CN104975057A - 一种利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，将发酵柠檬酸的废菌丝体用水冲洗，过滤，收集，然后将收集到的废菌丝体晾干；将晾干的废菌丝体用0.3~0.6mol/L的酸、碱或盐溶液浸泡，过滤，然后水洗废菌丝体至滤液呈无色且pH≈7.0；将处理得到的废菌丝体用甲壳素酶降解制备得到含有乙酰氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖二糖的甲壳低聚糖混合物溶液，在甲壳素酶降解的同时加入灭活的蜗牛酶酶解破壁，会有更高的产率。本发明利用酶法降解柠檬酸发酵废弃物，一方面能够降低发酵对环境的污染；另一方面，该发明可以利用废弃物更简便的直接获得甲壳低聚糖，并加少了酸碱的用量。

Description

一种利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法

技术领域

本发明涉及一种利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，属于生物工程和环境科学的交叉技术领域。

背景技术

几丁质是2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖通过β-(1,4)糖苷键连接的二元线性共聚物，每年生物合成的资源量高达100亿吨，是地球上仅次于植物纤维素的第二大生物资源。壳聚糖是几丁质脱乙酰基的产物，是一种天然的阳离子高分子多糖，已广泛应用于医药、材料合成、化工、食品、化妆品及环保等诸多领域。尽管几丁质和壳聚糖的应用范围不断扩展，但其较差的溶解性仍然严重限制了其进一步应用。和大分子相比，甲壳低聚糖无毒，易被人体吸收，并具有抗肿瘤、增强免疫力、抗菌、降胆固醇、保湿及促进植物抗逆生长等多种生理功能，在食品、医药、农业等领域有着广泛的应用前景，成为近年来的研究热点。

目前几丁质主要从虾、蟹壳中得到，但虾、蟹产量不稳定，难以收集、保鲜和运输；原料来源具有多样化、差异性，品质难以控制，使几丁质和几丁质的生产受到限制。微生物是几丁质和壳聚糖生产的又一重要的原料来源，几丁质在子囊菌纲、担子菌纲、藻类纲及半知菌纲等真菌细胞壁中的含量是十分可观的(几丁质含量为菌丝干重的20％-22％)。与虾、蟹壳相比，从真菌细胞壁中制取壳聚糖有许多优点。例如，大部分真菌可通过工业发酵技术大规模培养，不受原料复杂性、季节性、地域性等的限制，产品质量和产量易于控制，生产工艺简单，周期短，动力消耗和环境污染小。另外，发酵行业生产抗生素、酸后产生大量废渣，据调查国内每年产生的废青霉素菌丝体就达几十万吨，数量之大给废料处理造成了极大困难。黑曲霉是发酵工业最常用的真菌，也是含有几丁质最多的真菌，我国柠檬酸产量达50万吨，产黑曲霉干菌体8万多吨，可从中提取到约1.6万多吨的几丁质，其产量十分惊人，因此利用柠檬酸工厂废菌体中提取几丁质不仅可降低壳聚糖的成本，而且为综合利用发酵废渣提供了一条新途径。据文献报道，目前国内利用柠檬酸厂废菌丝体提取几丁质和壳聚糖大多采用酸碱法，该法工艺简单，操作方便，但会给环境带来很大污染且样品纯度及得率都很低。而采用生物法可大大减少环境污染，同时显著提高产品的质量与产率，故利用柠檬酸工厂废菌丝体生物法提取甲壳低聚糖有很好的应用前景。蔡骏等采用生物法利用柠檬酸发酵工厂废菌丝体制备壳聚糖，避免了酸碱法给环境带来的污染，分别选择蜗牛酶和溶菌酶、中性蛋白酶和几丁质脱乙酰酶来破碎细胞、脱蛋白及脱乙酰基，使黑曲霉细胞壁中的几丁质转化为壳聚糖。但细胞壁的主要组成成分是(1,3)-β-D-葡聚糖和一些(1,6)-β-D-葡聚糖连接的侧链，在几丁质链的还原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖通过(1,4)-或(1,2)-连接到侧链的葡萄糖单元上。所以，很难得到纯净的几丁质，但可以采用专一性强的几丁质酶直接降解几丁质，得到甲壳低聚糖，并且避免使用多种酶。由于甲壳低聚糖具有较好的生物活性，该方法不仅为综合利用青霉素、柠檬酸发酵工厂废渣开辟新的途径，而且可生产甲壳低聚糖，所以具有非常广阔的前景，但目前采用生物法以废菌丝体来制备甲壳低聚糖未见文献报道。

本发明利用柠檬酸发酵工业的黑曲霉废菌体，采用生物法处理废菌体，通过预处理、细胞破碎、酶法破壁，采用几丁质酶与蜗牛酶结合降解得到甲壳低聚糖，探讨提取方法和条件，并用红外光谱等方法对产品进行化学表征与分析对比，确立优化方法。该法制备甲壳低聚糖条件温和，综合利用工厂废菌体，减少环境污染，且甲壳低聚糖具有许多重要的生物活性和生理功能，变废为宝，降低原料成本，同时为再生资源的综合利用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用甲壳素酶降解发酵柠檬酸的废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，以柠檬酸发酵废弃菌丝体为原料，利用酶制剂进行生物降解，过程中不涉及强酸强碱，无环境污染。处理后的废弃菌丝体可以用于制备甲壳低聚糖，从而形成一条新的甲壳低聚糖制备方法。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复研究，最终获得了如下工艺路线：

一种利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)将发酵柠檬酸的废菌丝体用水冲洗，过滤，收集，然后将收集到的废菌丝体晾干；

(2)将晾干的废菌丝体用0.3～0.6mol/L的酸、碱或盐溶液浸泡，过滤，然后水洗废菌丝体至滤液呈无色且pH≈7.0；

(3)将步骤(2)处理得到的废菌丝体用甲壳素酶降解制备得到甲壳低聚糖溶液；

(4)将甲壳低聚糖溶液通过HPLC检测得到甲壳低聚糖。

所述步骤(3)中，将步骤(2)处理得到的废菌丝体在甲壳素酶降解之前用蜗牛酶或纤维素酶酶解破壁。

所述的蜗牛酶或纤维素酶酶解破壁步骤，采用的酶解缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，蜗牛酶或纤维素酶的用量为废菌丝体的4wt％，酶解温度为50℃，pH为5.6，酶解时间为4小时。

所述步骤(3)中，在甲壳素酶降解的同时加入灭活的蜗牛酶辅助降解。

步骤(1)中采用60目筛网过滤、300目筛网收集废菌丝体。

步骤(2)中将晾干的废菌丝体用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡8小时。

步骤(3)所述的甲壳素酶为基因重组蛋白，其制备方法为：重组大肠杆菌经诱导、表达，然后经破碎、分离、纯化获得重组甲壳素酶。

所述的甲壳素酶用量为废菌丝体的0.3wt％。

步骤(3)所述的甲壳素酶降解，降解温度37℃，降解pH为7.0-8.0，降解时间为4天，采用的酶解缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。

制备得到的甲壳低聚糖为乙酰氨基葡萄糖和/或乙酰氨基葡萄糖二糖。

与现有技术相比，本发明利用柠檬酸发酵后废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法所具有的创新点在于：

1)采用酶制剂进行生物法处理柠檬酸发酵后废弃物，既不同于现有的强酸强碱的方法对环境的危害，也不同于现有方法中指将废弃物制备成甲壳素或壳聚糖，而是利用甲壳素酶降解废菌丝体直接获得甲壳低聚糖，其在成本和效率上具有更大优势。

2)采用了简单的三步法降解制备甲壳低聚糖，即：0.5mol/L NaOH浸泡、蜗牛酶酶法破壁和甲壳素酶降解，可直接获得乙酰氨基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖二糖。其产物组分具有一定的稳定性。

综上，本发明利用酶法降解柠檬酸发酵废弃物，一方面能够降低发酵对环境的污染；另一方面，该发明可以利用废弃物更简便的直接获得甲壳低聚糖，并加少了酸碱的用量。

附图说明

图1为本发明利用柠檬酸发酵后废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法的路线图。

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

从-20℃下冰冻的柠檬酸厂废渣样品中取样，称取10g，其含水量为74.3wt％。先用清水冲洗废渣样品，然后用60目筛过滤，再用300目筛收集，将收集到的废菌丝体晾干，称重备用。用100mL 0.6mol/L NaCl溶液浸泡预处理后的废菌丝体8个小时，然后8000rpm离心10min，取沉淀备用。将上述沉淀用纯净水清洗两次，处理好的沉淀以十倍体积pH5.6的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液作为酶解缓冲液，用4wt％蜗牛酶酶解破壁，酶解温度为50℃，磁力搅拌。反应4个小时后用沸水煮20min用以灭蜗牛酶酶活，8000rpm离心10min后，取沉淀备用。将上述沉淀用纯净水清洗两次，处理好的沉淀以十倍体积pH7.0的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液作为酶解缓冲液，用甲壳素酶ChiA酶解，温度为37℃，磁力搅拌。反应4天后用沸水煮20min用以灭甲壳素酶酶活，12000rpm离心10min，取上清液与乙腈以3:7的比例混合，用HPLC/MS检测出降解产物为乙酰氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖二糖，其降解产量为2.58wt％(以菌丝体干重计)。

实施例2

从-20℃下冰冻的柠檬酸厂废渣样品中取样，称取10g，其含水量为74.3wt％。先用清水冲洗废渣样品，然后用60目筛过滤，再用300目筛收集，将收集到的废菌丝体晾干，称重备用。用100mL 0.5mol/L HCl溶液浸泡预处理后的废菌丝体8个小时，然后8000rpm离心10min，取沉淀备用。将上述沉淀用纯净水清洗两次，处理好的沉淀以十倍体积pH5.4的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液作为酶解缓冲液，用0.3wt％甲壳素酶ChiA酶解，温度为37℃，磁力搅拌。反应4天后用沸水煮20min用以灭甲壳素酶酶活，12000rpm离心10min，取上清液与乙腈以3:7的比例混合，用HPLC/MS检测出降解产物为乙酰氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖二糖，其降解产量为4.37wt％(以菌丝体干重计)。

实施例3

从-20℃下冰冻的柠檬酸厂废渣样品中取样，称取10g，其含水量为74.3wt％。先用清水冲洗废渣样品，然后用60目筛过滤，再用300目筛收集，将收集到的废菌丝体晾干，称重备用。用100mL 0.5mol/L NaOH溶液浸泡预处理后的废菌丝体8个小时，然后8000rpm离心10min，取沉淀备用。将上述沉淀用纯净水清洗两次，处理好的沉淀以十倍体积pH5.4的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液作为酶解缓冲液，用0.3wt％甲壳素酶ChiA加4wt％灭活的蜗牛酶酶解，温度为37℃，磁力搅拌。反应4天后用沸水煮20min用以灭甲壳素酶酶活，12000rpm离心10min，取上清液与乙腈以3:7的比例混合，用HPLC/MS检测出降解产物为乙酰氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖二糖，其降解产量为9.44wt％(以菌丝体干重计)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将发酵柠檬酸的废菌丝体用水冲洗，过滤，收集，然后将收集到的废菌丝体晾干；

(2)将晾干的废菌丝体用0.3～0.6mol/L的酸、碱或盐溶液浸泡，过滤，然后水洗废菌丝体至滤液呈无色且pH≈7.0；

(3)将步骤(2)处理得到的废菌丝体用甲壳素酶降解制备得到甲壳低聚糖溶液；

(4)将甲壳低聚糖溶液通过HPLC检测得到甲壳低聚糖。

2.根据权利要求1所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将步骤(2)处理得到的废菌丝体在甲壳素酶降解之前用蜗牛酶或纤维素酶酶解破壁。

3.根据权利要求2所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：所述的蜗牛酶或纤维素酶酶解破壁步骤，采用的酶解缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，蜗牛酶或纤维素酶的用量为废菌丝体的4wt％，酶解温度为50℃，pH为5.6，酶解时间为4小时。

4.根据权利要求1所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，在甲壳素酶降解的同时加入灭活的蜗牛酶辅助降解。

5.根据权利要求1～4任一项所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：步骤(1)中采用60目筛网过滤、300目筛网收集废菌丝体。

6.根据权利要求1～4任一项所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：步骤(2)中将晾干的废菌丝体用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡8-12小时。

7.根据权利要求1～4任一项所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：步骤(3)所述的甲壳素酶为基因重组蛋白，其制备方法为：重组大肠杆菌经诱导表达，然后经破碎、分离、纯化获得重组甲壳素酶。

8.根据权利要求1～4任一项所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：所述的甲壳素酶用量为废菌丝体的0.3wt％。

9.根据权利要求1～4任一项所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：步骤(3)所述的甲壳素酶降解，降解温度37℃，降解pH为7.0-8.0，降解时间为4天，采用的酶解缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。

10.根据权利要求1～4任一项所述的利用发酵柠檬酸废菌丝体制备甲壳低聚糖的方法，其特征在于：制备得到的甲壳低聚糖为乙酰氨基葡萄糖和/或乙酰氨基葡萄糖二糖。