CN104911125A - 一种壳聚糖酶生产菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种产壳聚糖酶的微生物菌株及应用该菌株制备壳寡糖的方法。本发明提供了一种产壳聚糖酶的菌株，为芽孢杆菌（Bacillus sp.），于2014年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.10066，本发明菌种缩短了发酵产酶时间，提高了壳寡糖的质量和生产效率。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种产壳聚糖酶的微生物菌株及应用该壳聚糖酶制备壳寡糖的方法。
背景技术
壳聚糖是迄今为止发现的唯一的天然碱性多糖，但由于其分子量较大，并且有紧密的晶体结构，不溶于普通的溶剂，只能在某些酸性介质中溶解，这使壳聚糖的应用受到很大的限制。研究表明，分子量对壳聚糖的性质有很大的影响，不同分子量的壳聚糖性质差异很大，有时甚至表现出截然相反的特性。壳寡糖即是壳聚糖降解后的低分子量产品，聚合度在2~10之间，具有较高的溶解性和生理活性。据报道，壳寡糖具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，从而使其在食品，农业和医药领域有着广泛的应用前景。
目前，国内外降解壳聚糖制备壳寡糖的方法大致可以分为物理降解法、化学降解法和生物酶降解法三大类。利用生物酶降解壳聚糖制备壳寡糖的过程明显优于另外两种方法，这是由于生物酶法降解过程使降解产物的分子量分布更容易控制，能对降解过程进行监控，而且降解条件比较温和，无需加入大量的反应试剂，对环境污染较少，易于实现工业化生产。
专利CN101148646B 公开了一株枯草芽孢杆菌，该菌株为诱导性壳聚糖酶产生菌，液体深层发酵22h所得壳聚糖酶平均酶活718U/mL，专利CN 101240305 B利用该酶在底物浓度为15%，酶-底物比为1:10 条件下需要的酶解时间为4-6 小时，相当于每毫升酶液可降解1.5克壳聚糖。王海波等人报道筛选的烟曲霉菌株经诱变后所产的壳聚糖酶酶活为8~9U/ml。
发明内容
发明目的：
本发明的目的在于提供一种能够缩短发酵产酶时间的产壳聚糖酶的芽孢杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种高产壳聚糖的芽孢杆菌的发酵产酶方法。
为实现上述目的，本发明提供了一株产壳聚糖酶的菌株，为芽孢杆菌（Bacillus sp.），于2014年11月26日保藏于位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10066，以下称为芽孢杆菌10066。
本发明的技术方案是：
一株芽孢杆菌10066，其保藏编号为CGMCC No.10066。
本发明芽孢杆菌10066的筛选过程：
（1）从荣成近海采集的土样，用无菌水配成10%的样品溶液，静置后，取上清液，做梯度稀释，涂布于以壳聚糖为唯一碳源的平板培养基上，37 ℃培养2天，从中筛选出具有透明圈的菌落。
（2）对筛选出的菌落进行复筛。复筛培养基的配方按质量百分比为：壳聚糖0.3%，酵母浸粉0.1%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%；37℃下于摇床中180 r/min振荡培养24h。然后测定各发酵液酶活，从中选出酶活力较高的3株菌。
（3）对筛选得到的3株菌进行深入的遗传稳定性、生长速率、产酶速率、降解产物与效率等进行比较，最终选出一株产酶能力强、易于培养并具有稳定性的传代特性的菌株，经16S rDNA菌株鉴定后，经数据库比对后，确认目标菌株为一株芽孢杆菌。
本发明芽孢杆菌10066的菌学特性以及优点：
（1）菌落形态特征：菌落大，乳白色，圆形，突起，菌落紧缩在一起，有皱褶，有光泽。
（2）生理生化特征：革兰氏阳性菌，菌落表面粗糙不透明，微黄色。
（3）本发明芽孢杆菌10066发酵生产的酶液，降解壳聚糖制备壳寡糖的过程中几乎不会产生单糖。而目前市售的壳聚糖酶，在降解壳聚糖制备壳寡糖的过程中，会产生大量单糖，影响寡糖品质。
（4）制备壳寡糖时，所需酶量少，后处理简单，对壳寡糖产品品质影响较小，反应过程温和可控，有利于实现产业化。
本发明芽孢杆菌10066在制备壳寡糖中的应用。
发酵产酶工艺包括如下步骤：
①菌株活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的芽孢杆菌10066试管斜面菌株置于室温条件下活化4h-8h；
②种子液扩大：在无菌操作台上，用10mL无菌蒸馏水将经过活化的芽孢杆菌10066试管斜面菌种制成菌悬液，冲洗入装有500ml无菌液体培养基的三角瓶中，37 ℃，震荡培养16h-18h制备种子液；
③产酶发酵
种子液以1%的接种量接种，培养条件：37℃，200r/min，最佳培养条件为壳聚糖1%，酵母浸粉0.5%，蛋白胨0.5%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾2%，氯化钠0.5%，通入压缩空气；发酵24-48小时得到壳聚糖粗酶液，经过离心过滤后得酶清液，测定酶活力备用；
④ 降解壳聚糖制备壳寡糖
配制浓度为6%的壳聚糖溶液，将芽孢杆菌10066发酵生产的酶液按照加酶量8U/g加入壳聚糖溶液中，在45℃的条件下降解壳聚糖6h。
本发明与现有技术相比具有以下突出特点：
1、高效产酶菌株
目前，一般菌株发酵产壳聚糖酶的较快周期都在48-72小时左右，例如：专利CN 1884477A公开了一株腐皮镰孢菌突变株CGMCC No.1720，该菌发酵产酶周期为44-50小时；专利CN201210300863公开一株蜡样芽孢杆菌JBSH-003，该菌株发酵产酶周期为48小时；专利CN201210543898公开一株扁座壳孢菌，该菌株发酵产酶周期为48小时。而本发明采用的芽孢杆菌CGMCC10066发酵产酶仅需要24小时，酶活力即可达到25U/mL。
2、酶解产物寡糖含量高
市售壳聚糖酶制备壳寡糖时，往往含有大量单糖，而本发明菌株生产的壳聚糖酶在制备壳寡糖时，产物以2-6糖为主。
有益效果：本发明筛选的芽孢杆菌CGMCC10066发酵产酶时间短，发酵24h就可以获得酶活力为25U/mL的壳聚糖酶，随着发酵时间的延长，酶活力不断增大，发酵48h酶活力达到最大，可达到30U/mL，降解壳聚糖时添加量为8U/g壳聚糖即可（相当于每毫升酶液可降解3~4克壳聚糖），降解时间为6-8个小时。
保藏信息：
菌株名称：
芽孢杆菌（Bacillus sp.）。
保藏日期：2014年11月26日。
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所
保藏号：CGMCC No.10066
附图说明
图1.壳聚糖酶降解制备壳寡糖TLC分析图
图2.市售酶制备壳寡糖HPLC分析图（峰1-峰8分别代表单糖，2-8糖）
图3.自制酶制备壳寡糖HPLC分析图（峰2-8分别代表2-8糖）
图2和图3分别是采用HPLC-示差检测器测得的实施例所得壳寡糖样品的检验结果，由图2可知，采用市售酶制备的壳寡糖产物为1-8糖，产物中有单糖且占有相当大的比例，图3为采用自制酶制备的壳寡糖，产物主要为2-8糖，且主要集中在2-5糖，聚合度较为集中，分布较市售酶制备的壳寡糖窄，质量更优。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
实施例
①芽孢杆菌10066菌株的选育
从荣成近海采集的土样，用无菌水配成10%的样品溶液，静置后，取上清液，做梯度稀释，涂布于以壳聚糖为唯一碳源的平板培养基上，37 ℃培养2天，从中筛选出具有透明圈的菌落24株。
经过筛选得到24株菌株，再经过液体培养基复筛，37℃摇床中180r/min振荡培养24h。培养基的配方按质量百分比为：壳聚糖0.3%，酵母浸粉0.1%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%。
通过3,5-二硝基水杨酸法（DNS）测定酶活力，选取酶活力较高的3株菌，进行稳定传代3代，同时测定3株菌生长曲线，产酶速率以及发酵液降解制备壳寡糖的产物与效率，最终得到一株产酶能力强、易于培养并具有稳定性的传代特性的菌株，经鉴定后为芽孢杆菌，送至中国微生物菌株保藏管理委员会平台微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10066。
②发酵生产壳聚糖酶
⑴ 菌株的活化：将4℃保存的芽孢杆菌CGMCC10066营养琼脂试管斜面菌株置于室温条件下活化8h。
⑵ 种子液培养：用1000mL的三角瓶装400mL含壳聚糖0.3%，酵母浸粉0.1%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%的液体培养基，121℃灭菌20min。用10mL 灭菌后的蒸馏水将经过活化的芽孢杆菌CGMCC10066试管斜面菌种冲洗入三角瓶中，37℃摇床上震荡（180r/min）培养18小时。
⑶ 用50L发酵罐装30L含壳聚糖1%，酵母浸粉0.5%，蛋白胨0.5%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾2%，氯化钠0.5%组成的液体培养基，同上，灭菌后接按1%接种量接种，于37℃下通气搅拌，分别于24h，36h和48h取样。采用DNS法测定24h，36h，48h的酶活力。共发酵三批，采用DNS法测定酶活力，结果如下表所示。
由上表可以看出，三批发酵24h、36h和48h的酶活平均值分别为25.6 U/ml，28.3 U/ml和30.1 U/ml，酶活随着发酵时间的延长逐渐增加，但是提升不明显，考虑到时效性，发酵时间24h最为经济。
⑷低温离心分离酶液：用大容量低温高速离心机以4000r/min的转速在4℃条件下离心15分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所述的酶液，于4℃低温保存备用。
⑸降解壳聚糖制备壳寡糖
配制6%的壳聚糖溶液1000mL，调节pH值为5.5左右，将芽孢杆菌CGMCC10066发酵生产的酶液按照加酶量8U/g壳聚糖加入酶液，在45℃的条件下降解壳聚糖6h，并与市售酶做对比，测得数均分子量分布为市售酶1482Da，自制酶1396Da，两者相差不大。
采用薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）对产物进行分析，结果见附图1-图3。
附图1说明：对照品显示的是1-6糖，市售酶所得产物中包含1-6糖，而自制酶不含有单糖，主要为2-6糖，有很好的应用前景。
芽孢杆菌CGMCC10066的16S rDNA鉴定结果
S211 1501bp
GGACCTGGCGGGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAACCCGCCCGCTAAAGGGGGAACAAAGAATGGGGTGAAATCCTAACCAGGGAACCCTATTCGAAGGGGGCG
Claims (3)
1.一株芽孢杆菌10066，其保藏编号为CGMCC No.10066。
2.权利要求1所述芽孢杆菌10066在制备壳寡糖中的应用。
3.权利要求1所述芽孢杆菌10066发酵产酶工艺包括如下步骤：
（1）菌株活化：将4℃条件保存在营养琼脂培养基上的芽孢杆菌10066试管斜面菌株置于室温条件下活化4h-8h；
（2）种子液扩大：在无菌操作台上，用10ml无菌蒸馏水将经过活化的芽孢杆菌10066试管斜面菌种制成菌悬液，冲洗入装有500ml无菌液体培养基的三角瓶中，37 ℃，震荡培养17h制备种子液；
（3）产酶发酵：种子液以1%的接种量接种，培养条件：37℃，200r/min，最佳培养条件为壳聚糖1%，酵母浸粉0.5%，蛋白胨0.5%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾2%，氯化钠0.5%，通入压缩空气；发酵24-48小时得到壳聚糖粗酶液，经过离心过滤后得酶清液，测定酶活力备用；
（4）降解壳聚糖制备壳寡糖：配制浓度为6%的壳聚糖溶液，将芽孢杆菌10066发酵生产的酶液按照加酶量8U/g加入壳聚糖溶液中，在45℃的条件下降解壳聚糖6h。
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