CN102911974A - 枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，是以枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GXA-28，保藏编号为CCTCCNO：M2012347的菌株通过菌种活化、保藏、种子液制备、液体摇瓶发酵、γ-聚谷氨酸提取纯化制备γ-聚谷氨酸。本发明可广泛使用廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用，在40~50℃的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸，发酵时间18~25h，产量最高可达20~30g/l，生产速率可达0.9~1.3g/l?h，具有高效、低成本的优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及到一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(Poly(γ-glutamic acid),γ-PGA)是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基聚合而成的一种独特的生物高分子。1937年由Ivánovics等人首先在炭疽芽胞杆菌荚膜中发现(Ivánovics and Bruckner 1937;Ivánovics and Erdōs1937)；并在1942年被证实可作为发酵产物由枯草芽孢杆菌分泌至液体培养基中（Bovamick1942）。由此，枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌被作为主要的γ-聚谷氨酸产生菌引起了广泛的研究。
γ-聚谷氨酸通常是由500-5000个谷氨酸单体聚合而成，分子量在100-1000kDa之间。γ-聚谷氨酸分子中的谷氨酸残基上带有大量游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子间形成氢键，具有极高的水溶性和吸水保湿性；这些游离羧基同时提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子具有良好的吸附性。除此之外，γ-聚谷氨酸作为一种环境友好型生物高分子，还具有一些独特的优良特性，如可食用、可降解、生物兼容性、对人体和环境无毒害等。因此，其被作为冷冻保护剂、祛苦剂、增稠剂和矿物质吸附剂应用于食品领域；作为药物输送剂、基因载体、医用生物粘合剂应用于医药领域；作为热塑性材料、水凝胶等应用于工业和农业领域；作为金属吸附剂和生物絮凝剂应用于环保领域；作为保湿剂应用于化妆品领域。
γ-聚谷氨酸制备方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成法过程复杂、收率低，工业应用价值不大；酶转化法，由于酶促反应所需的谷氨酰转肽酶在生物体内含量和活力较低，且分离纯化困难，因此制约了酶转化法的发展和应用。微生物合成法由于发酵过程容易控制、产量稳定、提取工艺简单、提取率高以及便于大规模生产等优点，已逐渐成为γ-聚谷氨酸的主要生产方法。尤其是近十年来，国内外对微生物发酵生产γ-聚谷氨酸进行了广泛深入地研究。目前，日本和韩国已进行了工业化试生产。国内开展γ-聚谷氨酸的研究相对较晚，一些科研院校主要对γ-聚谷氨酸产生菌筛选、发酵工艺优化、分批发酵生产等进行了研究，取得了一些可喜的研究成果。
γ-聚谷氨酸经过近二十年的研究和发展，菌种的发酵生产能力得到了较大幅度的提高，关于γ-聚谷氨酸的生产工艺研究，我们查到以下公开文献：
1.申请号：01127287.2，发明名称：γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，通过采用芽孢杆菌属菌株，如枯草芽孢杆菌，地衣芽胞杆菌，在37℃，含碳源、氮源、谷氨酸培养基上培养，生成高活力的γ-谷氨酰转肽酶，酶活力为1-10U/ml，从而可生成高浓度的γ-聚谷氨酸发酵液，进而用溶剂沉淀或化学沉淀法得γ-聚谷氨酸或其盐。
2.申请号：02151746.0，发明名称：利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体，是将枯草芽孢杆菌NX-2在30~37℃，含谷氨酸的培养基中培养，在优化条件下能积累30~50g/lγ-聚谷氨酸，生产效率高达0.8~2.5g·h-1·l-1。
3.申请号：200410010509.0，发明名称：枯草芽孢杆菌及其用于制备γ-聚谷氨酸的方法，是将CGMCC No．1250，在20~40℃，含有碳源、氮源、谷氨酸、MgSO4、NaCl和K2HPO4的培养基中培养，得到发酵液，再将发酵液通过有机溶剂沉淀、透析，得到γ-聚谷氨酸产品。该方法工艺简单，高效价廉，产量高。
4.申请号：200710130248.X，发明名称：一株γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法，是将CGMCC No．2108，在37℃，含有葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠、MgSO4和K2HPO4的培养基中培养，得到发酵液。该方法简便易行，所用培养基的原料来源广泛，价格低廉，有效降低了生产成本，适合大规模的工业化生产。
5.申请号：200810027184.5，发明名称：一种γ-聚谷氨酸的制备方法，是用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PGA-7CCTCC M206102做发酵菌株对发酵培养基进行摇瓶发酵以制备γ-聚谷氨酸，其工艺过程包括斜面菌种活化、菌种的液体活化、摇瓶发酵和摇瓶发酵醪液提取，发酵温度为32~37℃。该发明采用由多种有机氮源和无机氮源相组合的优选的发酵原料，在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产γ-聚谷氨酸最高可达27.3g/l，具有良好的工业化应用前景。
6.申请号：200810150830.7，发明名称：枯草芽孢杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法，是将编号为CCTCC NO：M208044的菌株通过菌种培养保藏、制备种子液、摇瓶液体发酵以及提取γ-聚谷氨酸步骤制备γ-聚谷氨酸，其发酵温度为30~40℃，发酵时间12~48小时。该方法可在低成本的液体培养基中高效合成γ-聚谷氨酸，且方法简单，可操作性强。
7.申请号：201010271196.X，发明名称：一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，是将编号为CGMCC No．4034的菌株通过种子培养、发酵培养、γ-聚谷氨酸的提取步骤制备γ-聚谷氨酸，其发酵温度为30~37℃，发酵时间24~72小时。该发明合成的γ-聚谷氨酸分子量较低（300~400KDa），分子量分布较窄，可适用于低分子量要求的应用领域。
上述查到的专利，存在以下不足之处：其发酵温度必须严格的控制在40℃以下、发酵条件要求高、发酵培养基成分复杂、发酵工艺成本高、发酵周期长、生产效率低等，严重制约了γ-聚谷氨酸发酵工业化的进程。因此，寻找高效、低成本的发酵工艺条件生产γ-聚谷氨酸具有重要的生产意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，本方法是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28，保藏编号CCTCC NO：M 2012347为出发菌株，可广泛使用廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用，在40~50℃的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸，发酵时间18~25h，产量最高可达20~30g/l，生产速率可达0.9~1.3g/l·h，具有高效、低成本的优点。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化、保藏
将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28接于固体斜面培养基上，40~50℃培养8-16h，于2~8℃作短期保藏；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28的保藏编号为CCTCC NO：M 2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；所述固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖8~12g/l，酵母膏3~6g/l，谷氨酸钠3~6g/l，MgSO4·7H2O0.1~0.2g/l，KH2PO40.3~0.5g/l，琼脂10~15g/l，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制；
（2）种子液制备
将上述斜面上1.0cm2的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速160~250rpm，40~50℃培养12~24h至菌株对数生长中期；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10~50g/l，酵母膏2~10g/l，谷氨酸钠5~20g/l，MgSO4·7H2O 0.1~0.5g/l，KH2PO40.5~2g/l，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制；
（3）液体摇瓶发酵
将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量1~10%，摇瓶装液量20~80ml/250ml,摇床转速160~250rpm，40~50℃培养18~25h；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源10~100g/l，氮源2~20g/l，谷氨酸钠10~100g/l，MgSO4·7H2O 0.1~1g/l，KH2PO4 0.5~5g/l，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制；
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化
收集成熟的发酵液，加入3~5倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.22~0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为50~100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30~50%，加入2~4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。
以上所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜中的任意一种或几种混合物。
以上所述氮源为酵母膏、玉米浆、尿素、NaNO3、NH4Cl和(NH4)2SO4中的任意一种或几种混合物。
本发明所获得的γ-聚谷氨酸产品理化性质表征如下：
（1）本发明产品易溶于水，不溶于甲醇、乙醇或丙酮等有机溶剂；
（2）本发明产品茚三酮显色反应呈阴性，盐酸水解产物茚三酮反应呈阳性；盐酸完全水解产物经薄层层析分析，氨基酸组分只有谷氨酸；上述说明本产品为谷氨酸的均聚物；
（3）本发明产品在216nm下具有特征吸收峰，在280nm下无吸收峰；缩二脲显色反应呈阴性；上述说明本产品没有典型的肽链结构；
（4）本发明产品经核磁共振（1H-NMR）和红外光谱检测，图谱结果显示与γ-聚谷氨酸标准品结构相符。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28为出发菌株，可在40~50℃的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸，发酵时间18~25h，产量最高可达20~30g/l，生产速率可达0.9~1.3g/l·h，这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。
2.本发明可广泛使用廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用，这些廉价原料可以满足工业化生产的要求。
附图说明
图1为γ-聚谷氨酸标准品的核磁共振（1H-NMR）图；
图2为本发明的产品γ-聚谷氨酸的核磁共振（1H-NMR）图；
图3为γ-聚谷氨酸标准品的红外谱图；
图4为本发明的产品γ-聚谷氨酸的红外谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围，本发明所利用的出发菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28，保藏编号为CCTCC NO：M2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；以下称为CCTCC NO：M2012347。
实施例1~5：
（1）菌种活化、保藏：将CCTCC NO：M2012347接于固体斜面培养基上，45℃培养16h，于4℃作短期保藏；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l，琼脂15g/l，pH值7.0，蒸馏水配制；
（2）种子液制备：将上述斜面上1.0cm2的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速180rpm，45℃培养12h至菌株对数生长中期；液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l，pH值7.0，蒸馏水配制；
（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm，45℃培养22h；其中所述液体发酵培养基浓度组分为：碳源30g/l，酵母膏2.5g/l，谷氨酸钠30g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l,KH2PO4 1g/l,pH值7.0，蒸馏水配制。
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集成熟的发酵液，加入4倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%，加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。
其中所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜，按上述方法经摇瓶发酵后，分析所得发酵液中γ-聚谷氨酸含量如下表1所示。
表1
实施例6~12：
（1）菌种活化、保藏：将CCTCC NO：M2012347接于固体斜面培养基上，45℃培养16h，于4℃作短期保藏；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l，琼脂15g/l，pH值7.0，蒸馏水配制；
（2）种子液制备：将上述斜面上1.0cm2的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速180rpm，45℃培养12h至菌株对数生长中期；液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l，pH值7.0，蒸馏水配制；
（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm，45℃培养22h；其中液体发酵培养基浓度组分为：葡萄糖30g/l，氮源2.5g/l，谷氨酸钠30g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l,KH2PO4 1g/l,pH7.0，蒸馏水配制。
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集成熟的发酵液，加入4倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%，加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。
其中所述氮源为酵母膏、玉米浆、尿素、NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母膏+NH4Cl（质量比1:4），按上述方法经摇瓶发酵后，分析所得发酵液中γ-聚谷氨酸含量如下表2所示。
表2
实施例13
（1）菌种活化：将CCTCC M2012347接于固体斜面培养基上，45℃培养16h，于4℃作短期保藏；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l，琼脂15g/l，pH值6.5，蒸馏水配制；
（2）种子液制备：将上述斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速180rpm，45℃培养12h至菌株对数生长中期；其中所述液体种子培养基浓度组分为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l,pH7.0，蒸馏水配制。
（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm，50℃培养22h；其中液体发酵培养基浓度组分为：葡萄糖30g/l，酵母膏2.5g/l，谷氨酸钠20g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l,KH2PO4 0.5g/l,pH7.0，蒸馏水配制。
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集成熟的发酵液，加入4倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%，加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为17.3±1.1g/l。
实施例14：
（1）菌种活化：将CCTCC M2012347接于固体斜面培养基上，45℃培养16h，于4℃作短期保藏；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l，琼脂15g/l，pH值7.5，蒸馏水配制；
（2）种子液制备：将上述斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速180rpm，45℃培养12h至菌株对数生长中期；其中所述液体种子培养基浓度组分为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l,KH2PO4 0.5g/l,pH7.0，蒸馏水配制。
（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm，45℃培养22h；其中液体发酵培养基浓度组分为：葡萄糖30g/l，酵母膏2.5g/l，谷氨酸钠20g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l,KH2PO4 0.5g/l,pH7.0，蒸馏水配制。
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集成熟的发酵液，加入4倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%，加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为19.9±1.3g/l。
实施例15：
（1）菌种活化：将CCTCC M2012347接于固体斜面培养基上，45℃培养16h，于4℃作短期保藏；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.5g/l，琼脂15g/l，pH值7.0，蒸馏水配制；
（2）种子液制备：将上述斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速180rpm，45℃培养12h至菌株对数生长中期；其中所述液体种子培养基浓度组分为：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠5g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l,KH2PO4 0.5g/l,pH7.0，蒸馏水配制。
（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量5%（v/v），摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm，45℃培养22h；其中所述液体发酵培养基浓度组分为：葡萄糖40g/l，酵母膏2.5g/l，谷氨酸钠40g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l,KH2PO4 1g/l,pH7.0，蒸馏水配制。
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集成熟的发酵液，加入4倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%，加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为33.6±1.5g/l。
实施例16：
与实施例15的不同之处在于：（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量5%（v/v），摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm，42℃培养22h；取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为28.9±1.3g/l。
其余步骤与实施例15相同。
实施例17：
（1）菌种活化：将CCTCC M2012347接于固体斜面培养基上，40℃培养8h，于2℃作短期保藏；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖8g/l，酵母膏3g/l，谷氨酸钠3g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l，KH2PO4 0.3g/l，琼脂10g/l，pH值6.5，蒸馏水配制；
（2）种子液制备：将上述斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速160rpm，40℃培养24h至菌株对数生长中期；其中所述液体种子培养基浓度组分为：葡萄糖20g/l，酵母膏10g/l，谷氨酸钠10g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l,KH2PO4 1g/l,pH6.5，蒸馏水配制。
（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量8%（v/v），摇瓶装液量20ml/250ml,摇床转速160rpm，40℃培养25h；其中液体发酵培养基浓度组分为：葡萄糖10g/l，酵母膏2g/l，谷氨酸钠10g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l,KH2PO4 2g/l,pH6.5，蒸馏水配制。
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集成熟的发酵液，加入3倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.22μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为50KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的40%，加入2倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为8.5±0.7g/l。
实施例18：
（1）菌种活化：将CCTCC M2012347接于固体斜面培养基上，50℃培养10h，于8℃作短期保藏；固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖12g/l，酵母膏6g/l，谷氨酸钠6g/l，MgSO4·7H2O 0.1g/l，KH2PO4 0.4g/l，琼脂12g/l，pH值7.5，蒸馏水配制；
（2）种子液制备：将上述斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速250rpm，50℃培养18h至菌株对数生长中期；其中所述液体种子培养基浓度组分为：葡萄糖50g/l，酵母膏2g/l，谷氨酸钠20g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l,KH2PO4 2g/l,pH7.5，蒸馏水配制。
（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量10%（v/v），摇瓶装液量80ml/250ml,摇床转速250rpm，50℃培养18h；其中液体发酵培养基浓度组分为：葡萄糖100g/l，酵母膏20g/l，谷氨酸钠100g/l，MgSO4·7H2O 1g/l,KH2PO4 5g/l,pH7.5，蒸馏水配制。
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化：收集成熟的发酵液，加入5倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.40μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为80KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的50%，加入4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为30.6±1.2g/l。
Claims (3)
1.一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）菌种活化、保藏
将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28接于固体斜面培养基上，40~50℃培养8-16h，于2~8℃作短期保藏；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXA-28的保藏编号为CCTCC NO：M 2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；所述固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖8~12g/l，酵母膏3~6g/l，谷氨酸钠3~6g/l，MgSO4·7H2O 0.1~0.2g/l，KH2PO4 0.3~0.5g/l，琼脂10~15g/l，pH 值6.5 ~ 7.5，蒸馏水配制；
（2）种子液制备
将上述斜面上1.0cm2的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速160 ~ 250rpm，40 ~ 50℃培养12 ~ 24h至菌株对数生长中期；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10 ~ 50g/l，酵母膏2~ 10g/l，谷氨酸钠5 ~ 20g/l，MgSO4·7H2O 0.1 ~ 0.5g/l，KH2PO4 0.5 ~ 2g/l，pH 值6.5 ~ 7.5，蒸馏水配制；
（3）液体摇瓶发酵
将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量1~10%，摇瓶装液量20 ~ 80ml/250ml, 摇床转速160 ~ 250rpm，40 ~ 50℃培养18 ~ 25h；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源10 ~ 100g/l，氮源2~ 20g/l，谷氨酸钠10 ~ 100g/l，MgSO4·7H2O 0.1 ~ 1g/l，KH2PO4 0.5 ~ 5g/l，pH 值6.5 ~ 7.5，蒸馏水配制；
（4）γ-聚谷氨酸提取纯化
收集成熟的发酵液，加入3 ~ 5倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.22 ~ 0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为50 ~ 100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30 ~ 50%，加入2 ~ 4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜中的任意一种或几种混合物。
3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述氮源为酵母膏、玉米浆、尿素、NaNO3、NH4Cl和(NH4)2SO4中的任意一种或几种混合物。
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