CN113073121B - 一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料及高聚合度多聚磷酸盐的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料的制备方法，包括如下步骤：(1)发酵活性菌株；(2)菌泥预处理；(3)高温烧制；(4)研磨，得到富含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料。将所述纳米碳材料经过，溶解抽提，冻干过程，得到混合的多聚磷酸盐粗品。本发明得到无内毒素、富含polyPn的生物纳米碳材料，具有高生物活性优点，可应用于医疗、日化、食品等领域；该制备工艺流程简单、提取效率高、生产成本低。

Description

一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料及高聚合度多聚磷酸盐的制备方法
技术领域
本发明涉及生物功能材料技术领域，尤其是涉及一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料及高聚合度多聚磷酸盐的制备方法。
背景技术
多聚磷酸盐(polyphosphates，polyPn)是一种由数十至数千个磷酸基团经高能磷酸键连接形成的线性无机多聚物(如图1所示)。polyPn最初是在火山岩浆和深海中发现，高温使得磷矿脱水熔融形成polyPn，后续研究发现polyPn存在于所有生物体中，从细菌、真菌到高等哺乳动物体内polyPn均发挥重要作用。1957年诺贝尔奖得主Arthur Kornberg教授发现polyPn这种古老又保守的生物聚合物是由细胞内酶促反应合成，哺乳动物细胞中polyPn聚合度约为60-100，原核细胞中polyPn聚合度可达到1000。近年来，研究者发现这种无机多聚物在高等哺乳动物中有着多样的生理功能，高聚合度polyPn不仅作为生物体中重要的生物能和磷酸基团供应者，还诱导细胞增殖分化、细胞钙化，促进血液凝结、骨骼再生。
德国约翰古登堡大学Werner E.G.Muller教授团队将polyP40与Ca2+、Mg2+、Sr2+熬合，并添加胶原蛋白、海藻酸盐、水凝胶成分可制成膏体或固体支架，polyPn成分的膏体可促进角质细胞生长并对伤口愈合、创伤修复有调节作用；polyPn成分的支架可作为骨科植入物用于骨骼修复，并展现出更好的生物相容性、促成骨功效。此外，专利CN 103687582 B中公开了一种酵母细胞抽提高聚合polyPn(n<300)的方法并作为有效成分开发育发剂、化妆品、口腔清洁剂。
尽管polyPn在医学以及生物科学研究中越来越重要，但该无机聚合物的合成与制备技术并不发达。化学合成polyPn方法需高温熔融，得到低聚合度polyPn(n<10)，该工艺具有能耗大、成本高、产物聚合度低等弊端；生物合成polyPn方法反应条件温和、生产成本低、可利用废弃磷源直接合成天然的高聚合度polyPn(n>10)。积磷小月菌工程菌(CN105368838 A)、约氏不动杆菌(CN 109022328 A)、转基因聚球藻(CN 106916775 A)、弗氏柠檬酸杆菌(CN 104531599 B)在好氧条件下可聚合胞外游离磷形成polyPn储存在体内，但专利中未说明polyPn的聚合度以及polyPn的分离制备方法。酵母细胞(CN 103687582 B)中抽提polyPn可得到聚合度20-300的混合产物，但制备得到的polyPn提取液中含有酵母细胞构成成分，包含酵母胞内蛋白质或其他内毒素成分。
虽然polyPn作为重要的多功能生物分子，但经济、环保制备无内毒素polyPn的工业化生产方法还未建立，对polyPn复合生物碳材料生产未有报道。亟待于制备天然的高聚合度多聚磷酸盐材料，并应用医疗、日化、食品领域。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料及无内毒素高聚合度多聚磷酸盐的制备方法。本发明得到无内毒素、富含polyPn的生物纳米碳材料，具有高生物活性优点，可应用于医疗、日化、食品等领域；该制备工艺流程简单、提取效率高、生产成本低。
本发明的技术方案如下：
一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)发酵活性菌株，活化转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌，接种于含磷培养基中并在生物反应器中培养，制得发酵液，发酵液浓缩后收集菌泥；
(2)菌泥预处理，将步骤(1)所得菌泥加入无菌超纯水重悬洗涤，5000-7000rpm离心10-20min，将收集的菌泥脱水干燥1-2天；
(3)高温烧制，将经过步骤(2)处理的菌泥放置于刚玉坩埚中，300-800℃烧制1-6h，自然冷却至室温，制得碳化菌泥；
(4)研磨，将步骤(3)制得的碳化菌泥置于生物样品均质仪中研磨1-2h，得到富含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料。
步骤(1)中，菌株活化方法为：LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h；按1％接种量接种至500mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h。
步骤(1)中，生物反应器培养的方法为：将LB液体培养基中的菌泥于5000-7000rpm、4℃离心收集，无菌超纯水洗涤后并接种于22L的含磷培养基中，并利用生物反应器于20-37℃条件下曝气培养15-30h，菌液经生物反应器中5块0.1μm的PVDF平板膜元件浓缩1-2h，得到发酵液。
所述含磷培养基成分为每升含：葡萄糖0.1-0.5g，蛋白胨0.05-0.3g，酵母粉0.01-0.1g，无水乙酸钠0.05-0.3g，氯化钠0.01-0.3g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，三水合磷酸氢二钾0.045-0.075g，氯化铵0.05-0.5g；所述含磷培养基的含磷量为6-10mg/L。
步骤(2)中，菌泥脱水干燥的方法为菌泥放置于50-80℃高温烘箱中烘干1-2天或预先将菌泥-80℃冷冻1-4h并放置在真空冻干机中冻干1-2天。
步骤(3)中，刚玉坩埚预先烧至质量恒定；烧制在箱式马弗炉或管式炉中进行。
步骤(4)中，生物样品均质仪的研磨频率为65Hz，研磨时间为1-2h。
一种无内毒素的不同链长混合多聚磷酸盐粗品的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(5)溶解抽提，将上述步骤(4)所得的纳米碳材料溶解在无菌超纯水中，震荡溶解1-6h，之后以8000-12000rpm离心5-20min，收集上清液并经0.22μm水系滤膜过滤，得到多聚磷酸盐水溶液；
(6)制备粗品，将步骤(5)制得的多聚磷酸盐水溶液于-80℃冰箱冷冻1-4h后置于真空冻干机中脱水干燥1-2天，得到混合的多聚磷酸盐粗品。
步骤(5)中，纳米碳材料在无菌超纯水中的浓度为0.2-1g/mL；震荡溶解采用的是放置于摇床中以200-300rpm速度震荡混匀1-6h。
所述转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌替换为转聚磷基因Ppk1大肠杆菌。
本发明有益的技术效果在于：
本发明制备方法流程简单、烧制温度适宜、提取效率高、经济成本低，相比于化学法，该方法无副产物生产，无需高温高压装置，绿色环保，将填补国内制备高聚合度polyPn的工业生产空白；本发明可获得含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料与无内毒素的不同链长混合多聚磷酸盐粗品，polyPn聚合度可达14-150，具有纳米尺寸，渗透性强，生物活性高，满足不同科研与市场需求，可应用于医疗、日化、食品领域，具有重大突出实施效果和商业化价值。
附图说明
图1为高聚合度多聚磷酸盐结构式。
图2为本发明工艺流程图。
图3为实施例1烧制得到的富含多聚磷酸盐的纳米碳材料与实施例2制得的多聚磷酸盐粗品的实物照片。
图4为实施例1研磨后纳米碳材料的扫描电镜照片。
图5为15％TBE-Urea尿素胶检测多聚磷酸盐粗品的聚合度范围。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
本发明中提及的“室温”指代的是15-30℃。
本发明转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌为专利(CN 104531599 B)中菌种。
本发明中发酵菌种是包括但不限于本专利中提及的高效聚合多聚磷酸盐的菌株。
以下实施例与比较例仅用于对本发明进行具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例与比较例。
实施例1
一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：工艺如图2所示；
(1)发酵活性菌株，LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养11h；按1％接种量接种至500mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养11h。
将LB液体培养基中的菌泥于5000rpm、4℃离心10min收集，无菌超纯水洗涤后并接种于22L的含磷培养基中(含磷培养基成分为每升含：葡萄糖0.5g，蛋白胨0.1g，酵母粉0.01g，无水乙酸钠0.3g，氯化钠0.3g，七水合硫酸镁0.5g，三水合磷酸氢二钾0.075g，氯化铵0.5g；所述含磷培养基的含磷量为10mg/L)，并利用生物反应器20℃培养，菌液经生物反应器中5块0.1μm的PVDF平板膜元件浓缩2h，得到浓缩的发酵液，浓缩的发酵液7000rpm离心10min收集菌泥，共计112.8g。
所述生物反应器中培养的条件为：a.预培养3h；b.在生物反应器中以0.5L/min流速加入含磷培养基，以相同速度抽出消耗后的培养基，保持反应器中含磷培养基液面稳定，连续进水、连续抽滤24h；c.生物反应器中培养基的曝气量保持在0.9L/min。
(2)菌泥预处理，将步骤(1)所得菌泥加入无菌超纯水重悬洗涤，7000rpm离心10min，将收集菌泥放置在60℃高温烘箱中烘干2天，干重21.8g。
(3)高温烧制，将经过步骤(2)处理的菌泥放置于刚玉坩埚中，在箱式马弗炉中500℃烧制3h，自然冷却至室温，制得碳化菌泥，共计6g；刚玉坩埚预先烧至质量恒定。
(4)研磨，将步骤(3)制得的碳化菌泥置于生物样品均质仪中研磨2h(均质仪的研磨频率为65Hz)，得到富含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料。其研磨前的外观结构如图3A所示。其研磨后的材料扫描电镜结果如图4所示，由图4可以看出其尺寸为500nm-5μm，具有较高的渗透能力，可用于医疗、日化、食品等领域的产品开发。
实施例2
一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)发酵活性菌株，LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，35℃，220rpm培养12h；按1％接种量接种至500mL LB液体培养基，35℃，220rpm培养12h。
将LB液体培养基中的菌泥于6000rpm、4℃离心15min收集，无菌超纯水洗涤后并接种于22L的含磷培养基中(含磷培养基成分为每升含：葡萄糖0.3g，蛋白胨0.2g，酵母粉0.05g，无水乙酸钠0.15g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.3g，三水合磷酸氢二钾0.06g，氯化铵0.3g；所述含磷培养基的含磷量为8mg/L)，并利用生物反应器30℃培养，菌液经生物反应器中5块0.1μm的PVDF平板膜元件浓缩1.5h，得到浓缩的发酵液，浓缩的发酵液6000rpm离心15min收集菌泥，共计86g。
所述生物反应器中培养的条件为：a.预培养4h；b.在生物反应器中以0.5L/min流速加入含磷培养基，以相同速度抽出消耗后的培养基，保持反应器中含磷培养基液面稳定，连续进水、连续抽滤16h；c.生物反应器中培养基的曝气量保持在0.6L/min。
(2)菌泥预处理，将步骤(1)所得菌泥加入无菌超纯水重悬洗涤，6000rpm离心15min，将收集菌泥预先-80℃冷冻2h并放置在真空冻干机中冻干1天，干重17.2g。
(3)高温烧制，将经过步骤(2)处理的菌泥放置于刚玉坩埚中，在管式炉中700℃烧制2h，自然冷却至室温，制得碳化菌泥，共计4.5g；刚玉坩埚预先烧至质量恒定。
(4)研磨，将步骤(3)制得的碳化菌泥置于生物样品均质仪中研磨1h(均质仪的研磨频率为65Hz)，得到富含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料。
一种无内毒素的不同链长混合多聚磷酸盐粗品的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：工艺如图2所示；
(5)溶解抽提，将前述步骤(4)所得的纳米碳材料溶解在无菌超纯水中(1g/mL)，放置于摇床中以300rpm速度震荡混匀4h，之后以12000rpm离心20min，收集上清液并经0.22μm水系滤膜过滤，得到多聚磷酸盐水溶液。
(6)制备粗品，将步骤(5)制得的多聚磷酸盐水溶液于-80℃冰箱冷冻2h后置于真空冻干机中脱水干燥1天，得到混合的多聚磷酸盐粗品1.256g，该粗品为白色絮状固体，易溶于水，如图3B所示。
用15％TBE-Urea尿素胶检测实施例2中多聚磷酸盐粗品链长，结果如图5所示，日本RegeneTiss公司提供的聚合度14、60、150的polyPn在尿素胶上显示如图所示，本发明多聚磷酸盐粗品在尿素胶上显示为一条长带，聚合度在14到150之间。
实施例3
一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)发酵活性菌株，LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，37℃，180rpm培养10h；按1％接种量接种至500mL LB液体培养基，37℃，180rpm培养10h。
将LB液体培养基中的菌泥于7000rpm、4℃离心10min收集，无菌超纯水洗涤后并接种于22L的含磷培养基中(含磷培养基成分为每升含：葡萄糖0.2g，蛋白胨0.05g，酵母粉0.01g，无水乙酸钠0.05g，氯化钠0.05g，七水合硫酸镁0.2g，三水合磷酸氢二钾0.045g，氯化铵0.05g；所述含磷培养基的含磷量为6mg/L)，并利用生物反应器37℃培养，菌液经生物反应器中5块0.1μm的PVDF平板膜元件浓缩2h，得到浓缩的发酵液，浓缩的发酵液7000rpm离心10min收集菌泥，共计108g。
所述生物反应器中培养的条件为：a.预培养5h；b.在生物反应器中以0.5L/min流速加入含磷培养基，以相同速度抽出消耗后的培养基，保持反应器中含磷培养基液面稳定，连续进水、连续抽滤20h；c.生物反应器中培养基的曝气量保持在0.8L/min。
(2)菌泥预处理，将步骤(1)所得菌泥加入无菌超纯水重悬洗涤，5000rpm离心20min，将收集菌泥预先-80℃冷冻3h并放置在真空冻干机中冻干2天，干重20.9g。
(3)高温烧制，将经过步骤(2)处理的菌泥放置于刚玉坩埚中，在管式炉中300℃烧制4h，自然冷却至室温，制得碳化菌泥，共计5.6g；刚玉坩埚预先烧至质量恒定。
(4)研磨，将步骤(3)制得的碳化菌泥置于生物样品均质仪中研磨1.5h(均质仪的研磨频率为65Hz)，得到富含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料。
一种无内毒素的不同链长混合多聚磷酸盐粗品的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(5)溶解抽提，将上述步骤(4)所得的纳米碳材料溶解在无菌超纯水中(0.5g/mL)，放置于摇床中以200rpm速度震荡混匀6h，之后以10000rpm离心20min，收集上清液并经0.22μm水系滤膜过滤，得到多聚磷酸盐水溶液。
(6)制备粗品，将步骤(5)制得的多聚磷酸盐水溶液于-80℃冰箱冷冻4h后置于真空冻干机中脱水干燥1天，得到混合的多聚磷酸盐粗品1.027g。
比较例1
(1)高温烧制：同实施例2相同操作获得等同重量冻干菌泥经管式炉700℃高温烧制2h，自然冷却至室温，得到碳化菌泥。
(2)研磨：将碳化菌泥利用研钵研杵进行手动研磨，研磨颗粒大，研磨固体不细腻。
(3)溶解抽提：将前述步骤(2)所得的纳米碳材料溶解在无菌超纯水中(1g/mL)，放置于摇床中以300rpm速度震荡混匀4h，之后以12000rpm离心20min，收集上清液并经0.22μm水系滤膜过滤，得到多聚磷酸盐水溶液。
(4)制备粗品：步骤(3)中多聚磷酸盐水溶液于-80℃冰箱冷冻2h后放置在真空冻干机中脱水干燥1天，得到无内毒素的不同链长混合的多聚磷酸盐粗品只有0.2g。
实施例2与比较例1对比说明研磨工艺对于polyPn粗品得率有很大影响，本专利工艺采用生物样品均质仪进行样品研磨，具有更好的polyPn溶出效果，使得制备的polyPn粗品产量提高。
Figure BDA0003007403780000071
Figure BDA0003007403780000081
比较例2
(1)高温烧制：同实施例2相同操作获得的等同重量冻干菌泥经管式炉1000℃高温烧制4h，自然冷却至室温，得到碳化菌泥。
(2)研磨：将步骤(1)制得的碳化菌泥置于生物样品均质仪中研磨1h(均质仪的研磨频率为65Hz)。
(3)溶解抽提：将前述步骤(2)所得的纳米碳材料溶解在无菌超纯水中(1g/mL)，放置于摇床中以300rpm速度震荡混匀4h，之后以12000rpm离心20min，收集上清液并经0.22μm水系滤膜过滤，得到多聚磷酸盐水溶液。
(4)制备粗品：步骤(3)中多聚磷酸盐水溶液于-80℃冰箱冷冻2h后放置在真空冻干机中脱水干燥1天，得到无内毒素的不同链长混合的多聚磷酸盐粗品0.675g，该粗品为无色透明粘稠液体，水溶性差。
实施例2与比较例2对比说明烧制温度与烧制时间对于polyPn粗品溶出状态与溶出量有关，本专利权利要求书中的烧制工艺为最优工艺，得到的polyPn粗品水溶性好，产量高，有利于后续polyPn在医疗、日化、食品等领域的产品开发。
烧制工艺 产品溶出状态 产品溶解性 <![CDATA[polyP<sub>n</sub>粗品产量]]>
700℃高温烧制2h 白色絮状固体 易溶于水 1.256g
1000℃高温烧制4h 无色透明粘稠液体 不易溶于水 0.675g
本公司生产的polyPn粗品聚合度高达150，具有更高的生物活性，可满足不同科研与市场需求，并应用于医疗、日化、食品领域。
本发明首次对高效聚磷菌株中的无机多聚阴离子—多聚磷酸盐(polyPn)提供一种分离制备方法，该工艺流程简单，提取效率高，经济环保；本发明可获得高聚合度多聚磷酸盐纳米生物碳材料与无内毒素的不同链长混合多聚磷酸盐粗品，聚合度可达到150，渗透性强，生物活性高，满足不同科研与市场需求，可应用于医疗、日化、食品领域。本发明对制备无内毒素polyPn的工业化生产方法进行建立，并发明一种全新的polyPn纳米生物碳材料。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种无内毒素的不同链长混合多聚磷酸盐粗品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)发酵活性菌株，活化转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌，接种于含磷培养基中并在生物反应器中培养，制得发酵液，发酵液浓缩后收集菌泥；
(2)菌泥预处理，将步骤(1)所得菌泥加入无菌超纯水重悬洗涤，5000-7000rpm离心10-20min，将收集的菌泥脱水干燥1-2天；菌泥脱水干燥的方法为菌泥放置于50-80℃高温烘箱中烘干1-2天或预先将菌泥-80℃冷冻1-4h并放置在真空冻干机中冻干1-2天；
(3)高温烧制，将经过步骤(2)处理的菌泥放置于刚玉坩埚中，300-800℃烧制1-6h，自然冷却至室温，制得碳化菌泥；
(4)研磨，将步骤(3)制得的碳化菌泥置于生物样品均质仪中研磨1-2h，得到富含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料；
(5)溶解抽提，将步骤(4)所得的纳米碳材料溶解在无菌超纯水中，震荡溶解1-6h，之后以8000-12000rpm离心5-20min，收集上清液并经0.22μm水系滤膜过滤，得到多聚磷酸盐水溶液；
(6)制备粗品，将步骤(5)制得的多聚磷酸盐水溶液于-80℃冰箱冷冻1-4h后置于真空冻干机中脱水干燥1-2天，得到混合的多聚磷酸盐粗品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，菌株活化方法为：LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h；按1％接种量接种至500mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，生物反应器培养的方法为：将LB液体培养基中的菌泥于5000-7000rpm、4℃离心收集，无菌超纯水洗涤后并接种于22L的含磷培养基中，并利用生物反应器于20-37℃条件下曝气培养15-30h，菌液经生物反应器中5块0.1μm的PVDF平板膜元件浓缩1-2h，得到发酵液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含磷培养基成分为每升含：葡萄糖0.1-0.5g，蛋白胨0.05-0.3g，酵母粉0.01-0.1g，无水乙酸钠0.05-0.3g，氯化钠0.01-0.3g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，三水合磷酸氢二钾0.045-0.075g，氯化铵0.05-0.5g；所述含磷培养基的含磷量为6-10mg/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，刚玉坩埚预先烧至质量恒定；烧制在箱式马弗炉或管式炉中进行。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，生物样品均质仪的研磨频率为65Hz，研磨时间为1-2h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，纳米碳材料在无菌超纯水中的浓度为0.2-1g/mL；震荡溶解采用的是放置于摇床中以200-300rpm速度震荡混匀1-6h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转聚磷基因Ppk1弗氏柠檬酸杆菌替换为转聚磷基因Ppk1大肠杆菌。
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