
实施例2
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥12min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到220mL体积分数为1.5％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入117℃的烘箱中酸解2h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至10进行脱毒1.5h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至5，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的12％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养6天，即得细菌纤维素。
将处理备用的细菌纤维素冷冻干燥，用X-射线衍射仪测试，实验结果见图4，可知花生壳酸解液培养得到的细菌纤维素结晶度为12.5％。
实施例3
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥11min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到240mL体积分数为1.4％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入120℃的烘箱中酸解1.5h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至10进行脱毒2h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至5，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的12％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养6天，即得细菌纤维素。
将得到的细菌纤维素冷冻干燥，用电子扫描显微镜观察其形态，实验结果见图5。SEM图显示，用花生壳酸解液培养木醋杆菌制备得到的的细菌纤维素，具有超细的三维网状结构，经过简单修饰，可以扩大细菌纤维素在生物组织工程中的应用范围。
实施例4
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥10min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到240mL体积分数为1.4％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入120℃的烘箱中酸解1h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至10进行脱毒1.5h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至6，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养5天，即得细菌纤维素。
实施例5
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥12min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到200mL体积分数为1.6％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入120℃的烘箱中酸解2h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至11进行脱毒1.5h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至5，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的12％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养6天，即得细菌纤维素。
实施例6
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥11min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到220mL体积分数为1.6％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入123℃的烘箱中酸解1.5h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至11进行脱毒1h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至6，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的10％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养5天，即得细菌纤维素。
实施例7
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥10min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到220mL体积分数为1.4％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入123℃的烘箱中酸解2h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至10进行脱毒1h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至5，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的12％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养5天，即得细菌纤维素。
实施例8
1.以花生壳酸解液为氮源制备细菌纤维素
步骤1、花生壳酸解液的制备：首先将40g花生壳置于125℃烘箱中干燥11min，然后用球磨机粉碎后过30目筛，将20g花生壳粉末加入到240mL体积分数为1.5％的稀硫酸中，搅拌均匀，放入120℃的烘箱中酸解1h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至11进行脱毒2h，然后过滤，用2.5M的硫酸调节滤液pH至6，最后先后两次分别加入8g活性炭进行脱色并过滤，即得花生壳酸解液；
步骤2、发酵培养基的配制：取100mL花生壳酸解液，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌10min后，放入冷柜冷却至4℃，迅速过滤即得发酵培养基；
步骤3、菌株接种与动态培养：将发酵培养基再次高温灭菌后接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养6天，即得细菌纤维素。
2.以硫酸铵为氮源制备细菌纤维素
取100mL去离子水，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.3g硫酸铵、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌20min后，接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养6天，即得细菌纤维素。
3.以蛋白胨为氮源制备细菌纤维素
取100mL去离子水，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.5g蛋白胨、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌20min后，接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养6天，即得细菌纤维素。
4.以酵母浸粉为氮源制备细菌纤维素
取100mL去离子水，依次加入2.5g葡萄糖、2.7g蔗糖、0.5g酵母浸粉、0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾和0.02g乳酸钙，配置成培养基，121℃灭菌20min后，接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、160rpm条件下动态培养6天，即得细菌纤维素。
用去离子水清洗培养得到的细菌纤维素，在100℃的烘箱里烘至恒重，经分析天平称重，得到细菌纤维素的干重，实验结果见图6。其中，以硫酸铵为氮源的产量为0.1120g，以蛋白胨为氮源的产量为0.2870g，以酵母浸粉为氮源的产量为0.2580g，以花生壳酸解液为氮源的产量为0.4210g。显然地，花生壳酸解液培养得到的细菌纤维素产量要比以硫酸铵、蛋白胨和酵母浸粉作氮源得到的细菌纤维素产量高。该实验结果表明，与分别以硫酸铵、蛋白胨和酵母浸粉做单独氮源相比，花生壳酸解液中的氮源更有利于细菌纤维素的合成，因此通过稀酸酸解花生壳这种方法得到的氮源是一种优质的氮源。
Claims (6)
1.一种花生壳制备细菌纤维素的方法，包括配制发酵培养基、菌株接种与动态培养步骤，其特征在于，配制发酵培养基时加入花生壳酸解液，所述花生壳酸解液的制备过程如下：首先将花生壳干燥后粉碎，然后在花生壳粉末中加入稀硫酸，117℃～123℃下酸解1～2h后过滤，之后加入氢氧化钙调节pH至10～11进行脱毒1～2h，然后过滤，调节滤液pH至5～6，最后脱色并过滤，即得花生壳酸解液，其中，花生壳粉末与稀硫酸的质量体积比为1：10～12，稀硫酸的体积分数为1.4％～1.6％。
2.如权利要求1所述的花生壳制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述花生壳的干燥温度为125℃，干燥时间为10～12min。
3.如权利要求1所述的花生壳制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述花生壳粉末的细度为30目以上。
4.如权利要求1所述的花生壳制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述脱色为活性炭脱色。
5.如权利要求1所述的花生壳制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的配制如下：在花生壳酸解液中加入葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾和乳酸钙，高温灭菌，冷却后过滤即得发酵培养基，其中，葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾、乳酸钙与花生壳酸解液的质量体积比分别为2.5％、2.7％、0.05％、0.06％、0.6％和0.02％。
6.如权利要求1所述的花生壳制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的菌株接种与动态培养为将发酵培养基再次高温灭菌后，接入木醋杆菌种子液，动态培养5～6d，其中木醋杆菌种子液的体积为发酵培养基的8％～12％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |