CN101402977A - 一种γ-聚谷氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种γ－聚谷氨酸的制备方法，该方法用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA－7 CCTCC M 206102做发酵菌株对发酵培养基进行摇瓶发酵以制备γ－聚谷氨酸，其工艺过程包括斜面菌种活化、菌种的液体活化、摇瓶发酵和摇瓶发酵醪液提取。本发明采用由多种有机氮源和无机氮源相组合的优选的发酵原料，在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产γ－PGA最高可达27.3g/l，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种γ-聚谷氨酸的制备方法，具体地说，涉及一种利用枯草芽孢杆菌PGA-7CCTCC M 206102进行摇瓶发酵制备γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(Polyγ-glutamic acid，γ-PGA)是一种可由微生物大量生物合成的氨基酸聚合物，它由D-型或L-型谷氨酸通过γ-酰胺键连接而成。微生物合成的γ-PGA是一种水溶性的可生物降解的生物高分子，通常它由5,000个左右谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在10万～100万。γ-PGA可以制成不同的分子量应用于各种不同领域。如：(1)γ-PGA具食品安全性，可作为膳食纤维、保健食品、食品增稠剂、安定剂或作为化妆品用的保湿剂；(2)γ-PGA可作成水胶，具有极高吸水能力，可吸水达3,500倍，极适合于农业土壤和环保产品之应用；(3)γ-PGA可以转化成各种不同的金属盐类，具不同pH值，并有特殊多阴离子表面特性，适用于组织培养和许多其它食品、化妆品、生物医学和工业应用等。随着从廉价资源生产可生物降解的多聚物用量的增加，以及γ-PGA许多新的领域的拓展，对γ-PGA生物合成的兴趣又重新振兴起来，目前，世界上有很多研究小组在从事γ-PGA生物合成的研究。
γ-PGA生物合成的研究主要集中在芽孢杆菌属细菌的B.anthracis和B.licheniformisATCC 9945a、B.licheniformis ATCC 9945(以前叫B.subtilis ATCC9945)等菌株上。根据细胞生长的营养要求是否需要L-谷氨酸，可以把γ-PGA产生菌分为两大类，一类是培养时需要L-谷氨酸才能积累γ-PGA，这类菌种主要有B.anthracis、B.subtilis MR-141、B.licheniformisATCC 9945、B.licheniformis ATCC 9945a、B.subtilis IFO3335和B.subtilis F-2-01等，此类菌种的γ-PGA产量较高，一般为15～35g/L，但是原料的相对成本较高；一类是培养时不需要L-谷氨酸也能积累γ-PGA，如B.subtilis 5E、B.subtilis var.polyglutamicum、B.licheniformisA35、B.subtilis TAM-4等，不需谷氨酸的γ-PGA产生菌，γ-PGA产率较低，一般为5～10g/L，但由于可用廉价原料代替谷氨酸，因此在工业生产中有其实际应用意义。
CN1932007公开了一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7CCTCC M 206102作为发酵菌株进行摇瓶发酵制备γ-聚谷氨酸的工艺，采用该工艺的发酵培养基配方，γ-PGA产率达18g/L。申请人在对上述发明的进一步研究中，发现采用同一γ-PGA产生菌，通过改良发酵配方，可以提高γ-PGA的产率，使其接近需要谷氨酸类产生菌的γ-PGA产量，同时又降低生产成本，在工业化生产中发挥巨大优势，由此产生本发明。
发明内容
本发明的目的是提出一种经改进的利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7 CCTCC M206102作为发酵菌株进行摇瓶发酵制备γ-聚谷氨酸的新方法。
本发明所采用的微生物菌株是经选育的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)产生菌--枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7，该菌株于2006年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为：CCTCC M 206102。该菌株以下简称：Bacillus subtilis CCTCC M 206102。
中国典型培养物保藏中心的联系资料如下：
电话：027-87682319传真：(027)87883833 E-mail：cctcc@whu.edu.cn地址：武汉武汉大学邮编：430072。
该菌株的菌学特性和保藏情况均已记载于CN1932007之中。
本发明所提供的γ-聚谷氨酸的制备方法，用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7CCTCCM206102做发酵菌株进行摇瓶发酵，其具体工艺过程如下：
(1)斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(Bacillus subtilis PGA-7CCTCC M 206102)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，琼脂15～20g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.8～7.2，33～38℃培养12～24小时，再冷藏于4℃ 1～5天；
(2)菌种的液体活化：将上述活化斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：柠檬酸15～20g，NH4Cl或(NH4)2SO46～10g，蛋白胨5～7g，酵母粉15～20g，玉米浆10～15g，NaCl 3～5g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.0～7.0，液体活化培养基装于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于32～37℃往复式摇床振荡培养18～24小时，摇床转速为80～110r/m，冲程为65～75mm；
(3)摇瓶发酵：按5％接种量，取2mL培养好的液体活化种，接入发酵培养基中，发酵培养基成份如下：葡萄糖或甘油或柠檬酸30～40g，果糖0～4g，NH4Cl 12～20g，蛋白胨10～14g，酵母粉30～45g，玉米浆20～30g，NaCl 5～8g，自来水溶解后定容至1L，所述的发酵培养基于灭菌前调pH值至6.2～6.5，可用NaOH及HCl调节，用500mL三角瓶装，装量40mL；于32～37℃，冲程65～80mm，转速90～130r/m的往复式摇床振荡培养60～84小时，停止发酵；
(4)发酵完毕的摇瓶发酵醪液经提取工艺即得含γ-聚谷氨酸的制品。
提取含γ-聚谷氨酸的制品的工艺为常规工艺，一般包括对发酵液离心去除菌体，取其上清液用乙醇沉淀提取等步骤。
发酵完毕的摇瓶发酵醪液可通过以下方法分析测试发酵醪液中的γ-PGA含量：
对发酵液离心去除菌体，取上清液测谷氨酸单体的含量；将上清液与6mol/L的盐酸按1∶1(体积比)加入玻璃水解管中，真空封口后于110℃水解24h，然后测定水解液中谷氨酸总量；两次测得的谷氨酸之差为γ-PGA的含量。
上述对谷氨酸的分析方法可以采用氨基酸自动分析仪，或高效液相色谱仪(HPLC)，或纸层析方法进行测定。纸层析方法如下：取10μL离心发酵上清液或它的水解液点样，层析过夜，用0.5％茚三酮丙酮溶液显色，65℃显色10min，剪下斑点用1.0g/L硫酸铜洗脱液(CuSO4·5H2O∶75％乙醇＝2∶38)5mL浸泡20min以上至纸条无色，Λmax＝570nm测其OD值，与谷氨酸标准曲线比较算出相应含量，再计算发酵醪液含γ-PGA量。
本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7CCTCC M 206102作为发酵菌株，采用本方法中提出的优选的发酵培养基配方，进行摇瓶发酵，在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产γ-PGA最高可达27.3g/L。本发明的发酵原料成本低，γ-PGA的产率高，与现有技术比较具有成本上优势，因而更具有工业化应用前景。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
下面的实施例中用到的斜面种采用如下方法培养：Bacillus subtilis PGA-7CCTCC M206102划线于新配制的保藏斜面上，保藏斜面组成见各实施案例，33℃培养17小时，再冷藏于4℃冰箱备用。
实施例一：
取4℃冰箱内保藏1天的斜面种【保藏斜面培养基的组成(g/L)：蛋白胨8，NaCl 11，酵母膏3，琼脂20，pH7.0】，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到新配置的种子液体活化培养基中【液体活化培养基组成(g/L)：柠檬酸15、NH4Cl 8、蛋白胨7、酵母粉15、玉米浆15、NaCl 3，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.5】，液体活化培养基装于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于32℃往复式摇床振荡培养18小时，摇床转速为110r/m，冲程为75mm。再按5％接种量转接入发酵培养基中，发酵培养基的组成如下：葡萄糖40g、NH4Cl 12g、蛋白胨14g、酵母粉38g、玉米浆30g、NaCl 5g，自来水溶解后定容至1L，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为6.2，120℃灭菌20分钟。发酵培养基装于500mL三角瓶中，装量40mL，于76mm冲程、转速130r/m往复式摇床振荡培养，经32℃恒温培养84小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20,000转/分钟离心10分钟，用纸层析法测定γ-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产γ-PGA可达到21.0g/L，无多糖等副产物。
实施例二：
取4℃冰箱内保藏3天的斜面种【保藏斜面培养基的组成(g/L)：蛋白胨12，NaCl 9，酵母膏8，琼脂16，pH6.8】，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到新配置的种子液体活化培养基中【液体活化培养基组成(g/L)：柠檬酸18、NH4Cl 8、蛋白胨5、酵母粉20、玉米浆10、NaCl 4.5，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.0】，液体活化培养基装于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于34℃往复式摇床振荡培养22小时，摇床转速为80r/m，冲程为65mm。再按5％接种量转接入发酵培养基中，发酵培养基的组成如下：甘油35g、果糖2g、NH4Cl 20g、蛋白胨10g、酵母粉45g、玉米浆28g、NaCl 7g，自来水溶解后定容至1L，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为6.3，120℃灭菌20分钟。发酵培养基装于500mL三角瓶中，装量40mL，于65mm冲程、转速90r/m往复式摇床振荡培养，经35℃恒温培养72小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20,000转/分钟离心10分钟，用纸层析法测定γ-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产γ-PGA可达到24.6g/L，不产生多糖等副产物。
实施例三：
取4℃冰箱内保藏3天的斜面种【保藏斜面培养基的组成(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母膏5，琼脂18，pH7.2】，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到新配置的种子液体活化培养基中【液体活化培养基组成(g/L)：柠檬酸20、(NH4)2SO48、蛋白胨6、酵母粉17、玉米浆13、NaCl 5，自来水溶解后定容至1L，调pH值至7.0】，液体活化培养基装于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于37℃往复式摇床振荡培养24小时，摇床转速为95r/m，冲程为70mm。再按5％接种量转接入发酵培养基中，发酵培养基的组成如下：柠檬酸30g、果糖4g、NH4Cl 16g、蛋白胨12g、酵母粉30g、玉米浆20g、NaCl 8g，自来水溶解后定容至1L，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为6.5，120℃灭菌20分钟。发酵培养基装于500mL三角瓶中，装量40mL，于80mm冲程、转速110r/m往复式摇床振荡培养，经37℃恒温培养60小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20,000转/分钟离心10分钟，用纸层析法测定γ-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产γ-PGA可达到27.3g/L，且不产生多糖等副产物。
Claims (1)
1.一种γ-聚谷氨酸的制备方法，用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7CCTCC M206102做发酵菌株进行摇瓶发酵，其工艺过程如下：
(1)斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(Bacillus subtilis PGA-7CCTCC M206102)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面培养基组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl9～11g，琼脂15～20g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.8～7.2，33～38℃培养12～24小时，再冷藏于4℃1～5天；
(2)菌种的液体活化：将上述活化斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：柠檬酸15～20g，NH4Cl或(NH4)2SO46～10g，蛋白胨5～7g，酵母粉15～20g，玉米浆10～15g，NaCl 3～5g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.0～7.0，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为25ml，于32～37℃往复式摇床振荡培养18～24小时，摇床转速为80～110r/m，冲程为65～75mm；
(3)摇瓶发酵：按5％接种量，取2ml培养好的液体活化种，接入发酵培养基中，发酵培养基成份如下：葡萄糖或甘油或柠檬酸30～40g，果糖0～4g，NH4Cl 12～20g，蛋白胨10～14g，酵母粉30～45g，玉米浆20～30g，NaCl 5～8g，自来水溶解后定容至1L，所述的发酵培养基于灭菌前调pH值至6.2～6.5，用500ml三角瓶装，装量40ml；于32～37℃，冲程65～80mm，转速90～130r/m的往复式摇床振荡培养60～84小时，停止发酵；
(4)发酵完毕的摇瓶发酵醪液经提取工艺即得含γ-聚谷氨酸的制品。
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