CN116179402A - 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 - Google Patents
一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116179402A CN116179402A CN202211095518.9A CN202211095518A CN116179402A CN 116179402 A CN116179402 A CN 116179402A CN 202211095518 A CN202211095518 A CN 202211095518A CN 116179402 A CN116179402 A CN 116179402A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- rhodococcus
- fermentation
- carotenoid
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 36
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 24
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims abstract description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims abstract description 15
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 22
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 8
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 8
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 7
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 14
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 abstract 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 2
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 2
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001746 carotenes Chemical class 0.000 description 2
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000032724 odontogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株类胡萝卜素合成菌株及其应用，所述菌株分类命名为食醚红球菌（Rhodococcus aetherivorans），菌株命名为N1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月11日，保藏号为：CCTCC NO：M 20221270。菌株N1在摇瓶发酵中利用葡萄糖，红球菌细胞干重达到5.0 g/L，合成类胡萝卜素含量达到6.1 mg/g。菌株N1还能够直接利用未经脱毒的玉米芯水解液作为碳源，合成类胡萝卜素含量达到5.5 mg/g。食醚红球菌N1做为一株具有类胡萝卜素合成能力的细菌菌株，能够利用广泛的糖类碳源及未经脱毒的玉米芯水解液，可为类胡萝卜素的工业化生产提供优良的菌株资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株类胡萝卜素合成菌株及其应用。
背景技术
类胡萝卜素是由植物、藻类、酵母、真菌和一些细菌产生的一系列天然生物分子。因其不饱和度和两端结构不同它们的颜色呈现从红色、黄色到橙色。目前已发现超过1100种来自不同物种的不同的类胡萝卜素，不同的类胡萝卜素具有不同的颜色和不同的生物功能特性。
此前，类胡萝卜素一直被作为维生素A合成前体被研究，直到最近，科学界才意识到它们具有很高的抗氧化潜力，这使它们能够对抗威胁生命的疾病，如癌症、黄斑变性等，人类牙齿或骨骼发育迟缓，粗糙鳞状皮肤受损等。有效的抗氧化活性提高了对感染的免疫反应，并在生态功能中发挥着独特的作用。这些生物活性化合物还能够避免与光氧化损伤相关的问题。因此类胡萝卜素不仅作为营养食品，还作为生物活性化合物而广受欢迎。2017年全球类胡萝卜素市场为15亿美元，2020年达到约20亿美元。全球市场调查（2018-2024年）估计，类胡萝卜素在食品和饮料、药品、化妆品、动物饲料和膳食补充剂中的市场份额分别为26.1%、9.2%、6.5%、34.8%和23.5%。目前，约80–90%的类胡萝卜素供应由化学合成完成。因此，与化学合成类胡萝卜素相比，天然类胡萝卜素的市场份额要低得多，因为其成本较高。化学合成类胡萝卜素的市场价值相对较低位250-2000美元酶公斤，而天然植物类胡萝卜素的市场价值为350-7500美元每公斤。由于植物来源的类胡萝卜素价格昂贵，近年来，由于其经济可持续性和成本效益，市场对微生物类胡萝卜素生产的兴趣不断上升。
目前已有一些关于微生物产类胡萝卜素的报道，包括藻类、霉菌、酵母、细菌。但是不同来源的类胡萝卜素种类有明显的差异，且菌株生成类胡萝卜素的能力也明显不同。目前关于细菌产类胡萝卜素工业化应用的研究还是较少的。红球菌作为一种能够产生类胡萝卜素的革兰氏阳性菌株，被科研人员进行相关研究。但是目前报道最多的类胡萝卜素合成菌株Rhodococcus opacusPD630通过分批培养类胡萝卜素含量仅为0.99 mg/L，产量低，无法实现大规模的制备类胡萝卜素。
发明内容
本发明旨在提供高产类胡萝卜素的菌株及其应用。
本发明中的食醚红球菌N1在摇瓶发酵中利用葡萄糖，红球菌细胞干重达到5.0 g/L，合成类胡萝卜素含量达到6.1 mg/g。食醚红球菌还能够直接利用未经脱毒的玉米芯水解液作为碳源，合成类胡萝卜素含量达到5.5 mg/g。菌株N1不仅能够利用多种碳源，生产高浓度的类胡萝卜素，还能够直接利用低劣生物质玉米芯水解液合成较高浓度的类胡萝卜素，降低了发酵过程中的成本，为菌株工业化合成类胡萝卜素提供有利条件。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一株产类胡萝卜素的细菌菌株，其分类命名为食醚红球菌（Rhodococcus aetherivorans），菌株命名为N1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月11日，保藏号为：CCTCC NO：M 20221270。保藏地址为：中国武汉。
本发明所述的菌株N1，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
本发明所述的Rhodococcus aetherivoransN1筛选方法为：在LB培养基中，对从江苏南京采集的土样进行筛选。具体地，在LB培养基中，30℃培养3-5天，进行稀释涂布，挑取橙黄色单菌落在LB培养中进行培养48 h，5000 rpm离心3min收集菌体，进行菌株合成类胡萝卜素验证，筛选得到一株类胡萝卜素产量最高的细菌。
高产类胡萝卜素的菌株Rhodococcus aetherivoransN1的鉴定：利用引物27F ：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’扩增菌株N1的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coliDH5α获得重组微生物Escherich coliDH5α ( pMD19T-16S )，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16SrDNA序列，在分子水平上将菌株N1鉴定至Rhodococcus aetherivoransN1菌属。
所述食醚红球菌N1的生理学特征：N1菌株在LB培养基中呈橙色，表面光滑；生长温度为22-30℃，生长pH为5-10，生长NaCl浓度为0-40g/L。
本发明所述食醚红球菌发酵培养的方式如下：
1）平板培养：将食醚红球菌划线至LB固体培养基培养，培养温度28-32℃，培养时间45-50 h；
2）种子培养：将固体培养基上的菌落接种到LB种子培养基中培养，培养温度28-32℃，培养时间28-32 h；
3）发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量3% -5%v/v，发酵温度28-32℃，发酵培养时间为120-125 h。
进一步的，所述食醚红球菌在好氧条件下发酵培养。
进一步的，所述食醚红球菌以葡萄糖为碳源发酵培养。
进一步的，所述食醚红球菌的发酵培养基配方为碳源10-80 g/L、尿素0.5-1 g/L、NaCl 1-3 g/L、K2HPO4·3H2O 1.5-2.0 g/L、KH2PO40.5-1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.3 g/L、微量元素 1 mL/L（FeCl2·4H2O 1.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.19 g/L、MnCl2·4H2O 0.1 g/L、ZnCl20.07 g/L、NiCl2·6H2O 0.024 g/L、Na2MO4·2H2O 0.036 g/L、CuCl2·2H2O 0.002 g/L），调节pH至7.0。
其中，所述的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、乳糖或蔗糖。最优选的是，所述的碳源为葡萄糖。
其中，所述葡萄糖浓度优选为60 g/L。
本发明中菌株Rhodococcus aetherivoransN1直接利用未脱毒的玉米芯水解液为碳源发酵方法如下：
发酵培养基配方为：玉米芯水解液100 mL、尿素0.5 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素 1 mL/L（FeCl2·4H2O 1.5g/L、CoCl2·6H2O 0.19 g/L、MnCl2·4H2O 0.1 g/L、ZnCl20.07 g/L、NiCl2·6H2O 0.024 g/L、Na2MO4·2H2O 0.036 g/L、CuCl2·2H2O 0.002 g/L），调节pH至7.0。
本发明中玉米芯水解液的制备方法为：玉米芯与质量分数2%的H2SO4混合，固液比（m/V）为 1:7.5，130℃下水解1 h，对得到的固型物使用0.22 μm的滤膜抽滤，抽滤同时加入一倍体积去离子水。用NaOH将pH调节至7.0，即得玉米芯稀酸水解液。
本发明中使用LB培养基配方如下：
LB固体培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15-20g/L。
LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
本发明具体发酵过程及类胡萝卜素检测方法如下：
将食醚红球菌划线至LB固体培养基培养，培养温度28-32℃，培养时间45-50 h；然后将固体培养基上的菌落接种到LB种子培养基中培养，培养温度28-32℃，培养时间28-32h；最后将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量3% -5%v/v，发酵温度28-32℃，发酵培养时间为120-125 h。取2 mL发酵结束后的菌液一式两份，10000 rpm、3 min；一份菌泥至于105℃烘干过夜至恒重，用于检测其生物量；一份菌泥加入400 uL，3moL/L HCL，沸水浴3min 后再冰水浴3 min，13000 rpm，5 min；弃去上清液，向菌体中加入400 uL 丙酮，浸提1h，取带有类胡萝卜素的上清保存好，重复此操作3-4 次，直至菌体无色结束，最后合并丙酮提取液，用分光光度计测检测455 nm处的吸光度。
有益效果
1. 本发明以南京森林土壤为分离材料，通过一系列的筛选分离纯化得到一株可以利用高产类胡萝卜素的菌株Rhodococcus aetherivoransN1，该菌株能够利用多种碳源生长及合成类胡萝卜素。
2. 发明中菌株N1在摇瓶发酵中利用葡萄糖，细胞干重达到5.0 g/L，合成类胡萝卜素含量达到6.1 mg/g。 菌株N1还能够直接利用未经脱毒的玉米芯水解液作为碳源，合成类胡萝卜素含量达到5.5mg/g，是目前报道的直接利用玉米芯水解液合成类胡萝卜素的最高水平。Rhodococcus aetherivoransN1做为一株具有高产类胡萝卜素能力的细菌菌株，可为类胡萝卜素的工业化生产提供优良的菌株资源。
附图说明
图1菌株N1在LB固体培养基中生长的菌落形态。
图2菌株N1利用不同碳源的生长及类胡萝卜素合成。
图3菌株N1利用不同浓度葡萄糖的生长及类胡萝卜素合成。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
高产类胡萝卜素的Rhodococcus aetherivoransN1的分离筛选：
称取5 g南京森林采取的土样，用生理盐水稀释，吸取200 μL至以LB固体培养基上，于30℃培养5天。选取生长出的具有橙黄色的菌落划线纯化5代，并将其在LB培养基中发酵，考察其发酵产物和性能，发现该菌株可以利用多种碳源进行生长，并且可以产生类胡萝卜素，最终筛选得到一株高产类胡萝卜素的菌株N1，菌株N1在LB固体培养基中形态如图1所示。
上述LB培养基配方为胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，LB固体培养基加入琼脂粉15 g/L，121℃灭菌15 min。
上述类胡萝卜素的检测方法为：
称取β-胡萝卜素标样15.5 mg，用丙酮定容至25 mL，得到620g/L浓度的母液，将β-胡萝卜素母液分别稀释10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，分别用分光光度计测455 nm处的吸光度，制作β-胡萝卜素的标准曲线，用于检测样品中β-胡萝卜素的含量。
取2 mL发酵结束后的菌液一式两份，10000 rpm、3 min；一份菌泥至于105 ℃烘干过夜至恒重，用于检测其生物量；一份菌泥加入400 uL，3 moL/L HCL，沸水浴3 min 后再冰水浴3 min，13000 rpm，5 min；弃去上清液，向菌体中加入400 uL 丙酮，浸提1 h，取带有类胡萝卜素的上清保存好，重复此操作3-4 次，直至菌体无色结束，最后合并丙酮提取液，用分光光度计检测455nm处的吸光度。
实施例2
高产类胡萝卜素的菌株Rhodococcus aetherivoransN1的鉴定：
对菌株N1进行16S rDNA鉴定：利用引物27F 5 ’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’扩增菌株N1的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coliDH5α获得重组微生物Escherich coliDH5α ( pMD19T-16S )，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株N1鉴定至Rhodococcus aetherivorans菌属，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
实施例3
菌株Rhodococcus aetherivoransN1利用不同碳源生长及发酵特性。
菌株Rhodococcus aetherivoransN1可以利用葡萄糖、木糖、果糖、乳糖或蔗糖为碳源生长及产类胡萝卜素（图2）。从固体培养基上挑取菌株N1单菌落接种到100 mL LB液体培养基中，30℃，180 r·min-1培养48 h，然后以接种量4% v/v接种到发酵培养基中，30℃，180 r·min-1震荡培养，发酵120 h。
上述发酵培养基配方为：碳源30 g/L、尿素0.5 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO4·3H2O1.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素 1 mL/L（FeCl2·4H2O 1.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.19 g/L、MnCl2·4H2O 0.1 g/L、ZnCl20.07 g/L、NiCl2·6H2O 0.024 g/L、Na2MO4·2H2O 0.036 g/L、CuCl2·2H2O 0.002 g/L），调节pH至7.0。由图2所示，分别以葡萄糖、木糖、果糖、乳糖或蔗糖为碳源培养Rhodococcus aetherivoransN1，以葡萄糖为碳源生产类胡萝卜素的量最高，达到4.03 mg/g。
实施例4
菌株Rhodococcus aetherivoransN1利用不同葡萄糖浓度的生长及发酵特性。
从固体培养基上挑取菌株N1单菌落接种到100 mL LB液体培养基中，30℃，180r·min-1培养48 h，然后以接种量4% v/v接种到不同葡萄糖浓度的发酵培养基中，30 ℃，180 r·min-1震荡培养，发酵120 h。
上述发酵培养基配方为：葡萄糖10-80 g/L、尿素0.5 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素 1 mL/L（FeCl2·4H2O 1.5g/L、CoCl2·6H2O 0.19 g/L、MnCl2·4H2O 0.1 g/L、ZnCl20.07 g/L、NiCl2·6H2O 0.024 g/L、Na2MO4·2H2O 0.036 g/L、CuCl2·2H2O 0.002 g/L），调节pH至7.0。由图3所示，分别以不同浓度的葡萄糖为碳源培养Rhodococcus aetherivoransN1，以60 g/L葡萄糖为碳源生产类胡萝卜素的量最高，达到6.1mg/g。
实施例5
菌株Rhodococcus aetherivoransN1直接利用未脱毒的玉米芯水解液为碳源的生长及发酵特性。
从固体培养基上挑取菌株N1单菌落接种到100 mL LB液体培养基中，30℃，180r·min-1培养48 h，然后以接种量4% v/v接种到不同葡萄糖浓度的发酵培养基中，30 ℃，180 r·min-1震荡培养，发酵120 h。
上述发酵培养基配方为：玉米芯水解液100 mL、尿素0.5 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素 1 mL/L（FeCl2·4H2O 1.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.19 g/L、MnCl2·4H2O 0.1 g/L、ZnCl20.07 g/L、NiCl2·6H2O0.024 g/L、Na2MO4·2H2O 0.036 g/L、CuCl2·2H2O 0.002 g/L），调节pH至7.0。菌株N1能够以未脱毒的玉米芯水解液为碳源，在100 mL摇瓶发酵合成类胡萝卜素，产量达到5.5 mg/g，菌体干重达2.5 g/L。
上述玉米芯水解液的制备方法为：玉米芯与质量分数2%的H2SO4混合，固液比（m/V）为 1:7.5，130℃下水解1 h，对得到的固型物使用0.22 μm的滤膜抽滤，抽滤同时加入一倍体积去离子水。用NaOH将pH调节至7.0，即得玉米芯稀酸水解液。
Claims (9)
1.一株类胡萝卜素合成菌株，其分类命名为食醚红球菌（Rhodococcus aetherivorans），菌株命名为N1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 20221270。
2.权利要求1所述菌株在生产类胡萝卜素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在营养培养基上，好氧条件下发酵培养食醚红球菌生产类胡萝卜素。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）平板培养：将食醚红球菌N1划线至LB固体培养基培养，培养温度28-32℃，培养时间45-50 h；
2）种子培养：将固体培养基上的菌落接种到LB种子培养基中培养，培养温度28-32℃，培养时间28-32 h；
3）发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量3-5% v/v，发酵温度28-32℃，发酵培养时间为120-125 h。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基配方为：碳源10-80 g/L、尿素0.5-1 g/L、NaCl 1-3 g/L、K2HPO4·3H2O 1.5-2.0 g/L、KH2PO4 0.5-1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.3 g/L、微量元素 1 mL/L，调节pH至7.0。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、蔗糖。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基配方为玉米芯水解液100 mL、尿素4 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、微量元素 1 mL/L，调节pH至7.0。
8.根据权利要求5或者7所述的应用，其特征在于，所述微量元素为FeCl2·4H2O 1.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.19 g/L、MnCl2·4H2O 0.1 g/L、ZnCl2 0.07 g/L、NiCl2·6H2O 0.024 g/L、Na2MO4·2H2O 0.036 g/L、CuCl2·2H2O 0.002 g/L。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述玉米芯水解液是将玉米芯与H2SO4混合，130℃下水解1 h，对得到的固型物进行抽滤，抽滤同时加入一倍体积去离子水,通过NaOH条件pH至7.0，即得到未经脱毒的玉米芯稀酸水解液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211095518.9A CN116179402B (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211095518.9A CN116179402B (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116179402A true CN116179402A (zh) | 2023-05-30 |
| CN116179402B CN116179402B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=86446830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211095518.9A Active CN116179402B (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116179402B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100145116A1 (en) * | 2007-03-08 | 2010-06-10 | Frederik Van Keulen | Production of High-Purity Carotenoids by Fermenting Selected Bacterial Strains |
| CN105121626A (zh) * | 2012-12-27 | 2015-12-02 | 凯米罗总公司 | 产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法 |
| CN113234634A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-08-10 | 辽宁大学 | 一种食醚红球菌及其在降解萘、蒽、菲、芴中的应用 |
| CN114196589A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-18 | 浙江工业大学 | 食醚红球菌zhc及其在降解丙烯酸甲酯中的应用 |
-
2022
- 2022-09-06 CN CN202211095518.9A patent/CN116179402B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100145116A1 (en) * | 2007-03-08 | 2010-06-10 | Frederik Van Keulen | Production of High-Purity Carotenoids by Fermenting Selected Bacterial Strains |
| CN105121626A (zh) * | 2012-12-27 | 2015-12-02 | 凯米罗总公司 | 产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法 |
| CN113234634A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-08-10 | 辽宁大学 | 一种食醚红球菌及其在降解萘、蒽、菲、芴中的应用 |
| CN114196589A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-18 | 浙江工业大学 | 食醚红球菌zhc及其在降解丙烯酸甲酯中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALESSANDRO PRESENTATO等: "Rhodococcus aetherivorans BCP1 as cell factory for the production of intracellular tellurium nanorods under aerobic conditions", MICROB CELL FACT, vol. 15, no. 1 * |
| 王雪妍等: "一株具有黄曲霉毒素B1降解功能的食醚红球菌的分离鉴定", 河南科学, vol. 35, no. 7 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116179402B (zh) | 2024-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111100827B (zh) | 一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114214251B (zh) | 一种生产d-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 | |
| EP3029147A1 (en) | A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp | |
| CN106754486B (zh) | 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法 | |
| CN116179402B (zh) | 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 | |
| CN110564649A (zh) | 一株产脂肪酶菌株及其应用 | |
| CN110819543B (zh) | 一种利用淀粉生产聚苹果酸的出芽短梗霉及其应用 | |
| CN110305797B (zh) | 一株花青素产生菌株cj6及其应用 | |
| CN113337403A (zh) | 一种球毛壳菌hjf 13菌株及其应用 | |
| CN116790382B (zh) | 一株高产叶黄素的诱变小球藻及其制备方法与应用 | |
| CN1187438C (zh) | 高产壳聚糖酶的真菌菌株及其用途 | |
| RU2080382C1 (ru) | Штамм бактерий clostridium acetobutylicum-продуцент н-бутилового спирта и ацетона | |
| CN113249248B (zh) | 一种暗红戈登氏菌、用途及生产色素的方法 | |
| CN111100802A (zh) | 一株粪肠球菌及其应用 | |
| CN110607266B (zh) | 产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用 | |
| JPH0558715B2 (zh) | ||
| CN109971688B (zh) | 低杂高产结冷胶产生菌及其应用 | |
| CN113337433B (zh) | 一种产吡咯喹啉醌的假单胞菌及其应用 | |
| CN117070367B (zh) | 出芽短梗霉ncps2022-m及培养方法 | |
| CN116515795B (zh) | 塔宾曲霉在制备植酸酶和/或降解植酸中的应用 | |
| CN113308381B (zh) | 一种平菇菌株znk-ms-08、培养方法、平菇培养基及培养基添加剂 | |
| CN116179400B (zh) | 一株产重排甾体化合物的黏细菌及其应用 | |
| CN113512504B (zh) | 一株产虾青素菌株及其应用 | |
| KR101058246B1 (ko) | 코엔자임 ｑ10 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈를 이용한 코엔자임 ｑ10의 대량생산 방법 | |
| CN108774626B (zh) | 一种生产尼莫克汀的方法和菌株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |