CN1396185A - 一种半纤维素酶及其在制备壳寡糖中的应用 - Google Patents
一种半纤维素酶及其在制备壳寡糖中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是关于一种半纤维素酶及其在制备壳寡糖中的应用，该半纤维素酶是短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)半纤酶A1号CCTCC M201023的发酵产物；本发明壳寡糖的制备方法包括对壳聚糖酶解、酶解液的离心过滤、絮凝澄清、真空浓缩、过滤去杂质、脱色、脱味、超滤分级、干燥，其特征在于对壳聚糖酶解使用前述的半纤维素酶。本发明的贡献在于提供了高效产酶菌株，且酶的活性大大提高，达300u/ml；酶解工艺效率高，仅需8－10小时；产物中有效组份含量高，壳3－10糖在70％以上。
Description
技术领域
本发明是关于一种半纤维素酶及其在制备壳寡糖中的应用。
背景技术
甲壳素是以江、河、湖、海中大量存在的虾、蟹壳为原料进行生产加工的天然动物性膳食纤维。壳聚糖是在浓碱的作用下脱去甲壳素分子中的乙酰基而得到的一种天然高分子化合物，在自然界中的含量仅次于纤维素。甲壳素以具加工方法的不同主要分为以下三个层次的系列衍生产品：A.几丁质(甲壳质)，分子量达到100万以上，其吸收能力强，适合工业和环保应用，但不溶于酸碱，也不溶于水，很难被人体吸收。B.几丁聚糖(壳聚糖)，分子量在10万左右，一般只溶于有机弱酸，不溶于水，可以被人体吸收，可以作为食品添加剂及保健品原料等，有着极其广泛的推广价值。C.壳寡糖，分子量低于5000，具水溶性，可直接被人体吸收，速度快，效果显著。已经证明，由壳聚糖降解生成的壳寡糖，更具有独特的生理活性和理化性质，是甲壳素系列产品中应用性能最好的产品。
目前，国内外降解制备壳寡糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法和酸降解法三大类。利用生物酶法降解制备壳寡糖的过程明显优于另两种化学降解法，这是由于酶法降解过程使降解产物的分子量分布更容易被控制，能对降解过程进行监控，生产出有效组份(壳3-10糖)含量较高的壳寡糖，且降解条件比较温和，无需加入大量的反应试剂，对环境污染较少。1999年第二期《中国海洋药物》登载“高产壳聚糖酶菌种的筛选及其降解壳聚糖反应初探”一文论述了中科院大连化学物理生化室通过两轮有效的紫外线诱变，获得了2株具有高产壳聚糖酶的突变株，具有较好的稳定性，其发酵液的粗酶活性达0.2u/ml，尽管其比原始保存突变菌株酶活性提高了8倍，并得到一定量壳寡糖，但其酶活性仍然较低，不能实现工业化生产。壳聚糖降解酶数量众多，降解的壳聚糖酶普遍存在酶活性低、副反应多和酶解时间长、能耗高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由微生物发酵产生的半纤维素酶和利用该半纤维素酶制备壳寡糖的工艺方法，使该半纤维素酶具有较高的活性，提高酶解效率，并且使产物中的有效成份即壳3-10糖的含量大大提高，从而使应用半纤维素酶实现工业化生产低聚寡糖成为可能。
使用的微生物
过快速平板鉴定并通过摇瓶，酶测筛选到了一株可迅速降解壳聚糖为壳寡糖的短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)半纤酶A1号(以下简称半纤酶A1号菌株)，该菌株于2001年7月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM201023，该菌株经优化培养，发酵达到300μ/ml以上的半纤维酶活性。1ml粗酶液可在5～10小时内有效降解10％浓度的壳聚糖为3～10糖为主的寡糖，并经质谱与分析鉴定证实，使工业化生产壳寡糖成为可能。
本发明使用的半纤酶A1号菌株的性质
属短小型杆菌，具芽孢，为革兰氏阳性细菌；
菌落形态，圆型，白色，半透明，有光泽，在多聚蛋白胨培养基上较易生长，
最适培养温度36℃。
本发明内容包括生产半纤维素酶的产酶工艺和生产壳寡糖的酶解工艺两方面。
产酶工艺过程是：半纤酶A1号菌株→上罐发酵→低温离心→去杂质→低温保存酶液。
应用正交实验法(L4(23)即三因素二水平四次正交实验)进行培养基配方优化，表明产酶稳定，平均酶活力达308u/ml。适宜产酶PH值为6.5，产酶高峰期为12～24小时。酶作用适宜PH值为5.5-6.5，最适宜PH值为6.0，酶作用适宜温度为45℃-48℃，最适温度为48℃，PH值为6.7时稳定性较好，酶的纯化方法一般为：盐析，有机溶剂沉淀，离子交换，吸附层析，凝胶过滤，亲和层析，膜分离，低温高速离心等，在生产时采用连续流离心即可，其分离效果好、方便，酶收率在84％以上。
酶的产生条件
(1)培养基成份对产酶的影响
应用正交试验法对中糊精、胰蛋白胨、酵母抽提物用3种主成份进行了优化，结果如表面1。对表1试验结果分析计算，发现各因素对酶活力影响的主次为：B＞C＞A，其优化配方为：中糊精10％、胰蛋白胨1％、酵母抽提物0.5％。按优化酶方重现实验表明产酶稳定，平均酶活力达308u/ml。
L4(23)表面化培养基配方优化方案表
(L4(23)即三因素二水平四次正交试验)
| 胰蛋白胨(％) | 中糊精(％) | 酵母抽提物(％) | 酶活性(U/ML) | |
| 1 | 1(0.6) | 1(6) | 1(0.5) | 216 |
| 2 | 2(1) | 1 | 2(0.8) | 210 |
| 3 | 1 | 2(10) | 2 | 270 |
| 4 | 2 | 2 | 1 | 308 |
| 主次号 | 3 | 1 | 2 |
.发酵工艺对产生酶的影响
A.PH值对产酶的影响：由摇瓶试验应用0.618对培养基起PH值进行优选。结果见表二。表明适宜产酶PH值为6.5。
表2培养基PH对产酶的影响
| 培养基起始PH值 | 6.0 | 6.5 | 7.5 | 8.0 | 9.0 |
| 酶活力 | 289 | 310 | 274 | 260 | 207 |
B.产酶时间过程：于不同培养时间取样，测试酶活性，结果见表3
表3产酶时间过程
| 培养时间U/h | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 | 24 | 28 |
| 酶活性U/ml | 30 | 65 | 113 | 200 | 278 | 309 | 295 |
分析表明12-24h为产酶高峰期，在24h达到最高水平，延迟后酶活性下降，可能是营养消耗，菌体自溶。
C.溶氧：短小芽孢杆菌是好气性细菌，在发酵过程中需要消耗大量溶氧；提高搅拌转速，加在通风量均能有效提高溶氧。经试验，选定的搅拌转速为350-500r/min(随着发酵时间的延长逐渐提高转速)，通风量：在发酵过程中，通气不间断：在0-16h，通气量为0.8m3/min；在16-24h通气量为0.6m3/min，全过程的溶氧值控制在65％～85％之间。
D.消泡剂：产酶发酵过程中会产生大量泡沫，由于泡沫的表面张力会使酶的活力降低，因此要及时消泡，根据发酵情况通过蠕动泵向罐中自动加聚醚类消泡剂。
本发明半纤维素酶的一般性质
A.酶作用最适PH值：于不同PH值条件下进行酶反应。酶作用适宜PH值为5.5～6.5，最适PH值为6.0。
B.酶作用最适温度：于不同温度条件下进行酶反应。酶作用适温度为45～48℃，最适温度为50℃。
C.PH值对酶稳定性的影响：酶于不同PH值缓冲体系中保存15min，测酶活表明：PH值6.7时稳定性较好。
D.PH值对酶稳定范围性的影响：酶于0.05mol/L，PH6.0的磷酸缓冲液中，在不同温度保温15min，结果表明该酶热稳定性较差，60℃保温15min，酶活仅剩余22％，故应在低温下保存。
酶的纯化
半纤维素酶常和其他酶共同存在于发酵体系中，且自身还有多种分子型，因而纯化较困难。一般采用的方法有：盐析、有机溶剂沉淀、离子交换、吸附层析、凝胶过滤、亲和层析、膜分离、低温高速离心等，考虑到生产的要求，可采用连续流离心即可，其分离效果好，方便，酶收率在84％以上。
本发明生产壳寡糖的酶解工艺过程是：壳聚糖冰乙酸溶液→入罐酶解→离心、絮凝、过滤、去杂质→脱色、脱味、分级→冻干(喷干)→壳寡糖
酶解工艺根据壳聚糖原料的溶解性差异，对应壳聚糖的量不同，一般是0.2ml冰乙酸(95％)比1g壳聚糖即能使壳聚糖充分溶解又不过量。冰乙酸溶液的浓度按底物浓度的变化来调节，比如：如果要求达到10％的底物浓度，每g壳聚糖对应0.2ml95％的冰乙酸，配100ml溶液需要：壳聚糖10g，冰乙酸2ml，蒸馏水100ml。壳聚糖原料的性状不同，则加酶量也不同。为了得到特定分子量分布的产品，可通过底物浓度、加酶量、酶解时间的改变来调控。
本发明与现有技术相比具有以下突出特点：
1.高效产酶菌株
目前，一般菌株发酵产壳聚糖酶的周期在6-7天(参阅《中国海洋药物》1999年第二期“高产壳聚糖酶菌株的筛选及降解壳聚糖反应初探”一文)，本发明采用的菌株则是通过诱变、筛选出的高效菌株，发酵周期仅需18-24小时，产酶效率大大提高。
2.酶的活性大大提高
现有壳聚糖酶的酶活性仅为0.2u/ml，而本发明提供的酶则是高活性半纤维素酶，酶活性达300u/ml。(酶活力的测定：用1％冰乙酸(95％)溶液配置浓度为1％的壳聚糖溶液，溶充分后于48℃，PH值为5.4条件下，酶解底物每分钟释放1umol的还原糖所需的酶量为一个活力单位U。)
3.酶解工艺效率高
水解效率高 在一般壳聚糖酶法工艺中，水解底物需2-3天时间。而本发明水解工艺中，水解时间仅需8-10小时。
4.产物中有效组份含量高
化学法制备壳寡糖，其产物中有效组份(壳3-10糖)仅占20％左右。而本发明的水解产物，通过质谱分析，其有效组份(壳3-10糖)在70％以上，远高于国内外报道的化学法收率，如一九九九年《第二届甲壳素化学与应用研讨会论文集》登载的题为“水溶性壳聚糖的制备”一文中报道化学法有效收率不到20％。
本项目主要技术性能指标与国内外同类产品指标比较
| 本发明产品主要技术性能指标名称 | 指标 | 现有同类产品指标 |
| 半纤维酶活力 | ≥300μ/ml | 0.2u/ml |
| 酶收率 | ＞80％ | |
| 壳寡糖收率 | ≥70％ | ≤20％ |
| 产品中功效成份(壳3糖-壳10糖)占总糖的比率(应用范围及功效见附表) | ≥60％ | 20％左右(化学法) |
| 其它理化、卫生指标 | 符合 | 符合 |
| 外观 | 白色或浅黄色粉末 | 白色或浅黄色粉末 |
| 灰份(％) | 0.1 | 0.2 |
| 重金属(mg/kg) | 0.1 | 0.3 |
| 平均分子量(Dalton) | 800～1200 | 800～1200 |
| 脱乙酰度％ | ＞80％ | |
| 水份％ | ≤2 | |
| 溶解度w/v | ≥10％ |
本发明提供的半纤维素酶活性高，产酶稳定，酶解条件较为温和，产品产率高，纯度高、杂质少、稳定性好。产酶及酶解工艺成熟，酶解成本低。
附图说明
图1为本发明产酶生产工艺流程图。
图2为本发明酶解生产工艺流程图。
图3、图4、图5为武汉大学测试分析中心对本发明方法制备的壳寡糖检测分析结果(质谱分析)。
具体实施方式
实施例1：本发明所述半纤维素酶的制备
1.将半纤酶A1号菌株用划线法接种在含胰蛋白胨(Tryptone)1％ 酵母抽提物(Yeast extract)0.5％氯化钠(Nacl)1％，琼脂1％的平板培养基上，37℃温度下培养18小时后使用；
2.用1000ml的三角摇瓶装100ml含中糊精10％，胰蛋白胨(Tryptone)1％酵母抽提物(Yeast extract)0.5％Nacl 1％的液体培养基，10磅灭菌20分钟，接种一环，36℃摇床上振荡(250r/min)培养18小时；
3.在10升发酵罐内装上8升含中糊精，胰蛋白胨，酵母抽提物组成的液体培养基，同上灭菌后接摇瓶种子悬液100ml于36℃下通气搅拌培养24小时。
4.低温离心分离酶液：将发酵液装入低温冷冻离心机的离心桶中，盖紧后，在+4℃条件下，以6000r/min转速离心20分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所述半纤维素酶酶液，置0-4℃低温保存备用。
实施例2：利用本发明提供的半纤维素酶生产壳寡糖
1.工艺流程：壳聚糖冰乙酸溶液→入罐酶解→离心、絮凝、过滤去杂质→脱色、脱异味→超滤分级→真空浓缩→喷雾干燥→壳寡糖
2.操作规程：(1)酶解工艺将冰乙酸配制成2％的溶液，加入壳聚糖升温搅拌溶解，温度控制在48℃，壳聚糖与冰乙酸溶液的体积重量比(W/V)为10％。加入本发明所述半纤维素酶液降解，反应温度48℃-50℃，保温，搅拌，时间8小时；(2)离心过滤 将反应后的酶解液离心过滤，转速3000r/min，时间15分钟；(3)絮凝、澄清、二次过滤将离心液加入少量壳聚糖絮凝4-5小时，澄清后再离心过滤，转速3000r/min，时间15分钟；(4)脱色、脱异味 将二次离心清液通过大孔吸附树脂进行脱色除味，流速1500ml/min，柱压0.15mPa，温度30℃；(5)超滤分级 通过超滤膜进行分子量截流，膜型号选用1K膜、3K膜，聚砜材质；将脱色好的粗聚寡糖液，先通过1K膜进行分子量截流除去单糖和双糖，留取浓缩液(含壳3糖以上的壳低聚糖)；再将浓缩液通过3K膜进行分子量截流，留取透过液(含壳3-10糖)备用。(6)真空浓缩将超滤好的壳寡糖溶液通过真空薄膜蒸发器进行真空浓缩，真空度-0.08mPa，流速150-200L/hr，温度60-65℃，浓缩液浓缩度控制在35％。(7)喷雾干燥将浓缩液选用25型高速离心式喷雾干燥机进行喷雾干燥，进口风温150℃，出口风温85℃，真空度-0.03mPa，加热功率36KW，进口流速25L/hr，通过旋风收集器收集壳寡糖干粉。(8)包装用纤维桶内衬聚乙烯袋包装。
Claims (5)
1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)的筛选培育品短小芽孢杆菌(BacillusPumilus)半纤酶A1号，其保藏号为CCTCC M201023。
2.一种半纤维素酶，其特征在于它是短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)半纤酶A1号CCTCC M201023的发酵产物。
3.权利要求2所述半纤维素酶的生产方法，包括微生物的发酵培养和除去菌体残存物的分离纯化，其特征在于培养短小芽孢杆菌(Bacillus Pumilus)半纤酶A1号CCTCC M201023。
4.一种壳寡糖的制备方法，包括对壳聚糖酶解、酶解液的离心过滤、絮凝澄清、真空浓缩、过滤去杂质、脱色、脱味、超滤分级、干燥，其特征在于对壳聚糖酶解使用了权利要求2所述的半纤维素酶。
5.一种壳寡糖的制备方法，包括对壳聚糖酶解、酶解液的离心过滤、絮凝澄清、真空浓缩、过滤去杂质、脱色、脱味、超滤分级、干燥，其特征在于对壳聚糖酶解使用了用权利要求3所述方法生产的半纤维素酶。
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