KR20150100762A - 니트릴 하이드라타제를 생산하는 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D, 그의 배양 방법 및 아크릴아미드의 제조 방법 - Google Patents

니트릴 하이드라타제를 생산하는 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D, 그의 배양 방법 및 아크릴아미드의 제조 방법 Download PDF

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KR20150100762A
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세르게이 블라디미로비치 코줄린
타티아나 니콜라에브나 코줄리나
알렉세이 세르게에비치 코줄린
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케미라 오와이제이
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Abstract

본 발명은 니트릴 하이드라타제의 생산자인 로도코커스 속에 속하는 세균 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 세균 균주의 바이오매스를 사용하는 아크릴로니트릴의 수화에 의해 아크릴아미드를 제조하는 방법 및 상기 세균 균주의 배양 방법에 관한 것이다.

Description

니트릴 하이드라타제를 생산하는 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D, 그의 배양 방법 및 아크릴아미드의 제조 방법{BACTERIAL STRAIN RHODOCOCCUS AETHERIVORANS VKM Ac-2610D PRODUCING NITRILE HYDRATASE, METHOD OF ITS CULTIVATION AND METHOD FOR PRODUCING ACRYLAMIDE}
본 발명의 그룹은 생물공학 및 미생물 산업에 관한 것이며,
- 높은 니트릴 하이드라타제 효소 활성을 갖는 세균(bacteria) 로도코커스 아에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans)의 신규 균주;
- 그의 배양 방법;
- 생물촉매로서 상기 균주의 세포를 사용하는 아크릴아미드의 농축된 용액의 제조 방법
을 포함한다.
카보니트릴을 상응하는 아미드로 전환시키는 미생물의 능력은 20세기 70년대 초에 문헌에 개시되었다. 상기와 같은 반응을 촉매화하는 니트릴 하이드라타제 효소는 다양한 분류학적 그룹과 관련하여 광범위한 세균에 내재되어 있다. 로도코커스 속을 대표하는 것들은 본 명세서의 주제와 관련하여 실제적으로 흥미롭다. 일본, 대한민국, 프랑스, 러시아, 독일, 미국과 중국의 큰 화학, 생물공학 회사들은 특히 아크릴아미드 생산에 유효한 생물촉매로서 상기 속에 속하는 균주의 세포를 사용한다.
니트릴의 상응하는 아미드로의 효소적 가수분해 공정에 대한 예의 연구 및 니트릴 하이드라타제 생산 균주의 선택 분야에서 상당한 성공에도 불구하고, 새로운 생물촉매에 대한 산업적 수요는 그치지 않고 있다. 상기 수요는, 한편으로 아미드, 특히 아크릴아미드의 생물공학적 생산의 효능 및 생태학적 안전성에 의해서, 및 다른 한편으로 선행 특허 균주 및 기술의 고비용에 의해서 야기된다. 따라서 최근 수십 년간 니트릴 하이드라타제 효소의 생산자인 새로운 미생물들이 분리되었다.
그러나, 공지된 세균 균주 및 상기와 같은 균주를 사용하는 아크릴아미드의 생산 방법은 다수의 결점들이 문제가 된다. 많은 균주들은 단지 최대 40% 미만의 농도로 아크릴아미드를 생산할 수 있으며, 따라서 상기와 같은 균주의 사용은 한계가 있다.
몇몇 균주의 또 다른 단점은 값이 비싸고 조성이 다양한 성분에 있다, 예를 들어 비타민, 펩톤 또는 효모 추출물을 상기 균주의 배양 배지에 포함시켜야 한다. 일부 균주는 단지 낮은 니트릴 하이드라타제 활성을 나타낸다. 활성을 증가시키기 위해서, 수일 동안 상기 효소의 활성화와 함께 배양 브로쓰로부터 산소를 제거하는 바와 같은 추가적인 단계들이 필요할 수도 있다.
일부 균주는 독성 성분들을 함유하는 배양 배지를 필요로 한다. 예를 들어, 아세토니트릴이 배양 배지에 필요할 수도 있는데, 아세토니트릴은 독성이고, 휘발성이며, 고도로 가연성이고, 값이 비싸다.
본 발명에 따른 세균 균주는 특허청구범위 제1항에 나타낸 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 아크릴아미드의 제조 방법은 특허청구범위 제3항에 나타낸 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세균 균주의 배양 방법은 특허청구범위 제10항에 나타낸 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 최종 생성물은 특허청구범위 제23항에 나타낸 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 아크릴아미드는 특허청구범위 제24항에 나타낸 것을 특징으로 한다.
본 발명은 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D에 관한 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D는 니트릴 하이드라타제의 생산자이다.
본 특허 출원은 또한 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법에 관한 것이다.
본 출원은 또한 아크릴아미드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특허청구된 그룹의 목적은 수요가 있는 제품의 산업적 생산에 사용하기 위한 높은 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 신규의 세균 균주의 생산이다.
상기 균주의 특허청구된 배양 방법의 목적은 불필요한 비용 없이, 더욱이, 가능하다면, 산업상 사용되는 기존의 유사한 방법들에 비해 비용이 감소된 상기 특허청구된 균주의 바이오매스 생산을 위한 기술의 개발이다.
신규 균주의 사용에 의한 상기 언급된 생성물의 특허청구된 제조 방법의 목적은 공정 비용의 증가 및 공정 작업의 추가적인 복잡화 없이, 상기 신규 균주의 사용에 의해 아크릴아미드를 소정의(predetermined) 농도로 제조하기 위한 기술의 개발이다.
본 발명은 또한 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 균주의 세포를
나트륨 및 칼륨 이온을 포함하는 수성 포스페이트 완충제;
탄소원;
질소원;
임의로 효소 유도물질;
임의로 코발트염;
마그네슘염;
아연염;
칼슘염; 및
철(II)염
을 포함하는 영양 배지를 사용하여 배양한다.
하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는
나트륨 및 칼륨 이온을 포함하는 수성 포스페이트 완충제;
탄소원;
질소원;
효소 유도물질;
코발트염;
마그네슘염;
아연염;
칼슘염; 및
철(II)염
을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는
나트륨 및 칼륨 이온을 포함하는 수성 포스페이트 완충제;
탄소원;
질소원;
임의로 효소 유도물질;
임의로 코발트염;
마그네슘염;
아연염;
칼슘염; 및
철(II)염
으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는
나트륨 및 칼륨 이온을 포함하는 수성 포스페이트 완충제;
탄소원;
질소원;
효소 유도물질;
코발트염;
마그네슘염;
아연염;
칼슘염; 및
철(II)염
으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 상기 균주의 세포를 상기 영양 배지에서 배양한다.
하나의 실시형태에서, 상기 균주의 세포를 배양하는 동안 상기 영양 배지에 현탁시킨다.
하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지의 pH는 6.3 내지 8.3이다. 하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지의 pH는 7.0 내지 7.4이다.
하나의 실시형태에서, 상기 공정을 26 내지 31 ℃의 온도에서 수행한다. 하나의 실시형태에서, 상기 공정을 28 내지 30 ℃의 온도에서 수행한다. 이와 관련하여, "상기 공정"이란 용어는 상기 영양 배지를 사용하여 상기 균주의 세포를 배양하는 공정을 지칭하는 것으로 이해해야 한다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주의 세포를 교반하면서 배양한다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주의 세포를 통기(aeration)와 함께 배양한다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주의 세포를, 상기 세균 균주의 세포의 증식이 정지상에 진입할 때까지 배양한다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주의 세포를, 상기 세균 균주의 세포의 소정의 수율이 성취될 때까지 배양한다.
상기 소정의 수율은 예를 들어 아크릴아미드의 생산 공정에 대해 수득되어야 하는 바이오매스의 양, 또는 상기 세균 균주의 세포의 니트릴 하이드라타제 활성에 따라 변할 수 있다.
세포의 소정의 수율의 성취를 공지된 방법, 예를 들어 상기 배양물의 광학 밀도의 측정 또는 상기 세포 질량의 건조 중량의 측정에 의해서 측정할 수 있다. 광학 밀도, 또는 흡광도를, 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같이 광전 비색계에서 측정할 수 있다. 마찬가지로, 상기 방법을 사용하여, 상기 세균 균주의 세포의 증식이 정지상에 진입하는 시기를 측정할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주의 세포를, 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도가 성취될 때까지 배양한다. 이와 관련하여, 상기 "현탁액"은 상기 세균 균주의 세포가 현탁되어 있는 영양 배지를 지칭하는 것으로서 이해해야 한다.
36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도는 세균 증식이 정지상에 도달했음을 가리킨다. 여기에서 및 실시예에서, 상기 광학 밀도를 540 ㎚ 파장에서 5 ㎜의 광학층 두께를 갖는 광전 비색계에서 측정한다. 광학 밀도의 측정에 적합한 광전 비색계 또는 분광광도계는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 공정을 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도가 성취될 때까지 수행한다.
하나의 실시형태에서, 상기 공정을 540 ㎚의 파장 및 5 ㎜의 광학층 두께에서 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도가 성취될 때까지 수행한다.
상기 수성 포스페이트 완충제는 당해 분야에 공지된 임의의 수성 포스페이트 완충제일 수 있으나, 단 상기 완충제는 나트륨(Na+) 및 칼륨(K+) 이온을 포함해야 한다. 상기 수성 포스페이트 완충제를 나트륨 및 칼륨의 다양한 포스페이트염을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 수성 포스페이트 완충제는 포스페이트염을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 수성 포스페이트 완충제는 Na2HPO4 NaH2PO4, KH2PO4, K2HPO4 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 포스페이트염을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 수성 포스페이트 완충제는 Na2HPO4·12H2O 및 KH2PO4를 포함한다. 상기 수성 포스페이트 완충제의 pH를, 상기 영양 배지의 pH를 6.3 내지 8.3 또는 7.0 내지 7.4로 조절하기 위해서 선택할 수도 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 탄소원은 글루코스, 셀로비오스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 만노스, 슈크로스, 트레할로스, 리보스, 글리세롤, 만니톨, 솔비톨, 살리신, 이눌린, 시트레이트, 피루베이트, 숙시네이트, 퓨마레이트 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 탄소원은 글루코스이다.
하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 20.0 내지 60.0 g/ℓ의 상기 탄소원을 포함한다.
상기 질소원은 상기 세균 균주의 세포가 사용할 수 있는 임의의 질소 공급원일 수 있다. 다수의 적합한 질소원들은 또한 니트릴 하이드라타제 활성을 유도할 수 있다. 따라서 숙련가는 단일 화합물을 질소원 및 효소 유도물질 모두로서 상기 영양 배지에 포함시킬 수도 있음을 알 것이다. 하나의 실시형태에서, 상기 질소원은 카브아미드(carbamide), 류신, 아세트아미드 및 임의의 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 실시형태에서, 상기 질소원은 카브아미드이다.
이와 관련하여, "효소 유도물질" 및 "유도물질"이란 단어는 호환적으로 사용될 수 있으며 니트릴 하이드라타제 활성을 유도할 수 있는 작용제를 지칭한다. 니트릴 하이드라타제 활성을 유도할 수 있는 다수의 효소 유도물질들이 당해 분야에 공지되어 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 효소 유도물질은 카브아미드이다. 하나의 실시형태에서, 상기 효소 유도물질은 지방족 아미드이다. 하나의 실시형태에서, 상기 효소 유도물질은 프로피온아미드, 아이소부티르아미드, 아세트아미드 및 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 질소원 및 상기 유도물질은 카브아미드이다. 카브아미드(우레아)는 미생물-친화적인 질소원으로서 사용될 수 있으며 산업적인 목적에 쉽게 이용될 수 있다. 상기는 또한 효소 유도물질로서 작용할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 10.0 내지 24.0 g/ℓ의 질소원을 포함한다.
상기 코발트염은 임의의 용해성 코발트염일 수 있다. 코발트 이온은 상기 니트릴 하이드라타제 효소에 대한 보조인자로서 사용된다. 하나의 실시형태에서, 상기 코발트염은 CoCl2, CoSO4 또는 이들의 혼합물이다. 하나의 실시형태에서, 상기 코발트염은 CoCl2·6H2O, CoSO4·7H2O 또는 이들의 혼합물이다. 하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 0.04 내지 0.085 g/ℓ의 코발트염을 포함한다.
상기 마그네슘염은 임의의 용해성 마그네슘염일 수 있다. 상기 마그네슘염에 의해 제공되는 마그네슘 이온은 상기 세균 균주의 세포의 수송 기능에 사용된다. 하나의 실시형태에서, 상기 마그네슘염은 MgSO4이다. 하나의 실시형태에서, 상기 마그네슘염은 MgSO4·7H2O이다. 하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 10.0 내지 24.0 g/ℓ의 마그네슘염을 포함한다.
상기 아연염은 임의의 용해성 아연염일 수 있다. 상기 아연염에 의해 제공되는 아연 이온은 카브아미드와 같은 질소원의 분해에 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 아연염은 ZnSO4이다. 하나의 실시형태에서, 상기 아연염은 ZnSO4·7H2O이다. 하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 0.08 내지 0.4 g/ℓ의 아연염을 포함한다.
상기 칼슘염은 임의의 용해성 칼슘염일 수 있다. 상기 칼슘염에 의해 제공되는 칼슘 이온은 글루코스와 같은 탄소원의 사용에 수반될 수도 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 칼슘염은 CaCl2, CaHPO4·2H20, Ca(H2P04)2·2Η20, Ca3(P04)2, CaCl2·2Η20, CaC03, CaS04, Ca(C3H5O3)2·3Η20, Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2·Η20 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 0.2 내지 0.6 g/ℓ의 칼슘염을 포함한다.
상기 Fe(II)염은 임의의 용해성 Fe(II)염일 수 있다. 상기 염에 의해 제공되는 제1철 이온은 호흡에 사용된다. 하나의 실시형태에서, 상기 Fe(II)염은 킬레이트 착체 형태(chelate complew form)로 존재한다. 하나의 실시형태에서, 상기 Fe(II)염은 킬레이트 착체 형태의 FeSO4이다. 하나의 실시형태에서, 상기 Fe(II)염은 킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O이다. 하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 0.025 내지 0.05 g/ℓ의 Fe(II)염을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 상기 마그네슘염은 MgSO4이고; 상기 아연염은 ZnSO4이고; 상기 칼슘염은 CaCl2, CaHPO4·2H20, Ca(H2P04)2·2Η20, Ca3(P04)2, CaCl2·2Η20, CaC03, CaS04, Ca(C3H5O3)2·3Η20, Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2·Η20 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 상기 Fe(II)염은 킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O이다.
상기 탄소원, 상기 질소원, 상기 유도물질 및 상기 코발트염을 상기 영양 배지에 상기 배양 및 세포 증식 동안 1회 분취량으로 또는 수회 분취량으로 도입시킬 수 있다.
상기 영양 배지는 제조가 간단하고 저렴하다. 상기 배지는 또한 상기 세균 균주의 바이오매스의 높은 수율 및 상기 세균 균주의 바이오매스 중 니트릴 하이드라타제의 높은 활성을 허용한다.
하나의 실시형태에서, 상기 영양 배지는 비타민, 아미노산, 펩톤, 식물 추출물, 효모 추출물 및/또는 아세토니트릴을 포함하지 않는다.
상기 생성된 바이오매스를 후속으로 분리시킬 수도 있다. 상기 생성된 바이오매스의 분리 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 균주의 세포를 고체 영양 배지 상에 시딩하고 일정 기간 동안 배양하고, 이어서 상기 바이오매스를 세척하고, 생성 현탁액을 상기 영양 배지를 포함하는 제1 용기의 접종에 사용하며, 상기 공정을 일정 기간 동안 교반하면서 수행하여, 540 ㎚의 파장 및 광학층 5 ㎜의 두께에서 2 내지 16 단위 범위의 상기 현탁액의 광학 밀도를 성취하고; 이어서 상기 생성 현탁액을, 상기 제1 용기의 부피보다 10 내지 100배 더 큰 부피를 갖고, 새로운 영양 배지를 포함하는 제2 용기의 접종에 사용하여 상기 제2 용기에서 0.1 내지 0.3의 광학 밀도를 성취하고; 상기 공정을 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도 및 7.5 내지 7.8의 pH가 성취될 때까지 통기와 함께 일정 시간 동안 계속하고; 이어서 상기 생성된 바이오매스를 분리시킨다.
하나의 실시형태에서, 상기 균주의 세포를 고체 영양 배지 상에 시딩하고 24 내지 48시간 동안 배양하고, 이어서 상기 바이오매스를 세척하고, 생성 현탁액을 상기 영양 배지를 포함하는 제1 용기의 접종에 사용하며, 상기 공정을 24 내지 48시간 동안 교반하면서 수행하여, 540 ㎚의 파장 및 광학층 5 ㎜의 두께에서 2 내지 16 단위 범위의 상기 현탁액의 광학 밀도를 성취하고, 이어서 상기 생성 현탁액을, 상기 제1 용기의 부피보다 10 내지 100배 더 큰 부피를 갖고, 새로운 영양 배지를 포함하는 제2 용기의 접종에 사용하여 상기 제2 용기에서 0.1 내지 0.3의 광학 밀도를 성취하고; 상기 공정을 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도 및 7.5 내지 7.8의 pH가 성취될 때까지 통기와 함께 48 내지 120시간 동안 계속하고; 이어서 상기 생성된 바이오매스를 분리시킨다.
상기 세균 균주의 세포를 1-단계 배양으로서 배양할 수 있으며, 여기에서 상기 세균 균주의 세포를 세포의 소정의 제1 수율이 성취될 때까지 상기 영양 배지 중에서 배양한다. 상기 세균 균주의 세포를 또한 2-단계 배양으로서 배양할 수 있으며, 여기에서 상기 세균 균주의 세포를 제1 용기 중의 상기 영양 배지 중에서 배양하고 후속으로 상기 생성 배양물 또는 현탁액을 사용하여 제2 용기 중의 새로운 영양 배지를 접종하고; 상기 세균 균주의 세포를 세포의 소정의 제2 수율이 성취될 때까지 상기 새로운 영양 배지에서 배양한다. 상기 소정의 제1 및 제2 수율은 동일할 필요는 없다. 전형적으로, 상기 소정의 제1 수율이 상기 소정의 제2 수율만큼 높을 필요는 없다.
상기 균주의 세포를 제1 단계로 제1 용기에서, 및 제2 단계로 제2 용기에서 배양하는 2-단계 배양은 상기 배지에 대한 상기 세균 균주의 보다 양호한 적응 및 개선된 효소 합성을 허용할 수 있다.
상기 고체 영양 배지는 예를 들어 고기 및 펩톤 아가, LB 배지 아가, 합성 배지, 또는 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 증식을 지지할 수 있는 임의의 다른 고체 영양 배지일 수 있다.
상기 바이오매스를, 예를 들어 멸균 생리 용액, 예를 들어 포스페이트-완충된 염수로 세척할 수 있다. 상기 멸균 생리 용액은 7.0 내지 7.4의 pH를 가질 수 있다.
상기 제1 용기의 교반은 예를 들어 140 내지 160 rpm 속도의 환상 교반일 수 있다.
이와 관련하여, "새로운 영양 배지"란 용어는 상기 정의된 영양 배지의 새로운 분량을 지칭하는 것으로서 이해해야 한다.
본 발명은 또한 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 균주의 세포를 고기 및 펩톤 아가 사면배지 상에 시딩하고 24 내지 48시간 동안 배양하고, 이어서 바이오매스를 7.0 내지 7.4의 pH를 갖는 멸균 생리 용액으로 세척하고, 생성 현탁액을 하기 조성(g/ℓ)의 영양 배지를 포함하는 제1 용기의 접종에 사용하며: 및
Na2HPO4·12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
글루코스 10.0 - 20.0
카브아미드 2.0 - 6.0
MgSO4·7H2O 1.0
ZnSO4·7H2O 0.08 - 0.2
CaCl2·2H2O 0.2
CoCl2·6H2O 0.01 - 0.02
킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O 0.01 - 0.025
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4;
상기 공정을 24 내지 48시간 동안 28 내지 30 ℃의 온도에서 140 내지 160 rpm의 속도로 환상 교반하면서 수행하여, 540 ㎚의 파장 및 광학층 5 ㎜의 두께에서 2 내지 16 단위 범위의 상기 현탁액의 광학 밀도를 성취한다. 이어서 상기 생성 현탁액을, 상기 제1 용기의 부피보다 10 내지 100배 더 큰 부피를 갖고 하기 조성(g/ℓ)의 새로운 영양 배지를 포함하는 제2 용기의 접종에 사용하여 상기 제2 용기에서 0.1 내지 0.3의 광학 밀도를 성취하고:
Na2HPO4·12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
글루코스 20.0 - 60.0
카브아미드 10.0 - 24.0
MgSO4·7H2O 0.8 - 1.0
ZnSO4·7H2O 0.08 - 0.4
칼슘염 0.2 - 0.6
코발트염 0.04 - 0.085
킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O 0.025 - 0.05
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4;
상기 공정을 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도 및 7.5 내지 7.8의 pH가 성취될 때까지 분당 0.5 내지 1.0의 공기 부피/배지 부피의 통기와 함께 26 내지 31 ℃의 온도에서 48 내지 120시간 동안 계속하고; 이어서 상기 수득된 바이오매스를 분리시킨다.
상술한 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법의 실시형태에서, 상기 제2 용기 중의 영양 배지는 칼슘염으로서 하기의 염들 중 하나:
CaHPO4·2H2O
Ca(H2PO4)2·2H2O
Ca3(PO4)2
CaCl2·2H2O
CaCO3
CaSO4
Ca(C3H5O3)2·3H2O
Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O;
및 코발트염으로서 하기의 염들 중 하나:
CoCl2·6H2O,
CoSO4·7H2O
를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 로도코커스 속에 속하고 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 균주의 바이오매스를 사용하는 아크릴로니트릴의 수화에 의한 아크릴아미드의 제조 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 수화를 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스를 사용하여, 0.5% 이하의 아크릴로니트릴의 작용 농도에서 수행한다.
아크릴아미드를 함유하는 최종 생성물을 상기 방법에 의해 수득한다.
하나의 실시형태에서, 상기 수화에 이어서 상기 최종 아크릴아미드 생성물의 분리를 수행한다.
"최종 아크릴아미드 생성물"이란 용어는 최종 생성물 중에 함유된 아크릴아미드를 지칭하는 것으로서 이해해야 한다. 상기 최종 생성물로부터 아크릴아미드를 분리시키기에 적합한 방법들은 당해 분야에 공지되어 있다.
아크릴로니트릴은 독성 화합물이며, 상기 세균 균주에 대해 과도하게 독성이지 않은 그의 적합한 작용 농도를 유지해야 한다. 0.5% 이하인 아크릴로니트릴의 작용 농도가 상기 세균 균주에 의해 허용된다. 상기 작용 농도는 또한 45 내지 49%의 농도로 상기 최종 생성물 중에 아크릴아미드를 함유할 수 있게 한다. 상기 작용 농도를 상기 수화 반응 동안 상기 반응 용액 중에 아크릴로니트릴을 부하함으로써 유지시킬 수 있다. 숙련가는, 예를 들어 상기 최종 아크릴아미드 생성물의 수화 속도 또는 양이 최적이 되도록 상기 아크릴로니트릴의 작용 농도를 선택할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 아크릴로니트릴의 작용 농도는 0.01 내지 0.5%, 또는 0.05 내지 0.5%, 또는 0.1 내지 0.5%의 범위이다.
하나의 실시형태에서, 상기 아크릴로니트릴의 작용 농도는 0.5% 이하이거나, 또는 상기 반응 용액의 전체 중량을 기준으로(w/w) 0.01 내지 0.5 중량%, 또는 0.05 내지 0.5 중량%, 또는 0.1 내지 0.5 중량%의 범위이다.
이와 관련하여, "작용 농도"란 용어는 상기 세균 균주의 바이오매스 및 아크릴로니트릴을 포함하는 반응 용액 중의 농도를 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 상기 반응 용액은 다른 성분들, 예를 들어 물, 아크릴아미드 및/또는 임의의 첨가제를 또한 포함할 수 있다.
"반응 용액"이란 용어는 상기 세균 균주의 바이오매스 및 아크릴로니트릴을 포함하는 반응 혼합물을 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 상기 반응 혼합물은 다른 성분들, 예를 들어 물, 아크릴아미드 및/또는 임의의 첨가제를 또한 포함할 수 있다.
상기 사용되는 세균 균주의 바이오매스의 양을, 예를 들어 상기 최종 아크릴아미드 생성물의 수화 속도 또는 양이 최적이 되도록 선택할 수 있다. 상기 세균 균주의 바이오매스의 양은 예를 들어 상기 세균 균주의 세포의 니트릴 하이드라타제 활성에 따라 변할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스는 상기 최종 생성물 1톤당 균주의 건조 중량을 기준으로 약 100 내지 1000 g, 또는 200 내지 1000 g, 또는 200 내지 800 g, 또는 300 내지 600 g, 또는 1000 g 미만, 또는 500 g 미만, 또는 400 g 미만이다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스는 상기 최종 생성물 1톤당 균주의 건조 중량을 기준으로 약 400 내지 500 g이다.
이와 관련하여, "최종 생성물"이란 용어는 상기 균주의 바이오매스 및 아크릴아미드를 포함하는 반응 용액을 지칭하는 것으로서 이해해야 한다. 상기 최종 생성물은 다른 성분들, 예를 들어 물, 소량의 아크릴로니트릴 및/또는 임의의 첨가제를 또한 포함할 수도 있다. 숙련가는 상기 반응 용액 중에 포함된 아크릴로니트릴이 상기 세균 균주의 바이오매스에 의해 아크릴아미드로 수화됨을 이해할 것이다. 즉, 상기 최종 생성물은 상기 반응 용액 중에 첨가된 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 수화된 완전한 반응 용액을 지칭한다.
"바이오매스"란 용어는 상기 세균 균주의 세포의 덩어리를 지칭하는 것으로서 이해해야 한다.
하나의 실시형태에서, 상기 최종 생성물은 아크릴아미드를 적어도 40%; 또는 적어도 41%; 또는 적어도 42%; 또는 적어도 43%; 또는 적어도 44%; 또는 40-55%; 또는 41-55%; 42-55%; 또는 43-55%; 또는 44-55%의 농도로 함유한다.
하나의 실시형태에서, 상기 최종 생성물은 아크릴아미드를 적어도 45%; 또는 적어도 46%; 또는 적어도 47%; 또는 45-55%; 또는 45-54%; 또는 45-53%; 또는 45-52%; 또는 45-51%; 또는 45-50%; 또는 45-49%; 또는 46-55%; 또는 46-54%; 또는 46-53%; 또는 46-52%; 또는 46-51%; 또는 46-50%; 또는 46-49%; 또는 47-55%; 또는 47-54%; 또는 47-53%; 또는 47-52%; 또는 47-51%; 또는 47-50%; 또는 47-49%의 농도로 함유한다.
하나의 실시형태에서, 상기 최종 생성물은 아크릴아미드를 상기 최종 생성물의 전체 중량을 기준으로 적어도 40%; 또는 적어도 41%; 또는 적어도 42%; 또는 적어도 43%; 또는 적어도 44%; 또는 40-55%; 또는 41-55%; 42-55%; 또는 43-55%; 또는 44-55%; 또는 적어도 45%; 또는 적어도 46%; 또는 적어도 47%; 또는 45-55%; 또는 45-54%; 또는 45-53%; 또는 45-52%; 또는 45-51%; 또는 45-50%; 또는 45-49%; 또는 46-55%; 또는 46-54%; 또는 46-53%; 또는 46-52%; 또는 46-51%; 또는 46-50%; 또는 46-49%; 또는 47-55%; 또는 47-54%; 또는 47-53%; 또는 47-52%; 또는 47-51%; 또는 47-50%; 또는 47-49%의 농도로 함유한다.
실시예 6에 상응하는 일례로, 상기 최종 생성물 중에서 47%의 농도로 아크릴아미드를 수득하기 위해서, 757.2 g의 아크릴로니트릴을 반응기에 도입시켜, 총 2157.2 g의 반응 질량을 생성시킬 수 있다. 모든 아크릴로니트릴은 상기 세균 균주의 세포에 의해 아크릴아미드로 전환되기 때문에, 47%의 최종 농도의 아크릴아미드가 상기 최종 생성물 중에서 수득된다. 상기 반응은 본 예에서 1 g의 바이오매스(건조 중량)를 포함할 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 아크릴로니트릴의 수화를 10 내지 23 ℃의 온도에서 수행한다.
하나의 실시형태에서, 상기 아크릴로니트릴의 수화를 6.8 내지 8.4의 pH에서 수행한다.
하나의 실시형태에서, 상기 아크릴로니트릴의 수화를 10 내지 23 ℃의 온도 및 6.8 내지 8.4의 pH에서 수행한다.
하나의 실시형태에서, 상기 세균 균주의 바이오매스를 수용액 중에 현탁하며; 아크릴로니트릴을 상기 수용액에 가하여 반응 용액을 형성시킨다.
하나의 실시형태에서, 아크릴로니트릴을 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스의 수성 현탁액(aqueous suspension)에서 혼합하여 반응 용액을 형성시키고; 수화를, 상기 반응 용액 중의 아크릴로니트릴의 작용 농도가 0.5% 이하에서 유지되도록 수행한다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스를 수용액 중에 현탁시켜 현탁액을 수득하고;
b) 아크릴로니트릴을 단계 a)로부터 수득할 수 있는 현탁액 중에 혼합하여 반응 용액을 형성시키고;
c) 수화를, 상기 반응 용액 중의 아크릴로니트릴의 작용 농도가 0.5% 이하에서 유지되도록 수행한다.
하나의 실시형태에서, 상기 반응 용액 중의 아크릴로니트릴의 작용 농도를, 적어도 45% 이상의 농도로 아크릴아미드를 함유하는 최종 생성물이 수득될 때까지 0.5% 이하에서 유지시킨다.
니트릴 하이드라타제 활성을 갖는, 상기 로도코커스 속에 속하는 균주의 바이오매스를 사용하는 아크릴로니트릴의 수화, 및 이어서 최종 생성물, 즉 아크릴아미드의 분리를 포함하는 상기 방법의 실시형태에서, 상기 수화를, 45 내지 49% 농도의 아크릴아미드인 최종 생성물 1톤당 상기 균주의 건조 중량 기준으로 약 400 내지 500 g의 양의 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스를 사용하여, 0.5% 이하의 아크릴로니트릴의 작용 농도에서 수행한다.
본 발명은 또한 아크릴아미드의 제조 방법의 하나 이상의 실시형태에 의해 수득될 수 있는 최종 생성물에 관한 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 최종 생성물은 상기 세균 균주의 바이오매스 및 아크릴아미드를 포함한다. 상기 최종 생성물은 다른 성분들, 예를 들어 물, 소량의 아크릴로니트릴 및/또는 임의의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 최종 생성물은 아크릴아미드를 적어도 40%; 또는 적어도 41%; 또는 적어도 42%; 또는 적어도 43%; 또는 적어도 44%; 또는 40-55%; 또는 41-55%; 42-55%; 또는 43-55%; 또는 44-55%의 농도로 함유한다.
하나의 실시형태에서, 상기 최종 생성물은 아크릴아미드를 적어도 45%; 또는 적어도 46%; 또는 적어도 47%; 또는 45-55%; 또는 45-54%; 또는 45-53%; 또는 45-52%; 또는 45-51%; 또는 45-50%; 또는 45-49%; 또는 46-55%; 또는 46-54%; 또는 46-53%; 또는 46-52%; 또는 46-51%; 또는 46-50%; 또는 46-49%; 또는 47-55%; 또는 47-54%; 또는 47-53%; 또는 47-52%; 또는 47-51%; 또는 47-50%; 또는 47-49%의 농도로 함유한다.
하나의 실시형태에서, 상기 최종 생성물은 아크릴아미드를 상기 최종 생성물의 전체 중량을 기준으로 적어도 40%; 또는 적어도 41%; 또는 적어도 42%; 또는 적어도 43%; 또는 적어도 44%; 또는 40-55%; 또는 41-55%; 42-55%; 또는 43-55%; 또는 44-55%; 또는 적어도 45%; 또는 적어도 46%; 또는 적어도 47%; 또는 45-55%; 또는 45-54%; 또는 45-53%; 또는 45-52%; 또는 45-51%; 또는 45-50%; 또는 45-49%; 또는 46-55%; 또는 46-54%; 또는 46-53%; 또는 46-52%; 또는 46-51%; 또는 46-50%; 또는 46-49%; 또는 47-55%; 또는 47-54%; 또는 47-53%; 또는 47-52%; 또는 47-51%; 또는 47-50%; 또는 47-49%의 농도로 함유한다.
본 발명은 또한 상기 최종 생성물로부터 수득될 수 있는 아크릴아미드에 관한 것이다.
기술적 결과는 본 발명의 특허청구된 그룹에 의해 제공된다.
상기 세균 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 균주는 간단한 유기-미네랄 배지 상에서 증식하며 20 ℃에서 332 U/㎎ 또는 25 ℃에서 521 U/㎎ 이하의 높은 니트릴 하이드라타제 활성을 가짐을 특징으로 한다. 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 니트릴 하이드라타제는 열안정성이다.
상기 균주를 아크릴아미드 및 폴리아크릴아미드 제조의 폐수로부터 분리하였으며 유전자 변형시키지 않았다. 많은 국가의 입법조치는 유전자 변형된 미생물의 사용을 제한하고 있기 때문에 산업적인 생물촉매로서 그의 사용이 특히 중요하다.
세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 상기 개발된 배양 방법은 값비싼 유도물질, 비타민, 아미노산 및 식물 추출물을 포함하지 않는 간단한 유기-미네랄 영양 배지 상에서 높은 활성을 갖는 세포를 고수율로 얻을 수 있게 한다. 상기 영양 배지의 모든 성분들을 상업적으로 입수할 수 있기 때문에, 상기 특허청구된 균주를 기본으로 제조되는 산업적인 생물촉매의 비용이 감소한다. 하나 이상의 실시형태에 따른 배양 방법은 상기 세균 균주의 빠른 증식에 최적이다. 더욱 또한, 하나 이상의 실시형태에 따른 배양 방법을 사용하여, 하나 이상의 실시형태에 따른 아크릴아미드의 제조 방법에 사용될 수 있는 상기 세균 균주의 바이오매스를 제공할 수 있다.
본 출원에 개시된 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D를 사용하는 합성에 의한 아크릴아미드의 제조 방법은 경제적으로 유리하다. 아크릴아미드의 농축된 용액의 합성 조건은 최적화된다.
상기 특허청구된 균주를, 선택성 배지 상에 직접 시딩하는 방법에 의해 상기 아크릴아미드 및 폴리아크릴아미드 제조의 폐수로부터 분리한다.
상기 세균 로도코커스 아에테리보란스의 특허청구된 균주는 부다페스트 조약하에서 개인 사업자 세르게이 코줄린(Sergey Kozulin)에 의해 올-러시안 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스(All-Russian Collection of Microorganisms)(Russian Collection of Microorganisms (VKM), G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Prospekt Nauki No. 5, Push-chino 142290 (Moscow Region) , Russian Federation)에 수납 번호 VKM Ac-2610D로 기탁되어 있다(상기 기탁자에 의해 제공된 식별 참조번호: 로도코커스 아에테리보란스 KTN26-1). 상기 균주를 2012년 7월 20일자로 기탁 기관에 의해 제공 받았으며, 상기 기탁물을 2013년 11월 15일자로 부다페스트 조약 하의 기탁물로 전환하였다. 상기 균주는 하기의 형태학적, 배양 및 생화학적 성질들을 특징으로 한다.
형태학적 성질: 로도코커스의 생활사, 비-운동성, 비-포자형성성을 갖는 그람-음성 균주는 피낭형성을 하지 않으며, 산-불내성이고, 호기성이다.
배양 성질: 상기 균주는 고기 및 펩톤 아가 상에서 둥글고 매끄러운 콜로니를 형성하며, 황색-오렌지색 내지 적색-오렌지색 색상 및 1 내지 2 ㎜의 직경을 갖는다(72 내지 96 시간 후에). 특수 배지 상에서 증식시, R-, S- 및 M-형태로 분리된다.
생리학적 성질: 상기 균주는 옥시다제-음성, 카탈라제- 및 포스파타제-양성이고, 질산염을 아질산염으로 환원시킨다. 상기는 전분, 트윈 60 및 트윈 80을 가수분해하고; 셀룰로스, 에스쿨린 및 DNA를 가수분해하지 않는다. 상기 균주는 5.5 내지 9.5의 pH(최적 pH 값은 7.2±0.2이다); 및 5 내지 45 ℃의 온도(최적값은 29±1 ℃이다)에서 증식한다. 상기 균주는 유일한 탄소원으로서, 셀로비오스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 말토스, 만노스, 슈크로스, 트레할로스, 리보스, 글리세롤, 만니톨, 솔비톨을 사용하지만, 둘시톨 및 이노시톨은 사용하지 않는다. 상기 균주는 살리신, 이눌린, 시트레이트, 피루베이트, 숙시네이트, 퓨마레이트 상에서 증식하지만, 글루코네이트 상에서는 증식하지 않는다. 상기 균주는 메타- 및 파라-하이드록시벤조산, 아이소부탄올, 2,3-부틸렌글리콜, 모노에탄올 아민을 사용한다. 상기 균주는 유일한 질소원으로서 류신 및 아세트아미드를 사용한다.
병원성: 상기 균주는 병원성이 아니다.
상기 성질들을 근거로, 버지의 세균생태 확정 매뉴얼(Opredelitel bakteriy Berdgy, Moscow: Mir, 1997) 및 리보솜 리보핵산의 유전자 16s의 제한 단편 길이 다형성 분석에 따르면, 상기 균주는 로도코커스 속, 아에테리보란스 종인 것으로 추정된다.
상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법을 하기와 같이 수행할 수 있다.
0.4% 아가처리된 LB 배지 또는 고기 및 펩톤 브로쓰의 스탭에서 4 ℃의 온도에서 보관된 상기 로도코커스 아에테리보란스 균주의 세포를 고기 펩톤 아가 사면배지(meat peptone agar slope) 상에 시딩하고 24 내지 48시간 동안 배양할 수 있다. 상기 수득된 바이오매스를 7.0 내지 7.4의 pH를 갖는 멸균 생리 용액으로 세척할 수 있다. 상기 수득된 현탁액을 하기 조성(g/ℓ)의 영양 배지를 포함하는 제1 용기의 접종에 사용할 수 있다:
Na2HPO4·12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
글루코스 10.0 - 20.0
카브아미드 2.0 - 6.0
MgSO4·7H2O 1.0
ZnSO4·7H2O 0.08 - 0.2
CaCl2·2H2O 0.2
CoCl2·6H2O 0.01 - 0.02
킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O 0.01 - 0.025
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4.
상기 공정을 24 내지 48시간 동안 28 내지 30 ℃의 온도에서 140 내지 160 rpm의 속도로 환상 교반(circular stirring)하면서 수행하여, 540 ㎚의 파장에서 5 ㎜의 광학층 두께를 갖는 광전 비색계에서 측정된 2 내지 16 단위 범위의 상기 현탁액의 광학 밀도를 성취할 수 있다.
이어서 상기 생성 현탁액을 상기 제1 용기의 부피보다 10 내지 100배 더 큰 부피를 갖는 제2(더 큰) 용기의 접종에 사용할 수 있으며, 상기 제2 용기는 예를 들어 하기 조성(g/ℓ)의 새로운 영양 배지를 포함하는 큰 플라스크 또는 발효기이다:
Na2HPO4·12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
글루코스 20.0 - 60.0
카브아미드 10.0 - 24.0
MgSO4·7H2O 0.8 - 1.0
ZnSO4·7H2O 0.08 - 0.4
칼슘염 0.2 - 0.6
코발트염 0.04 - 0.085
킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O 0.025 - 0.05
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4.
상기 제2 용기 중의 영양 배지는 칼슘염으로서 하기의 염들 중 하나: CaHPO4·2H2O, Ca(H2PO4)2·2H2O, Ca3(PO4)2, CaCl2·2H2O, CaCO3, CaSO4, Ca(C3H5O3)2·3H2O, Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O; 및 코발트염으로서 하기의 염들 중 하나: CoCl2·6H2O, CoSO4·7H2O를 포함할 수 있다.
글루코스, 카브아미드 및 코발트염을 상기 세포 증식 동안 1회 분취량 또는 수회 분취량으로 상기 영양 배지에 도입시킬 수 있다.
상기 제2 용기 중의 광학 밀도의 값을 0.1 내지 0.3 단위로 만들 수 있다. 상기 공정을 36 내지 40 범위의 상기 현탁액의 광학 밀도 및 7.5 내지 7.8의 pH가 성취될 때까지 분당 0.5 내지 1.0의 공기 부피/배지 부피의 통기와 함께 26 내지 31 ℃의 온도에서 48 내지 120시간 동안 계속할 수 있다. 상기 공정이 끝난 후에, 상기 바이오매스를 임의의 공지된 방법, 예를 들어 원심분리, 응집, 부유, 침강에 이은 여과에 의해 분리시킨다. 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 상기 배양 방법의 실행은 250 내지 332 U/㎎의 니트릴 하이드라타제 효소의 활성과 함께 10 내지 18 g/ℓ의 세포 수율을 제공할 수 있다. 상기 바이오매스를 나중에 아크릴아미드 제조 공정에 사용할 수 있다.
니트릴 하이드라타제 효소의 활성의 시험을 하기와 같이 수행할 수 있다: 세포의 현탁액을 0.01M 포스페이트 완충제(pH 7.6) 중에서 0.04 내지 0.06 ㎎의 세포(건조 중량 기준)/㎖의 농도로 제조한다. 상기 아크릴로니트릴 기질을 25 ㎕의 양으로 1 ㎖의 현탁액에 도입시킨다. 전환 반응을 20 내지 25 ℃의 온도에서 10분 동안 교반하면서 수욕 중에서 수행한다. 50 ㎕의 6H HCl을 가하여 상기 반응을 정지시킨다. 세균 세포를 원심분리에 의해 분리시킨다. 상등액 중의 아크릴아미드의 농도를 분광광도측정 또는 기체 크로마토그래피 방법에 의해 측정한다. 본 출원 및 실시예에 개시된 니트릴 하이드라타제의 활성 측정을 달리 나타내지 않는 한 20 ℃의 온도에서 수행하였다.
니트릴 하이드라타제 비활성(U/㎎)의 단위는 1 ㎎의 세포 중 시간단위(1분)당 1 μM의 아크릴아미드의 발생을 촉매화하는 효소의 양이다. 총 니트릴 하이드라타제 활성의 단위(U/㎖)는 1 ㎖의 배양 브로쓰 중에 함유된 효소 단위의 양이다.
상세하게, 아크릴아미드의 제조 방법을 하기와 같이 수행할 수 있다.
상기 배양 방법의 설명에서 나타낸 바와 같은 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 세포를 임의의 공지된 방법에 따라 상기 배양 브로쓰로부터 분리시키고, 탈염수(pH 7.0 내지 7.6)로 세척할 수 있다. 상기 세척에 사용될 수 있는 물의 양은 세포의 부피당 1 내지 10 부피일 수 있다. 상기 세척된 세포를 수돗물 또는 증류수(pH 6.8 내지 8.4) 중에, 최종 생성물 1톤당 약 400 내지 500 g의 세포(건조 중량 기준)로 현탁시킬 수 있다, 즉 아크릴아미드의 45 내지 49% 용액을 최종 생성물의 목적하는 농도 및 합성 시간에 따라 제조할 수 있다. 상기 세포의 수 현탁액을 자동온도조절 반응기에 넣을 수 있다. 상기 아크릴아미드 합성의 반응을 pH 6.8 내지 8.4의 범위에서 수행할 수 있다. 아크릴로니트릴을, 상기 반응 용액 중의 그의 농도가 0.5% 이하이도록 상기 전환 동안 상기 반응 용액에 부하할 수 있다. 상기 반응 혼합물을 꾸준히 교반할 수도 있다. 상기 반응 용액의 온도를 10 내지 23 ℃의 범위에서 유지시킬 수 있다. 반응 시간은 5 내지 8 시간일 수 있다. 상기 반응 용액 중의 아크릴아미드 및 아크릴로니트릴을 임의의 공지된 방법, 예를 들어 액체 또는 기체 크로마토그래피, 분광광도측정, 굴절측정법에 의해 분석할 수 있다. 상기 분석을 1시간에 적어도 한 번 수행할 수 있다. 아크릴로니트릴 가수분해 속도가 갑자기 떨어진 후에 상기 공정을 정지할 수 있다. 상기 공정의 종료 후에 상기 생물촉매의 세포를 임의의 공지된 방법에 의해, 예를 들어 응집, 여과, 부유, 원심분리에 의해 상기 반응 혼합물로부터 분리시킬 수 있다. 상기 공정은 예를 들어 45 내지 49%의 아크릴아미드 농도를 갖는 용액을 제공할 수 있다.
숙련가는 상기 방법들을, 상기 세균 균주의 큰 바이오매스를 배양하고 다량의 아크릴아미드를 산업적인 규모로 제조하기 위해서, 예를 들어 큰 부피를 갖는 산업적인 발효기 및 반응기를 사용함으로써 확장시킬 수 있음을 알 것이다.
실시예
하기에서, 본 발명을 보다 상세히 개시할 것이다. 하기 설명은 당해 분야의 숙련가가 이 내용을 근거로 본 발명을 이용할 수 있도록 본 발명의 일부 실시형태 및 실시예들을 상세히 개시한다. 상기 실시형태들의 모든 단계를, 이들 단계 중 다수가 본 명세서를 근거로 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이므로, 상세히 논의하지는 않는다. 하기의 실시예들을 소규모 시험 실험실에서 수행하였지만; 당해 분야의 숙련가는 이들 실시예를 원하는대로 확장시킬 수 있다.
실시예 1. 니트릴 하이드라타제 효소의 생산자인 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 분리
상기 균주를 아크릴아미드 및 폴리아크릴아미드 제조의 폐수로부터 분리한다.
폐수의 조성은 하기와 같다:
아크릴아미드 6.0 g/ℓ
아크릴로니트릴 3.3 g/ℓ
Cu2+ 1.25 ㎎/ℓ
Zn2+ 1.93 ㎎/ℓ
Fe3+ 0.43 ㎎/ℓ
솔비탈(Sorbital) C-20 잔량.
상기 균주의 분리를 위해서, 0.9 g/ℓ의 Na2HPO4·12H2O, 0.5 g/ℓ의 KH2PO4, 1.0 g/ℓ의 MgSO4·7H2O, 0.5 g/ℓ의 효모 추출물이 보충된 상기 조성을 갖는 아가처리된 폐수를 나타내는 선택성 배지를 사용하였다. 상기 선택성 배지를 갖는 플레이트를 0.1 ㎖의 폐수의 론(lawn)으로 시딩하고 72 내지 96시간 동안 배양하였다. 상기 증식된 콜로니를 고기 및 펩톤 아가 상에서 2회 재시딩하여 순도를 시험하고 이어서 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 전환 능력에 대해 분석하였다. 이를 위해서 상기 시험된 균주를, 하기 조성(g/ℓ)을 갖는 배지를 1/8-채운 40 ㎖ 부피의 세균학적 튜브에서 증식시켰다:
Na2HPO4·12H2O 0.9
KH2PO4 0.5
글루코스 20.0
카브아미드 12.0
CoCl2·6H2O 0.02
MgSO4·7H2O 1.0
효모 추출물 1.0
pH 7.0 내지 7.4
배양을 28 내지 30 ℃에서 교반하면서 2일 동안 수행하였다. 상기 수득된 세포 현탁액을 15000 rpm에서 1분간 원심분리시켰다. 세포를 0.01 M 포스페이트 완충제(pH 7.6)로 세척하고, 1 ㎖의 동일한 완충제에 재현탁하고, 이어서 니트릴 하이드라타제 활성을 상기 시험에 개시된 바와 같이 측정하였다. 그 결과 95 U/㎎의 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 균주가 생성된다.
실시예 2. 실험실 조건에서 삼각 플라스크 중의 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
상기 균주의 세포를 고기 및 펩톤 아가 사면배지 상에서 28 ℃에서 36시간 동안 증식시켰다. 상기 수득된 바이오매스를 멸균 생리 용액(pH 7.0 내지 7.4)으로 세척하고, 예비배양을 위해서 하기 조성(g/ℓ)의 액체 영양 배지내로 시딩하였다:
Na2HPO4·12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
글루코스 12.0
카브아미드 4.0
MgSO4·7H2O 1.0
ZnSO4·7H2O 0.1
CaCl2·2H2O 0.2
CoCl2·6H2O 0.02
FeSO4·7H2O 0.025
아스코르브산 0.05
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4.
상기 예비배양을 24 내지 48시간 동안 28 내지 30 ℃에서 120 내지 160 rpm의 속도로 환상 교반하면서 삼각 플라스크에서 수행하였다. 그 결과 λ 540 ㎚, 1 = 5 ㎜에서 4.6 단위의 광학 밀도를 갖는 세포 현탁액이 생성된다. 2 ㎖의 양의 상기 수득된 현탁액을 하기 조성(g/ℓ)을 갖는 배양 배지에 무균적으로 시딩하였다:
Na2HPO4·12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
글루코스 40.0
카브아미드 24.0
MgSO4·7H2O 1.0
ZnSO4·7H2O 0.3
CaHPO4·2H2O 0.24
CoCl2·6H2O 0.06
FeSO4·7H2O 0.05
아스코르브산 0.10
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4.
상기 배양을 28 내지 30 ℃의 온도에서 환상 교반하면서(160 rpm), 상기 배지를 1/6 채운 300 ㎖ 부피의 삼각 플라스크에서 4일 동안 수행하였다. 상기 배양의 완료 후에, 샘플 중의 세포의 농도 및 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다. 96시간의 배양 후에 세포의 수율은 16.0 g/ℓ이고, 니트릴 하이드라타제 비활성은 20 ℃에서 332 U/㎎ 및 25 ℃에서 521 U/㎎이고, 총 니트릴 하이드라타제 활성은 20 ℃에서 5312 U/㎖ 및 25 ℃에서 8336 U/㎖이었다. 25 ℃에서 활성의 측정을 균주 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) GT와의 비교를 위해 수행하였다.
상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법의 확장성 및 산업적인 사용 가능성을 확인하기 위해서, 3 리터의 부피를 갖는 발효기에서 상기 균주의 배양을 수행하였다.
실시예 3. 발효기에서 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양.
배양 배지 중의 세포의 현탁액을 나타내는 접종물을 28시간 동안 제조하였다. 이를 위해서 세포를, 하기 조성(g/ℓ)의 배지를 1/6 채운, 300 ㎖ 부피의 삼각 플라스크에서 28 내지 30 ℃의 온도에서 환상 교반하면서(160 rpm) 증식시켰다:
Na2HPO4·12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
글루코스 12.0
카브아미드 4.0
MgSO4·7H2O 1.0
ZnSO4·7H2O 0.1
CaCl2·2H2O 0.2
CoCl2·6H2O 0.02
FeSO4·7H2O 0.025
EDTA 0.05
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4.
그 결과 λ 540 ㎚, 1 = 5 ㎜에서 6 단위의 광학 밀도를 갖는 세포 현탁액이 생성되었다. 100 ㎖의 상기 수득된 현탁액을 3 리터 부피(1.5 리터의 상기 배지로 채운)의 실험실 발효기의 접종에 사용하였다.
상기 발효기에 대한 배지의 조성(g/ℓ):
Na2HPO4·12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
글루코스 40.0
카브아미드 22.0
MgSO4·7H2O 1.0
ZnSO4·7H2O 0.25
CaHPO4·2H2O 0.24
CoCl2·6H2O 0.05
FeSO4·7H2O 0.05
EDTA 0.10
증류수 1 ℓ까지
pH 7.0 내지 7.4.
상기 배양을 28 ℃의 온도에서, 분당 0.5 내지 1.0의 공기 부피/배지 부피의 통기로, 560 rpm으로 연속적으로 교반하면서 수행하였다. 주기적으로, 6시간에 한 번, 발효기로부터 배양 브로쓰의 샘플을 취하여 pH, 세포의 수율 및 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였다. 상기 수득된 데이터를 표에 나타낸다.
Figure pct00001

70시간의 배양 후에, 상기 세포의 수율은 18.1 g/ℓ이고, 상기 세포의 니트릴 하이드라타제 비활성은 (20 ℃에서) 280 U/㎎ 또는 25 ℃에서 440 U/㎎이고, 총 니트릴 하이드라타제 활성은 (20 ℃에서) 5058 U/㎖ 또는 25 ℃에서 7964 U/㎖이었다.
실시예 4. 플라스크에서의 배양에 의해 생산된 세포를 사용하는 실험실 반응기에서 농축된 아크릴아미드 용액의 제조.
270 U/㎎의 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 수돗물 중의 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 세포 현탁액 66.2 g을 자기 혼합기 및 온도계가 공급된 150 ㎖ 자동온도조절 반응기에 넣었으며; 따라서, 상기 반응기는 30 ㎎(건조 중량 기준)의 생물촉매 세포를 함유하였다. 상기 세포를 실시예 2에 개시된 바와 같이 생성시켰다. 상기 반응 용액의 pH는 7.6이었다. 24.2 g의 아크릴로니트릴을, 상기 용액 중의 아크릴로니트릴 농도가 0.3% 이하이도록 전체 합성 기간에 걸쳐 연속적으로 교반하면서 17 내지 22 ℃의 온도에서 상기 반응기에 부하하였다. 상기 용액 중의 아크릴아미드 및 아크릴로니트릴을 1시간에 한 번 주기적으로 기체 크로마토그래피 방법에 의해 분석하였다. 7.0 시간의 합성 후에, 아크릴로니트릴 가수분해 속도가 감소하였기 때문에 상기 반응을 정지시켰다. 세포를 원심분리에 의해 상기 반응 용액으로부터 분리시켰다. 상기 용액 중의 아크릴아미드의 농도는 49%이었고, 잔류 아크릴로니트릴은 존재하지 않았다.
산업적인 아크릴아미드 제조 공정에서 상기 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 사용 가능성 및 특허청구된 기술의 확장성을 확인하기 위해서, 아크릴아미드의 합성을, 산업적인 반응기와 유사물인 3 리터 부피의 장치에서 수행하였다.
실시예 5. 플라스크에서의 배양에 의해 수득된 세포를 사용하는 3 ℓ 반응기에서 농축된 아크릴아미드 용액의 합성.
254 U/㎎의 니트릴 하이드라타제 효소의 활성을 갖는 탈염수 중의 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 세포 현탁액 1.4 ℓ를, 기계적 혼합기 및 열 제거용 재킷이 공급되고 20 내지 22 ℃의 온도 범위로 자동온도 조절되는 3 리터 반응기에 부하하였으며; 따라서 상기 반응기는 1 g(건조 중량 기준)의 생물촉매 세포를 포함하였다. 상기 세포를 실시예 2에 개시된 바와 같이 수득하였다. 상기 반응 용액의 pH는 7.4이었다. 아크릴로니트릴을, 초기 및 현재 모두의 아크릴로니트릴 농도가 0.5% 이하이도록 전환이 발생함에 따라 상기 반응 용액에 도입시켰다. 5시간의 반응 후에, 47%의 농도를 갖는 아크릴아미드 용액을 수득하였다. 이어서 상기 아크릴로니트릴 가수분해 속도가 급격히 감소하였기 때문에 상기 반응을 정지시켰다.
실시예 6. 발효기에서의 배양에 의해 생산된 세포를 사용하는 3 리터 부피의 반응기에서 농축된 아크릴아미드 용액의 제조.
280 U/㎎의 니트릴 하이드라타제 효소의 활성을 갖는 탈염수 중의 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 세포 현탁액 1.4 ℓ를, 기계적 혼합기 및 열 제거용 재킷이 공급되고 14 내지 23 ℃의 온도 범위로 자동온도 조절되는 3 리터 반응기에 부하하였으며; 따라서 상기 반응기는 1 g(건조 중량 기준)의 생물촉매 세포를 포함하였다. 상기 세포를 실시예 3에 개시된 바와 같이 수득하였다. 상기 반응 용액의 pH는 7.8이었다. 아크릴로니트릴을, 초기 및 현재 모두의 아크릴로니트릴 농도가 0.1% 이하이도록 전환이 발생함에 따라 상기 반응 용액에 도입시켰다. 상기 용액 중의 아크릴아미드 및 아크릴로니트릴을 시간당 1회 주기적으로 기체 크로마토그래피 방법에 의해 분석하였다. 7.0시간 후에 상기 아크릴로니트릴 가수분해 속도가 감소하였기 때문에 상기 반응을 정지시켰다. 상기 용액 중의 아크릴아미드(즉 최종 생성물)의 농도는 49%이었다. 용액 중 잔류 아크릴로니트릴은 존재하지 않았다.
실시예 7. 24 리터 부피의 발효기에서의 배양에 의해 생산된 세포를 사용하는 1 리터 부피의 반응기에서 농축된 아크릴아미드 용액의 제조.
상기 세균 균주의 바이오매스를 선행 실시예들에 개시된 바와 같이 증식시켰으나, 단 24 리터의 부피를 갖는 발효기를 사용하였다. 상기 바이오매스를 사용하여, 1 리터 부피의 반응기를 사용하는 선행 실시예들에 개시된 바와 같이 아크릴아미드를 제조하였다. 상기 수득된 최종 생성물 중의 아크릴아미드의 농도는 49.5%이었다.
기술의 진보에 따라, 본 발명의 기본적인 생각을 다양한 방식으로 실행할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 따라서 본 발명 및 그의 실시형태들은 상술한 실시예들로 제한되지 않으며, 대신에 청구항들의 범위내에서 다양할 수 있다.
IBPM VKMAc-2610D 20120720

Claims (24)

  1. 세균(bacteria) 균주 로도코커스 아에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) VKM Ac-2610D.
  2. 제1항에 있어서,
    니트릴 하이드라타제의 생산자인 세균 균주.
  3. 로도코커스 속에 속하고 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 균주의 바이오매스를 사용하는 아크릴로니트릴의 수화에 의한 아크릴아미드의 제조 방법으로, 상기 수화를 상기 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스를 사용하여, 0.5% 이하의 아크릴로니트릴의 작용 농도에서 수행하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    아크릴로니트릴을 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스의 수성 현탁액(aqueous suspension) 중에 혼합하여 반응 용액을 형성시키고; 수화를, 상기 반응 용액 중의 아크릴로니트릴의 작용 농도가 0.5% 이하에서 유지되도록 수행하는, 아크릴아미드의 제조 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    수화에 이어서 최종 아크릴아미드 생성물을 분리하는, 아크릴아미드의 제조 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 바이오매스가 최종 생성물 1톤당 균주의 건조 중량을 기준으로 약 100 내지 1000 g, 또는 200 내지 1000 g, 또는 200 내지 800 g, 또는 300 내지 600 g, 또는 400 내지 500 g, 또는 1000 g 미만, 또는 500 g 미만, 또는 400 g 미만인, 아크릴아미드의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    최종 생성물이 아크릴아미드를 적어도 40%; 또는 적어도 41%; 또는 적어도 42%; 또는 적어도 43%; 또는 적어도 44%; 또는 40-55%; 또는 41-55%; 42-55%; 또는 43-55%; 또는 44-55%; 또는 적어도 45%; 또는 적어도 46%; 또는 적어도 47%; 또는 45-55%; 또는 45-54%; 또는 45-53%; 또는 45-52%; 또는 45-51%; 또는 45-50%; 또는 45-49%; 또는 46-55%; 또는 46-54%; 또는 46-53%; 또는 46-52%; 또는 46-51%; 또는 46-50%; 또는 46-49%; 또는 47-55%; 또는 47-54%; 또는 47-53%; 또는 47-52%; 또는 47-51%; 또는 47-50%; 또는 47-49%의 농도로 함유하는, 아크릴아미드의 제조 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    아크릴로니트릴의 수화를 10 내지 23 ℃의 온도에서 수행하는, 아크릴아미드의 제조 방법.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    아크릴로니트릴의 수화를 6.8 내지 8.4의 pH에서 수행하는, 아크릴아미드의 제조 방법.
  10. 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법으로, 상기 균주의 세포를
    나트륨 및 칼륨 이온을 포함하는 수성 포스페이트 완충제;
    탄소원;
    질소원;
    임의로 효소 유도물질;
    임의로 코발트염;
    마그네슘염;
    아연염;
    칼슘염; 및
    철(II)염
    을 포함하는 영양 배지를 사용하여 배양하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    세균 균주의 세포를, 상기 세균 균주의 세포의 증식이 정지상에 진입할 때까지 또는 소정의(predetermined) 세포 수율이 성취될 때까지 배양하는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    영양 배지의 pH가 6.3 내지 8.3 또는 7.0 내지 7.4인, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정을 26 내지 31 ℃의 온도 또는 28 내지 30 ℃의 온도에서 수행하는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    세균 균주의 세포를 36 내지 40의 현탁액의 광학 밀도가 성취될 때까지 배양하는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    수성 포스페이트 완충제가 Na2HPO4 NaH2PO4, KH2PO4, K2HPO4 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 포스페이트염을 포함하는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    탄소원이 글루코스, 셀로비오스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 만노스, 슈크로스, 트레할로스, 리보스, 글리세롤, 만니톨, 솔비톨, 살리신, 이눌린, 시트레이트, 피루베이트, 숙시네이트, 퓨마레이트 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    질소원 및 유도물질이 카브아미드(carbamide)인, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    코발트염이 CoCl2, CoSO4 또는 이들의 혼합물인, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    마그네슘염이 MgSO4이고/이거나; 아연염이 ZnSO4이고/이거나; 칼슘염이 CaCl2, CaHPO4·2H20, Ca(H2P04)2·2Η20, Ca3(P04)2, CaCl2·2Η20, CaC03, CaS04, Ca(C3H5O3)2·3Η20, Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2·Η20 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고/되거나; Fe(II)염이 킬레이트 착체 형태(chelate complex form)의 FeSO4·7H2O인, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    균주의 세포를 고체 영양 배지 상에 시딩하고 24 내지 48시간 동안 배양하고, 이어서 바이오매스를 세척하고, 생성 현탁액을 상기 영양 배지를 포함하는 제1 용기의 접종에 사용하며, 상기 공정을 24 내지 48시간 동안 교반하면서 수행하여, 540 ㎚의 파장 및 광학층 5 ㎜의 두께에서 2 내지 16 단위 범위의 상기 현탁액의 광학 밀도를 성취하고; 이어서 상기 생성 현탁액을, 상기 제1 용기의 부피보다 10 내지 100배 더 큰 부피를 갖고, 새로운 영양 배지를 포함하는 제2 용기의 접종에 사용하여 상기 제2 용기에서 0.1 내지 0.3의 광학 밀도를 성취하고; 상기 공정을 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도 및 7.5 내지 7.8의 pH가 성취될 때까지 통기(aeration)와 함께 48 내지 120시간 동안 계속하고; 이어서 상기 생성된 바이오매스를 분리시키는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    균주의 세포를 고기 펩톤 아가 사면배지(meat peptone agar slope) 상에 시딩하고 24 내지 48시간 동안 배양하고, 이어서 바이오매스를 7.0 내지 7.4의 pH를 갖는 멸균 생리 용액으로 세척하고, 생성 현탁액을 하기 조성(g/ℓ)의 영양 배지를 포함하는 제1 용기의 접종에 사용하며: 및
    Na2HPO4·12H2O 6.06
    KH2PO4 1.3
    글루코스 10.0 - 20.0
    카브아미드 2.0 - 6.0
    MgSO4·7H2O 1.0
    ZnSO4·7H2O 0.08 - 0.2
    CaCl2·H2O 0.2
    CoCl2·6H2O 0.01 - 0.02
    킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O 0.01 - 0.025
    증류수 1 ℓ까지
    pH 7.0 내지 7.4;
    상기 공정을 24 내지 48시간 동안 28 내지 30 ℃의 온도에서 140 내지 160 rpm의 속도로 환상 교반하면서 수행하여, 540 ㎚의 파장 및 광학층 5 ㎜의 두께에서 2 내지 16 단위 범위의 상기 현탁액의 광학 밀도를 성취하고, 이어서 상기 생성 현탁액을, 상기 제1 용기의 부피보다 10 내지 100배 더 큰 부피를 갖고 하기 조성(g/ℓ)의 새로운 영양 배지를 포함하는 제2 용기의 접종에 사용하여 상기 제2 용기에서 0.1 내지 0.3의 광학 밀도를 성취하고:
    Na2HPO4·12H2O 6.20
    KH2PO4 1.65
    글루코스 20.0 - 60.0
    카브아미드 10.0 - 24.0
    MgSO4·7H2O 0.8 - 1.0
    ZnSO4·7H2O 0.08 - 0.4
    칼슘염 0.2 - 0.6
    코발트염 0.04 - 0.085
    킬레이트 착체 형태의 FeSO4·7H2O 0.025 - 0.05
    증류수 1 ℓ까지
    pH 7.0 내지 7.4;
    상기 공정을 36 내지 40의 상기 현탁액의 광학 밀도 및 7.5 내지 7.8의 pH가 성취될 때까지 분당 0.5 내지 1.0의 공기 부피/배지 부피의 통기와 함께 26 내지 31 ℃의 온도에서 48 내지 120시간 동안 계속하고; 이어서 상기 생성된 바이오매스를 분리시키는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    제2 용기 중의 영양 배지가 칼슘염으로서 하기의 염들 중 하나:
    CaHPO4·2H2O
    Ca(H2PO4)2·2H2O
    Ca3(PO4)2
    CaCl2·2H2O
    CaCO3
    CaSO4
    Ca(C3H5O3)2·3H2O
    Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2·H2O;
    및 코발트염으로서 하기의 염들 중 하나:
    CoCl2·6H2O,
    CoSO4·7H2O
    를 포함하는, 세균 균주 로도코커스 아에테리보란스 VKM Ac-2610D의 배양 방법.
  23. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 최종 생성물.
  24. 제23항에 따른 최종 생성물로부터 수득될 수 있는 아크릴아미드.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2520870C1 (ru) 2012-12-27 2014-06-27 Кемира Оюй Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида
ES2784277T3 (es) * 2014-09-30 2020-09-23 Solenis Technologies Cayman Lp Método de cultivo de microorganismos que tienen actividad de nitrilo hidratasa
KR20170066471A (ko) * 2014-09-30 2017-06-14 바스프 에스이 낮은 아크릴산 농도를 갖는 아크릴아미드 수용액의 제조 방법
ITUA20163572A1 (it) * 2016-05-18 2017-11-18 Columbia S R L Metodo biotecnologico per la produzione di acrilammide e relativo nuovo ceppo batterico
CN107475317B (zh) * 2016-06-07 2021-12-17 中国石油化工股份有限公司 丙烯酰胺水溶液的制备方法
CN107881163A (zh) * 2017-09-29 2018-04-06 浙江大学 一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用
CN107586750B (zh) * 2017-11-02 2020-04-21 山东阳成生物科技有限公司 一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法
WO2019097123A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Kemira Oyj A process for producing aqueous acrylamide solution, aqueous acrylamide solution and use thereof
WO2021138205A1 (en) * 2019-12-30 2021-07-08 Kemira Oyj Ftnir spectroscopy for reaction monitoring of acrylamide synthesis
CN114196589B (zh) * 2021-12-23 2023-05-23 浙江工业大学 食醚红球菌zhc及其在降解丙烯酸甲酯中的应用
CN116179402B (zh) * 2022-09-06 2024-01-30 南京工业大学 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179014A (en) 1985-01-08 1993-01-12 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for the preparation of amides using microorganisms
JPS63137688A (ja) 1986-12-01 1988-06-09 Res Assoc Util Of Light Oil アミド化合物の製造法
CZ280901B6 (cs) 1988-10-06 1996-05-15 Hideaki Yamada Způsob kultivace bakterií
SU1731814A1 (ru) 1990-05-17 1992-05-07 Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленныхмикроорганизмов Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы
RU2053300C1 (ru) 1993-12-17 1996-01-27 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы
RU2077588C1 (ru) 1996-01-16 1997-04-20 Государственное унитарное предприятие Саратовский научно-исследовательский институт биокатализа Способ получения акриламида
DE19620594A1 (de) 1996-05-22 1997-11-27 Sel Alcatel Ag Resonator für elektromagnetische Wellen mit einer Stabilisierungseinrichtung und Verfahren zum Stabilisieren der Resonatorlänge
JPH1171478A (ja) 1997-08-29 1999-03-16 Santen Pharmaceut Co Ltd 粘度低下防止方法
RU2146291C1 (ru) * 1998-12-17 2000-03-10 Закрытое акционерное общество "Биоамид" Усовершенствованный биотехнологический способ получения акриламида
JP2001069978A (ja) 1999-09-02 2001-03-21 Showa Denko Kk ロドコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子
RU2159817C1 (ru) * 1999-11-23 2000-11-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Пермский завод им. С.М. Кирова" Способ получения акриламида
RU2196822C1 (ru) 2001-07-25 2003-01-20 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы
RU2223316C2 (ru) * 2001-12-06 2004-02-10 ФГУП "Пермский завод им. С.М.Кирова" ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ
DE10315376B4 (de) * 2003-04-03 2005-07-14 Stockhausen Gmbh Verfahren zur Kultivierung des Nitrilhydratase-produzierenden Stammes RHODOCOCCUS RHODOCHROUS M33
SG148992A1 (en) * 2003-12-02 2009-01-29 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Strain of rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
DE102004013824A1 (de) 2004-03-20 2005-10-13 Degussa Ag Nitrilhydratasen aus Rhodococcus opacus
GB0416101D0 (en) * 2004-07-19 2004-08-18 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Process for preparing monomers and polymers thereof
RU2304165C1 (ru) 2006-03-02 2007-08-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) Способ получения акриловых мономеров и штамм бактерий rhodococcus rhodochrous для его осуществления
CN101186911B (zh) 2007-09-20 2010-06-02 清华大学 一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用
FR2944006B1 (fr) * 2009-04-03 2011-04-01 Inst Francais Du Petrole Bacteries capables de degrader des composes petroliers multiples en solution dans des effluents aqueux et procede de traitement desdits effluents
CN101892228B (zh) 2010-05-24 2012-05-23 清华大学 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
RU2468084C1 (ru) 2011-06-16 2012-11-27 Общество с ограниченной ответственностью научно-производственное предприятие "Гель-Плюс" Биотехнологический способ получения акриламида
RU2520870C1 (ru) 2012-12-27 2014-06-27 Кемира Оюй Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида

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