CN101538335B - 从发酵法生产衣康酸产生的土曲霉废菌丝体中提取壳聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从发酵法生产衣康酸产生的土曲霉废菌丝体中提取壳聚糖的方法，将土曲霉废菌丝体与盐酸混合、浸泡、过滤回收菌丝体，干燥；再与氢氧化钠溶液混匀，温度90～95℃反应8-9小时，过滤回收滤饼、干燥，制得的干滤饼与盐酸溶液按比例混匀，60-62℃浸泡5-6小时，离心回收沉淀，干燥即为壳聚糖粗品，壳聚糖粗品与氢氧化钠溶液按1∶5的质量比混匀，18-22℃搅拌30-35分钟，离心回收沉淀，洗涤，干燥得精品壳聚糖。壳聚糖产品用途广泛，本发明以衣康酸发酵产生的土曲霉废菌丝体为原料提取壳聚糖，提取率达到12％以上，减少了污染。

Description

从发酵法生产衣康酸产生的土曲霉废菌丝体中提取壳聚糖的方法

技术领域

本发明涉及到一种提取壳聚糖的方法，尤其涉及到利用衣康酸发酵产生的土曲霉废菌丝体提取壳聚糖的方法，属于工业废弃物资源化利用技术领域。

背景技术

衣康酸(Itaconic acid)又称为甲叉丁二酸、亚甲基琥珀酸，衣康酸及其酯类是生产腈纶等化纤、合成树脂、塑料、橡胶、药物、表面活性剂、无毒食品包装材料、除草剂、乳胶、除垢剂、粘合剂等的重要工业原料，是一种应用前景十分广阔的化学合成中间体，广泛应用于化工、医药、造纸、纺织、印刷等领域。

衣康酸生产方法主要有发酵法和化学合成法，参见刘建军，衣康酸发酵的研究[P]，天津科技大学博士论文，2003。发酵法原料来源丰富、生产条件温和、易于控制、产品成本相对较低，在经济上占有一定优势，因此，国际上多采用该方法；化学合成法又根据采用的原料不同，主要分为柠檬酸合成法和石油化工产品合成法，由于化学合成法存在许多不足，到目前为止这一工艺方法尚没有应用于衣康酸的工业化生产。

发酵法生产衣康酸是以糖类为主要原料，补充适当的氮源和无机盐，控制适宜的温度等条件，利用衣康酸生产菌种土曲霉转化葡萄糖生成衣康酸，发酵液经除杂、提取、精制等工序制备成品衣康酸。我国发酵法生产衣康酸是在上世纪末才研究成功的新技术，在衣康酸发酵过程中，土曲霉的繁殖、菌丝体的积累是衣康酸发酵生产必需的，但发酵结束后形成的土曲霉废菌丝体的处理技术一直是人们关注的问题，尤其是环境友好意识以及资源利用意识的加强，工业废弃物资源化利用技术的研究已引起广泛重视。

废菌丝体作为发酵行业的主要固体废渣，数量巨大。早期的处理方案主要是直接作为饲料、锅炉焚烧或丢弃，由于多数废菌丝体成分复杂、具有异味、适口性差，直接作为饲料效果不好，锅炉焚烧或丢弃造成了资源浪费和环境污染。而废菌丝体中含有多种有用的成分，进行有效的分离，可以提高其附加值，废菌丝体的资源化利用技术在柠檬酸、啤酒行业等行业的研究参见曹健，黑曲霉几丁质和壳聚糖的研究[M].微生物学通报，1995，22(4)：200-203.和陈忻等，用丝状真菌制备壳聚糖的研究[M].精细化工，2000，3：133-135，和李浪等，从柠檬酸生产废渣中提取壳聚糖的研究[M].粮食流通技术，2004，1：40-42。

几丁质是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4糖苷键连接起来的直链多聚物，又称甲壳质或甲壳素，几丁质在自然界的储量位居第二，仅次于纤维素，几丁质是白色或灰白色无定型、半透明固体，不溶于水、稀酸、稀碱、浓碱和一般有机溶剂，可溶于浓盐酸、硫酸、磷酸和无水甲酸。无论是天然存在的几丁质还是人工制备的几丁质，并不是每个糖基上都有N-乙酰基，几丁质分子中糖基与N-乙酰基结合的程度以N-乙酰度表示，通常，N-乙酰度低于55％称为壳聚糖，N-乙酰度大于55％称为几丁质，参见MuzzarelliR.A.A.Chitin[M]，Oxford：Perga-monPree，1977。壳聚糖由于分子内含有活泼的羟基和氨基等基团，可发生多种化学反应，并具有很好的生物相容性、吸湿性、吸附性、成膜性和保湿性，无毒、易生物降解，在医药、农业、环保、纺织、印染、造纸、生物发酵等领域具有广泛的用途，参见苏海佳等，交联菌丝体吸附剂的制备及其对Cr³⁺的吸附性[M].环境污染治理技术与设备：2005，8：10-13。几丁质广泛存在于海洋节肢动物(如虾、蟹)的甲壳和植物、某些微生物的细胞壁中，如丝状真菌中的黑曲霉、土曲霉等。目前壳聚糖主要从虾、蟹壳中提取得到，市场价格非常昂贵。

衣康酸发酵产生的土曲霉菌丝体是衣康酸生产中主要的固体废渣，板框压榨的湿渣占总发酵液的2％(W/V)，含水50％左右。由于废菌丝体中含有少量残留衣康酸，适口性差，不能直接作为动物饲料，目前衣康酸工厂所采用的主要处理方式是锅炉烧掉或空场堆放，待风干后集中填埋，由于菌体自溶并产生恶臭，尤其是夏季，环境污染严重。土曲霉属于真菌类，菌体细胞壁的主要成分是壳聚糖或几丁质，约占菌体干重的20％左右。以土曲霉衣康酸发酵废菌丝体为原料提取生产壳聚糖，不但为工业废水处理提供高效絮凝剂，为医药、食品和化工行业提供重要的原料，而且还为衣康酸发酵工厂解决固体废渣的污染，变废为宝，实现循环经济开辟了一条新途径，具有重要的社会效益、经济效益和环境效益。

发明内容

为实现衣康酸发酵中产生的土曲霉废菌丝体的资源化利用，提高其利用价值，减少污染，本发明提供一种利用土曲霉废菌丝体提取壳聚糖的方法。本发明方法可以实现从土曲霉衣康酸发酵废菌体提取壳聚糖，壳聚糖提取率达到12％以上(相对干菌丝体计)。

本发明所述利用土曲霉废菌丝体提取壳聚糖，步骤如下：

(1)衣康酸发酵土曲霉废菌体的预处理

衣康酸发酵产生的土曲霉废菌体除菌丝体外，含有许多其他成分，吸附了残留的培养基以及代谢产物、菌丝自溶物、色素、无机盐等，在用于提取壳聚糖以前，必须进行预处理，预处理的目的主要是去除上述杂质组分。

预处理方法是：将含水率10％以下的土曲霉废菌丝体与10～30g/L的盐酸按1∶4～8的质量比均匀混合，温度30℃、浸泡时间2-3小时，期间每隔30分钟搅拌5分钟。然后过滤回收菌丝体，水洗至pH值中性，60℃干燥至水分10％以下。

(2)衣康酸发酵土曲霉废菌丝体蛋白的去除

土曲霉衣康酸发酵废菌体中蛋白质的比例大，蛋白质含量达44-50％，菌体蛋白的存在对壳聚糖的提取影响很大，将步骤(1)获得的预处理后的干菌丝体用于提取壳聚糖以前，必须尽可能的除去其中的蛋白质。

土曲霉废菌丝体蛋白的去除方法是：将步骤(1)获得的预处理后的干菌丝体与30～50g/L的氢氧化钠溶液混合均匀，NaOH溶液与干菌丝体的质量比为30～40∶1，温度控制在90～95℃，反应时间为8-9小时。然后，过滤回收滤饼，水洗滤饼至pH值中性，60℃干燥至水分10％以下，蛋白去除率在85％以上。得干滤饼。

(3)壳聚糖粗品的制备

步骤(2)获得的脱蛋白以后的土曲霉菌丝体的成分主要是几丁质，及非甲壳素糖类杂质，而脱乙酰度大于55％的几丁质才称为壳聚糖，需要对其中的几丁质进行脱乙酰，制备壳聚糖粗品。具体方法如下：

将步骤(2)制得的干滤饼与30～50g/L的盐酸溶液按1∶5～10的质量比混合均匀，温度控制在60-62℃，浸泡5-6小时，期间每隔30分钟搅拌5分钟。4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性，60℃干燥至水分10％以下即为壳聚糖粗品，脱乙酰度80％以上。

(4)壳聚糖的精制

步骤(3)获得的壳聚糖粗品除含有壳聚糖外，还含有部分非甲壳素糖类、核酸等杂质，要获得精制的壳聚糖产品，必须对壳聚糖粗品进行精制，精制方法是：

将步骤(3)获得的壳聚糖粗品与40g/L的氢氧化钠溶液按1∶5的质量比混合均匀，18-22℃搅拌30-35分钟，4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性。然后，分别用10倍体积的95％的乙醇和丙酮分别洗涤，回收滤饼，25-60℃干燥，制得精品壳寡糖。

本发明方法的壳聚糖提取率达到12％以上(相对干菌丝体)，得到的壳聚糖样品经红外线法鉴定，与标准壳聚糖结构一致。

上述步骤(1)所述的盐酸浓度优选20g/L，土曲霉废菌丝体与盐酸质量比优选1∶5。

上述步骤(2)所述的氢氧化钠溶液浓度优选40g/L，NaOH溶液与干菌丝体的质量比优选1∶4，浸泡温度控制优选92℃。

上述步骤(3)所述的盐酸浓度优选40g/L，干滤饼与盐酸溶液质量比优选1∶8。

上述的废菌丝体蛋白的测定采用GB/T14771-93微量凯氏定氮法。

上述的废菌丝体粗脂肪的测定采用索氏抽提法(GB 5512-85)。

上述的废菌丝体灰分按下述的方法测定：

将称得的样品，先在电炉上烧至无烟，再放进马福炉中550摄氏度灼烧2至4h，直至恒重(两次称重之差不大于0.2毫克)。

上述的废菌体粗纤维的测定采用GB/T5009.10-2003中的方法。

上述的壳聚糖提取率按下述的方法计算：

$Y_{\mathrm{chitosan}}=\frac{W_{\mathrm{chitosan}}}{W_{\mathrm{dry}}}\×100\%$

式中：Y_chitosan-壳聚糖提取率(％)

W_chitosan-壳聚糖重量(g)

W_dry-干菌体重量(g)

上述的脱乙酰度(DD)按下述方法测定：

双突跃电位滴定法：参阅参考文献[贾之慎，李奇彪.双突跃电位滴定法测定壳聚糖脱乙酰度.化学世界，2001，(5)：240-241]。

原理：壳聚糖胺基呈游离态，属伯胺，具有阳离子性质，可与酸定量地发生质子化，形成壳聚糖的胶体溶液，溶液中过量的酸，可以用碱液进行反滴，这样，通过溶解壳聚糖样品的酸量与滴定用去的碱量之差，就可推算出与壳聚糖中自由氨基结合的酸的量，即样品壳聚糖中自由氨基的量。双突跃电位滴定法是以溶液的pH值对NaOH标准溶液滴定体积作图，即得到酸碱滴定曲线，做pH值对V_NaOH的一级微商曲线，得到双突跃滴定曲线，通过两突跃点之间消耗NaOH标准溶液的差值可以计算出壳聚糖样品的脱乙酰度。

考虑到壳聚糖制备过程中可能残留的酸碱会对结果造成一定的影响，将壳聚糖样品预先装柱，水洗至中性，置于105℃烘箱中烘至恒重后，放入干燥器中。

步骤：精密称取约0.2克样品(三份，分别为样品1、样品2、样品3)，置于250mL三角烧瓶或烧杯中，加入0.1mol/L的标准盐酸溶液25.00mL，于室温下用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加入蒸馏水20.00mL，作为待测样品溶液。

用0.1mol/L的标准NaOH溶液进行滴定(慢滴，磁力搅拌)，每滴加约0.50mLNaOH标准溶液，记下体积V及相应pH值，直至pH＞10，以溶液的pH值对NaOH滴定体积作图，得酸碱滴定曲线，以ΔpH对ΔV做一级微商曲线，即得双突跃滴定曲线，由两突跃点之差就可计算出样品的脱乙酰度。

计算公式：由壳聚糖脱乙酰度的定义(分子中脱除乙酰基的链结数与总链结数的百分比)可知：

$\mathrm{DD}(\%)=\frac{n}{N}\×100\%=\frac{n}{n+\frac{W-161n}{203}}\×100\%=\frac{203n}{W+42n}\×100\%$ 式(1)

n＝C₂(V₂-V₃)/1000                    式(2)

根据不同的终点判定方式选择不同的公式

氨基质量分数为：

$W_{-\mathrm{NH}2}(\%)=\frac{16n}{W}\×100\%$ 式(3)

所以，壳聚糖脱乙酰度也可用氨基质量分数表示为：

$\mathrm{DD}(\%)=\frac{203{\mathrm{WW}}_{-\mathrm{NH}2}/16}{W+42{\mathrm{WW}}_{-\mathrm{NH}2}/16}\×100\%=\frac{203W_{-\mathrm{NH}2}}{16+42W_{-\mathrm{NH}2}}\×100\%$ 式(4)

式中：

W-壳聚糖样品的质量，g(以干基计)；

W_-NH2-氨基质量分数％

n-Wg壳聚糖样品中氨基葡萄糖残基的物质的量，mol；

N-Wg壳聚糖样品中N-乙酰氨基葡萄糖残基的物质的量，mol；

C₁-标准HCl溶液的浓度，mol/L；

C₂-标准NaOH溶液的浓度，mol/L；

V₁-溶解样品时所加的标准HCl溶液的体积，mL；

V₂-到达滴定终点时所消耗标准NaOH溶液的体积，mL；

V₃-出现第一突变点时消耗标准NaOH溶液的体积，mL；

203-N-乙酰氨基葡萄糖残基的相对分子量；

161-氨基葡萄糖残基的相对分子量；

16-氨基的相对分子量。

壳聚糖产品用途广泛，市场前景广阔，本发明以衣康酸发酵产生的土曲霉废菌丝体为原料提取壳聚糖，提取率达到12％以上(相对干菌体)，提高了土曲霉废菌丝体的利用价值，减少了污染，具有良好的推广应用前景。目前尚未检索到利用衣康酸发酵产生的土曲霉废菌丝体为原料提取壳聚糖的文献报道。

附图说明

图1是本发明实施例1得到的壳聚糖样品红外光谱图，图2为标准商品壳聚糖红外光谱图。

具体实施方式

以下实施例中使用的原料废菌丝体为青岛琅琊台集团股份有限公司生产衣康酸过程中产生的风干的土曲霉废菌丝体，主要成分组成(干)：蛋白质44-50％，粗纤维30-35％，粗脂肪4-5％，灰分2-4％。

实施例1

(1)衣康酸发酵土曲霉废菌体的预处理

称取水分含量9.8％的土曲霉废菌体10Kg，置于带有多孔假底的不锈钢抽滤罐中(假底孔的直径为2mm，开孔率为40％)，加入50L、20g/L的盐酸，搅拌均匀，控制温度30℃，每30分钟搅拌5分钟，浸泡2小时后，利用菌体形成的滤层自然过滤回收菌体，自来水洗涤上述菌体至pH值中性，抽滤至水分含量在60％左右，60℃滚筒干燥至水分10％以下。土曲霉废菌体的预处理后，由红褐色变为乳白色，通过预处理，获得乳白色菌体8.45Kg，水分含量8.4％，菌体损失率8.58％。

(2)衣康酸发酵土曲霉废菌体蛋白的去除

将步骤(1)获得的乳白色菌体8.45Kg，置于带有多孔假底的不锈钢抽滤罐中，(假底孔的直径为2mm，开孔率为40％)，加入38L、40g/L的氢氧化钠溶液，混合均匀，温度控制在92℃，每30分钟搅拌5分钟，浸泡3小时。然后，抽滤回收滤饼，自来水洗涤至pH值中性，60℃滚筒干燥至水分10％以下。获得脱蛋白菌体4.84Kg，水分8.8％，蛋白含量8.47％，菌体蛋白含量由47.80％减少到8.47％，菌体蛋白脱除率为89.92％。

(3)壳聚糖粗制品的制备

将步骤(2)的干菌丝滤饼4.84Kg与50L、40g/L的盐酸溶液混合均匀，温度控制在60℃，浸泡5小时，期间每30分钟搅拌5分钟。4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性，60℃干燥，获得壳聚糖粗品2.24Kg，水分9.4％。

(4)壳聚糖的精制

将获得的壳聚糖粗品2.24Kg与40g/L的氢氧化钠溶液按1∶5的比例，混合均匀20℃搅拌30分钟，4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性。然后，分别用10倍的95％的乙醇和丙酮洗涤，回收滤饼，60℃干燥，获得精制壳寡糖1.32Kg，水分9.1％。壳聚糖提取率达到13.3％(相对干菌丝体计)，脱乙酰度84.5％。

实施例2.

(1)衣康酸发酵土曲霉废菌体的预处理

称取水分含量8.1％的土曲霉废菌体5Kg，置于带有多孔假底的不锈钢抽滤罐中(假底孔的直径为2mm，开孔率为40％)，加入10L、20g/L的盐酸，搅拌均匀，控制温度35℃，每30分钟搅拌一次，2小时后，利用菌体形成的滤层自然过滤回收菌体，水洗上述菌体至pH值中性，抽滤至干，60℃干燥箱烘干2小时，获得乳白色菌体4.05Kg，水分含量7.5％，菌体损失率18.5％。

(2)衣康酸发酵土曲霉废菌体蛋白的去除

将步骤(1)获得的菌体，置于带有多孔假底的不锈钢抽滤罐中，(假底孔的直径为2mm，开孔率为40％)，加入14L、40g/L的氢氧化钠溶液，混合均匀，温度控制在95℃以上，连续搅拌30分钟后，浸泡2小时。真空抽滤并回收滤饼，自来水洗涤至pH值中性，获得脱蛋白菌体2.74Kg，水分20.8％，菌体蛋白含量由45.60％减少到7.47％。

(3)壳聚糖粗制品的制备

将步骤(2)的菌丝滤饼与18L、40g/L的盐酸溶液混合均匀，温度控制在55℃，浸泡6小时，4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性，60℃干燥，获得壳聚糖粗品1.04Kg，水分7.4％。

(4)壳聚糖的精制

将步骤(3)获得的壳聚糖粗品与40g/L的氢氧化钠溶液按1∶5的比例，混合均匀20℃搅拌30分钟，4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性。然后，分别用10倍的95％的乙醇和丙酮洗涤，回收滤饼，60℃干燥，获得精制壳寡糖0.58Kg，水分8.4％。壳聚糖提取率达到12％(相对干菌丝体计)，脱乙酰度86.1％。

Claims (4)

1.利用土曲霉废菌丝体提取壳聚糖的方法，步骤如下：

(1)将含水率10％以下的土曲霉废菌丝体与10～30g/L的盐酸按1∶4～8的质量比均匀混合，温度30℃、浸泡时间2-3小时，期间每隔30分钟搅拌5分钟；然后过滤回收菌丝体，水洗至pH值中性，60℃干燥至水分10％以下；

(2)将步骤(1)制得的干菌丝体与30～50g/L的氢氧化钠溶液混合均匀，NaOH溶液与干菌丝体的质量比为30～40∶1，温度控制在90～95℃，反应时间为8-9小时，去除蛋白；然后，过滤回收滤饼，水洗滤饼至pH值中性，60℃干燥至水分10％以下，得干滤饼；

(3)将步骤(2)制得的干滤饼与30～50g/L的盐酸溶液按1∶5～10的质量比混合均匀，温度控制在60-62℃，浸泡5-6小时，期间每隔30分钟搅拌5分钟；4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性，60℃干燥至水分10％以下即为壳聚糖粗品；

(4)将步骤(3)获得的壳聚糖粗品与40g/L的氢氧化钠溶液按1∶5的质量比混合均匀，18-22℃搅拌30-35分钟，4000r/min、离心15分钟回收沉淀，水洗至中性；然后，分别用10倍体积的95％的乙醇和丙酮分别洗涤，回收滤饼，25-60℃干燥，制得精品壳聚糖。

2.如权利要求1所述的利用土曲霉废菌丝体提取壳聚糖的方法，其特征在于步骤(1)所述的盐酸为20g/L。

3.如权利要求1所述的利用土曲霉废菌丝体提取壳聚糖的方法，其特征在于步骤(1)所述的土曲霉废菌丝体与盐酸质量比为1∶5。

4.如权利要求1所述的利用土曲霉废菌丝体提取壳聚糖的方法，其特征在于步骤(3)所述的盐酸浓度为40g/L，干滤饼与盐酸溶液质量比为1∶8。

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