CN112592914B - 一种专用绿藻多糖裂解酶及其生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种专用绿藻多糖裂解酶及其生产工艺，属于海洋生物技术领域。本发明利用Alteromonas sp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13等微生物通过发酵法制备浒苔多糖裂解酶，该酶具有高效降解浒苔多糖及显著降粘的作用，可为今后浒苔活性物质提取及不同聚合度寡糖制备提供高效的酶制剂；）本发明通过发酵法制备浒苔多糖裂解酶，生产工艺简单，浒苔多糖裂解酶产率高，发酵液中酶活最高可为72.8U/ml，可为浒苔多糖的产业化发展提供强有力的支持，具有较好的产业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种专用绿藻多糖裂解酶及其生产工艺，属于海洋生物技术领域。
背景技术
我国海藻资源丰富，其资源化利用已经成为我国海洋经济发展的重点。浒苔是一种大型经济绿藻，俗称苔条、海苔，为绿藻门，石莼目石莼科植物。经研究发现，浒苔富含碳水化合物、蛋白质、粗纤维、氨基酸、脂肪酸、多糖、维生素和多种矿物元素，其中浒苔多糖的含量最高，主要由鼠李糖、木糖、葡萄糖及少量甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成，并含有糖醛酸和硫酸基，多糖主链含有多种连接键型。现代药理学研究证明浒苔多糖具有多种生理功能，例如降血糖血脂、抗氧化、抗菌、消炎、抗肿瘤、免疫等。目前，浒苔多糖的功能与活性在制药、功能性食品、天然食品添加剂、化妆品等行业均有应用。虽然浒苔多糖具有良好的生物活性，但因其自身较大的分子量和较高的粘度影响了其吸收性及生理功能，限制其进一步应用。研究发现通过物理、化学方法将多糖降解为分子质量较低的寡糖，降低固有粘度，可大大提高其使用价值和应用范围。
目前常用的浒苔多糖降解方法包括酸解法、微波辅助酸解法等，但通过酸解法得到的寡糖分子量分布较宽且糖链基团及结构受到一定程度影响；通过微波辅助酸解法得到的寡糖收率较低，且生产成本高。相较于物理、化学方法，生物酶法因具有特异性强、酶解条件温和、工艺简单及水解可控等特点，成为多糖降解的最理想手段。浒苔多糖作为一种聚阴离子异质多糖，其糖链结构特殊，现有的工具酶不能有效将其水解。因此，开发一种专用浒苔裂解酶对提高浒苔寡糖的资源化利用率具有十分重要的作用，也是本领域亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术中的不足，提供一种专用绿藻多糖裂解酶及其生产工艺，开发出高效的浒苔多糖降解酶，能够有效降解浒苔水溶性多糖，并具有显著降粘的作用，可为今后浒苔活性物质提取及不同聚合度寡糖制备提供专用酶制剂。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述海藻多糖裂解酶由微生物菌种发酵制备，其中所述微生物菌种包括Alteromonas sp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13中的一种或几种混合菌种。
上述微生物菌种中，Alteromonas sp.A321为交替单胞菌，由中国海洋大学食品科学与工程学院实验室筛选保藏；甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13由青岛海大生物集团有限公司筛选，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.7570、CGMCCNo.7285，可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心直接购买。
最优的，上述微生物菌种的组成为Alteromonas sp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13的混合菌种，其配伍比例为6:2:1。
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵6～10h，得到发酵种子液；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为6～10%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵24～48h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
优选的，上述酶解液可通过喷雾干燥或冷冻干燥制备得到固体绿藻多糖裂解酶。
上述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%。
上述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%。
本发明还保护所述绿藻多糖裂解酶在浒苔降解中的应用。
与现有技术相比，本发明的技术优势在于：
（1）本发明利用Alteromonas sp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13等微生物通过发酵法制备浒苔多糖裂解酶，该酶具有高效降解浒苔多糖及显著降粘的作用，可为今后浒苔活性物质提取及不同聚合度寡糖制备提供高效的酶制剂；
（2）本发明选用中国海洋大学筛选的能够产浒苔多糖裂解酶菌种Alteromonassp.A321和公司自主筛选的微生物菌种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13协同发酵，以浒苔为发酵基质，使得酶制剂为含有多种酶组成的复合酶系，显著提升了浒苔多糖裂解酶的酶解效果；
（3）本发明通过发酵法制备浒苔多糖裂解酶，生产工艺简单，浒苔多糖裂解酶产率高，发酵液中酶活最高可为72.8U/ml，显著优于李银平等的技术效果，可为浒苔多糖的产业化发展提供强有力的支持，具有较好的产业化应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵8h，得到发酵种子液；所述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；所述微生物菌种的组成为Alteromonassp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillussiamensis)L13的混合菌种，其配伍比例为6:2:1；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；所述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为8%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵36h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
实施例2
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵8h，得到发酵种子液；所述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；所述微生物菌种为Alteromonassp.A321；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；所述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为8%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵36h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
实施例3
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵8h，得到发酵种子液；所述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；所述微生物菌种为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；所述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为8%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵36h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
实施例4
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵8h，得到发酵种子液；所述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；所述微生物菌种为西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；所述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为8%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵36h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
实施例5
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵8h，得到发酵种子液；所述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；微生物菌种的组成为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13的混合菌种，其配伍比例为2:1；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；所述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为8%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵36h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
实施例6
一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵8h，得到发酵种子液；所述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；微生物菌种的组成为Alteromonassp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillussiamensis)L13的混合菌种，其配伍比例为8:2:1；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；所述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为8%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵36h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
实施例7
分别将实施例1-6所述浒苔多糖降解酶调节至酶活为200U/m L，按固定加酶量1.5%、底物质量浓度14mg/mL、酶解时间6h，反应结束后立即煮沸5min将酶灭活，测定其粘度和还原糖生成量。加2倍体积无水乙醇，4 ℃静置过夜，4000 r/min 离心 10 min，沉淀复溶至初始体积，测定总糖质量浓度，以加等量灭活酶制剂的处理作为对照组，计算多糖降解率。实验结果如表1所示：
表1 不同酶制剂对浒苔多糖降解效率的比较
根据上述实验结果可以发现：实施例1还原糖生成量、多糖降解率显著高于实施例2-6，粘度显著低于实施例2-6，说明在实施例1中交替单胞菌Alteromonas sp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13间具有显著的协同增效作用，为本发明最佳实施例；实施例2采用交替单胞菌Alteromonassp.A321发酵制备浒苔多糖裂解酶，与李银平报道的技术效果接近，但低于李银平等人的技术效果，分析原因可能是因为发酵培养基及培养条件的差异所致；实施例3-5实验结果表明利用单一的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13或两种菌种混合发酵制备浒苔多糖裂解酶，其技术效果与实施例1-2差异极显著；实施例6实验结果表明微生物菌种的接种比例对浒苔多糖裂解酶具有显著的影响。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述绿藻多糖裂解酶的生产工艺具体包括如下步骤：
（1）活化：将微生物菌种接种至活化培养基，调整初始pH为7.0，在28～35℃条件下发酵8h，得到发酵种子液；所述活化培养基的组成为：葡萄糖2%、浒苔多糖1%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；所述微生物菌种的组成为Alteromonassp.A321、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillussiamensis)L13的混合菌种，其配伍比例为6:2:1；所述微生物菌种中，Alteromonassp.A321为交替单胞菌，由中国海洋大学食品科学与工程学院实验室筛选保藏；甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LJ、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L13由青岛海大生物集团有限公司筛选，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.7570、CGMCC No.7285；
（2）发酵液制备：配制发酵液，调整初始pH为7.0，在121℃条件下灭菌30min；所述发酵液的组成为：浒苔2%、蛋白胨0.5%、硝酸钠0.5%、氯化钠1%、MgSO4 0.10%，K2HPO4 0.20%；
（3）接种：将发酵种子液接种至发酵液，接种量为8%；
（4）发酵：控温28～35℃条件下发酵36h，得发酵液；
（5）浓缩：将发酵液浓缩至固形物含量值30～35%，得酶解液。
2.根据权利要求1所述的一种专用绿藻多糖裂解酶，其特征在于所述酶解液通过喷雾干燥或冷冻干燥制备得到固体绿藻多糖裂解酶。
3.权利要求1所述绿藻多糖裂解酶在浒苔降解中的应用。
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