CN109971688B - 低杂高产结冷胶产生菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低杂高产结冷胶产生菌，为Sphingomonas elodea LG010，其保藏号为：CCTCC NO:2016143。本发明还提供了该低杂高产结冷胶产生菌的用途：生产不含念珠藻黄素和聚‑β‑羟基丁酸的结冷胶。本发明从源头去除与结冷胶竞争底物并影响提纯的代谢副产物，并有效改善发酵效率、简化提纯步骤，降低生产成本。

Description

低杂高产结冷胶产生菌及其应用

技术领域

本发明涉及低杂高产结冷胶产生菌及其应用。

背景技术

微生物多糖作为发酵工业产品，不仅性能优良且具备许多其它同类多糖所欠缺的特殊功用，比动植物多糖应用更广泛，且其生产不受地理环境、气候、自然灾害等因素的影响，生产周期短，产量及质量稳定，性价比较高。在很大程度上能满足人们对天然无公害食品的需求。

结冷胶是一种新型的微生物多糖，于1978年被发现，是伊乐鞘氨醇单胞菌在有氧条件下发酵产生的线性阴离子杂多糖。先后在日本、美国、欧盟及我国获得批准作为食品添加剂应用于各类食品中。其理化性质及凝胶性能优越，逐步作为新型乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、缓释剂、成膜材料等日益应用于食品、医药、化工等领域，甚至已逐步取代卡拉胶、琼脂等同类食品添加剂，且市场需求量在逐年增加，其年增长率在30％以上。由于其生产所用的原料(如蔗糖)价格低廉且易得，而自身的市场价格却很高，因此有极高的商业利润和市场前景。

虽然国内市场的需求量增长很快，结冷胶在市场上占的份额越来越大，但是结冷胶行业还存在以下困境。

首先，虽然具更优秀的理化性质以及更广泛的应用价值，但结冷胶发酵时的糖胶转化率(每克发酵底物糖产出的多糖胶比例)只有40％-50％左右，显著低于另外一种微生物胞外多糖黄原胶(60-80％)，因此造成结冷胶产量较低。其次，菌株发酵产结冷胶的同时能产生代谢副产物黄色类胡萝卜色素—念珠藻黄素，使发酵液变黄，给纯化带来不便。并且念珠藻黄素合成的前体乙酰辅酶A也是结冷胶合成的前体之一，因此，念珠藻黄素的合成也在一定程度上抑制了结冷胶的合成。第三，除了黄色色素外，结冷胶生产所需的高碳氮比培养基同样也利于主要由碳骨架组成的聚-β-羟基丁酸(PHB)的大量合成，其合成量可达总生物量的15-25％。PHB与结冷胶竞争有限的碳源，且降低结冷胶成品的透明度，影响应用，因此也需提纯过程中去除。由于发酵液的粘性高，结冷胶粘连在细胞表面，以粘性聚合物的形式构成网络结构，使得黄色念珠藻黄素和PHB等杂质的去除存在较大难度。在结冷胶的提取和纯化过程中，一般需要2倍发酵液体积的乙醇或异丙醇用于去除胶体中的黄色素等杂质并沉淀多糖，并且还需硅藻土板框压滤去除PHB。这种提取方法需要消耗大量的有机溶剂和硅藻土，增加纯化步骤和能耗，极大的降低了生产效率，增加了生产成本。

规模相对较小，结冷胶产率较低，能耗成本高、产物提取繁杂、产品澄清纯化困难等难题，造成生产成本相对较高，限制了结冷胶企业的进一步发展。因此，解决当前国内结冷胶生产企业困境的当务之急是提高结冷胶产量、简化提纯步骤从而降低生产成本。尽管当前许多基因工程手段提高产量降低代谢副产物的方法，但结冷胶作为一种食品添加剂，使用基因工程菌株进行生产，尤其是在食品安全问题极为突出的当下，容易引起消费者的顾虑。因此，采用非基因工程方法对菌株进行改造是解决这一问题的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株不产代谢副产物代谢念珠藻黄素和聚-β-羟丁酸结冷胶产生菌——伊乐鞘氨醇单胞菌，并且此菌株发酵时结冷胶产量提高，此菌株用于结冷胶工业生产不仅可以增加产量而且可以简化纯化步骤，降低纯化成本。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种低杂高产结冷胶产生菌，为Sphingomonas elodeaLG010，其保藏号为：CCTCC NO:2016143。

本发明还同时提供了上述低杂高产结冷胶产生菌的用途：生产结冷胶。

作为本发明的低杂高产结冷胶产生菌的用途的改进：生产不含念珠藻黄素和聚-β-羟基丁酸(PHB)的结冷胶。

作为本发明的低杂高产结冷胶产生菌的用途的进一步改进：结冷胶的制备方法为：

1)、种子培养：将斜面保存的菌株转接入种子培养基，于30℃，200rpm振荡培养24h，得为种子液；

2)发酵：将种子液以15％体积比的接种量接入发酵培养基中，于30℃，220rpm振荡培养60h；得含结冷胶的发酵液。

本发明是利用伊乐鞘氨醇单胞菌通过甲基磺酸乙酯(EMS)结合高效筛选方法经多轮突变得到不产念珠藻黄素和聚-β-羟丁酸，同时结冷胶产量提高的菌株。

本发明还涉及基于此菌株的优化的发酵培养基和纯化工艺。

方法一、发酵培养过程如下：

种子培养：将一接种环的斜面保存的菌株转接入50～100mL种子培养基(盛于250～500mL三角瓶)，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为种子液；

发酵：将种子液以15％体积比的接种量接入100mL发酵培养基中(盛于500mL三角瓶)，于30℃，220rpm振荡培养60h；得含结冷胶的发酵液。

所涉及的培养基组成：

种子培养基：蔗糖10g/L；酵母膏3g/L；蛋白胨3g/L；磷酸二氢钾0.6g/L；磷酸氢二钾0.6g/L；硫酸镁0.6g/L；溶剂为蒸馏水；pH7.2；

发酵培养基：蔗糖40g/L；酵母粉0.45g/L；大豆蛋白粉5.5g/L；磷酸二氢钾0.8g/L；磷酸氢二钾1.2g/L；硫酸镁0.6g/L；硫酸亚铁0.002g/L硫酸锰0.00005g/L；硫酸锌0.00006g/L；氯化钴0.00005g/L；溶剂为普通自来水；pH7.2。

方法二、结冷胶的纯化工艺如下：

将上述含结冷胶的发酵液调pH值为6.0，升温至50℃～70℃(优选60℃)保温30min～2h(优选1h)后，降温至40℃～50℃，调pH为7.0，加入溶菌酶和碱性蛋白酶保温1h～3h(优选2h)去除蛋白质；去除蛋白质后的发酵液加入占发酵液体积的5％的CaCl₂溶液(浓度通常为20％，w/v)及发酵液体积20％的乙醇的进行絮凝沉淀，搅拌，板框压滤、所得滤饼干燥(90℃)，制得不含念珠藻黄素及PHB的结冷胶(高酰基结冷胶)。

出胶率％(多糖产率％，1g/100ml)＝每百毫升发酵液制备获得的结冷胶干重(g)。

本发明的有益效果主要体现在：提供一种不产念珠藻黄素及PHB等代谢副产物且高产结冷胶的伊乐鞘氨醇单胞菌；从源头去除与结冷胶竞争底物并影响提纯的代谢副产物，并有效改善发酵效率、简化提纯步骤，降低生产成本。此菌株发酵时结冷胶产量提高，此菌株用于结冷胶工业生产不仅可以增加产量而且可以简化纯化步骤，降低纯化成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、不含念珠藻黄素的结冷胶产生菌的筛选(EMS诱变及高效筛选)：

1)、第一轮诱变处理：

伊乐鞘氨醇单胞菌ATCC 31461YM培养基保藏的斜面转接LB液体培养基，30℃培养16h，然后按照LB液体培养基1％的体积比加入EMS(甲基磺酸乙酯)，避光室温放置1h，再转接新鲜YM液体培养基，30℃培养6h。

YM液体培养基的组成：蛋白胨5g/L，麦芽浸粉3g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，溶剂为水，pH7.0。

YM固体培养基的组成：蛋白胨5g/L，麦芽浸粉3g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，15g/L琼脂，溶剂为水，pH7.0。

2)、第一轮诱变处理所得的样品经梯度稀释涂布于YM平板(YM固体培养基)中，30℃培养72h，肉眼观察筛选的白色单菌落，经YM平板划线分离纯化后单菌落继续为白色的则为不产念珠藻黄素的菌株；

3)、收集所有不产念珠藻黄素的菌株，发酵(按照上述方法一)、测定(按照上述方法二)结冷胶的多糖产率。

实施例2、不含念珠藻黄素和PHB的结冷胶产生菌的筛选：

1)、第二轮诱变处理：

以实施例1所得的结冷胶多糖产率最高且不产念珠藻黄素的菌株为第二轮诱变的出发菌株，转接YM液体培养基，30℃培养16h，然后按照YM液体培养基1％的体积比加入EMS，避光室温放置1h，再转接新鲜YM培养基，30℃培养6h。

2)、第二轮诱变处理所得的样品经梯度稀释涂布于加入荧光显色剂5μg/mL尼罗蓝尼罗蓝的YM固体培养基中，30℃培养72h。其中尼罗蓝可以与PHB结合而使含PHB的菌株在紫外下产生荧光，而无荧光或者荧光极弱的菌株则为不产PHB的缺陷型菌株。在此筛选平板中紫外下无荧光或者荧光极弱的菌落则是念珠藻黄素和PHB均不产的菌株；

3)、收集所有念珠藻黄素和PHB均不产的菌株，发酵(按照上述方法一)、测定(按照上述方法二)结冷胶的多糖产率。

实施例3、不含念珠藻黄素和PHB且高产结冷胶的产生菌的筛选：

1)、第三轮诱变处理：

以实施例2所得的多糖产率最高且不产念珠藻黄素和PHB的菌株为第三轮诱变的出发菌株，转接YM液体培养基，30℃培养16h，然后按照YM液体培养基1％的体积比加入EMS，避光室温放置1h，转接新鲜YM培养基，30℃培养6h；

2)、第三轮诱变处理所得的样品经梯度稀释涂布于添加100μg/mL氨苄青霉素的YM高产筛选平板中，30℃培养5天。

添加100μg/mL氨苄青霉素的YM高产筛选平板的配方：

蛋白胨5g/L，麦芽浸粉3g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，结冷胶15g/L，氨苄青霉素100μg/mL，溶剂为水，pH7.0。

3)、挑选筛选平板中长出的具有氨苄青霉素抗性，菌落生成处培养基不下沉的单菌落，这些单菌落为潜在的高产菌株。

说明：结冷胶的生物合成与肽聚糖的合成途径有共通之处，而氨苄青霉素耐药性菌株可能具有更强的结冷胶合成性能。另外结冷胶产生菌能分泌结冷胶降解酶降解结冷胶，当以结冷胶为凝固剂的平板筛选时，普通菌株因凝固剂结冷胶被降解而造成菌落生长处的培养基内凹，而高产菌株可能具有更强的结冷胶产生性能，能补充被降解的结冷胶而使培养基维持原样，通过这种方法筛选到了结冷胶高产菌株。本发明结合上述高效筛选方法，对筛选培养基进行优化。

4)、收集所有潜在的高产菌株，发酵测定结冷胶多糖的产量。从而筛选出一株不产念珠藻黄素色素和PHB的高产菌株，发酵(按照上述方法一)、测定(按照上述方法二)结冷胶的多糖产率。

该高产菌株的保藏信息如下：

保藏名称为Sphingomonas elodea LG010，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:2016143，保藏时间2016年03月23日。

实施例4、鞘氨醇单胞菌(CCTCC NO：M 2016143)的发酵工艺及于野生型出发菌株结冷胶出胶率的比较：

将Sphingomonas elodea LG010(CCTCC NO:2016143)和野生型菌株ATCC 31461分别进行如下步骤：

1)、将菌株接种于YM培养基斜面上活化，30℃培养72h；

2)、种子培养：

将一接种环的斜面种子接入盛于250mL三角瓶的50mL种子培养基中，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为种子液；

3)、发酵：

将种子液以15％体积比的接种量接入100mL发酵培养基中(盛于500mL三角瓶)，于30℃，220rpm振荡培养60h；得含结冷胶的发酵液。

出胶率％(多糖产率％，1g/100ml)＝每百毫升发酵液制备获得的结冷胶干重(g)。

CCTCC NO：M 2016143和野生型菌株ATCC 31461的出胶率见表1。

表1

菌株	出胶率％	纯化后念珠藻黄素含量％	纯化后PHB含量％
				ATCC 31461	1.12	0.062	5.75
CCTCC NO：M 2016143	1.67	无	无

注：CCTCC NO：M 2016143的转化率(每克发酵底物糖产出的多糖胶比例)为41.75％。

实施例5：高酰基结冷胶的制备

1)、发酵液预处理：

发酵液100L，用10％(v/v)的HCl调pH6，升温至60℃，保温1h；

2)、蛋白杂质去除：

步骤1)所得物降温至40℃时，10％(w/v)NaOH调pH7.0，加入50g的溶菌酶(20万U/g，庞博生物)及100g的碱性蛋白酶(2万U/g，庞博生物)，保温2h；从而去除蛋白杂质；

3)、絮凝沉淀，分离：

将在步骤2)所得的蛋白去杂处理后的发酵液中加入5L浓度为20％(w/v)的CaCl₂溶液和20L乙醇，搅拌1h后，板框压滤；

4)、干燥、粉碎：

将压滤所得的滤饼90℃干燥1h后粉碎至能过80目的筛，制得高酰基结冷胶成品(含水率≤5％)，为乳白色粉末，测定成品高酰基结冷胶中念珠藻黄素及PHB的含量，具体含量见表1。

注：通过高效液相测定确证菌株不产念珠藻黄素色素，通过次氯酸处理菌体后离心加入浓硫酸反应后经分光光度计测定确认菌株不产PHB。

对比试验：将如下表2所述的菌株按照上述实施例4和实施例5所述方法进行检测，所得结果与CCTCC NO：M 2016143的对比如下表2。

表2

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.低杂高产结冷胶产生菌，其特征在于：为Sphingomonas elodea LG010，其保藏号为：CCTCC NO:2016143。

2.如权利要求1所述的低杂高产结冷胶产生菌的用途，其特征在于：生产不含念珠藻黄素和聚-β-羟基丁酸的结冷胶。

3.根据权利要求2所述的低杂高产结冷胶产生菌的用途，其特征在于结冷胶的制备方法为：

1)、种子培养：将斜面保存的菌株转接入种子培养基，于30℃，200rpm振荡培养24h，得为种子液；

2)发酵：将种子液以15％体积比的接种量接入发酵培养基中，于30℃，220rpm振荡培养60h；得含结冷胶的发酵液。