CN109868245A - 一种枯草芽孢杆菌bsln-08及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌BSLN‑08及其培养方法和应用，涉及微生物技术领域，具有高转化D‑葡萄糖生成D‑阿洛酮糖的能力，能够以葡萄糖为原料，显著降低D‑阿洛酮糖的生产成本。枯草芽孢杆菌BSLN‑08取枯草芽孢杆菌BSLN‑08接种于固体培养基中，制得活化菌株，在种子培养基中增殖培养后制得种子液，种子液在发酵培养基中扩大即得菌体发酵液。本发明首次获得与D‑葡萄糖水性溶液接触高产D‑阿洛酮糖的枯草芽孢杆菌BSLN‑08，与传统制备D‑阿洛酮糖的方法相比，此过程更加经济环保。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌BSLN-08及其培养方法和应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌，属芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0 .8×2～3微米，着色均匀。芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黄色，需氧菌，革兰氏阳性菌。
随着人们对健康饮食的日益重视，研发健康安全的低热量功能性甜味剂成为食品行业研究的重点。D-阿洛酮糖是近年发现的一种新型功能性稀少糖，其甜度相当于蔗糖的70% ,但能量只有蔗糖的0.3%，可以用作低卡路里减肥食品的甜味剂。它还示出重要的生理机能，例如活性氧种类清除活性和神经保护作用，它也可以用作肝脂肪生成酶和肠α-糖苷酶的抑制剂，用于减少体内脂肪累积。此外，D-阿洛酮糖还能够改善食品风味、外观等，延长食品的保存期限。2011 年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质。因此，D-阿洛酮糖这种健康安全的低热量功能性甜味剂已获得越来越多学者的关注，成为最具市场竞争力的新型甜味剂之一。
由于D-阿洛酮糖是一种较为稀有的天然单糖，从自然界中分离提取产量低，成本高，难以满足人们作为低热量健康甜味剂的需要，也不适宜工业化大生产的要求，因此为了应用于食品工业，需要有高效的D-阿洛酮糖生产方法。目前生物法制备D-阿洛酮糖最为有效的方法是使用将果糖转变为D-阿洛酮糖的酶。然而催化活性高的酶资源仍然很少，且果糖生产工艺复杂，技术要求高，导致成本较高不利于D-阿洛酮糖的普及推广。
葡萄糖是果糖的同分异构体，在自然界中分布最广,也是最重要的单糖。游离状态的葡萄糖存在于植物果实中, 动物中也有存在。葡萄糖是有机体能量的主要来源, 是许多糖类化合物的组成部分，在糖果制造业和医药领域有着广泛应用。结晶葡萄糖生产工艺简单, 过程容易控制, 成本低廉。
发明内容
本发明提供一种枯草芽孢杆菌BSLN-08及其培养方法和应用，枯草芽孢杆菌BSLN-08具有高转化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的能力，以葡萄糖为原料，显著降低D-阿洛酮糖的生产成本。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌BSLN-08，于2019年1月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17169，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
枯草芽孢杆菌BSLN-08的原始菌株分离于广东省韶关市翁源县翁源广业食品科技有限公司附近甘蔗地的土壤，并经过诱变后获得。该菌株在LB培养基上形成的菌落呈微黄色，半透明，菌落表面粗糙，边缘不规整，呈波浪状。经显微镜观察，该菌株长约1.0～1.5微米，宽约0.6～0.9微米，无荚膜，周生鞭毛，芽孢位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。该菌株发酵培养后经简单的离心、洗涤即可得到粗酶制剂，与高浓度的D-葡萄糖（700g/L）水性溶液接触高产D-阿洛酮糖，可以显著降低D-阿洛酮糖的生产成本。
一种枯草芽孢杆菌BSLN-08的培养方法，步骤包括：
S1、取枯草芽孢杆菌BSLN-08接种于固体培养基中，在37℃的条件下，活化培养12h，制得活化菌株；
S2、取S2制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在37℃的条件下，增殖培养12h，制得种子液；
S3、取S2制得的种子液，按体积比4%的比例接种于发酵培养基中，在37℃，扩大培养36～42h，即得菌体发酵液。
进一步的，种子培养基组分的重量百分比为：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，磷酸二氢钾0.02%，无水硫酸镁0.02%,余量水，pH6.5～7.5。
进一步的，发酵培养基组分的重量百分比为：玉米浆粉3%，葡萄糖1%，酵母浸粉3%，无水硫酸镁0.02%，磷酸氢二铵0.02%，硫酸铵0.02%，余量水，pH6.5～7.5。
作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌BSLN-08或上述制备方法得到的枯草芽孢杆菌BSLN-08在制备D-阿洛酮糖中的应用。
进一步的，所述应用包括以下步骤：
取枯草芽孢杆菌BSLN-08的菌体发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为粗酶制剂；
将制得的粗酶制剂与D-葡萄糖水性溶液混合接触生产D-阿洛酮糖。
本发明的有益效果是：
枯草芽孢杆菌BSLN-08具有高转化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的能力，而葡萄糖是许多糖类化合物的组成部分，在糖果制造业和医药领域有着广泛应用，结晶葡萄糖生产工艺简单, 过程容易控制, 成本低廉，枯草芽孢杆菌BSLN-08以D-葡萄糖为原料制造D-阿洛酮糖，相比现有的酶催化方法，生产工艺简单、成本低廉，更利于D-阿洛酮糖的普及推广。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
枯草芽孢杆菌BSLN-08的筛选过程如下：
（1）富集培养
选取广东省韶关市翁源县翁源广业食品科技有限公司附近甘蔗地的土壤，用小铲子除去表土，取离地面10～20cm处的土壤约15g，用无菌水稀释10倍，加入LB培养基进行富集培养，37℃培养24h。
（2）纯种分离
采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，37℃培养24h后，挑取单个菌落接种于30个斜面培养基上，分别编号01～30。
将01～30斜面种子接种于摇瓶培养基中培养37℃培养24h，对01～30摇瓶发酵液进行D-葡萄糖对D-阿洛酮糖的转化实验。
所述平板培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，余量水，pH自然；
所述斜面培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，琼脂粉2％，余量水，pH自然；
所述摇瓶培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米浆粉3%，葡萄糖1%，酵母浸粉3%，无水硫酸镁0.02%，磷酸氢二铵0.02%，硫酸铵0.02%，余量水，pH6.5～7.5。
（3）诱变筛选
D-葡萄糖和D-阿洛酮糖的浓度是利用高效液相色谱法测量的，该高效液相色谱法使用BP-100钙离子碳氢化合物柱和RI检测器，柱温80℃，流动相为超纯水，流速0.5 mL/min。
对初筛的高产菌株08号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用15W紫外线灯20cm照射，照射时间为120s，得到的高产菌种再进行亚硝基胍诱变处理，最终得到高产D-阿洛酮糖的菌株命名为BSLN-08。
实施例
枯草芽孢杆菌BSLN-08的培养方法，步骤如下：
(1)取枯草芽孢杆菌BSLN-08接种于LB培养基中，在37℃的条件下，活化培养12h，制得活化菌株。
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在37℃的条件下，增殖培养12h，制得种子液。
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.02％，
余量水，pH7.0。
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比4％的比例接种于发酵培养基中，在37℃，扩大培养48h，即得菌体发酵液。
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米浆粉3%，葡萄糖1%，酵母浸粉3%，无水硫酸镁0.02%，磷酸氢二铵0.02%，硫酸铵0.02%，余量水，pH7.0。
将所得菌体发酵液在4℃ 8000rpm条件下离心分离10min，采用pH7.5 50mM的磷酸钠洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为粗酶制剂。
对比例
枯草芽孢杆菌BSLN-08的培养方法，步骤如下：
(1)取枯草芽孢杆菌BSLN-08接种于LB培养基中，在30℃的条件下，活化培养12h，制得活化菌株。
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30℃的条件下，增殖培养12h，制得种子液。
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0 .02％，
余量水，pH6.0。
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比4％的比例接种于发酵培养基中，在30℃，扩大培养48h，即得菌体发酵液。
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米浆粉3%，葡萄糖1%，酵母浸粉3%，无水硫酸镁0.02%，磷酸氢二铵0.02%，硫酸铵0.02%，余量水，pH6.0。
将所得菌体发酵液在4℃ 8000rpm条件下离心分离10min，采用pH7.5 50mM的磷酸钠洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为粗酶制剂。
效果展示
为了生产高浓度的D-阿洛酮糖，将相同重量的实施例与对比例所得的粗酶制剂均溶解在pH7.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，缓冲液中含有700g/L的D-葡萄糖溶液，在60°C条件下进行反应。然后在不同反应时间点取样，通过在沸水中加热5分钟终止该反应，并测量样品中D-葡萄糖与D-阿洛酮糖的浓度。不同反应时间的D-阿洛酮糖产量显示在下表1中。
表1
| 反应时间（小时） | 对比例/ D-阿洛酮糖(g/L) | 实施例/ D-阿洛酮糖(g/L) |
| 1 | 12 | 91 |
| 2 | 35 | 133 |
| 3 | 66 | 175 |
| 4 | 98 | 196 |
| 6 | 120 | 231 |
| 8 | 119 | 230 |
结果显示，反应6小时，以对比例培养的枯草芽孢杆菌产生的粗酶为催化剂的反应体系产生了120 g/L的D-阿洛酮糖，转化率约为17%，而以实施例培养的枯草芽孢杆菌产生的粗酶为催化剂的反应体系产生了231g/L的D-阿洛酮糖，转化率约为33%。由上述结果可以看出，培养条件不在本发明所述权利要求范围内时，D-阿洛酮糖的转化率大幅降低。
本发明的有益效果是：
枯草芽孢杆菌BSLN-08具有高转化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的能力，而葡萄糖是许多糖类化合物的组成部分，在糖果制造业和医药领域有着广泛应用，结晶葡萄糖生产工艺简单, 过程容易控制, 成本低廉，枯草芽孢杆菌BSLN-08以D-葡萄糖为原料制造D-阿洛酮糖，相比现有的酶催化方法，生产工艺简单、成本低廉，更利于D-阿洛酮糖的普及推广。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种枯草芽孢杆菌BSLN-08，其特征在于，包括：所述枯草芽孢杆菌BSLN-08于2019年1月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17169，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
2.一种枯草芽孢杆菌BSLN-08的培养方法，其特征在于，步骤包括：
S1、取枯草芽孢杆菌BSLN-08接种于固体培养基中，在37℃的条件下，活化培养12h，制得活化菌株；
S2、取S2制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在37℃的条件下，增殖培养12h，制得种子液；
S3、取S2制得的种子液，按体积比4%的比例接种于发酵培养基中，在37℃，扩大培养36～42h，即得菌体发酵液。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养基组分的重量百分比为：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，磷酸二氢钾0.02%，无水硫酸镁0.02%,余量水，pH6.5～7.5。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基组分的重量百分比为：玉米浆粉3%，葡萄糖1%，酵母浸粉3%，无水硫酸镁0.02%，磷酸氢二铵0.02%，硫酸铵0.02%，余量水，pH6.5～7.5。
5.一种如权利要求1或2-4中任一项所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌BSLN-08在制备D-阿洛酮糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
取枯草芽孢杆菌BSLN-08的菌体发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为粗酶制剂；
将制得的粗酶制剂与D-葡萄糖水性溶液混合接触生产D-阿洛酮糖。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114621893A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-06-14 | 山东星光首创生物科技有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
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