CN1133746C - 游离细胞重复利用多次转化制备木糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种重复利用微生物细胞转化木糖或木质素、半纤维素水解物制备木糖醇的方法，木糖醇的产率最高达到0.84g/g木糖，反应液中木糖醇浓度最高达到178.77g/L。该方法工艺简单、成本低、产率高，可利用廉价原料生产木糖醇，对木糖醇的生产有实际意义。
Description
本发明属生物技术领域，具体地说是用异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)细胞生物转化的方法将木糖转化制备木糖醇。
木糖醇是自然界存在的一种五碳糖醇。作为一种甜味剂，由于它不会导致龋齿，且具有较高的甜度，近年来它引起人们越来越多的注意。木糖醇的代谢无须胰岛素的调节，因此在临床上被用作糖尿病患者食物中的蔗糖的替代品。同时，它的代谢过程也无须6-磷酸葡萄糖脱氢酶的作用，因此它也是6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症患者理想的食用甜味剂。
在自然界中，木糖醇存在于许多水果和蔬菜中，如覆盆子、草霉、莴苣、花椰菜等，但由于含量很低，直接提取非常困难且较为昂贵。目前工业上都用木糖化学催化加氢生产木糖醇(Jaffe et al：US 3.787,408)。木糖则由玉米芯、木材、甘蔗渣或其它木聚糖含量较丰富的原料经水解得到，但这种方法也存在以下一些问题：
一、制氢、加氢设备较复杂，设备投资及操作费用均较大；
二、加氢前原料需经多步纯化，工艺复杂；
三、化学加氢催化剂无专一性，造成产品中杂醇多且不易分离，不但增加了后处理成本，而且产品质量难以提高。
由于化学加氢存在的这些问题，微生物发酵法引起了科学家的兴趣。生物化学反应的条件温和，专一性强，氢直接来自细胞中的辅酶。这些特点克服了化学加氢法分离纯化过程复杂、制氢与加氢设备昂贵等缺点。用纯木糖发酵可达到较高的水平，木糖转化率(消耗)达97.5-100％，木糖醇产率达0.46-0.7g/g(木糖)，发酵180小时木糖醇浓度达200g/L(Meyrial，V etal：Biotechnol.Lett.13(4)：281-286，1991)，此外还克隆了木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因，并在啤酒酵母中得到表达(Hallborn，J.etal：Biotechnol.9：1090-1095，1991)。但是用纯木糖发酵因原料成本太高而难于产业化。
直接用含木聚糖的廉价原料如玉米芯、木材、甘蔗渣等的水解液进行发酵，可以大大降低成本，但由于这些水解液中含有抑制细胞生长的物质，因此发酵水平不高，发酵100小时木糖醇浓度仅为8-17g/L(Paraj，J.L.etal：Enzyme Microbial Technol.21：18-24，1997)。
微生物还原木糖生产木糖醇的原理是：
随着反应的进行，细胞内消耗的NADPH必需得到补充(再生)，因此，下面的反应为：
NADPH的再生消耗了木糖醇，因此木糖醇对木糖的理论产率在实际采用的半厌氧条件下为0.87g/g(Maria F.S.Babosa et al：J.IndustrialMicrobiology，3：241-252，1988)。虽然生物法生产木糖醇的产率较低，但比化学法仍有其优越性。
目前生物法生产木糖醇存在的一个主要问题是有相当一部分成本被用于培养细胞，因此尽管对细胞的性状用现代生物技术作了许多改进(Apajalahti et al：WO 93/01299)但培养一批细胞只能生产一批木糖醇，成本仍难以大幅度降低。
本发明的目的在于克服现有技术的缺欠，提高木糖醇的产率，利用酵母细胞多次重复使用进行木糖转化，降低生产成本，使微生物转化生产木糖醇的规模生产成为可能性。实现本发明的具体方法是用一株保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册的编号为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)突变株9922，CGMCCNo.0551。细胞培养后与培养基分离，用细胞转化木糖或木质素、半纤维素(玉米芯、甘蔗渣、秸杆、碎木等)水解物为木糖醇。将保存在斜面培养基(2％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，2％琼脂，自然pH)上的酵母菌接于液体培养基(葡萄糖和/或蔗糖和/或麦芽糖和或木糖0.1-5.0％，有机和/或无机氮源0.02-2.0％，pH4.0-6.5)中，在24-37℃振荡培养，培养时间可控制在8-96小时之间，以12-48小时为最佳，然后离心收集细胞。该细胞与含木糖溶液反应。将固体木糖或浓缩后的含木糖底物分次加入反应体系，反应一次结束。木糖溶液中木糖浓度在1％-50％之间，以6％-35％最佳，木糖可以一次加入或流加；反应温度范围可以为18-58℃，以25-40℃最佳；反应时间可以控制在12-300小时之间，最佳反应时间为18-240小时；细胞可重复使用。反应液中木糖转化为木糖醇，木糖醇浓度最高可达200g/L，产率为0.5-0.8g/g。
本发明与现有技术比，有如下特点：
一、采用微生物转化法，将细胞培养与木糖醇转化分别进行，因此既可利用价格低廉的水解物作原料，又避免了发酵法中细胞生长受抑制的问题，分次转化液木糖醇浓度可达30-60g/L，流加木糖转化液木糖醇浓度可达160-180g/L，木糖醇对木糖产率0.5-0.8g/g，达到纯木糖发酵水平，而可比纯木糖发酵大大降低成本。
二、游离细胞可多次重复使用，在转化5-10次时细胞的仍保持约50％的活力，这样培养的游离细胞，既有固定化细胞可多次重复使用的长处，又避免了固定化带来的增加工艺过程、降低细胞活力等问题，从而进一步降低了成本。
三、本方法除细胞培养时需无菌操作，转化反应可在简单的设备和控制条件下进行。由于细胞可多次利用，细胞培养只占整个工艺的一小部分，因此本方法的设备与工艺均比现有技术简单。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例：1
从麦牙汁斜面培养基上挑取一环菌体接于30ml液体种子培养基中，于30℃摇床上以200rpm培养20小时后，取3ml液体培养物转入60ml发酵培养基中，以同样条件培养菌体24小时。取50ml发酵液以8000rpm离心10分钟收集菌体，所得菌体用于转化木糖制备木糖醇的反应。
实验中种子培养基与发酵培养基的组成如下：
种子培养基：葡萄糖和/或蔗糖和/或麦芽糖和或木糖0.1-4.0％，有机和/或无机氮源0.01-2.0％，pH4.5-6.5。
发酵培养基：葡萄糖和/或蔗糖和/或麦芽糖和或木糖0.1-5.0％，有机和/或无机氮源0.02-2.0％，pH4.0-6.5。
用10ml蒸馏水悬浮例1中所得菌体，并将其转入100ml三角瓶中。向瓶中加入0.8g木糖和0.05g葡萄糖与菌悬液混匀后在摇床上进行转化反应，反应温度为30℃，摇床转速为200rpm。反应22小时后停止，离心分离菌体与反应液，菌体用于重复转化反应。反应上清液取样后测定木糖和木糖醇的浓度并计算木糖醇产率及反应强度。
实施例：2
重复实施例1中的步骤进行菌体对木糖的反复转化，菌体对木糖反复转化十次，每次转化反应的结果如下表所示。
| 一 | 二 | 三 | 四 | 五 | 六 | 七 | 八 | 九 | 十 | |
| 木糖醇浓度(g/L) | 44. | 40. | 41. | 39. | 38. | 41. | 42. | 43. | 40. | 34. |
| 木糖醇产率(g/g) | 10.5 | 70.5 | 00.5 | 60.5 | 50.5 | 80.5 | 10.5 | 80.5 | 40.5 | 10.4 |
| 反应强度(g/L.h) | 62.0 | 61.7 | 51.5 | 51.4 | 40.8 | 50.8 | 80.9 | 81.0 | 10.8 | 40.4 |
0 0 7 1 4 9 2 1 8 9
实施例：3
称取500g玉米芯，用开水洗静，再将其浸于2％硫酸溶液中至总体积为5000ml，加热至121℃(1大气压)水解2小时。压滤除去固形物得玉米芯水解液，其中D-木糖含量约为5％。
分别用阴、阳离子交换树脂及活性炭对水解液进行中和、除离子及脱色等提纯步骤，再将其减压浓缩至木糖浓度为8％，此水解液用作酵母细胞转化的原料。实施例：4
按照例1所述方法发酵制备转化反应所需酵母菌体，并将其与36ml例3中的水解液混合后转入250ml三角瓶中，置于摇床上进行转化反应，反应温度为30℃，摇床转速为220rpm。反应48小时后停止，离心分离菌体与反应液，菌体用于重复转化反应。反应上清液取样后测定木糖和木糖醇的浓度并计算木糖醇产率及反应强度。
重复上述步骤进行菌体对木糖的反复转化，菌体对木糖反复转化七次，每次转化反应的结果如下表所示。
实施例：5
| 一 | 二 | 三 | 四 | 五 | 六 | 七 | |
| 木糖醇浓度(g/L) | 64.2 | 63.4 | 61.4 | 55.8 | 49.8 | 51.5 | 50.5 |
| 木糖醇产率(g/g) | 0.84 | 0.84 | 0.83 | 0.79 | 0.75 | 0.71 | 0.71 |
| 反应强度(g/L.h) | 1.34 | 1.32 | 1.28 | 1.16 | 0.94 | 0.72 | 0.53 |
称取1000g风干的甘蔗渣，用5000ml 2％硫酸溶液将其浸泡后，加热至121℃(1大气压)水解1.5小时。压滤除去固形物即得甘蔗渣水解液，其中D-木糖含量约为3％。
分别用阴、阳离子交换树脂及活性炭对水解液进行中和、除离子及脱色等纯化过程，再将其减压浓缩至木糖浓度为8％，此水解液用作酵母细胞转化的原料。
实施例：6
按照例1所述方法发酵制备转化反应所需酵母菌体，并将其与36ml例5中的水解液混合后转入250ml三角瓶中，置于摇床上进行转化反应，反应温度为30℃，摇床转速为200rpm。反应18小时后停止，离心分离菌体与反应液，菌体用于重复转化反应。反应上清液取样后测定木糖和木糖醇的浓度并计算木糖醇产率及反应强度。
重复上述步骤进行菌体对木糖的反复转化，菌体对木糖反复转化五次，每次转化反应的结果如下表所示。
实施例：7
| 第一次 | 第二次 | 第三次 | 第四次 | 第五次 | |
| 木糖醇浓度(g/L) | 39.5 | 39.2 | 39.0 | 36.8 | 31.2 |
| 木糖醇产率(g/g) | 0.54 | 0.53 | 0.50 | 0.47 | 0.41 |
| 反应强度(g/L.h) | 1.41 | 1.32 | 1.15 | 0.91 | 0.52 |
按照例1所述方法发酵制备转化反应所需酵母菌体，将其与2.88g木糖和36ml水混合后转250ml三角瓶中，置于摇床上进行转化反应，反应温度为30℃，摇床转速为220rpm。每隔24小时加1.35g木糖，共流加6次，反应于238小时结束。离心分离菌体与反应液，菌体用于第二批转化反应。反应上清液取样后测定木糖和木糖醇的浓度并计算木糖醇产率及反应强度。
重复上述步骤进行菌体对木糖的转化反应，每批转化反应的结果如下表所示。
| 第一批(六次) | 第二批(六次) | |
| 木糖醇浓度(g/L) | 178.77 | 169.07 |
| 木糖醇产率(g/g) | 0.56 | 0.56 |
| 反应强度(g/L.h) | 0.78 | 0.70 |
Claims (12)
1.一种木糖醇的制备方法，该方法包括先培养异常汉逊氏酵母Hansenula anomala细胞突变株9922，CGMCCNo.0551；培养后的酵母细胞与培养基分离得到游离细胞；利用该游离细胞转化含木糖的底物；含木糖底物一次性或经流加的方式与游离细胞混合进行反应制备木糖醇；将反应后的酵母细胞与反应液分离，细胞可重复多次与木糖底物进行反应制备木糖醇。
2.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其特征在于先培养异常汉逊氏酵母Hansenula anomala突变株9922，CGMCC No.0551细胞的培养基组分中含有木糖或木质素、半纤维素水解物；葡萄糖；酵母膏；蛋白胨。
3.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其特征在于细胞培养过程中的温度范围为24-37℃。
4.根据权利要求3所述的细胞培养过程中的温度范围，其中最适温度范围为28-32℃。
5.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其特征在于细胞培养过程中，细胞培养的时间范围为8-96小时。
6.根据权利要求5所述的细胞培养时间范围，其中细胞培养的最适时间为12-48小时。
7.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其特征在于所用含木糖底物为木糖或木质素、半纤维素水解物包括玉米芯、甘蔗渣、秸杆、碎木。
8.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其特征在于含木糖底物与游离细胞混合进行反应制备木糖醇的反应温度范围为18-58℃。
9.根据权利要求8所述的制备木糖醇的反应温度范围，其中最佳反应温度范围为25-40℃。
10.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其特征在于含木糖底物与游离细胞混合进行反应制备木糖醇的反应时间范围为12-300小时。
11.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其中所述的木糖底物的流加方式其特征在于将固体木糖或浓缩后的含木糖底物分次加入反应体系，反应一次结束。
12.根据权利要求1所述的木糖醇的制备方法，其中所述的细胞可重复多次与木糖底物进行反应制备木糖醇是指将反应后的酵母细胞与反应液分离，与木糖底物混合后再次进行转化反应。
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