CN105121626A - 产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法 - Google Patents

产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105121626A
CN105121626A CN201380067953.3A CN201380067953A CN105121626A CN 105121626 A CN105121626 A CN 105121626A CN 201380067953 A CN201380067953 A CN 201380067953A CN 105121626 A CN105121626 A CN 105121626A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhodococcus
bacterial strain
ether
vkmac
food
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380067953.3A
Other languages
English (en)
Inventor
S·V·柯祖林
T·N·柯祖林娜
A·S·柯祖林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kemira Oyj
Original Assignee
Kemira Oyj
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kemira Oyj filed Critical Kemira Oyj
Publication of CN105121626A publication Critical patent/CN105121626A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Abstract

本发明涉及属于红球菌属的细菌菌株，其是腈水合酶的生产者。本发明还涉及通过使用所述细菌菌株的生物质水合丙烯腈来生产丙烯酰胺的方法以及培养所述细菌菌株的方法。

Description

产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法
发明领域
本组发明涉及生物技术和微生物工业，并包括：
-具有高腈水合酶活性的细菌食醚红球菌(Rhodococcusaetherivorans)的新菌株；
-其培养方法；
-使用该菌株的细胞作为生物催化剂生产丙烯酰胺浓缩液的方法。
发明背景
在XX世纪70年代初的文献中描述了微生物将腈类化合物转化为相应的酰胺类的能力。催化这种反应的腈水合酶对于涉及各种分类群的广泛多种细菌而言是固有的。代表性的属红球菌属(Rhodococcus)对于本说明书的主题具有实际意义。除其他外，日本、韩国、法国、俄罗斯、德国、美国和中国的大型化工及生物技术公司还使用属于该属的菌株的细胞作为用于丙烯酰胺生产的有效生物催化剂。
尽管对于将腈类酶水解为相应的酰胺类的方法进行了深入研究并且在选择生产腈水合酶的菌株领域中取得相当大的成功，但是对于新型生物催化剂的工业需求并未下降。一方面，这是由于采用生物技术生产酰胺特别是丙烯酰胺的效率和生态安全性引起的，另一方面是由于早期的专利菌株和技术的高成本造成的。因此，近年来分离了为腈水合酶生产者的新微生物。
然而，已知的细菌菌株和使用这些菌株来生产丙烯酰胺的方法具有一些缺点。许多菌株仅能够生产最大浓度小于40％的丙烯酰胺，因此这样的菌株的使用是有限的。
某些菌株的另一个缺点是，在其培养基中必须包括昂贵且组成不同的组分，例如维生素、蛋白胨(peptone)或酵母提取物。一些菌株仅表现出低的腈水合酶活性。为了增加活性，可能需要额外的步骤，例如从发酵液除去氧以及在几天内激活酶。
一些菌株要求含有有毒组分的培养基。例如，在培养基中可能需要乙腈，但乙腈是有毒的、易挥发的、高度易燃且昂贵的。
发明概述
本发明的细菌菌株的特征在于权利要求1所显示的内容。
本发明的生产丙烯酰胺的方法的特征在于权利要求3所显示的内容。
本发明的培养细菌菌株的方法的特征在于权利要求10所显示的内容。
本发明的最终产物的特征在于权利要求23所显示的内容。
本发明的丙烯酰胺的特征在于权利要求24所显示的内容。
发明详述
本发明涉及细菌菌株食醚红球菌(Rhodococcusaetherivorans)VKMAc-2610D。
在一个实施方式中，细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D为腈水合酶的生产者。
本专利申请还涉及培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法。
本申请还涉及生产丙烯酰胺的方法。
所要求保护的一组发明的目的是创造一种用于商品的工业生产且具有高腈水合酶活性的新细菌菌株。
所要求保护的培养所述菌株的方法的目的是开发用于生物质生产所要求保护的菌株而无需多余的成本，而且如果可能的话，与工业中使用的现有类似方法相比成本降低的技术。
所要求保护的使用新菌株生产提到的产品的方法的目的是开发使用新菌株生产预定浓度的丙烯酰胺而不增加工艺成本且无需额外的复杂的工艺操作的技术。
本发明还涉及培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述菌株的细胞使用含有下述组分的营养培养基进行培养：
含有钠离子和钾离子的含水磷酸盐缓冲液；
碳源；
氮源；
任选的酶诱导剂；
任选的钴盐；
镁盐；
锌盐；
钙盐；以及
Fe(II)盐。
在一个实施方式中，营养培养基包含：
含有钠离子和钾离子的含水磷酸盐缓冲液；
碳源；
氮源；
酶诱导剂；
钴盐；
镁盐；
锌盐；
钙盐；以及
Fe(II)盐。
在一个实施方式中，营养培养基由下述组分组成：
含有钠离子和钾离子的含水磷酸盐缓冲液；
碳源；
氮源；
任选的酶诱导剂；
任选的钴盐；
镁盐；
锌盐；
钙盐；以及
Fe(II)盐。
在一个实施方式中，营养培养基由下述组分组成：
含有钠离子和钾离子的含水磷酸盐缓冲液；
碳源；
氮源；
酶诱导剂；
钴盐；
镁盐；
锌盐；
钙盐；以及
Fe(II)盐。
在一个实施方式中，在营养培养基中培养菌株的细胞。
在一个实施方式中，在培养过程中将菌株的细胞悬浮在营养培养基中。
在一个实施方式中，营养培养基的pH为6.3-8.3。在一个实施方式中，营养培养基的pH为7.0-7.4。
在一个实施方式中，所述过程在26-31℃的温度下进行。在一个实施方式中，所述过程在28-30℃的温度下进行。在本文中，术语“所述过程”应被理解为是指使用营养培养基培养菌株的细胞的过程。
在一个实施方式中，在搅拌下培养细菌菌株的细胞。
在一个实施方式中，在通气条件下培养细菌菌株的细胞。
在一个实施方式中，对细菌菌株的细胞进行培养直到细菌菌株的细胞生长进入稳定期。
在一个实施方式中，对细菌菌株的细胞进行培养直到实现预定的细菌菌株细胞产率。
预定的产率可以变化，例如取决于应当得到的用于生产丙烯酰胺的工艺中的生物质的量或取决于细菌菌株细胞的腈水合酶活性。
预定的细胞产率的实现可以通过已知方法例如测量培养物的光学密度或测量细胞团块的干重量来确定。光学密度或吸光度可以例如在如下所述的光电比色计中进行测量。同样，所述方法可以用于确定所述细菌菌株的细胞生长何时进入稳定期。
在一个实施方式中，对细菌菌株的细胞进行培养，直到实现悬浮液的光学密度为36-40。在本文中，“悬浮液”应被理解为是指包含悬浮于其中的细菌菌株细胞的营养培养基。
悬浮液的光学密度为36-40表明细菌生长已达到稳定期。在此以及在实施例中，在光电比色计中在540nm波长下采用5mm的光学层厚度测量光学密度。适合于测量光学密度的光电比色计或分光光度计是本领域中公知的。
在一个实施方式中，进行该过程直到实现悬浮液的光学密度为36-40。
在一个实施方式中，进行该过程直到实现在540nm的波长以及5mm的光学层厚度下悬浮液的光学密度为36-40。
含水磷酸盐缓冲液可以是本领域中已知的任何含水磷酸盐缓冲液，只要其包含钠(Na+)和钾(K+)离子。所述含水磷酸盐缓冲液可以通过使用钠和钾的各种磷酸盐来制备。在一个实施方式中，含水磷酸盐缓冲液包含磷酸盐。在一个实施方式中，含水磷酸盐缓冲液包含选自Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、K2HPO4、以及其任意混合物的磷酸盐。在一个实施方式中，含水磷酸盐缓冲液包含Na2HPO4·12H2O和KH2PO4。可以选择含水磷酸盐缓冲液的pH，从而调节营养培养基的pH为6.3-8.3或为7.0-7.4。
在一个实施方式中，碳源选自葡萄糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、核糖、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、水杨苷、菊粉、柠檬酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、以及其任意混合物。
在一个实施方式中，碳源是葡萄糖。
在一个实施方式中，营养培养基包含20.0-60.0g/l的碳源。
氮源可以是细菌菌株的细胞能够利用的任何氮源。许多合适的氮源也能够诱导腈水合酶活性。因此本领域技术人员将理解，可以在营养培养基中包括单一化合物既作为氮源又作为酶诱导剂。在一个实施方式中，氮源选自碳酰二胺、亮氨酸、乙酰胺或其任意混合物。在一个实施方式中，氮源是碳酰二胺。
在本文中，词语“酶诱导剂”和“诱导剂”可以互换使用并且是指能够诱导腈水合酶活性的物质。能够诱导腈水合酶活性的几种酶诱导剂是本领域中已知的。在一个实施方式中，酶诱导剂是碳酰二胺。在一个实施方式中，酶诱导剂是脂肪族酰胺。在一个实施方式中，酶诱导剂选自丙酰胺、异丁酰胺、乙酰胺、及其混合物。
在一个实施方式中，氮源和诱导剂是碳酰二胺。碳酰二胺(尿素)可以被用作微生物友好的氮源并且对于工业用途是容易得到的。其也可以充当酶诱导剂。
在一个实施方式中，营养培养基包含10.0-24.0g/l的氮源。
钴盐可以是任何可溶性钴盐。钴离子被用作腈水合酶的辅因子。在一个实施方式中，钴盐为CoCl2、CoSO4、或其混合物。在一个实施方式中，钴盐为CoCl2·6H2O、CoSO4·7H2O、或其混合物。在一个实施方式中，营养培养基包含0.04-0.085g/l的钴盐。
镁盐可以是任何可溶性镁盐。由镁盐提供的镁离子被用于细菌菌株细胞的转运功能。在一个实施方式中，镁盐是MgSO4。在一个实施方式中，镁盐是MgSO4·7H2O。在一个实施方式中，营养培养基包含10.0-24.0g/l的镁盐。
锌盐可以是任何可溶性锌盐。由锌盐提供的锌离子可以被用于分解氮源如碳酰二胺。在一个实施方式中，锌盐是ZnSO4。在一个实施方式中，锌盐是ZnSO4·7H2O。在一个实施方式中，营养培养基包含0.08-0.4g/l的锌盐。
钙盐可以是任何可溶性钙盐。由钙盐提供的钙离子可以参与碳源如葡萄糖的利用。在一个实施方式中，钙盐选自CaCl2、СаНРО4·2H2O、Са(H2PO4)2·2H2O、Ca3(PO4)2、CaCl2·2H2O、СаСО3、CaSO4、Ca(C3H5O3)2·3H2O、Са(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O、以及其任意混合物。在一个实施方式中，营养培养基包含0.2-0.6g/l的钙盐。
Fe(II)盐可以是任何可溶性Fe(II)盐。由所述盐提供的亚铁离子被用于呼吸作用中。在一个实施方式中，Fe(II)盐是螯合物形式。在一个实施方式中，铁(II)盐是螯合物形式的FeSO4。在一个实施方式中，Fe(II)盐是螯合物形式的FeSO4·7H2O。在一个实施方式中，营养培养基包含0.025-0.05g/l的Fe(II)盐。
在一个实施方式中，镁盐为MgSO4；锌盐为ZnSO4；钙盐选自CaCl2、СаНРО4·2H2O、Са(H2PO4)2·2H2O、Ca3(PO4)2、CaCl2·2H2O、СаСО3、CaSO4、Ca(C3H5O3)2·3H2O、Са(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O、以及其任意混合物；以及Fe(II)盐为螯合物形式的FeSO4·7H2O。
在培养和细胞生长过程中可以在营养培养基中一次或分几次引入碳源、氮源、诱导剂、以及钴盐。
营养培养基的生产是简单且廉价的。其也允许细菌菌株生物质的高产率和细菌菌株生物质中的腈水合酶的高活性。
在一个实施方式中，营养培养基不包含维生素、氨基酸、蛋白胨、植物提取物、酵母提取物和/或乙腈。
可以随后分离所生产的生物质。分离所生产的生物质的方法是本领域中公知的。
在一个实施方式中，将菌株细胞接种在固体营养培养基上并培养一段时间，然后清洗生物质，将所得到的悬浮液用于接种含有所述营养培养基的第一容器，并且该过程在搅拌下进行一段时间，以实现在540nm的波长和5mm的光学层厚度下悬浮液的光学密度为2-16个单位；然后将所得的悬浮液用于接种容积比第一容器的容积大10-100倍的第二容器，以在所述第二容器中实现0.1-0.3的光学密度，所述第二容器含有新的营养培养基；所述过程在通气条件下继续一段时间直至实现所述悬浮液的光学密度为36-40和рН为7.5-7.8；然后将所产生的生物质分离出来。
在一个实施方式中，将菌株细胞接种在固体营养培养基上并培养24-48小时，然后清洗生物质，并且将所得到的悬浮液用于接种含有所述营养培养基的第一容器，并且该过程在搅拌下进行24-48小时，以实现在540nm的波长和5mm的光学层厚度下悬浮液的光学密度为2-16个单位；然后将所得的悬浮液用于接种容积比所述第一容器的容积大10-100倍的第二容器，以在所述第二容器中实现0.1-0.3的光学密度，所述第二容器含有新的营养培养基；该过程在通气条件下继续48-120小时直至实现所述悬浮液的光学密度为36-40和рН为7.5-7.8；然后将所产生的生物质分离出来。
可以以一步培养法培养细菌菌株的细胞，其中将所述细菌菌株的细胞培养在营养培养基中直到实现细胞的第一预定产率。也可以以两步培养法培养细菌菌株细胞，其中将细菌菌株的细胞培养在第一容器的营养培养基中，随后使用所得到的培养物或悬浮液来接种第二容器中的新的营养培养基；将细菌菌株的细胞培养在该新的营养培养基中，直到实现细胞的第二预定产率。第一和第二预定产率不需要是相同的。通常，第一预定产率不需要如第二预定产率那么高。
其中将菌株细胞在第一步骤中培养在第一容器中和作为第二步骤培养在第二容器中的两步培养法允许细菌菌株更好地适应培养基以及改善酶合成。
固体营养培养基可以是例如肉膏蛋白胨琼脂、LB培养基琼脂、合成培养基或能够支持细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生长的任何其它固体营养培养基。
可以用例如无菌生理溶液如磷酸盐缓冲盐水清洗生物质。无菌生理溶液可以具有7.0-7.4的pH。
第一容器的搅拌可以是例如速率为140-160rpm的循环搅拌。
在本文中，术语“新的营养培养基”应被理解为是指新鲜体积的上述定义的营养培养基。
本发明还涉及培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中将菌株细胞接种在肉膏蛋白胨琼脂的斜面上并培养24-48小时，然后用рН为7.0-7.4的无菌生理溶液清洗生物质，并将所得的悬浮液用于接种含有营养培养基的第一容器，所述营养培养基具有下述组成，以g/l表示：
并且所述过程在28-30℃的温度下在速率为140-160rpm的循环搅拌下进行24-48小时，以实现在540nm的波长和5mm的光学层厚度下悬浮液的光学密度为2-16个单位。然后将所得的悬浮液用于接种容积比所述第一容器的容积大10-100倍的第二容器，以在所述第二容器中实现0.1-0.3的光学密度；所述第二容器含有新的营养培养基，所述营养培养基具有下述组成，以g/l表示：
所述过程在26-31℃的温度、每分钟0.5-1.0体积空气/体积培养基的通气条件下继续48-120小时，直至实现悬浮液的光学密度为36-40和рН为7.5-7.8；然后将所得到的生物质分离出来。
在上述培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法的一个实施方式中，第二容器中的营养培养基可以含有下述盐中的一种作为钙盐：
СаHPO4·2H2O
Са(H2PO4)2·2H2O
Ca3(PO4)2
CaCl2·2H2O
СаСО3
CaSO4
Ca(C3H5O3)2·3H2O
Са(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O；
以及含有下述盐中的一种作为钴盐：
CoCl2·6H2O,
CoSO4·7H2O。
本发明还涉及通过使用属于红球菌属并且具有腈水合酶活性的菌株的生物质水合丙烯腈来生产丙烯酰胺的方法，其中使用细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质在丙烯腈的工作浓度不高于0.5％的条件下进行所述水合。
通过该方法得到含有丙烯酰胺的最终产物。
在一个实施方式中，在水合之后，分离最终的丙烯酰胺产物。
术语“最终的丙烯酰胺产物”应被理解为是指所述最终产物中含有的丙烯酰胺。适于从最终产物分离丙烯酰胺的方法是本领域中已知的。
丙烯腈是有毒化合物，并且应当保持对于细菌菌株而言不过度有毒的合适的工作浓度。细菌菌株耐受不超过0.5％的丙烯腈工作浓度。所述工作浓度还可以允许获得在最终产物中浓度为45-49％的丙烯酰胺。可以通过在水合反应期间在反应溶液中加载丙烯腈来保持工作浓度。本领域技术人员可以选择丙烯腈的工作浓度例如使得水合速率或最终的丙烯酰胺产物的量是最佳的。在一个实施方式中，丙烯腈的工作浓度为0.01-0.5％、或0.05-0.5％、或0.1-0.5％。
在一个实施方式中，丙烯腈的工作浓度基于反应溶液的总重量按重量计不超过0.5％、或为0.01-0.5％、或0.05-0.5％、或0.1-0.5％(w/w)。
在本文中，术语“工作浓度”应被理解为是指在含有细菌菌株生物质和丙烯腈的反应溶液中的浓度。反应溶液也可以包含其它组分，如水、丙烯酰胺和/或任何添加物。
术语“反应溶液”应被理解为是指含有细菌菌株生物质和丙烯腈的反应混合物。该反应混合物也可以包含其它组分，如水、丙烯酰胺和/或任何添加物。
可以选择所使用的细菌菌株生物质的量，例如使得水合速率或最终的丙烯酰胺产物的量是最佳的。细菌菌株生物质的量可以取决于例如细菌菌株细胞的腈水合酶活性。
在一个实施方式中，细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质按菌株干重计为每1吨最终产物约100-1000克、或200-1000克、或200-800克、或300-600克、或小于1000克、或小于500克、或小于400克。
在一个实施方式中，细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质按菌株干重计为每1吨最终产物约400-500克。
在本文中，术语“最终产物”应被理解为是指含有菌株生物质和丙烯酰胺的反应溶液。最终产物也可以包含其它组分，例如水、少量的丙烯腈和/或任何添加物。本领域技术人员将理解在反应溶液中包括的丙烯腈通过细菌菌株生物质被水合为丙烯酰胺。换句话说，最终产物是指其中加入到反应溶液中的丙烯腈已被水合为丙烯酰胺的整个反应溶液。
术语“生物质”应被理解为是指大量的细菌菌株细胞。
在一个实施方式中，最终产物含有浓度为至少40％、或至少41％、或至少42％、或至少43％、或至少44％、或40-55％、或41-55％、42-55％、或43-55％、或44-55％的丙烯酰胺。
在一个实施方式中，最终产物含有浓度为至少45％、或至少46％、或至少47％、或45-55％、或45-54％、或45-53％、或45-52％、或45-51％、或45-50％、或45-49％、或46-55％、或46-54％、或46-53％、或46-52％、或46-51％、或46-50％、或46-49％、或47-55％、或47-54％、或47-53％、或47-52％、或47-51％、或47-50％、或47-49％的丙烯酰胺。
在一个实施方式中，基于最终产物的总重量，最终产物含有按重量计浓度为至少40％、或至少41％、或至少42％、或至少43％、或至少44％、或40-55％、或41-55％、42-55％、或43-55％、或44-55％、或至少45％、或至少46％、或至少47％、或45-55％、或45-54％、或45-53％、或45-52％、或45-51％、或45-50％、或45-49％、或46-55％、或46-54％、或46-53％、或46-52％、或46-51％、或46-50％、或46-49％、或47-55％、或47-54％、或47-53％、或47-52％、或47-51％、或47-50％、或47-49％的丙烯酰胺。
在对应于实施例6的实例中，为了得到在最终产物中浓度为47％的丙烯酰胺，可以将757.2克的丙烯腈引入到反应器中，得到2157.2克的总反应质量。由于所有的丙烯腈通过细菌菌株细胞被转化为丙烯酰胺，在最终产物中得到最终浓度为47％的丙烯酰胺。在本实例中反应将包括1克生物质(干重)。
在一个实施方式中，丙烯腈的水合反应在10-23℃的温度下进行。
在一个实施方式中，丙烯腈的水合反应在6.8-8.4的pH下进行。
在一个实施方式中，丙烯腈的水合反应在10-23℃的温度下和6.8-8.4的pH下进行。
在一个实施方式中，将细菌菌株的生物质悬浮于水溶液中；和
将丙烯腈加入到该水溶液中以形成反应溶液。
在一个实施方式中，将丙烯腈混合在细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质的含水悬浮液中以形成反应溶液；以及进行水合反应，使得丙烯腈在所述反应溶液中的工作浓度保持为不超过0.5％。
在一个实施方式中，该方法包括以下步骤：
a)将细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质悬浮在水溶液中以得到悬浮液；
b)将丙烯腈混合在从步骤a)可获得的悬浮液中以形成反应溶液；和
c)进行水合反应，使得丙烯腈在所述反应溶液中的工作浓度保持为不超过0.5％。
在一个实施方式中，丙烯腈在反应溶液中的工作浓度保持为不超过0.5％，直到获得包含至少45％浓度的丙烯酰胺的最终产物。
在包括使用属于红球菌属并具有腈水合酶活性的菌株的生物质水合丙烯腈，然后分离最终产物即丙烯酰胺的方法的一个实施方式中，以按菌株干重计每1吨最终产物约400-500克的量使用细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质，在丙烯腈的工作浓度不超过0.5％的条件下进行水合反应，所述最终产物为浓度为45-49％的丙烯酰胺。
本发明还涉及通过生产丙烯酰胺的方法的一个或多个实施方式可得到的最终产物。
在一个实施方式中，最终产物包含细菌菌株生物质和丙烯酰胺。最终产物还可以包含其它组分，例如水、少量的丙烯腈和/或任何添加物。
在一个实施方式中，最终产物含有浓度为至少40％、或至少41％、或至少42％、或至少43％、或至少44％、或40-55％、或41-55％、42-55％、或43-55％、或44-55％的丙烯酰胺。
在一个实施方式中，最终产物含有浓度为至少45％、或至少46％、或至少47％、或45-55％、或45-54％、或45-53％、或45-52％、或45-51％、或45-50％、或45-49％、或46-55％、或46-54％、或46-53％、或46-52％、或46-51％、或46-50％、或46-49％、或47-55％、或47-54％、或47-53％、或47-52％、或47-51％、或47-50％、或47-49％的丙烯酰胺。
在一个实施方式中，基于最终产物的总重量，最终产物包含按重量计浓度为至少40％、或至少41％、或至少42％、或至少43％、或至少44％、或40-55％、或41-55％、42-55％、或43-55％、或44-55％、或至少45％、或至少46％、或至少47％、或45-55％、或45-54％、或45-53％、或45-52％、或45-51％、或45-50％、或45-49％、或46-55％、或46-54％、或46-53％、或46-52％、或46-51％、或46-50％、或46-49％、或47-55％、或47-54％、或47-53％、或47-52％、或47-51％、或47-50％、或47-49％的丙烯酰胺。
本发明还涉及由最终产物可得到的丙烯酰胺。
由所要求保护的一组发明提供的技术结果。
细菌食醚红球菌VKMAc-2610D的菌株的特征在于，其在简易有机-矿质培养基中生长并具有在20℃下高达332U/mg或25℃下高达521U/mg的高腈水合酶活性。细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的腈水合酶是热稳定的。
该菌株是从丙烯酰胺和聚丙烯酰胺生产的废水中分离的，并且未被基因改造。这对于其用作工业生物催化剂而言尤其重要，因为许多国家的法律限制使用基因改造微生物。
开发的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法使得可能获得高产率的对简易有机-矿质营养培养基具有高活性的细胞，所述营养培养基不包含昂贵的诱导剂、维生素、氨基酸、以及植物提取物。因为营养培养基的所有组分都是可商购获得的，因此降低了基于所要求保护的菌株制备工业生物催化剂的成本。根据一个或多个实施方式的培养方法对于细菌菌株的快速增长是最佳的。此外，根据一个或多个实施方式的培养方法可以用来提供细菌菌株生物质，该细菌菌株生物质能够用于根据一个或多个实施方式的生产丙烯酰胺的方法中。
本申请中描述的通过使用细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D进行合成来生产丙烯酰胺的方法在经济上是有利的。对合成丙烯酰胺浓缩溶液的条件进行了优化。
所要求保护的菌株是通过直接接种在选择性培养基上的方法从丙烯酰胺和聚丙烯酰胺生产的废水中分离的。
所要求保护的细菌食醚红球菌(Rhodococcusaetherivorans)菌株由个体企业家SergeyKozulin根据布达佩斯条约保藏在全俄微生物菌种保藏中心(All-RussianCollectionofMicroorganisms)中(俄罗斯微生物保藏中心(VKM)，斯克利雅宾微生物生物化学和生理学研究所，俄罗斯科学院，普希诺科学大街5号142290(莫斯科地区)，俄罗斯联邦(RussianCollectionofMicroorganisms(VKM),G.K.SkryabinInstituteofBiochemistryandPhysiologyofMicroorganisms,RussianAcademyofSciences,ProspektNaukiNo.5,Pushchino142290(MoscowRegion),RussianFederation)，保藏编号为VKMAC-2610D(由请求保藏人给出的识别符号为RhodococcusaetherivoransKTN26-1(食醚红球菌KTN26-1))。保藏机构在2012年7月20日收到菌株，并且该保藏在2013年11月15日转变为根据布达佩斯条约的保藏。菌株通过下述的形态学特性、培养特性和生化特性进行表征。
形态学特性：革兰氏阳性菌株，具有红球菌属的生命周期，非运动性，不产生芽孢，不形成包囊，不耐酸，需氧。
培养特性：其在肉膏蛋白胨琼脂上形成圆的光滑菌落，颜色为黄橙色到红橙色，直径为1-2mm(72-96小时后)。当在特殊培养基上生长时其解离为R-、S-和M-形式。
生理学特性：该菌株是氧化酶阴性的、过氧化氢酶和磷酸酶阳性的，将硝酸盐还原成亚硝酸盐。其水解淀粉、吐温60和吐温80；其不水解纤维素、七叶苷和DNA。其在5.5-9.5的pH(最佳pH值为7.2±0.2)和5-45℃的温度(最佳值是29±1℃)下生长。其使用纤维二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、核糖、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇作为唯一的碳源，但其不使用半乳糖醇及肌醇。该菌株在水杨苷、菊粉、柠檬酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐上生长，但在葡糖酸盐上不生长。其利用间-和对-羟基苯甲酸、异丁醇、2,3-丁二醇、单乙醇胺。其使用亮氨酸和乙酰胺作为唯一的氮源。
致病性：该菌株是不致病的。
基于上述特性，根据Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology(OpredelitelbakteriyBerdgy,Moscow:Mir,1997)和对核糖体核糖核酸的基因16S的限制性片段长度多态性分析，该菌株被归属于红球菌属食醚(aetherivorans)种。
培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法可以如下进行。
可以将在4℃温度下储存在0.4％的琼脂化LB培养基或肉膏蛋白胨肉汤的穿刺培养物(stab)中的菌株食醚红球菌的细胞接种在肉膏蛋白胨琼脂斜面上并培养24-48小时。所得到的生物质可以用рН为7.0-7.4的无菌生理溶液清洗。所得到的悬浮液可以用于接种含有营养培养基的第一容器，所述营养培养基具有下述组成，以g/l表示：
该过程在28-30℃的温度下在速率为140-160rpm的循环搅拌下进行24-48小时，以实现在光电比色计中在540nm的波长和5mm的光学层厚度下测量的悬浮液的光学密度为2-16个单位。
然后可以将所得的悬浮液用于接种容积比所述第一容器的容积大10-100倍的第二(较大的)容器，例如含有新的营养培养基的大烧瓶或发酵罐，所述新的营养培养基具有下述组成，以g/l表示：
第二容器中的营养培养基可以含有下述盐中的一种作为钙盐：СаHPO4·2H2O、Са(H2PO4)2·2H2O、Ca3(PO4)2、CaCl2·2H2O、СаСО3、CaSO4、Ca(C3H5O3)2·3H2O；Са(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O；以及含有下述盐中的一种作为钴盐：CoCl2·6H2O、CoSO4·7H2O。
可以在细胞生长过程中在营养培养基中以一次或分几次的形式引入葡萄糖、碳酰二胺以及钴盐。
第二容器中的光学密度值可以达到0.1-0.3个单位。该过程可以在26-31℃的温度、每分钟0.5-1.0体积空气/体积培养基的通气条件下继续48-120小时，直至实现所述悬浮液的光学密度为36-40和рН为7.5-7.8。在该过程结束后，通过任何已知方法如离心、絮凝、浮选、沉降之后过滤来分离生物质。实施这种培养菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法能够给出细胞产率为10-18g/l，腈水合酶的活性为250-332U/mg。生物质可以随后用于生产丙烯酰胺的工艺中。
可以如下进行腈水合酶的活性测试：在0.01M、pH为7.6的磷酸盐缓冲液中制备浓度为0.04-0.06毫克细胞(以干重计)/ml的细胞悬浮液。在1ml悬浮液中引入量为25μl的丙烯腈底物。转化反应在20-25℃的温度、搅拌下的水浴中进行10分钟。通过加入50μl6HHCl停止反应。通过离心分离细菌细胞。通过分光光度法或气相色谱法测定上清液中的丙烯酰胺浓度。除非另有说明，在本文以及在实施例中描述的腈水合酶的活性测量均在20℃的温度下进行。
一单位的腈水合酶比活性(U/mg)为在1mg细胞(以干重计)中每单位时间(1分钟)催化产生1μM的丙烯酰胺的酶的量。一单位的总的腈水合酶总活性(U/ml)为1ml培养液中所包含的酶单位的量。
详细地说，生产丙烯酰胺的方法可以如下进行。
可以根据任何已知的方法将如培养方法的描述中所述得到的细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的细胞从培养液中分离出来，并用pH为7.0-7.6的脱盐水洗涤。可以用于洗涤的水的量可以是1-10体积/细胞体积。可以将洗涤后的细胞以每1吨最终产物约400-500克细胞(干重计)悬浮在pH为6.8-8.4的自来水或蒸馏水中，即根据最终产物的预期浓度和合成时间，可以制备45-49％的丙烯酰胺溶液。细胞的水悬浮液可以放置在恒温反应器中。丙烯酰胺合成的反应可以在6.8-8.4的pH进行。可以在转化期间将丙烯腈加载到反应溶液中，使得其在溶液中的浓度不超过0.5％。可以不断地搅拌反应混合物。反应溶液的温度可以保持在10-23℃。反应时间可以是5-8个小时。反应溶液中的丙烯酰胺和丙烯腈可以通过任何已知的方法例如液相或气相色谱法、分光光度法、折射法进行分析。可以以至少一小时一次进行该分析。在丙烯腈水解速率突然下降后可以停止该过程。在该过程终止后，可以通过任何已知的方法(例如絮凝、过滤、浮选、离心)从反应混合物分离生物催化剂的细胞。该过程可以给出具有例如45-49％的丙烯酰胺浓度的溶液。
本领域技术人员将理解例如通过利用具有大容量的工业发酵罐和反应器，可以放大该方法从而在工业规模上培养大量的细菌菌株生物质并生产大量的丙烯酰胺。
实施例
在下文中，将对本发明进行更详细的说明。下面的描述详细地公开了本发明的一些实施方式和实施例，使得本领域技术人员基于公开内容能够利用本发明。并没有详细讨论实施方式的所有步骤，因为基于本说明书许多步骤对于本领域技术人员而言将是显而易见的。下面的实施例在小规模试验实验室进行；然而，本领域技术人员能够根据期望来放大所述实施例。
实施例1.为腈水合酶的生产者的细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的分离
从丙烯酰胺和聚丙烯酰胺生产的废水中分离菌株。
为分离菌株，使用选择性培养基代表具有上述组成并补充0.9g/l的Na2HPO4·12H2O、0.5g/l的KH2PO4、1.0g/l的MgSO4·7H2O、0.5g/l的酵母提取物的琼脂化废水。将具有选择性培养基的板用0.1ml废水的菌苔(lawn)接种并培养72-96小时。将生长的菌落在肉膏蛋白胨琼脂上再接种两次以测试纯度，然后分析其将丙烯腈转化为丙烯酰胺的能力。出于这个目的，使所测试菌株在具有40ml容积且1/8充满培养基的细菌学试管中生长，所述培养基具有下列组成，以g/l表示：
在28-30℃的温度、搅拌下培养2天。将得到的细胞悬浮液以15000rpm离心1分钟。用0.01MpH为7.6的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，将细胞再悬浮在1ml相同的缓冲液中，然后如在测试中所述测量腈水合酶活性。这得到具有95U/mg的腈水合酶活性的菌株。
实施例2.在实验室条件下在Erlenmeyer烧瓶中培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法
使菌株细胞在28℃在肉膏蛋白胨琼脂斜面上生长36小时。将所得到的生物质用pH为7.0-7.4的无菌生理溶液洗涤，并接种到具有下述组成(g/l)的液体营养培养基中进行预培养：
预培养在Erlenmeyer烧瓶中在28-30℃、120-160rpm的循环搅拌下进行24-48小时。这产生在λ540nm，l＝5mm的条件下具有4.6个单位的光学密度的细胞悬浮液。将2ml量的所得悬浮液在无菌条件下接种到用于培养的具有下述组成(以g/l表示)的培养基中：
在容积为300ml且1/6充满培养基的Erlenmeyer烧瓶中在28-30℃、循环搅拌(160rpm)下培养4天。培养完成后，测定样品中的细胞浓度和腈水合酶活性。培养96小时后的细胞产率为16.0g/l，腈水合酶比活性在20℃下为332U/mg，在25℃下为521U/mg，总的腈水合酶活性在20℃下为5312U/ml和在25℃下为8336U/ml。在25℃下进行活性测定，以与菌株赤红球菌(Rhodococcusruber)GT进行比较。
为了证实细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的培养方法的可放大性以及工业应用的可能性，在容积为3升的发酵罐中进行该菌株的培养。
实施例3.在发酵罐中培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D。
在28小时的时间段制备代表细胞在培养基中的悬浮液的接种物。为了此目的，使细胞在28-30℃的温度、循环搅拌(160rpm)下在Erlenmeyer烧瓶中生长，该烧瓶的容积为300ml且1/6充满具有下述组成(g/l)的培养基：
这产生在λ540nm，l＝5mm下具有6个单位的光学密度的细胞悬浮液。将100ml所得的细胞悬浮液用于接种容积为3升的实验室发酵罐(装有1.5升培养基)。
用于所述发酵罐的培养基的组成(g/l)：
在28℃的温度、每分钟0.5-1.0体积空气/体积培养基的通气和在560rpm的连续搅拌下进行培养。周期性地，每六小时一次从发酵罐中取出培养液样品以测定pH、细胞的产率和腈水合酶活性。所得数据列于表中。
发酵周期，小时 0 6 12 18 24 30 36
рН 7.11 6.95 6.91 6.88 6.87 6.88 6.87
细胞产率，g/l(基于干重) 0.1 0.4 1.3 2.4 3.7 5.5 7.1
腈水合酶比活性，U/mg - 40 34 55 126 185 219
发酵时长，小时 42 48 54 60 66 70
рН 6.86 6.85 6.92 6.97 7.06 7.51
细胞产率，g/l(基于干重) 8.2 9.9 12.6 13.9 16.4 18.1
腈水合酶比活性，U/mg 236 249 256 267 274 280
培养70小时后，细胞产率为18.1g/l，腈水合酶比活性为280U/mg(在20℃下)或在25℃下为440U/mg，总的腈水合酶活性为5058U/ml(在20℃下)或在25℃下为7964U/ml。
实施例4.使用通过在烧瓶中培养生产的细胞在实验室反应器中制备浓缩的丙烯酰胺溶液。
将66.2g在自来水中的具有270U/mg的腈水合酶活性的细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的细胞悬浮液置于150ml的配有磁力混合器和温度计的恒温反应器中；因而，该反应器含有30mg(按干重计)生物催化细胞。如实施例2所述生产细胞。反应溶液的pH为7.6。在整个合成期间在连续搅拌和17-22℃的温度下将24.2g丙烯腈加载在反应器中，从而使得溶液中的丙烯腈浓度不大于0.3％。用气相色谱法以每小时一次周期性地分析溶液中的丙烯酰胺和丙烯腈。合成7.0小时后停止反应，因为丙烯腈水解速率下降。通过离心将细胞从反应溶液中分离。溶液中丙烯酰胺的浓度为49％，无残留的丙烯腈。
为了证实在工业丙烯酰胺制备工艺中使用菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的可能性以及所要求保护的技术的可放大性，在具有3升容积的装置中进行丙烯酰胺合成，所述装置是工业反应器的类似物。
实施例5.使用通过在烧瓶中培养得到的细胞在3升反应器中合成浓缩的丙烯酰胺溶液。
将1.4升在脱盐水中的具有254U/mg腈水合酶活性的菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的细胞悬浮液装载到3升的配有磁力混合器和用于除热的夹套并且恒温控制在20-22℃温度下的反应器中；因而，该反应器包含1g(按干重计)生物催化细胞。如实施例2所述得到细胞。反应溶液的pH为7.4。将丙烯腈引入到反应溶液中，随着其发生转化，使得初始和现在的丙烯腈浓度均不大于0.5％。反应5小时后得到具有47％浓度的丙烯酰胺溶液。然后停止反应，因为丙烯腈水解速率急剧下降。
实施例6.使用通过在发酵罐中培养生产的细胞在容积为3升的反应器中制备浓缩的丙烯酰胺溶液
将1.4升在脱盐水中的具有280U/mg腈水合酶活性的菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的细胞悬浮液装载入3升的配有磁力混合器和用于除热的夹套并且恒温控制在14-23℃温度下的反应器中；因而，该反应器包含1g(按干重重)生物催化细胞。如实施例3所述得到细胞。反应溶液的pH为7.8。将丙烯腈引入到反应溶液中，随着其发生转化，使得初始和现在的丙烯腈浓度均不大于0.1％。采用气相色谱法以每小时一次周期性地分析溶液中的丙烯酰胺和丙烯腈。7.0小时后，由于丙烯腈水解速率下降而停止反应。溶液(即最终产物)中丙烯酰胺的浓度为49％。溶液中无残留的丙烯腈。
实施例7.使用通过在容积为24升的发酵罐中培养生产的细胞在容积为1升的反应器中制备浓缩的丙烯酰胺溶液
如前面的实施例中所述生长细菌菌株生物质，除了使用容积为24升的发酵罐。使用容积为1升的反应器如前面的实施例中所述使用生物质来制备丙烯酰胺。所得到的最终产物中的丙烯酰胺浓度为49.5％。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，随着技术的进步，本发明的基本思路可以以各种方式进行实施。因此本发明及其实施方式不限于如上所述的实施例，反而其可以在权利要求的范围内变化。

Claims (24)

1.一种细菌菌株食醚红球菌(Rhodococcusaetherivorans)VKMAc-2610D。
2.根据权利要求1所述的细菌菌株，其是腈水合酶的生产者。
3.使用属于红球菌属并且具有腈水合酶活性的菌株的生物质水合丙烯腈来生产丙烯酰胺的方法，其中使用细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质在丙烯腈的工作浓度不高于0.5％的条件下进行所述水合。
4.根据权利要求3所述的生产丙烯酰胺的方法，其中将丙烯腈混合在细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质的含水悬浮液中以形成反应溶液；并且进行水合，从而使得丙烯腈在所述反应溶液中的工作浓度保持为不超过0.5％。
5.根据权利要求3或4所述的生产丙烯酰胺的方法，其中在所述水合之后，分离最终的丙烯酰胺产物。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的生产丙烯酰胺的方法，其中所述细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的生物质按菌株干重计为每1吨所述最终产物约100-1000克、或200-1000克、或200-800克、或300-600克、或约400-500克、或小于1000克、或小于500克、或小于400克。
7.根据权利要求6所述的生产丙烯酰胺的方法，其中所述最终产物含有浓度为至少40％、或至少41％、或至少42％、或至少43％、或至少44％、或40-55％、或41-55％、42-55％、或43-55％、或44-55％、或至少45％、或至少46％、或至少47％、或45-55％、或45-54％、或45-53％、或45-52％、或45-51％、或45-50％、或45-49％、或46-55％、或46-54％、或46-53％、或46-52％、或46-51％、或46-50％、或46-49％、或47-55％、或47-54％、或47-53％、或47-52％、或47-51％、或47-50％、或47-49％的丙烯酰胺。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的生产丙烯酰胺的方法，其中丙烯腈的水合在10-23℃的温度下进行。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的生产丙烯酰胺的方法，其中所述丙烯腈的水合在6.8-8.4的pH下进行。
10.培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中使用营养培养基来培养所述菌株的细胞，所述营养培养基含有：
含有钠离子和钾离子的含水磷酸盐缓冲液；
碳源；
氮源；
任选的酶诱导剂；
任选的钴盐；
镁盐；
锌盐；
钙盐；以及
Fe(II)盐。
11.根据权利要求10所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中对所述细菌菌株的细胞进行培养直到所述细菌菌株的细胞的生长进入稳定期或直到达到预定的细胞产率。
12.根据权利要求10或11所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述营养培养基的pH为6.3-8.3或7.0-7.4。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述过程在26-31℃的温度下或在28-30℃的温度下进行。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中对所述细菌菌株的细胞进行培养直到实现所述悬浮液的光学密度为36-40。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述含水磷酸盐缓冲液包含选自以下的磷酸盐：Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、K2HPO4、以及其任意混合物。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述碳源选自葡萄糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、核糖、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、水杨苷、菊粉、柠檬酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、以及其任意混合物。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述氮源和所述诱导剂为碳酰二胺。
18.根据权利要求10-17中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述钴盐为CoCl2、CoSO4、或其混合物。
19.根据权利要求10-18中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述镁盐为MgSO4；和/或所述锌盐为ZnSO4；和/或所述钙盐选自CaCl2、СаНРО4·2H2O、Са(H2PO4)2·2H2O、Ca3(PO4)2、CaCl2·2H2O、СаСО3、CaSO4、Ca(C3H5O3)2·3H2O、Са(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O、以及其任意混合物；和/或所述Fe(II)盐为螯合物形式的FeSO4·7H2O。
20.根据权利要求10-19中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中将所述菌株的细胞接种在固体营养培养基上并培养24-48小时，然后清洗生物质，并将所得到的悬浮液用于接种含有所述营养培养基的第一容器，并且该过程在搅拌下进行24-48小时，以实现在540nm的波长和5mm的光学层厚度下悬浮液的光学密度为2-16个单位；然后将所得的悬浮液用于接种容积比所述第一容器的容积大10-100倍的第二容器，所述第二容器含有新的营养培养基，以在所述第二容器中实现0.1-0.3的光学密度；该过程在通气条件下继续48-120小时直至实现所述悬浮液的光学密度为36-40和рН为7.5-7.8；然后将所产生的生物质分离出来。
21.根据权利要求10-20中任一项所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中将所述菌株的细胞接种在肉膏蛋白胨琼脂斜面上并培养24-48小时，然后用рН为7.0-7.4的无菌生理溶液清洗生物质，并将所得的悬浮液用于接种含有营养培养基的第一容器，所述营养培养基具有下述组成，以g/l表示：
并且该过程在28-30℃的温度下在速率为140-160rpm的循环搅拌下进行24-48小时，以实现在540nm的波长和5mm的光学层厚度下悬浮液的光学密度为2-16个单位；然后将所述所得的悬浮液用于接种容积比所述第一容器的容积大10-100倍的的第二容器，以在所述第二容器中实现0.1-0.3的光学密度，所述第二容器含有新的营养培养基，该新的营养培养基具有下列组成，以g/l表示：
该过程在26-31℃的温度、每分钟0.5-1.0体积空气/体积培养基的通气条件下继续48-120小时，直至实现所述悬浮液的光学密度为36-40和рН为7.5-7.8；然后将所产生的生物质分离出来。
22.根据权利要求21所述的培养细菌菌株食醚红球菌VKMAc-2610D的方法，其中所述第二容器中的营养培养基含有下述盐中的一种作为钙盐：
СаHPO4·2H2O
Са(H2PO4)2·2H2O
Ca3(PO4)2
CaCl2·2H2O
СаСО3
CaSO4
Ca(C3H5O3)2·3H2O
Са(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O；
以及含有下述盐中的一种作为钴盐：
CoCl2·6H2O，
CoSO4·7H2O。
23.通过权利要求3-9中任一项所述的方法可得到的最终产物。
24.由权利要求23所述的最终产物可得到的丙烯酰胺。
CN201380067953.3A 2012-12-27 2013-12-23 产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法 Pending CN105121626A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012157783 2012-12-27
RU2012157783/10A RU2520870C1 (ru) 2012-12-27 2012-12-27 Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида
PCT/IB2013/061268 WO2014102703A1 (en) 2012-12-27 2013-12-23 BACTERIAL STRAIN RHODOCOCCUS AETHERIVORANS VKM Ac-2610D PRODUCING NITRILE HYDRATASE, METHOD OF ITS CULTIVATION AND METHOD FOR PRODUCING ACRYLAMIDE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105121626A true CN105121626A (zh) 2015-12-02

Family

ID=49876491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380067953.3A Pending CN105121626A (zh) 2012-12-27 2013-12-23 产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法

Country Status (13)

Country Link
US (2) US9518279B2 (zh)
EP (1) EP2749637B1 (zh)
JP (1) JP6329176B2 (zh)
KR (1) KR20150100762A (zh)
CN (1) CN105121626A (zh)
AR (1) AR094316A1 (zh)
AU (1) AU2013368889A1 (zh)
BR (1) BR112015015538A2 (zh)
ES (1) ES2629489T3 (zh)
RU (1) RU2520870C1 (zh)
SA (1) SA515360688B1 (zh)
WO (1) WO2014102703A1 (zh)
ZA (1) ZA201505342B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475317A (zh) * 2016-06-07 2017-12-15 中国石油化工股份有限公司 丙烯酰胺水溶液的制备方法
CN107586750A (zh) * 2017-11-02 2018-01-16 山东阳成生物科技有限公司 一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法
CN109153966A (zh) * 2016-05-18 2019-01-04 哥伦比亚有限责任公司 生产丙烯酰胺的生物技术方法及相关新菌株
CN114196589A (zh) * 2021-12-23 2022-03-18 浙江工业大学 食醚红球菌zhc及其在降解丙烯酸甲酯中的应用
CN116179402A (zh) * 2022-09-06 2023-05-30 南京工业大学 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2520870C1 (ru) 2012-12-27 2014-06-27 Кемира Оюй Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида
PL3201316T3 (pl) * 2014-09-30 2020-06-29 Solenis Technologies Cayman, L.P. Metoda hodowli mikroorganizmów o aktywności hydratazy nitrylowej
JP6716547B2 (ja) * 2014-09-30 2020-07-01 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 低いアクリル酸濃度を有するアクリルアミド水溶液の製造方法
CN107881163A (zh) * 2017-09-29 2018-04-06 浙江大学 一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用
WO2019097123A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Kemira Oyj A process for producing aqueous acrylamide solution, aqueous acrylamide solution and use thereof
US20230079664A1 (en) * 2019-12-30 2023-03-16 Kemira Oyj Ftnir spectroscopy for reaction monitoring of acrylamide synthesis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5827699A (en) * 1993-12-17 1998-10-27 Gosudarstvenny. Nauchno-Issledovatelsky Institut Genetiki I Selektsii Promshlennykh Mikroorganizmov Strain of Rhodococcus rhodochrous as a producer of nitrile hydratase
WO2005054456A1 (en) * 2003-12-02 2005-06-16 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Strain of rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
WO2006007957A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-26 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Process for preparing monomers and polymers thereof

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179014A (en) 1985-01-08 1993-01-12 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for the preparation of amides using microorganisms
JPS63137688A (ja) 1986-12-01 1988-06-09 Res Assoc Util Of Light Oil アミド化合物の製造法
CZ280901B6 (cs) 1988-10-06 1996-05-15 Hideaki Yamada Způsob kultivace bakterií
SU1731814A1 (ru) 1990-05-17 1992-05-07 Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленныхмикроорганизмов Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы
RU2077588C1 (ru) 1996-01-16 1997-04-20 Государственное унитарное предприятие Саратовский научно-исследовательский институт биокатализа Способ получения акриламида
DE19620594A1 (de) 1996-05-22 1997-11-27 Sel Alcatel Ag Resonator für elektromagnetische Wellen mit einer Stabilisierungseinrichtung und Verfahren zum Stabilisieren der Resonatorlänge
JPH1171478A (ja) 1997-08-29 1999-03-16 Santen Pharmaceut Co Ltd 粘度低下防止方法
RU2146291C1 (ru) * 1998-12-17 2000-03-10 Закрытое акционерное общество "Биоамид" Усовершенствованный биотехнологический способ получения акриламида
JP2001069978A (ja) 1999-09-02 2001-03-21 Showa Denko Kk ロドコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子
RU2159817C1 (ru) * 1999-11-23 2000-11-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Пермский завод им. С.М. Кирова" Способ получения акриламида
RU2196822C1 (ru) 2001-07-25 2003-01-20 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы
RU2223316C2 (ru) * 2001-12-06 2004-02-10 ФГУП "Пермский завод им. С.М.Кирова" ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ
DE10315376B4 (de) * 2003-04-03 2005-07-14 Stockhausen Gmbh Verfahren zur Kultivierung des Nitrilhydratase-produzierenden Stammes RHODOCOCCUS RHODOCHROUS M33
DE102004013824A1 (de) 2004-03-20 2005-10-13 Degussa Ag Nitrilhydratasen aus Rhodococcus opacus
RU2304165C1 (ru) 2006-03-02 2007-08-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) Способ получения акриловых мономеров и штамм бактерий rhodococcus rhodochrous для его осуществления
CN101186911B (zh) 2007-09-20 2010-06-02 清华大学 一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用
FR2944006B1 (fr) * 2009-04-03 2011-04-01 Inst Francais Du Petrole Bacteries capables de degrader des composes petroliers multiples en solution dans des effluents aqueux et procede de traitement desdits effluents
CN101892228B (zh) 2010-05-24 2012-05-23 清华大学 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
RU2468084C1 (ru) 2011-06-16 2012-11-27 Общество с ограниченной ответственностью научно-производственное предприятие "Гель-Плюс" Биотехнологический способ получения акриламида
RU2520870C1 (ru) 2012-12-27 2014-06-27 Кемира Оюй Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5827699A (en) * 1993-12-17 1998-10-27 Gosudarstvenny. Nauchno-Issledovatelsky Institut Genetiki I Selektsii Promshlennykh Mikroorganizmov Strain of Rhodococcus rhodochrous as a producer of nitrile hydratase
WO2005054456A1 (en) * 2003-12-02 2005-06-16 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Strain of rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
WO2006007957A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-26 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Process for preparing monomers and polymers thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOODFELLOW ET AL.: "Rhodococcus aetherivorans sp.nov.,A new species that contains methyl t-butyl ether-degrading actinomycetes", 《SYSTTEMATIC AND APPLIED MICROBIOLOGY》 *
李文忠等: "微生物转化丙烯腈生产丙烯酰胺菌种筛选及丙烯腈的微生物转化", 《微生物学报》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109153966A (zh) * 2016-05-18 2019-01-04 哥伦比亚有限责任公司 生产丙烯酰胺的生物技术方法及相关新菌株
CN109153966B (zh) * 2016-05-18 2021-11-02 哥伦比亚有限责任公司 生产丙烯酰胺的生物技术方法及相关新菌株
CN107475317A (zh) * 2016-06-07 2017-12-15 中国石油化工股份有限公司 丙烯酰胺水溶液的制备方法
CN107475317B (zh) * 2016-06-07 2021-12-17 中国石油化工股份有限公司 丙烯酰胺水溶液的制备方法
CN107586750A (zh) * 2017-11-02 2018-01-16 山东阳成生物科技有限公司 一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法
CN107586750B (zh) * 2017-11-02 2020-04-21 山东阳成生物科技有限公司 一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法
CN114196589A (zh) * 2021-12-23 2022-03-18 浙江工业大学 食醚红球菌zhc及其在降解丙烯酸甲酯中的应用
CN114196589B (zh) * 2021-12-23 2023-05-23 浙江工业大学 食醚红球菌zhc及其在降解丙烯酸甲酯中的应用
CN116179402A (zh) * 2022-09-06 2023-05-30 南京工业大学 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用
CN116179402B (zh) * 2022-09-06 2024-01-30 南京工业大学 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016503651A (ja) 2016-02-08
ZA201505342B (en) 2016-10-26
SA515360688B1 (ar) 2018-02-04
US20170058255A1 (en) 2017-03-02
WO2014102703A1 (en) 2014-07-03
EP2749637B1 (en) 2017-04-05
US10138459B2 (en) 2018-11-27
US9518279B2 (en) 2016-12-13
AU2013368889A1 (en) 2015-07-02
BR112015015538A2 (pt) 2017-07-11
RU2520870C1 (ru) 2014-06-27
JP6329176B2 (ja) 2018-05-23
AR094316A1 (es) 2015-07-29
US20140187818A1 (en) 2014-07-03
KR20150100762A (ko) 2015-09-02
ES2629489T3 (es) 2017-08-10
EP2749637A1 (en) 2014-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105121626A (zh) 产腈水合酶的细菌菌株食醚红球菌VKM Ac-2610D、其培养方法以及生产丙烯酰胺的方法
Canale-Parola Biology of the sugar-fermenting Sarcinae
CN104364377B (zh) 通过生物转化从长链脂肪酸产生中链ω‑羟基脂肪酸、α，ω‑二羧酸和ω‑氨基脂肪酸的方法
CN100334200C (zh) 一株可高产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌
CN109385388A (zh) 嗜盐反硝化菌yl5-2及其应用
CN108467860A (zh) 一种高产γ-氨基丁酸的方法
CN110656057B (zh) 异养硝化-好氧反硝化的副球菌菌株、种子液及其制备方法和应用
CN109868249A (zh) 一株具有好氧反硝化能力的海杆菌及其应用
CN109337832A (zh) 一种耐高氨氮异养硝化-好氧反硝化的苍白杆菌及其应用
JP6521243B2 (ja) ３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の好気的生産方法
Ust’ak et al. Experimental verification of various methods for biological hydrogen production
CN106834177B (zh) 一株瘤胃菌及其应用
El-Rab et al. Costless and huge hydrogen yield by manipulation of iron concentrations in the new bacterial strain Brevibacillus invocatus SAR grown on algal biomass
CN103667107B (zh) 一种产l-乳酸的屎肠球菌菌株
JP2020054334A (ja) 微生物タンパク質を得るための共棲菌 従属栄養細菌Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｇｉｌａｒｄｉｉ ＧＢＳ−１５−１菌株
CN111778199B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其应用
RU2745093C1 (ru) Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы
JPH08187092A (ja) 好熱性微生物が有するニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を向上させる方法
CN113564081A (zh) 一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌scs-3及其应用
CN104277996B (zh) 解角质素微杆菌及其培养方法和应用
US3994781A (en) Process for the production of protein
RU2773502C1 (ru) Штамм метанолокисляющих бактерий Acidomonas methanolica BF 21-05М - продуцент для получения микробной белковой массы
CN112574933B (zh) 一株产还原性脱卤素酶的菌株及其应用
CN106811432A (zh) 一种骚动厄斯考维菌及在制备(r)‑3‑氯苯乙醇中的应用
JPH01108988A (ja) 焦性ぶどう酸の製法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151202

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication