CN101948785B - 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 - Google Patents
一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101948785B CN101948785B CN201010271196XA CN201010271196A CN101948785B CN 101948785 B CN101948785 B CN 101948785B CN 201010271196X A CN201010271196X A CN 201010271196XA CN 201010271196 A CN201010271196 A CN 201010271196A CN 101948785 B CN101948785 B CN 101948785B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gamma
- polyglutamic acid
- acid
- salt
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一株γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PGS-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4034，保藏日期为2010年7月23日。本发明还公开了利用上述γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法。与现有技术相比，本发明的γ-聚谷氨酸产生菌合成的γ-聚谷氨酸分子量较低(300～400KDa)，分子量分布较窄，可适用于低分子量要求的应用领域，因此极具开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物和发酵技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸的合成菌株以及利用其制备低分子量且窄分子量分布的γ-聚谷氨酸及其盐的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，以下简称γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而成的一类均聚氨基酸，可由微生物发酵合成。由于γ-PGA具有极佳的成膜性、成纤维性、可塑性、粘合性、保湿性、生物相容性和可降解性等优异的理化和生物学特性，在工农业、食品与医药等领域极具应用潜力。
目前文献报道的γ-PGA产生菌大多为Bacillus species(如炭疽芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等)，合成的γ-PGA分子量在10～1000KDa之间(AshiuchiM，Misono H.Biopolymers[M].Weinheim：Wiley-VCH，2002，7：123.)，且分子量分布较宽，其多分散系数(Polydispersity：重均分子量Mw/数均分子量Mn)在1.2～5.0之间。高分子量的γ-PGA(1000KDa)作为增稠剂以及制备高吸水性树脂很有用，这类γ-PGA合成菌文献报道较多；较低分子量的γ-PGA(100KDa)用于药物的控缓释载体更为有利，但一直未能筛选到既能高效合成γ-PGA且又适合工业化生产的菌株，其制备只能采用物理或化学降解的方法，工艺繁琐，成本较高；此外，分子量窄分布的γ-PGA更利于其精细化应用。因此如何获得窄分子量分布和低分子量的γ-PGA值得深入开发研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株γ-聚谷氨酸产生菌，该菌株能够发酵合成低分子量且窄分子量分布的γ-PGA。
本发明还要解决的技术问题是提供利用上述γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
申请人从苏南地区高盐、中性土壤中筛选得到一株γ-聚谷氨酸产生菌γ-PGA合成菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGS-1，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏编号为：CGMCC No.4034。保藏日期为：2010年7月23日。该菌株以下简称CGMCC No.4034，其性状特征如下所述。
(1)形态特征
在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.6～1.0×1.2～2.5μm大小的杆菌，37℃培养3～5天形成芽孢，芽孢大小0.6～0.9×1.0～1.5μm，为长圆形或圆柱形。
(2)培养性质
1)牛肉膏、葡萄糖、琼脂培养基平板培养：30～40℃培养1天可大量生长，菌落呈黄白色，表面有褶皱，不透明，不反光，边缘形状不规则。
2)牛肉膏、葡萄糖、琼脂培养基斜面培养：同1)。
3)牛肉膏、葡萄糖液体培养：在液体表面可形成菌膜，培养液略显浑浊。
4)牛肉膏、葡萄糖穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。
(3)生理生化性质：如表1所示
表1 CGMCC No.4034的生理生化性质
(4)16S rDNA序列分析
测得16S rDNA大部分序列1415bp，具体如SEQ ID No.1所示。将所测序列从GenBank数据库中的相关种进行比较，构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明CGMCC No.4034菌株与芽孢杆菌(Bacillus Species)同源性为98.1％，与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源性为99.9％。结合形态、细胞化学成分及16S rDNA全系列分析的系统发育研究结果，可以将菌株CGMCC 4034的分类定位为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGS-1(即CGMCC No.4034)。
菌株CGMCC No.4034可采用如下防水剂保藏：将CGMCC No.4034接于固体培养基斜面，30～37℃培养8～20h，可于2～10℃短期保藏。或将培养好的CGMCC No.4034接入10～50％(v/v)无菌甘油的冻存管中，-40～-80℃冷冻作长期保藏。
利用上述的γ-聚谷氨酸产生菌CGMCC No.4034制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：将经斜面活化的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速150～400r/min，30～37℃下培养3～15h至对数生长期中期；
(2)发酵培养：将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量1～10％(v/v)，摇瓶装液量20～200mL/500mL，摇床转速150～400r/min，30～37℃下培养24～72小时；或者接入含碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机盐和水的无菌发酵培养基的发酵罐中，接种量1～10％(v/v)，通气量0.5～3.0vvm，30～37℃下培养24～72小时；
(3)γ-聚谷氨酸的提取与纯化：①发酵醪液酸化：调发酵醪液pH至2～4；②微滤除菌：采用微滤膜滤除菌体；③超滤浓缩：加入5～20倍体积的蒸馏水稀释，采用超滤膜对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释浓缩步骤2～4次，直至浓缩液体积为原发酵液体积的20～50％；④产物沉淀：超滤浓缩液直接采用低级醇或丙酮进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终制得γ-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩液调pH5.0～7.5，再采用低级醇或丙酮进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终制得γ-聚谷氨酸盐成品。
其中，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；优选葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖中的任意一种或几种任意比例的组合；最优选葡萄糖。氮源为有机氮源，如蛋白胨、牛肉膏、酵母浸汁、玉米浆、玉米粉、黄豆饼粉、尿素，或采用无机氮源NaNO3、KNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、(NH4)2CO3，上述氮源可单独使用也可复配使用；优选蛋白胨、牛肉膏、酵母浸汁和玉米浆中的任意一种或几种任意比例的组合。谷氨酸或谷氨酸盐可以采用添加味精、谷氨酸钠、谷氨酸发酵液、谷氨酸结晶母液和麸酸等含谷氨酸物质中的任一方式。无机盐为NaCl，K2HPO4·3H2O，CaCl2和MgSO4中的任意一种或几种的组合。
其中，种子培养基包含如下浓度的组分：碳源10～100g/L、氮源10～100g/L、谷氨酸或谷氨酸盐10～100g/L、无机盐1～100g/L，其余为水，pH 6.5～7.5；优选的方式是种子培养基包含如下浓度的组分：碳源20～60g/L、氮源15～60g/L、谷氨酸或谷氨酸盐10～50g/L、无机盐1～40g/L，其余为水，pH 6.5～7.5。
其中，发酵培养基包含如下浓度的组分：碳源10～100g/L、氮源10～100g/L、谷氨酸或谷氨酸盐10～150g/L、无机盐1～150g/L，其余为水，pH 6.5～7.5；优选的方式是发酵培养基包含如下浓度的组分：碳源30～80g/L、氮源20～80g/L、谷氨酸或谷氨酸盐10～80g/L、无机盐2～50g/L，其余为水，pH 6.5～7.5。
步骤(3)中，所述的微滤膜孔径为0.22～0.65μm。
步骤(3)中，所述的超滤膜截留分子量为10～100KDa。
步骤(3)中，所述的低级醇为甲醇或乙醇。
步骤(3)中，所述的发酵醪液酸化所用酸为硫酸、盐酸、三氯乙酸、乙酸、甲酸中的一种；调节最终超滤浓缩液pH所用碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2的任意一种，根据用碱类型决定沉淀获得的γ-聚谷氨酸盐类型为钠盐型型、钾盐型、钙盐型。
本发明方法获得的γ-PGA产品理化性质如下：
1)本产品能溶于水，不溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂。
2)本产品茚三酮显色反应呈阴性，高温酸水解后茚三酮显色反应呈阳性。
3)对2)的水解产物采用氨基酸分析仪检测，氨基酸组分只出现一个谷氨酸峰，证明产物为谷氨酸的均聚物。
4)经核磁共振(1H-NMR图略，13C-NMR见图1)与红外(FTIR)图谱检测(图2)，证明本产品与γ-PGA的理论结构相符。
5)室温、中性条件下采用乌氏粘度计测定本γ-PGA产品稀溶液的特性粘度([η])在5-10L/g之间。
6)采用凝胶渗透色谱(GPC)测得的γ-PGA分子量为300～400KDa，分子量分布的多分散系数(Polydispersity：重均分子量Mw/数均分子量Mn)在1.2～2.0之间，GPC图谱如图3所示。
有益效果：
本发明与现有技术相比，具有以下优势：
1)本发明使用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGS-1(CGMCC No.4034)对碳源和氮源的利用较为广泛，特别是可使用较为廉价的糖蜜、淀粉作为碳源，可将无机铵盐作为唯一氮源，而谷氨酸发酵液、谷氨酸结晶母液或麸酸等含谷氨酸物质也可作为谷氨酸的替代组分。这对于实现γ-PGA的工业化生产是极其有利的条件。
2)通过对培养条件的优化，本发明使用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGS-1(CGMCC No.4034)可高效合成γ-PGA，产量最高可达50～60g/L。
3)本发明使用的Bacillus subtilis CGMCC 4034制备的γ-PGA分子量为300～400KDa，分子量分布较窄，多分散系数(Polydispersity：重均分子量Mw/数均分子量Mn)在1.2～2.0之间。这一特性为实现γ-PGA的精细化应用创造了条件。
附图说明
图1为本发明方法制备的γ-PGA产品的13C-NMR谱图。
图2为本发明方法制备的γ-PGA产品的γ-PGA产品红外(FTIR)谱图。
图3为本发明方法制备的γ-PGA产品的γ-PGA产品凝胶渗透色谱(GPC)谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
斜面培养基组分：蛋白胨8g/L，酵母浸汁10g/L，谷氨酸钠10g/L，琼脂20g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，NaCl 10g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，酵母浸汁15g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，CaCl21g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖30g/L，酵母浸汁25g/L，谷氨酸钠20g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
将低温冻存的CGMCC No.4034菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养8h。将经斜面活化的CGMCC No.4034接种于种子培养基，摇床转速200r/min，37℃培养10小时。
将上步获得的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量10％(v/v)，摇瓶装液量100mL/500mL，摇床转速200r/min，37℃培养30小时。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量达16g/L。硫酸调发酵醪液pH至3.0，采用微滤膜(滤膜孔径0.45μm)滤除菌体，再加入10倍蒸馏水稀释，采用超滤膜(截留分子量50KDa)对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2～4次，对最终的浓缩液(体积为原发酵液体积的50％)不调pH或用NaOH调pH6.5，采用3倍体积丙酮进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终相应得到γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量356KDa，分子量分布的多分散系数：1.34)。
实施例2：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，牛肉膏15g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖30g/L，牛肉膏30g/L，谷氨酸钠50g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
将低温冻存的CGMCC No.4034菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养8h。将经斜面活化的CGMCC No.4034接种于种子培养基，摇床转速200r/min，35℃培养12小时。
将上步获得的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量10％(v/v)，摇瓶装液量200mL/500mL，摇床转速150r/min，32℃培养60小时。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量达22g/L。乙酸调发酵醪液pH至2.0，采用微滤膜(滤膜孔径0.22μm)滤除菌体，再加入5倍蒸馏水稀释，采用超滤膜(截留分子量100KDa)对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2～4次，对最终的浓缩液(体积为原发酵液体积的30％)不调pH或用KOH调pH7.5，采用3倍体积甲醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终相应得到γ-PGA(H+型)或γ-PGA钾盐的成品(分子量360KDa，分子量分布的多分散系数：1.41)。
实施例3：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，谷氨酸10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖30g/L，蛋白胨30g/L，谷氨酸70g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
将低温冻存的CGMCC No.4034菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养8h。将经斜面活化的CGMCC No.4034接种于种子培养基，摇床转速300r/min，30℃培养15小时。
将上步获得的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量10％(v/v)，摇瓶装液量50mL/500mL，摇床转速400r/min，30℃培养72小时。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量达28g/L。盐酸调发酵醪液pH至4.0，采用微滤膜(滤膜孔径0.65μm)滤除菌体，再加入20倍蒸馏水稀释，采用超滤膜(截留分子量20KDa)对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2～4次，对最终的浓缩液(体积为原发酵液体积的20％)不调pH或用Ca(OH)2调pH5.0，采用3倍体积乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终相应得到γ-PGA(H+型)或γ-PGA钙盐的成品(分子量365KDa，分子量分布的多分散系数：1.39)。
实施例4：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，玉米浆25g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖30g/L，玉米浆40g/L，谷氨酸钠90g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
种子制备和发酵培养条件：同实施例1。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量为31g/L。并按实施例1进行γ-PGA的提取纯化，获得γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量369KDa，分子量分布的多分散系数：1.53)。
实施例5：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，玉米粉15g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L％，CaCl2 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖50g/L，玉米粉50g/L，谷氨酸钠90g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
种子制备和发酵培养条件：同实施例1。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量为42g/L。并按实施例1进行γ-PGA的提取纯化，获得γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量370KDa，分子量分布的多分散系数：1.55)。
实施例6：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，酵母浸汁15g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖80g/L，酵母浸汁80g/L，谷氨酸钠90g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
种子制备和发酵培养条件：同实施例1。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量为51g/L。并按实施例1进行γ-PGA的提取纯化，获得γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量373KDa，分子量分布的多分散系数：1.46)。
实施例7：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，酵母浸汁5g/L，NH4Cl 10g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖80g/L，酵母浸汁40g/L，NH4Cl 40g/L，谷氨酸钠90g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
种子制备和发酵培养条件：同实施例1。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量为47g/L。并按实施例1进行γ-PGA的提取纯化，获得γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量355KDa，分子量分布的多分散系数：1.36)。
实施例8：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：蔗糖20g/L，酵母浸汁15g/L，谷氨酸钠10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：蔗糖80g/L，酵母浸汁80g/L，谷氨酸钠90g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
种子制备和发酵培养条件：同实施例1。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量为54g/L。并按实施例1进行γ-PGA的提取纯化，获得γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量378KDa，分子量分布的多分散系数：1.40)。
实施例9：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：麦芽糖20g/L，酵母浸汁15g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。。
发酵培养基配制：麦芽糖80g/L，酵母浸汁80g/L，谷氨酸钠90g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。。
种子制备和发酵培养条件：同实施例1。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量为49g/L。并按实施例1进行γ-PGA的提取纯化，获得γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量377KDa，分子量分布的多分散系数：1.52)。
实施例10：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖20g/L，酵母浸汁15g/L，谷氨酸钠10g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L％，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖80g/L，酵母浸汁80g/L，谷氨酸钠90g/L，NaCl 10g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4 1g/L，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。
种子制备：同实施例1。
罐上发酵：将种子液接入5L发酵罐培养基中，接种量10％，发酵罐装液量3.5L/5L，搅拌转速500r/min，通气量0.5vvm，控发酵液pH6.0～7.5，37℃培养30小时。
发酵结束后，检测发酵醪液γ-PGA含量为55g/L。并按实施例1进行γ-PGA的提取纯化，获得γ-PGA(H+型)或γ-PGA钠盐的成品(分子量382KDa，分子量分布的多分散系数：1.50)。
Claims (6)
1.一株γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGS-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4034，保藏日期为2010年7月23日；该γ-聚谷氨酸产生菌所制得的γ-聚谷氨酸分子量为300～400KDa，分子量分布的多分散系数为1.2～2.0。
2.利用权利要求1所述的γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)种子培养：将经斜面活化的CGMCC No.4034菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速150～400r/min，30～37℃下培养3～15h至对数生长期中期；
(2)发酵培养：将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量1～10％(v/v)，摇瓶装液量20～200mL/500mL，摇床转速150～400r/min，30～37℃下培养24～72小时；或者接入含碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机盐和水的无菌发酵培养基的发酵罐中，接种量1～10％(v/v)，通气量0.5～3.0vvm，30～37℃下培养24～72小时；
(3)γ-聚谷氨酸的提取与纯化：①发酵醪液酸化：调发酵醪液pH至2～4；②微滤除菌：采用微滤膜滤除菌体；③超滤浓缩：加入5～20倍体积的蒸馏水稀释，采用超滤膜对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释浓缩步骤2～4次，直至浓缩液体积为原发酵液体积的20～50％；④产物沉淀：超滤浓缩液直接采用低级醇或丙酮进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终制得γ-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩液调pH5.0～7.5，再采用低级醇或丙酮进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终制得γ-聚谷氨酸盐成品；
其中，所制得的γ-聚谷氨酸分子量为300～400KDa，分子量分布的多分散系数为1.2～2.0；
其中，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸汁、玉米浆、玉米粉、黄豆饼粉、尿素、NaNO3、KNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4和(NH4)2CO3中的任意一种或几种任意比例的组合；谷氨酸或谷氨酸盐采用添加味精、谷氨酸钠、谷氨酸发酵液、谷氨酸结晶母液和麸酸等含谷氨酸物质中的任一方式；无机盐为NaCl，K2HPO4·3H2O，CaCl2和MgSO4中的任意一种或几种的组合；
其中，种子培养基包含如下浓度的组分：碳源10～100g/L、氮源10～100g/L、谷氨酸或谷氨酸盐10～100g/L、无机盐1～100g/L，其余为水，pH 6.5～7.5；发酵培养基包含如下浓度的组分：碳源10～100g/L、氮源10～100g/L、谷氨酸或谷氨酸盐10～150g/L、无机盐1～150g/L，其余为水，pH 6.5～7.5。
3.根据权利要求2所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的微滤膜孔径为0.22～0.65μm。
4.根据权利要求2所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的超滤膜截留分子量为10～100KDa。
5.根据权利要求2所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的低级醇为甲醇或乙醇。
6.根据权利要求2所述的利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，其特征在于步骤(3)中，发酵醪液酸化所用酸为硫酸、盐酸、三氯乙酸、乙酸或甲酸；调节最终超滤浓缩液的pH所用碱为NaOH、KOH或Ca(OH)2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010271196XA CN101948785B (zh) | 2010-08-31 | 2010-08-31 | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010271196XA CN101948785B (zh) | 2010-08-31 | 2010-08-31 | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101948785A CN101948785A (zh) | 2011-01-19 |
| CN101948785B true CN101948785B (zh) | 2012-06-13 |
Family
ID=43452417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010271196XA Expired - Fee Related CN101948785B (zh) | 2010-08-31 | 2010-08-31 | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101948785B (zh) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102827890A (zh) * | 2012-09-07 | 2012-12-19 | 吉林中粮生化科技有限公司 | 玉米浸泡水发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN102965311B (zh) * | 2012-11-16 | 2015-03-25 | 南京轩凯生物科技有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 |
| CN103881954B (zh) * | 2012-12-20 | 2016-03-02 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法 |
| CN104087628A (zh) * | 2014-04-28 | 2014-10-08 | 广西大学 | 一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法 |
| CN104232504A (zh) * | 2014-07-10 | 2014-12-24 | 樟树市狮王生物科技有限公司 | 一种合成γ-聚谷氨酸的菌株以及利用其高效制备γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN104805143B (zh) * | 2015-04-21 | 2017-12-26 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种制备低分子量γ‑聚谷氨酸的方法 |
| CN105296558B (zh) * | 2015-11-18 | 2018-11-20 | 广东迪美生物技术有限公司 | 一种基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法 |
| JP6371810B2 (ja) * | 2016-08-25 | 2018-08-08 | 花王株式会社 | ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法 |
| CN107881124A (zh) * | 2016-12-23 | 2018-04-06 | 南京轩凯生物科技有限公司 | 一种产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN106701644A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-05-24 | 中国科学院微生物研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ‑聚谷氨酸中的应用 |
| CN107446128A (zh) * | 2017-08-18 | 2017-12-08 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种利用超滤技术对聚谷氨酸进行分级分离的方法 |
| CN108048499A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-05-18 | 烟台市佳益有机肥料有限公司 | 一种固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN108752625A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-06 | 广州无添加主义化妆品有限公司 | 制备不同分子量聚谷氨酸的方法 |
| CN109161492A (zh) * | 2018-08-06 | 2019-01-08 | 南京卉之源生物科技有限公司 | 一种γ-聚谷氨酸产生菌及高效合成γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN110129225B (zh) * | 2019-05-14 | 2021-07-23 | 汉肽生物医药集团有限公司 | γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 |
| CN110373346B (zh) * | 2019-06-10 | 2023-05-23 | 上海市农业科学院 | 枯草芽孢杆菌Bacillus sp.A-5及其用途 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1164737C (zh) * | 2002-12-30 | 2004-09-01 | 南京工业大学 | 利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体 |
| CN1269951C (zh) * | 2004-12-29 | 2006-08-16 | 浙江大学 | 枯草芽孢杆菌及其用于制备γ－聚谷氨酸的方法 |
| CN100999745A (zh) * | 2006-12-18 | 2007-07-18 | 浙江大学 | 一种制备γ－聚谷氨酸的方法 |
| CN100410364C (zh) * | 2006-10-09 | 2008-08-13 | 广东省微生物研究所 | γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN101402977A (zh) * | 2008-04-02 | 2009-04-08 | 广东省微生物研究所 | 一种γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN101486977A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-07-22 | 西北农林科技大学 | 枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN101538593A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-09-23 | 浙江大学 | 一种微生物发酵和膜分离技术耦合生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN101109010B (zh) * | 2007-07-17 | 2010-06-16 | 秦皇岛领先科技发展有限公司 | 一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法 |
-
2010
- 2010-08-31 CN CN201010271196XA patent/CN101948785B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1164737C (zh) * | 2002-12-30 | 2004-09-01 | 南京工业大学 | 利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体 |
| CN1269951C (zh) * | 2004-12-29 | 2006-08-16 | 浙江大学 | 枯草芽孢杆菌及其用于制备γ－聚谷氨酸的方法 |
| CN100410364C (zh) * | 2006-10-09 | 2008-08-13 | 广东省微生物研究所 | γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN100999745A (zh) * | 2006-12-18 | 2007-07-18 | 浙江大学 | 一种制备γ－聚谷氨酸的方法 |
| CN101109010B (zh) * | 2007-07-17 | 2010-06-16 | 秦皇岛领先科技发展有限公司 | 一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法 |
| CN101402977A (zh) * | 2008-04-02 | 2009-04-08 | 广东省微生物研究所 | 一种γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN101486977A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-07-22 | 西北农林科技大学 | 枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN101538593A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-09-23 | 浙江大学 | 一种微生物发酵和膜分离技术耦合生产γ-聚谷氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| wu q et al.Contribution of Glycerol on Production of Poly(γ-Glutamic Acid) in Bacillus subtilis NX-2.《Appl Biochem Biotechnol》.2010,第160卷(第2期),386-392. * |
| yao j et al.Analysis of Carbon Metabolism and Improvement of γ-Polyglutamic Acid Production from Bacillus subtilis NX-2.《Appl Biochem Biotechnol》.2010,第160卷(第8期),2332-2341. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101948785A (zh) | 2011-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101948785B (zh) | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 | |
| CN101109010B (zh) | 一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法 | |
| CN109161492A (zh) | 一种γ-聚谷氨酸产生菌及高效合成γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN102965311B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在制备γ-D-聚谷氨酸中的应用 | |
| CN102911974B (zh) | 枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN103421718B (zh) | 一种少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用 | |
| CN101215592B (zh) | 生产普鲁兰多糖的发酵方法 | |
| CN101875910A (zh) | 一株产γ-聚谷氨酸的解淀粉芽孢杆菌 | |
| CN101948769B (zh) | 一种固体发酵生产γ-多聚谷氨酸的细菌YXY-C1及其产品 | |
| CN101486977B (zh) | 枯草芽孢杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN102597251A (zh) | 用于由长心卡帕藻集成生产乙醇和海藻液的方法 | |
| CN105017086B (zh) | 一种l‑瓜氨酸分离纯化的方法 | |
| CN102533885A (zh) | 发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN102174448B (zh) | 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用 | |
| CN104893997A (zh) | 一种低温生产几丁质酶的菌株及其发酵方法 | |
| CN101724592B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化生产l-乳酸中的应用 | |
| CN105176859B (zh) | 一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株mqo-153 | |
| CN110129225A (zh) | γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 | |
| CN108220352A (zh) | 一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN105567779A (zh) | 一种高产低分子量热凝胶的发酵方法 | |
| CN101392231A (zh) | 一种重组大肠杆菌及应用其以生物质原料生产phb的方法 | |
| CN105175275B (zh) | 一种l‑鸟氨酸的分离纯化方法 | |
| CN105177075A (zh) | 一种以精氨酸为原料制备l-瓜氨酸的方法 | |
| CN102286569B (zh) | 一种可德胶及其制备方法 | |
| CN103468606A (zh) | 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120613 Termination date: 20170831 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |