ES2629489T3 - Cepa bacteriana Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D que producee nitrilo hidratasa, su método de cultivo y método para producir acrilamida - Google Patents

Cepa bacteriana Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D que producee nitrilo hidratasa, su método de cultivo y método para producir acrilamida Download PDF

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ES2629489T3 ES13199300.8T ES13199300T ES2629489T3 ES 2629489 T3 ES2629489 T3 ES 2629489T3 ES 13199300 T ES13199300 T ES 13199300T ES 2629489 T3 ES2629489 T3 ES 2629489T3
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Abstract

Una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D.

Description

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descripcion
Cepa bacteriana Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D que producee nitrilo hidratasa, su metodo de cultivo y metodo para producir acrilamida
Campo de la invencion
El presente grupo de invenciones versa sobre biotecnolog^a y la industria microbiologica e incluye:
- una nueva cepa de la bacteria Rhodococcus aetherivorans que tiene una elevada actividad de la enzima nitrilo hidratasa;
- un metodo para su cultivo;
- un metodo para producir soluciones concentradas de acrilamida usando celulas de la cepa como biocatalizador.
Antecedentes de la invencion
La capacidad de los microorganismos de transformar los carbonitrilos en las correspondientes amidas fue descrita en la bibliograffa a comienzos de la decada de 1970. La enzima nitrilo hidratasa que cataliza tales reacciones es inherente a una amplia gama de bacterias relacionadas con diversos grupos taxonomicos. Las representantes del genera Rhodococcus son de interes practico con respecto al objeto de la presente memoria. Grandes empresas qmmicas y biotecnologicas de Japon, Corea, Francia, Rusia, Alemania, EE. UU. y China usan, inter alia, celulas de cepas pertenecientes a este genero como biocatalizadores eficaces para la produccion de acrilamida.
Pese a profundas investigaciones del proceso de la hidrolisis enzimatica de los nitrilos en las correspondientes amidas y a considerables exitos en el campo de la seccion de cepas productoras de nitrilo hidratasa, la demanda de nuevos biocatalizadores por parte de la industria no ha decafdo. Esto es causado, por un lado, por la eficacia y la seguridad ecologica de la produccion biotecnologica de amidas, in particular acrilamida, y, por otro, por el elevado coste de cepas y tecnologfas patentadas con anterioridad. Por lo tanto, en anos recientes se aislaron nuevos microorganismos que eran productores de la enzima nitrilo hidratasa.
Sin embargo, las cepas bacterianas conocidas y los metodos de produccion de acrilamida que usan tales cepas adolecen de varios inconvenientes. Muchas cepas solo son capaces de producir una concentracion maxima de acrilamida inferior al 40% y, por lo tanto, el uso de tales cepas es limitado.
Otra desventaja de ciertas cepas es que deben incluirse en su medio de cultivo componentes que son caros y vanan en su composicion, tales como vitaminas, peptona o extracto de levadura. Algunas cepas unicamente presentan una baja actividad de la nitrilo hidratasa. Para aumentar la actividad, pueden requerirse etapas adicionales, tales como la eliminacion de ox^geno del caldo de cultivo, junto con la activacion enzimatica durante varios dfas.
Algunas cepas requieren un medio de cultivo que contiene componentes toxicos. Por ejemplo, puede requerirse acetonitrilo en el medio de cultivo, pero el acetonitrilo es toxico, volatil, muy inflamable y caro.
El documento US5827699 describe la cepa Rhodococcus rhodochrous M33, que puede ser cultivada en medios simples que contienen una fuente de carbono y una fuente de nitrogeno, tales como urea sin vitaminas, aminoacidos o extracto de levadura. La descripcion de la cepa indica que es capaz de producir acrilamida en una concentracion del 46% (p/p).
Compendio
La cepa bacteriana segun la presente invencion esta caracterizada por lo presentado en la reivindicacion 1.
El metodo de produccion de acrilamida segun la presente invencion esta caracterizado por lo presentado en la reivindicacion 3.
El metodo de cultivo de la cepa bacteriana segun la presente invencion esta caracterizado por lo presentado en la reivindicacion 10.
Descripcion detallada
La presente invencion versa sobre una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D.
En una realizacion, la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D es productora de nitrilo hidratasa.
La presente solicitud de patente tambien versa sobre un metodo de cultivo de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D.
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La presente solicitud tambien versa sobre un metodo de produccion de acrilamida.
Un objeto del grupo reivindicado de invenciones es la ereaeion de una nueva cepa bacteriana que tiene nitrilo hidratasa de alta actividad para su uso en la produccion industrial de productos comercializables.
Un objeto del metodo reivindicado de cultivo de la cepa es el desarrollo de una tecnologfa para la produccion de biomasa de la cepa reivindicada sin un coste superfluo; por otra parte, si es posible, con una redueeion de coste con respecto a metodos similares existentes que se usan en la industria.
Un objeto del metodo reivindicado de produccion del referido producto mediante el uso de una nueva cepa es el desarrollo de una tecnologfa de produccion de acrilamida en una eoneentraeion predeterminada mediante el uso de la nueva cepa sin aumentar el coste del procedimiento y sin complicaeion adicional de las operaciones del procedimiento.
La presente inveneion tambien versa sobre un metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetheivorans VKM Ac-2610D en el que las eelulas de la cepa son cultivadas usando un medio nutriente que comprende
un tampon acuoso de fosfato que comprende iones de sodio y potasio;
una fuente de carbono;
una fuente de nitrogeno;
opcionalmente, un inductor enzimatico;
opcionalmente, una sal de cobalto;
una sal de magnesio;
una sal de cine;
una sal de ealeio; y
una sal de Fe(ll).
En una realizaeion, el medio nutriente comprende
un tampon acuoso de fosfato que comprende iones de sodio y potasio;
una fuente de carbono;
una fuente de nitrogeno;
un inductor enzimatico;
una sal de cobalto;
una sal de magnesio;
una sal de cine;
una sal de ealeio; y
una sal de Fe(ll).
En una realizaeion, el medio nutriente consiste en
un tampon acuoso de fosfato que comprende iones de sodio y potasio;
una fuente de carbono;
una fuente de nitrogeno;
opcionalmente, un inductor enzimatico;
opcionalmente, una sal de cobalto;
una sal de magnesio;
una sal de cine;
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una sal de calcio; y una sal de Fe(ll).
En una realizacion, el medio nutriente consiste en
un tampon acuoso de fosfato que comprende iones de sodio y potasio;
una fuente de carbono;
una fuente de nitrogeno;
un inductor enzimatieo;
una sal de cobalto;
una sal de magnesio;
una sal de cine;
una sal de calcio; y
una sal de Fe(ll).
En una realizacion, las celulas de la eepa son eultivadas en el medio nutriente.
En una realizacion, las celulas de la eepa estan suspendidas en el medio nutriente durante el eultivo.
En una realizacion, el pH del medio nutriente es 6,3-8,3. En una realizacion, el pH del medio nutriente es 7,0-7,4.
En una realizacion, el proeedimiento se lleva a eabo a una temperatura de 26-31°C. En una realizacion, el proeedimiento se lleva a eabo a una temperatura de 28-30°C. En este contexto, debena entenderse que la expresion "el proeedimiento" se refiere al proeedimiento de eultivo de las celulas de la eepa usando el medio nutriente.
En una realizacion, las celulas de la eepa baeteriana son eultivadas eon agitaeion.
En una realizacion, las celulas de la eepa baeteriana son eultivadas eon aireaeion.
En una realizacion, las celulas de la eepa baeteriana son eultivadas hasta que el desarrollo de las celulas de la eepa
baeteriana entre en la fase estaeionaria.
En una realizacion, las celulas de la eepa baeteriana son eultivadas hasta que se logre una produeeion predeterminada de celulas de la eepa baeteriana.
La produeeion predeterminada puede variar dependiendo, por ejemplo, de la eantidad de biomasa que debena ser obtenida para el proeedimiento de produeeion de aerilamida, o de la aetividad de la nitrilo hidratasa de las celulas de la eepa baeteriana.
El logro de una produeeion predeterminada de celulas puede determinarse mediante metodos conoeidos tales eomo la medieion de la densidad optica del eultivo o la medieion del peso seeo de la masa de celulas. La densidad optica, o absorbaneia, puede medirse, por ejemplo, en un calonmetro fotoeleetrieo, segun se describe posteriormente. Asimismo, dichos metodos pueden ser usados para determinar cuando el desarrollo de las celulas de la eepa baeteriana entra en la fase estaeionaria.
En una realizacion, las celulas de la eepa baeteriana son eultivadas hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40. En este contexto, se debena entender que la “suspension” se refiere al medio nutriente que comprende las celulas de la eepa baeteriana suspendida en el mismo.
Una densidad optica de la suspension de 36-40 indiea que el desarrollo baeteriano ha aleanzado la fase estaeionaria. En la presente memoria y en los Ejemplos, la densidad optica se mide en un calonmetro fotoeleetrieo eon un grosor de eapa optica de 5 mm a la longitud de onda de 540 nm. Los ealonmetros fotoeleetrieos o espeetrofotometros adeeuados para medir la densidad optica son muy conoeidos en la teeniea.
En una realizacion, el proeedimiento se lleva a eabo hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40.
En una realizacion, el proeedimiento se lleva a eabo hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 3640 a una longitud de onda de 540 nm y un grosor de la eapa optica de 5 mm.
El tampon acuoso de fosfato puede ser eualquier tampon acuoso de fosfato conoeido en la teeniea, siempre y cuando eomprenda iones de sodio (Na+) y de potasio (K+). Dicho tampon acuoso de fosfato puede ser preparado usando diversas sales fosfato de sodio y de potasio. En una realizacion, el tampon acuoso de fosfato comprende
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una sal fosfato. En una realizacion, el tampon acuoso de fosfato comprende una sal fosfato selecclonada del grupo constltuldo por Na2HP04, NaH2P04, KH2PO4, K2HPO4 y cualquier mezcla de los mismos. En una realizacion, el tampon acuoso de fosfato comprende Na2HP04'12H20 y KH2PO4. El pH del tampon acuoso de fosfato puede ser seleccionado para ajustar el pH del medio nutriente a 6,3-8,3 0 a 7,0-7,4.
En una realizacion, la fuente de carbono es seleccionada del grupo constituido por glucosa, celobiosa, fructosa, galactosa, maltosa, manosa, sacarosa, trehalosa, ribosa, glicerol, manitol, sorbitol, salicina, inulina, citrato, piruvato, succinato, fumarato y cualquier mezcla de los mismos.
En una realizacion, la fuente de carbono es glucosa.
En una realizacion, el medio nutriente comprende 20,0-60,0 g/l de la fuente de carbono.
La fuente de nitrogeno puede ser cualquier fuente de nitrogeno que las celulas de la cepa bacteriana sean capaces de utilizar. Muchas fuentes adecuadas de nitrogeno tambien son capaces de inducir la actividad de la nitrilo hidratasa. Por lo tanto, una persona experta entendera que puede incluirse un unieo compuesto en el medio nutriente tanto como una fuente de nitrogeno y como un inductor enzimatico. En una realizacion, la fuente de nitrogeno es seleccionada del grupo constituido por carbamida, leucina, acetamida 0 cualquier mezcla de las mismas. En una realizacion, la fuente de nitrogeno es carbamida.
En este contexto, las palabras "inductor enzimatico" e "inductor" pueden ser usadas de forma intercambiable y se refieren a un agente capaz de inducir la actividad de la nitrilo hidratasa. En la teeniea se conocen varios inductores enzimatieos capaces de inducir la actividad de la nitrilo hidratasa. En una realizacion, el inductor enzimatico es carbamida. En una realizacion, el inductor enzimatico es una amida alifatiea. En una realizacion, el inductor enzimatico es seleccionado del grupo constituido por propionamida, isobutiramida, acetamida y una mezcla de las mismas.
En una realizacion, la fuente de nitrogeno e inductor es carbamida. Puede utilizarse carbamida (urea) como fuente de nitrogeno respetuosa con los microorganismos y que esta inmediatamente disponible para fines industriales. Tambien puede funcionar como inductor enzimatico.
En una realizacion, el medio nutriente comprende 10,0-24,0 g/l de la fuente de nitrogeno.
La sal de cobalto puede ser cualquier sal soluble de cobalto. Los iones de cobalto se utilizan como cofactores para la enzima nitrilo hidratasa. En una realizacion, la sal de cobalto es C0CI2, C0SO4 0 una mezcla de los mismos. En una realizacion, la sal de cobalto es C0CI26H2O, C0SO47H2O 0 una mezcla de los mismos. En una realizacion, el medio nutriente comprende 0,04-0,085 g/l de la sal de cobalto.
La sal de magnesio puede ser cualquier sal soluble de magnesio. Los iones de magnesio proporcionados por la sal de magnesio son utilizados en las funciones de transporte de las celulas de la cepa bacteriana. En una realizacion, la sal de magnesio es MgS04. En una realizacion, la sal de magnesio es MgS04'7H20. En una realizacion, el medio nutriente comprende 10,0-24,0 g/l de la sal de magnesio.
La sal de cine puede ser cualquier sal soluble de cine. Los iones de cine proporcionados por la sal de cine pueden ser utilizados en la descomposicion de la fuente de nitrogeno, tal como carbamida. En una realizacion, la sal de cine es ZnS04. En una realizacion, la sal de cine es ZnS04'7H20. En una realizacion, el medio nutriente comprende 0,080,4 g/l de la sal de cine.
La sal de ealeio puede ser cualquier sal soluble de ealeio. Los iones de ealeio proporcionados por la sal de ealeio pueden estar implieados en la utilizaeion de la fuente de carbono, tal como glucosa. En una realizacion, la sal de ealeio es seleccionada del grupo constituido por CaCl2, CaHP04'2H20, Ca(H2PO4)2'2H2O, Ca3(P04)2, CaCl2'2H20, CaC03, CaS04, Ca(C3H5O3)2'3H2O, Ca(HoCh2(CHOH)4COO)2'H2O y cualquier mezcla de los mismos. En una realizacion, el medio nutriente comprende 0,2-0,6 g/l de la sal de ealeio.
La sal de Fe(ll) puede ser cualquier sal soluble de Fe(ll). Los iones ferrosos proporcionados por la sal son utilizados en la respiraeion. En una realizacion, la sal de Fe(ll) esta en forma de complejo de quelato. En una realizacion, la sal de Fe(ll) es FeS04 en forma de complejo de quelato. En una realizacion, la sal de Fe(ll) es FeS04'7H20 en forma de complejo de quelato. En una realizacion, el medio nutriente comprende 0,025-0,05 g/l de la sal de Fe(ll).
En una realizacion, la sal de magnesio es MgS04; la sal de cine es ZnS04; la sal de ealeio es seleccionada del grupo constituido por CaCl2, CaHP04'2H20, Ca(H2PO4)2'2H2O, Ca3(P04)2, CaCl2'2H20, CaC03, Cas04, Ca(C3H5O3)2'3h2O, Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2'H2O y cualquier mezcla de los mismos; y la sal de Fe(ll) es FeS04'7H20 en forma de complejo de quelato.
La fuente de carbono, la fuente de nitrogeno, el inductor, y la sal de cobalto pueden ser introdueidos en el medio nutriente en una poreion 0 en varias porciones durante el cultivo y el desarrollo eelular.
El medio nutriente es de fabrieaeion simple y barata. Tambien permite una produeeion elevada de biomasa de la cepa bacteriana y una actividad elevada de la nitrilo hidratasa en la biomasa de la cepa bacteriana.
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En una realizacion, el medio nutriente no comprende vitaminas, aminoacidos, peptonas, extractos de plantas, extractos de levadura y/o acetonitrilo.
La biomasa producida puede ser separada posteriormente. Los metodos para separar la biomasa producida son muy conocidos en la tecnica.
En una realizacion, las celulas de la cepa son sembradas en un medio nutriente solido y cultivadas durante un periodo de tiempo; despues se lava la biomasa, y la suspension resultante es usada para la inoculacion de un primer recipiente que comprende el medio nutriente, y el procedimiento se lleva a cabo durante un periodo de tiempo con agitacion para lograr una densidad optica de la suspension en el intervalo de 2-16 unidades a una longitud de onda de 540 nm y un grosor de la capa optica de 5 mm; a continuacion, la suspension resultante es usada para la inoculacion de un segundo recipiente que tiene un volumen que es 10-100 veces mayor que el volumen del primer recipiente, comprendiendo el segundo recipiente un nuevo medio nutriente, para lograr una densidad optica de 0,10,3 en el segundo recipiente; el procedimiento continua durante un periodo de tiempo con aireacion hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40 y un pH de 7,5-7,8; a continuacion, se separa la biomasa producida.
En una realizacion, las celulas de la cepa son sembradas en un medio nutriente solido y cultivadas durante 24-48 horas, despues se lava la biomasa, y la suspension resultante es usada para la inoculacion de un primer recipiente que comprende el medio nutriente, y el procedimiento se lleva a cabo durante 24-48 horas con agitacion para lograr una densidad optica de la suspension en el intervalo de 2-16 unidades a una longitud de onda de 540 nm y un grosor de la capa optica de 5 mm; a continuacion, la suspension resultante es usada para la inoculacion de un segundo recipiente que tiene un volumen que es 1O-1o0 veces mayor que el volumen del primer recipiente, comprendiendo el segundo recipiente un nuevo medio nutriente, para lograr una densidad optica de 0,1-0,3 en el segundo recipiente; el procedimiento continua durante 48-120 horas con aireacion hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40 y un pH de 7,5-7,8; a continuacion, se separa la biomasa producida.
Las celulas de la cepa bacteriana pueden ser cultivadas como un cultivo en una unica etapa en el que las celulas de la cepa bacteriana son cultivadas en el medio nutriente hasta que se logra una primera produccion predeterminada de celulas. Las celulas de la cepa bacteriana tambien pueden ser cultivadas como un cultivo en dos etapas, en el que las celulas de la cepa bacteriana son cultivadas en el medio nutriente en un primer recipiente y, posteriormente, el cultivo o suspension resultante es usado para inocular un nuevo medio nutriente en un segundo recipiente; las celulas de la cepa bacteriana son cultivadas en el nuevo medio nutriente hasta que se logra una segunda produccion predeterminada de celulas. No es preciso que las producciones predeterminadas primera y segunda sean iguales. Normalmente, no es preciso que la primera produccion predeterminada sea tan elevada como la segunda produccion predeterminada.
El cultivo en dos etapas en el que las celulas de la cepa son cultivadas en el primer recipiente en una primera etapa y en el segundo recipiente como segunda etapa puede permitir una mejor adaptacion de la cepa bacteriana al medio y una mejor smtesis enzimatica.
El medio nutriente solido puede ser, por ejemplo, un agar con carne y peptona, agar de medio de LB, un medio sintetico o cualquier otro medio nutriente solido que sea capaz de soportar el desarrollo de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D.
La biomasa puede lavarse, por ejemplo, con una solucion fisiologica esteril, tal como suero fisiologico con tampon de fosfato. La solucion fisiologica esteril puede tener un pH de 7,0 - 7,4.
La agitacion del primer recipiente puede ser, por ejemplo, una agitacion circular a una velocidad de 140-160 rpm.
En este contexto, debena entenderse que la expresion "nuevo medio nutriente" se refiere a un nuevo volumen del medio nutriente definido anteriormente.
La invencion tambien versa sobre un metodo de cultivo de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en el que las celulas de la cepa son sembradas en rampa de agar con carne y peptona y cultivadas durante 24-48 horas, despues se lava la biomasa con una solucion fisiologica esteril que tiene un pH de 7,0-7,4, y la suspension resultante es usada para la inoculacion de un primer recipiente que comprende un medio nutriente de la siguiente composicion, g/l:
Na2HPO4-12H2O
6,06
KH2PO4
1,3
glucosa
10,0-20,0
carbamida
2,0-6,0
MgS04-7H20
i,o
5
10
15
ZnS04-7H20
0,08-0,2
CaCl2-2H20
0,2
C0CI26H2O
0,01-0,02
FeS04'7H20 en forma de complejo de quelato
0,01-0,025
agua destilada
hasta 1 I
ph
7,0-7,4;
y el procedimiento se lleva a cabo durante 24-48 horas a una temperatura de 28-30°C con agitacion circular a una velocidad de 140-160 rpm para lograr una densidad optica de la suspension en el intervalo de 2-16 unidades a una longitud de onda de 540 nm con un grosor de la capa optica de 5 mm. Despues, la suspension resultante es usada para la inoculacion de un segundo recipiente que tiene un volumen que es 10-100 veces mayor que el volumen del primer recipiente, comprendiendo el segundo recipiente un nuevo medio nutriente de la siguiente composicion, g/l:
Na2HPO4-12H2O
6,20
KH2PO4
1,65
glucosa
20,0-60,0
carbamida
10,0-24,0
MgS04-7H20
0,8-1,0
ZnS04-7H20
0,08-0,4
una sal de calcio
0,2-0,6
una sal de cobalto
0,04-0,085
FeS04'7H20 en forma de complejo de quelato
0,025-0,05
agua destilada
hasta 1 I
ph
7,0-7,4;
para lograr una densidad optica de 0,1-0,3 en el segundo recipiente; el procedimiento continua durante 48-120 horas a una temperatura de 26-31°C, una aireacion de 0,5-1,0 de volumen de aire/volumen de medio por minuto hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40 y un pH de 7,5-7,8; a continuacion, se separa la biomasa obtenida.
En una realizacion del metodo de cultivo anteriormente descrito de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D, el medio nutriente en el segundo recipiente puede comprender una de las siguientes sales como una sal de calcio:
CaHPO4-2H2O
Ca(H2PO4)2'2H2O
Ca3(P04)2
CaCl2-2H20
CaC03
CaS04
Ca(C3H5O3)2'3H2O Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2H2O; y una de las siguientes sales como una sal de cobalto:
C0CI26H2O,
C0SO47H2O.
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La presente invencion tambien versa sobre un metodo de produccion de acrilamida mediante hidratacion de acrilonitrilo usando una biomasa de una cepa perteneciente al genero Rhodococcus y que tiene actividad de la nitrilo hidratasa, en el que la hidratacion se lleva a cabo a una concentracion de trabajo de acrilonitrilo que no es mayor del 0,5%, usando una biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D.
Mediante el metodo se obtiene un producto final que contiene acrilamida.
En una realizacion, la hidratacion va seguida por el aislamiento del producto final de acrilamida.
Debena entenderse que la expresion "producto final de acrilamida" se refiere a la acrilamida contenida en el producto final. Los metodos que son adecuados para aislar la acrilamida del producto final son conocidos en la tecnica.
El acrilonitrilo es un compuesto toxico, y debena mantenerse una concentracion adecuada de trabajo del mismo que no sea toxica para la cepa bacteriana. La cepa bacteriana tolera una concentracion de trabajo de acrilonitrilo que no sea mayor del 0,5%. Dicha concentracion de trabajo tambien puede permitir obtener acrilamida en el producto final a una concentracion del 45-49%. La concentracion de trabajo puede mantenerse cargando acrilonitrilo en la solucion de reaccion durante la reaccion de hidratacion. Una persona experta puede seleccionar la concentracion de trabajo de acrilonitrilo, por ejemplo, para que la tasa de hidratacion o la cantidad del producto final de acrilamida sea optima. En una realizacion, la concentracion de trabajo de acrilonitrilo esta en el intervalo del 0,01-0,5%, o del 0,05-0,5%, o del 0,1-0,5o/o.
En una realizacion, la concentracion de trabajo of acrilonitrilo no supera el 0,5%, o esta en el intervalo de 0,01-0,5%, o 0,05-0,5%, o 0,1-0,5% en peso con respecto al peso total de la solucion de reaccion (p/p).
En este contexto, debena entenderse que la expresion "concentracion de trabajo" se refiere a la concentracion en la solucion de reaccion que comprende la biomasa de la cepa bacteriana y el acrilonitrilo. La solucion de reaccion tambien puede comprender otros componentes, tales como agua, acrilamida y/o aditivos cualesquiera.
Debena entenderse que la expresion "solucion de reaccion" se refiere a la mezcla de reaccion que comprende la biomasa de la cepa bacteriana y el acrilonitrilo. La mezcla de reaccion tambien puede comprender otros componentes, tales como agua, acrilamida y/o aditivos cualesquiera.
La cantidad de la biomasa de la cepa bacteriana usada puede ser seleccionada, por ejemplo, para que la tasa de hidratacion o la cantidad del producto final de acrilamida sea optima. La cantidad de la biomasa de la cepa bacteriana puede depender, por ejemplo, de la actividad de la nitrilo hidratasa de las celulas de la cepa bacteriana.
En una realizacion, la biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D se encuentra en aproximadamente 100-1000 g, o 200-1000 g, o 200-800 g, o 300-600 g, o menos de 1000 g, o menos de 500 g, o menos de 400 g en peso seco de la cepa por tonelada del producto final.
En una realizacion, la biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D se encuentra en aproximadamente 400-500 g en peso seco de la cepa por tonelada del producto final.
En este contexto, debena entenderse que la expresion "el producto final" se refiere a la solucion de reaccion que comprende la biomasa de la cepa y la acrilamida. El producto final tambien puede comprender otros componentes; por ejemplo, agua, pequenas cantidades de acrilonitrilo y/o aditivos cualesquiera. Una persona experta entendera que el acrilonitrilo incluido en la solucion de reaccion es hidratado por la biomasa de la cepa bacteriana formando la acrilamida. En otras palabras, el producto final se refiere a toda la solucion de reaccion en la que el acrilonitrilo anadido en la solucion de reaccion ha sido hidratado formando acrilamida.
Debena entenderse que el termino "biomasa" se refiere a una masa de celulas de la cepa bacteriana.
En una realizacion, el producto final contiene acrilamida en una concentracion de al menos el 40%; o al menos el 41%; o al menos el 42%; o al menos el 43%; o al menos el 44%; o el 40-55%; o el 41-55%; o el 42-55%; o el 4355%; o el 44-55%.
En una realizacion, el producto final contiene acrilamida en una concentracion de al menos el 45%; o al menos el 46%; o al menos el 47%; o el 45-55%; o el 45-54%; o el 45-53%; o el 45-52%; o el 45-51%; o el 45-50%; o el 4549%; o el 46-55%; o el 46-54%; o el 46-53%; o el 46-52%; o el 46-51%; o el 46-50%; o el 46-49%; o el 47-55%; o el 47-54%; o el 47-53%; o el 47-52%; o el 47-51%; o el 47-50%; o el 47-49%.
En una realizacion, el producto final contiene acrilamida en una concentracion de al menos el 40%; o al menos el 41%; o al menos el 42%; o al menos el 43%; o al menos el 44%; o el 40-55%; o el 41-55%; o el 42-55%; o el 4355%; o el 44-55%; o al menos el 45%; o al menos el 46%; o al menos el 47%; o el 45-55%; o el 45-54%; o el 4553%; o el 45-52%; o el 45-51%; o el 45-50%; o el 45-49%; o el 46-55%; o el 46-54%; o el 46-53%; o el 46-52%; o el 46-51%; o el 46-50%; o el 46-49%; o el 47-55%; o el 47-54%; o el 47-53%; o el 47-52%; o el 47-51%; o el 47-50%; o el 47-49% en peso con respecto al peso total del producto final.
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En un ejemplo correspondiente al Ejemplo 6, para obtener acrilamida en una concentracion del 47% en el producto final, se pueden introducir en un reactor 757,2 g de acrilonitrilo, dando como resultado una masa total de reaccion de 2157,2 g. Dado que todo el acrilonitrilo es transformado en acrilamida por las celulas de la cepa bacteriana, se obtiene una concentracion final del 47% de acrilamida en el producto final. En este ejemplo, la reaccion incluina 1 g de biomasa (peso seco).
En una realizacion, la hidratacion de acrilonitrilo se lleva a cabo a una temperatura de 10-23°C.
En una realizacion, la hidratacion de acrilonitrilo se lleva a cabo a un pH de 6,8-8,4.
En una realizacion, la hidratacion de acrilonitrilo se lleva a cabo a una temperatura de 10-23°C y a un pH de 6,8-8,4.
En una realizacion, una biomasa de la cepa bacteriana esta suspendida en una solucion acuosa; y
se anade acrilonitrilo en la solucion acuosa para formar una solucion de reaccion.
En una realizacion, se mezcla acrilonitrilo en una suspension acuosa de una biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D para formar una solucion de reaccion; y se lleva a cabo una hidratacion para que la concentracion de trabajo de acrilonitrilo en la solucion de reaccion se mantenga a no mas del 0,5%.
En una realizacion, el metodo comprende las etapas siguientes:
a) se suspende una biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en una solucion acuosa para obtener una suspension;
b) se mezcla acrilonitrilo en la suspension obtenible de la etapa a) para formar una solucion de reaccion; y
c) se lleva a cabo una hidratacion para que la concentracion de trabajo de acrilonitrilo en la solucion de reaccion se mantenga a no mas del 0,5%.
En una realizacion, la concentracion de trabajo of acrilonitrilo en la solucion de reaccion se mantiene a no mas del 0,5% hasta que se obtiene un producto final que contiene acrilamida en una concentracion de al menos el 45%.
En una realizacion del metodo que incluye la hidratacion de acrilonitrilo usando una biomasa de una cepa perteneciente al genero Rhodococcus, que tiene actividad de la nitrilo hidratasa, y luego el aislamiento del producto final, es decir, la acrilamida, la hidratacion se lleva a cabo a una concentracion de trabajo de acrilonitrilo de no mas del 0,5%, usando una biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en una cantidad de aproximadamente 400-500 g en peso seco de la cepa por tonelada del producto final, que es acrilamida en una concentracion de 45-49%.
En la presente memoria tambien se da a conocer el producto final obtenible por una o mas realizaciones del metodo de produccion de acrilamida.
El producto final comprende una biomasa de la cepa bacteriana y acrilamida. El producto final puede comprender, ademas, otros componentes; por ejemplo, agua, pequenas cantidades de acrilonitrilo y/o aditivos cualesquiera.
El producto final contiene acrilamida en una concentracion de al menos el 40%; o al menos el 41%; o al menos el 42%; o al menos el 43%; o al menos el 44%; o el 40-55%; o el 41-55%; o el 42-55%; o el 43-55%; o el 44-55%.
El producto final contiene acrilamida en una concentracion de al menos el 45%; o al menos el 46%; o al menos el 47%; o el 45-55%; o el 45-54%; o el 45-53%; o el 45-52%; o el 45-51%; o el 45-50%; o el 45-49%; o el 46-55%; o el 46-54%; o el 46-53%; o el 46-52%; o el 46-51%; o el 46-50%; o el 46-49%; o el 47-55%; o el 47-54%; o el 47-53%; o el 47-52%; o el 47-51%; o el 47-50%; o el 47-49%.
El producto final contiene acrilamida en una concentracion de al menos el 40%; o al menos el 41%; o al menos el 42%; o al menos el 43%; o al menos el 44%; o el 40-55%; o el 41-55%; o el 42-55%; o el 43-55%; o el 44-55%; o al menos el 45%; o al menos el 46%; o al menos el 47%; o el 45-55%; o el 45-54%; o el 45-53%; o el 45-52%; o el 4551%; o el 45-50%; o el 45-49%; o el 46-55%; o el 46-54%; o el 46-53%; o el 46-52%; o el 46-51%; o el 46-50%; o el 46-49%; o el 47-55%; o el 47-54%; o el 47-53%; o el 47-52%; o el 47-51%; o el 47-50%; o el 47-49% en peso con respecto al peso total del producto final.
Resultado tecnico proporcionado por el grupo reivindicado de invenciones
La cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D esta caracterizada por desarrollarse en un medio organico-mineral simple y tener elevada actividad de la nitrilo hidratasa de hasta 332 U/mg a 20°C o 521 U/mg a 25°C. La nitrilo hidratasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D es termoestable.
La cepa fue aislada de aguas residuales de la fabricacion de acrilamida y poliacrilamida y no fue modificada geneticamente. Es especialmente importante para su uso como biocatalizador industrial, porque la legislacion de muchos pa^ses limita el uso de microorganismos modificados geneticamente.
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El metodo desarrollado de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D hace posible que haya una gran produccion de celulas que tienen actividad elevada sobre un medio nutriente organico- mineral simple, que no comprende inductores, vitaminas, aminoacidos ni extractos de plantas caros. Dado que todos los componentes del medio nutriente estan disponibles comercialmente, el coste del biocatalizador industrial preparado con base en la cepa reivindicada es reducido. El metodo de cultivo segun una o mas realizaciones es optimo para el rapido desarrollo de la cepa bacteriana. Ademas, el metodo de cultivo segun una o mas realizaciones puede ser usado para proporcionar una biomasa de la cepa bacteriana que puede ser usada en el metodo de produccion de acrilamida segun una o mas realizaciones.
El metodo de produccion de acrilamida mediante su smtesis usando la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans vKm Ac-2610D descrita en esta solicitud es economicamente ventajoso. Las condiciones de smtesis de soluciones concentradas de acrilamida estan optimizadas. La cepa reivindicada es aislada de las aguas residuales de la fabricacion de acrilamida y poliacrilamida mediante un metodo de siembra directa en un medio selectivo.
La cepa bacteriana reivindicada de Rhodococcus aetherivorans fue depositada segun el Tratado de Budapest por el empresario particular Sergey Kozulin en la coleccion mtegramente rusa de microorganismos (Coleccion Rusa de Microorganismos (VKm), InsTituto G. K. Skryabin de Bioqmmica y Fisiolog^a de Microorganismos, Academia Rusa de Ciencias, ProspekT Nauki N0 5, Pushchino 142290 (Zona de Moscu), Federacion Rusa) con numero de acceso VKM Ac-2610D (referenda identificativa dada por el depositante: Rhodococcus aetherivorans KTN26-1). La Autoridad Depositaria recibio la cepa el 20.07.2012, y el deposito fue converTido en un deposito segun el Tratado de Budapest el 15.11.2013. La cepa esta caracterizada por las siguientes propiedades morfologicas, de cultivo y bioqmmicas.
Propiedades morfologicas: cepa grampositiva que tiene un ciclo vital de Rhodococcus, no motil, no formadora de esporas, no forma quistes, es intolerante a los acidos, aerobica.
Propiedades del cultivo: forma colonias lisas redondas en el agar con carne y peptona, que tienen un color entre amarillo-anaranjado y rojo- anaranjado y un diametro de 1-2 mm (despues de 72-96 horas). Cuando crece en medios especiales, se disocia en formas R, S y M.
Propiedades fisiologicas: La cepa es negativa a la oxidasa, positiva a la catalasa y la fosfatasa, reduce nitratos a nitritos. Hidroliza el almidon, el Tween 60 y el Tween 80; no hidroliza la celulosa, la esculina ni el ADN. Se desarrolla a un pH de 5,5-9,5, siendo el valor optimo del pH 7,2±0,2; a una temperatura de 5-45°C, siendo el valor optimo 29±1°C. Como fuente unica de carbono usa: celobiosa, fructosa, galactosa, glucosa, maltosa, manosa, sacarosa, trehalosa, ribosa, glicerol, manitol, sorbitol, pero no usa dulcitol ni inositol. La cepa se desarrolla sobre salicina, inulina, citrato, piruvato, succinato, fumarato, pero no se desarrolla sobre gluconato. Utiliza acidos meta y para- hidroxibenzoicos, isobutanol, 2,3-butilenglicol, monoetanol amina. Usa leucina y acetamida como fuente unica de nitrogeno.
Patogenicidad: la cepa no es patogena.
Con base en las anteriores propiedades, segun el Manual de bacteriologfa determinativa de Bergey (Opredeli tel bakteriy Berdgy, Moscu: Mir, 1997) y el analisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restriccion de un gen 16S del acido ribonucleico ribosomico, la cepa es atribuida al genero Rhodococcus, especie aetherivorans.
El metodo de cultivo de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D puede ser llevado a cabo como sigue.
Las celulas de la cepa Rhodococcus aetherivorans almacenadas a temperatura de 4°C en bandas de medio de LB agarizado al 0,4% o caldo de carne y peptona pueden ser sembradas en una rampa de agar con carne y peptona y cultivadas durante 24-48 horas. La biomasa obtenida puede ser lavada con una solucion fisiologica esteril que tiene un pH de 7,0-7,4. La suspension obtenida puede ser usada para la inoculacion de un primer recipiente que comprende un medio nutriente de la siguiente composicion, g/l:
Na2HPO4-12H2O
6,06
KH2PO4
1,3
glucosa
10,0-20,0
carbamida
2,0-6,0
MgS04-7H20
1,0
ZnS04-7H20
0,08-0,2
CaCl2-2H20
0,2
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C0CI26H2O
0,01-0,02
FeS04'7H20 en forma de complejo de quelato
0,01-0,025
agua destilada
hasta 1 I
ph
7,0-7,4;
El procedimiento puede llevarse a cabo durante 24-48 horas a una temperatura de 28-30°C con agitacion circular a una velocidad de 140-160 rpm para lograr una densidad optica de la suspension en el intervalo de 2-16 unidades medidas en un calonmetro fotoelectrico con un grosor de la capa optica de 5 mm a la longitud de onda de 540 nm.
A continuacion, la suspension resultante puede ser usada para inocular un segundo recipiente (mayor) que tiene un volumen que es 10-100 veces mayor que el volumen del primer recipiente; por ejemplo, un gran matraz 0 fermentador que comprende un nuevo medio nutriente de la siguiente composicion, g/l:
Na2HP04-12H20
6,20
KH2PO4
1,65
glucosa
20,0-60,0
carbamida
10,0-24,0
MgS04-7H20
0,8-1,0
ZnS04-7H20
0,08-0,4
una sal de calcio
0,2-0,6
una sal de cobalto
0,04-0,085
FeS04'7H20 en forma de complejo de quelato
0,025-0,05
agua destilada
hasta 1 I
ph
7,0-7,4.
El medio nutriente en el segundo recipiente puede comprender una de las sales siguientes como una sal de caIcio: CaHP04'2H20, Ca(H2PO4)2'2H2O, Caa(P04)2, CaCh^O, CaCOa, CaS04, Ca(C3H503)2'3H20,
Ca(HOCH2(CHOH)4c0o)2-H2O; y una de las sales siguientes como una sal de cobalto: C0CI26H2O, C0SO47H2O.
Pueden introducirse glucosa, carbamida y sales de cobalto en el medio nutriente en una porcion 0 en varias porciones durante el desarrollo de las celulas.
El valor de la densidad optica en el segundo recipiente puede ser llevado hasta las 0,1-0,3 unidades. El procedimiento puede continuar durante 48-120 horas a una temperatura de 26-31°C, una aireacion de 0,5-1,0 de volumen de aire/volumen de medio por minuto hasta el logro de una densidad optica de la suspension en el intervalo de 36-40 y un pH de 7,5-7,8. Tras el fin del procedimiento, se separa la biomasa por medio de cualquier metodo conocido, tal como centrifugacion, floculacion, flotacion, sedimentacion con un filtrado posterior. La implementacion de este metodo de cultivo de la cepa Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D puede dar una produccion celular de 10-18 g/l con una actividad de la enzima nitrilo hidratasa de 250-332 U/mg. La biomasa puede ser usada despues en procedimientos de produccion de acrilamida.
La comprobacion de la actividad de la enzima nitrilo hidratasa puede llevarse a cabo como sigue: se prepara una suspension de celulas en tampon de fosfato 0,01 M, pH 7,6, a una concentracion de 0,04-0,06 mg de celulas (en peso seco) /ml. Se introduce un sustrato de acrilonitrilo en la cantidad de 25 |jl en 1 ml de suspension. Se lleva a cabo una reaccion de transformacion en un bano de agua a una temperatura de 20-25°C y con agitacion durante 10 min. Se detiene la reaccion anadiendo 50 |jl de 6H HCI. Las celulas bacterianas son separadas por centrifugacion. La concentracion de acrilamida en el sobrenadante es determinada mediante un metodo espectrofotometrico 0 de cromatograffa de gases. Las medidas de la actividad de la nitrilo hidratasa descritas en la presente memoria y en los Ejemplos se llevaron a cabo a una temperatura de 20°C, a no ser que se indique algo distinto.
Una unidad de la actividad espedfica de la nitrilo hidratasa (U/mg) es la cantidad de la enzima que cataliza la generacion de 1 |jM de acrilamida por unidad de tiempo (1 minuto) en 1 mg de celulas (en peso seco). Una unidad de la actividad total de la nitrilo hidratasa (U/ml) es la cantidad de unidades enzimaticas contenidas en 1 ml del caldo de cultivo.
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En detalle, el metodo de produccion de acrilamida puede llevarse a cabo como sigue.
Las celulas de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D obtenida segun se ha indicado en la descripcion del metodo de cultivo, pueden ser separadas del caldo de cultivo segun cualquier metodo conocido, lavadas con agua desalada, pH 7,0-7,6. La cantidad de agua que puede usarse para el lavado puede ser 1-10 volumenes/volumen de celulas. Las celulas lavadas pueden ser suspendidas en agua de grifo o destilada, pH 6,88,4, a aproximadamente 400-500 g de celulas (en peso seco) por tonelada del producto final; es decir, puede prepararse una solucion de acrilamida al 45-49%, dependiendo de la concentracion deseada del producto final y del tiempo de smtesis. La suspension de celulas en agua puede ser colocada en un reactor termostatico. La reaccion de smtesis de la acrilamida puede llevarse a cabo en el intervalo de pH de 6,8-8,4. Puede cargarse acrilonitrilo en la solucion de reaccion durante la transformacion para que su concentracion en la solucion no supere el 0,5%. La mezcla de reaccion puede ser agitada constantemente. La temperatura de la solucion de reaccion puede ser mantenida en el intervalo de 10-23°C. El tiempo de reaccion puede ser 5-8 horas. La acrilamida y el acrilonitrilo en la solucion de reaccion pueden ser analizados mediante cualquier metodo conocido; por ejemplo, cromatograffa de Ifquidos o gases, espectrofotometna, refractometna. El analisis puede llevarse a cabo al menos una vez por hora. El procedimiento puede detenerse despues de una cafda repentina en la velocidad de hidrolisis del acrilonitrilo. Tras la terminacion del procedimiento, las celulas del biocatalizador pueden ser separadas de la mezcla de reaccion mediante cualquier metodo conocido; por ejemplo, mediante floculacion, filtrado, flotacion, centrifugacion. El procedimiento puede dar soluciones que tienen una concentracion de acrilamida de, por ejemplo, 45-49%.
Una persona experta entendera que los metodos pueden ser cambiados de escala para cultivar grandes biomasas de la cepa bacteriana y producir grandes cantidades de acrilamida a escala industrial; por ejemplo, utilizando fermentadores y reactores industriales que tienen gran volumen.
Ejemplos
En lo que sigue, la presente invencion sera descrita con mayor detalle. La siguiente descripcion da a conocer algunas realizaciones y ejemplos de la invencion con tal detalle que una persona experta en la tecnica pueda utilizar la invencion con base en la divulgacion. No se exponen con detalle todas las etapas de las realizaciones, ya que muchas de las etapas resultaran obvias para la persona experta en la tecnica con base en esta memoria. Los ejemplos siguientes se llevaron a cabo en un laboratorio de pruebas a pequena escala; sin embargo, una persona experta en la tecnica es capaz de cambiar la escala de los ejemplos a voluntad.
Ejemplo 1. Aislamiento de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D, que es productora de la enzima nitrilo hidratasa
La cepa se afsla del agua residual de la fabricacion de acrilamida y poliacrilamida.
Composicion del agua residual:
Acrilamida
6,0 g/l;
Acrilonitrilo
3,3 g/l;
Cu2+
1,25 mg/l
Zn2+
1,93 mg/l
Fe3+
0,43 mg/l
Sorbital C-20
trazas.
Para el aislamiento de la cepa, se uso un medio selectivo que representaba un agua residual agarizada que tema la composicion anterior complementada con 0,9 g/l de Na2HPO4'12H2O, 0,5 g/l de KH2PO4, 1,0 g/l de MgS04'7H20, 0,5 g/l de un extracto de levadura. Unas placas con el medio selectivo fueron sembradas con una capa de 0,1 ml de agua residual y cultivadas durante 72-96 horas. Las colonias desarrolladas fueron resembradas dos veces en un agar con carne y peptona para comprobar su pureza y luego fueron analizadas para hallar su capacidad de transformar el acrilonitrilo en acrilamida. Con este fin, las cepas sometidas a ensayo fueron cultivadas en tubos bacteriologicos que tema un volumen de 40 ml, llenos hasta 1/8 con un medio que tema la siguiente composicion (g/l):
Na2HPO4-12H2O
0,9
KH2PO4
0,5
Glucosa
20,0
Carbamida
12,0
C0CI26H2O
0,02
MgS04-7H20
1,0
Extracto de levadura
1,0
ph
7,0-7,4
El cultivo se llevo a cabo durante 2 dfas con agitacion, a una temperatura de 28-30°C. La suspension celular obtenida fue centrifugada durante 1 minuto a 15000 rpm. Las celulas fueron lavadas con tampon de fosfato 0,01 M, pH 7,6, resuspendidas en 1 ml del mismo tampon y despues se midio la actividad de la nitrilo hidratasa segun se describe en el ensayo. Esto da como resultado que la cepa tenga una actividad de la nitrilo hidratasa de 95 U/mg.
5 Ejemplo 2. Un metodo de cultivo de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en matraces Erlenmeyer en condiciones de laboratorio.
Las celulas de la cepa fueron cultivadas en una rampa de agar con carne y peptona durante 36 horas a 28°C. La biomasa obtenida fue lavada con una solucion fisiologica esteril, pH 7,0-7,4, y sembrada para un precultivo en un medio nutriente Kquido de la siguiente composicion, (g/l):
Na2HPO4-12H2O
6,06
KH2PO4
1,3
Glucosa
12,0
Carbamida
4,0
MgS04-7H20
1,0
ZnS04-7H20
0,1
CaCl2-2H20
0,2
C0CI26H2O
0,02
FeS04-7H20
0,025
Acido ascorbico
0,05
Agua destilada
hasta 1 litro
ph
7,0-7,4
10 El precultivo se llevo a cabo en matraces Erlenmeyer a 28-30°C, con agitacion circular de 120-160 rpm durante 2448 horas. Esto da como resultado una suspension celular que tiene una densidad optica of 4,6 unidades a A 540 nm, l=5 mm. La suspension obtenida en la cantidad de 2 ml fue sembrada asepticamente en un medio de cultivo que tema la siguiente composicion, g/l:
Na2HPO4-12H2O
6,20
KH2PO4
1,65
Glucosa
40,0
Carbamida
24,0
MgS04-7H20
1,0
ZnS04-7H20
0,3
CaHP04-2H20
0,24
C0CI26H2O
0,06
FeS04-7H20
0,05
Acido ascorbico
0,10
Agua destilada
hasta 1 litro
ph
7,0-7,4
El cultivo se llevo a cabo en matraces Erlenmeyer que teman un volumen de 300 ml, llenos hasta 1/6 con el medio, durante 4 dfas con agitacion circular (160 rpm), a una temperatura de 28-30°C. Despues de la finalizacion del cultivo, se determino la concentracion de celulas y la actividad de la nitrilo hidratasa en muestras. La produccion de celulas despues de 96 horas de cultivo fue de 16,0 g/l, la actividad espedfica de la nitrilo hidratasa fue 332 U/mg a 20°C y 5 521 U/mg a 25°C, la actividad total de la nitrilo hidratasa fue 5312 U/ml a 20°C y 8336 U/ml a 25°C. La determinacion
de la actividad a 25°C se llevo a cabo para tener una comparacion con una cepa de Rhodococcus ruber GT.
Para confirmar la escalabilidad del metodo de cultivo y a posibilidad del uso industrial de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D, se llevo a cabo un cultivo de esta cepa en un fermentador que tema un volumen de 3 litros.
10 Ejemplo 3. Cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en un fermentador.
Se preparo durante 28 horas un inoculo que representaba una suspension de celulas en un medio de cultivo. Con este fin se cultivaron celulas con agitacion circular (160 rpm), a una temperatura de 28-30°C en matraces Erlenmeyer que teman un volumen de 300 ml llenos hasta 1/6 con el medio, que tema la siguiente composicion, (g/l):
Na2HPO4-12H2O
6,06
KH2PO4
1,3
Glucosa
12,0
Carbamida
4,0
MgS04-7H20
1,0
ZnS04-7H20
0,1
CaCl2-2H20
0,2
C0CI26H2O
0,02
FeS04-7H20
0,025
edta
0,05
Agua destilada
hasta 1 litro
ph
7,0-7,4
Esto dio como resultado una suspension celular que tema una densidad optica de 6 unidades a A 540 nm, l=5 mm. 15 Se usaron 100 ml de la suspension celular obtenida para la inoculacion de un fermentador de laboratorio que tema un volumen de 3 litros (lleno con 1,5 l del medio).
Composicion del medio para el fermentador, (g/l):
Na2HPO4-12H2O
6,20
KH2PO4
1,65
Glucosa
40,0
Carbamida
22,0
MgS04-7H20
1,0
ZnS04-7H20
0,25
CaHPO4-2H2O
0,24
C0CI26H2O
0,05
FeS04-7H20
0,05
edta
0,10
Agua destilada
hasta 1 litro
ph
7,0-7,4
5
10
15
20
25
30
35
40
El cultivo se llevo a cabo a una temperatura de 28°C, una aireacion de 0,5-1,0 de volumen de aire/volumen de medio por minuto, con agitacion continua de 560 rpm. Periodicamente, una vez cada seis horas, se tomaron muestras del caldo de cultivo de un fermentador para determinar el pH, la produccion y la actividad de la nitrilo hidratasa de celulas. La tabla presenta los datos obtenidos.
Periodo de fermentacion, horas
0 6 12 18 24 30 36
ph
7,11 6,95 6,91 6,88 6,87 6,88 6,87
Produccion de celulas, g/l (en peso seco)
0,1 0,4 1,3 2,4 3,7 5,5 7,1
Actividad espedfica de la nitrilo hidratasa, U/mg
- 40 34 55 126 185 219
Periodo de fermentacion, horas
42 48 54 60 66 70
ph
6,86 6,85 6,92 6,97 7,06 7,51
Produccion de celulas, g/l (en peso seco)
8,2 9,9 12,6 13,9 16,4 18,1
Actividad espedfica de la nitrilo hidratasa, U/mg
236 249 256 267 274 280
Despues de 70 horas de cultivo, la produccion de celulas fue 18,1 g/l, la actividad espedfica de la nitrilo hidratasa de celulas fue 280 U/mg (a 20°C) o 44o U/mg a 25°C, la actividad total de la nitrilo hidratasa fue 5058 U/ml (a 20°C) o 7964 U/ml a 25°C.
Ejemplo 4. Preparacion de una solucion concentrada de acrilamida en un reactor de laboratorio usando las celulas producidas por el cultivo en matraces.
Se pusieron en agua de grifo 66,2 g de una suspension celular de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D que tema una actividad de la nitrilo hidratasa de 270 U/mg en un reactor termostatico de 150 dotado de un mezclador magnetico y un termometro; as^ el reactor contema 30 mg (en peso seco) de las celulas biocatalfticas. Las celulas se produjeron segun se describe en el Ejemplo 2. El pH de la solucion de reaccion fue 7,6. Se cargaron 24,2 g de acrilonitrilo en el reactor con agitacion continua y una temperatura de 17-22°C en todo el periodo de smtesis de modo que la concentracion de acrilonitrilo en la solucion no superara el 0,3%. La acrilamida y el acrilonitrilo en la solucion fueron analizados con un metodo de cromatograffa de gases con una periodicidad de una vez por hora. Despues de 7,0 horas de smtesis, la reaccion se detuvo porque disminuyo la velocidad de hidrolisis del acrilonitrilo. Las celulas fueron separadas de la solucion de reaccion mediante centrifugacion. La concentracion de acrilamida en la solucion fue del 49%; no habfa presencia de acrilonitrilo residual.
Para confirmar la posibilidad de uso de la cepa de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en un procedimiento de la preparacion industrial de acrilamida y de la escalabilidad de la tecnologfa reivindicada, se llevo a cabo una smtesis de acrilamida en un aparato que tema un volumen de 3 litros que es analogo del reactor industrial.
Ejemplo 5. Smtesis de una solucion concentrada de acrilamida en un reactor de 3 l que usa las celulas obtenidas por el cultivo en matraces.
En un reactor de 3 litros dotado de un mezclador mecanico y camisa para la eliminacion de calor, y controlado termostaticamente en un intervalo de temperaturas de 20-22°C, se cargo una suspension celular de 1,4 l de la cepa de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en el agua desalada que tema una actividad de la enzima nitrilo hidratasa de 254 U/mg; asf, el reactor comprendfa 1 g (en peso seco) de las celulas biocatalfticas. Las celulas fueron obtenidas segun se ha descrito en el Ejemplo 2. El pH de la solucion de reaccion fue 7,4. El acrilonitrilo fue introducido en la solucion de reaccion mientras ocunia su transformacion de modo que la concentracion de acrilonitrilo, tanto inicial como actual, no superara el 0,5%. Despues de 5 horas de la reaccion, se obtuvo una solucion de acrilamida que tema una concentracion del 47%. Despues, la reaccion se detuvo debido a la abrupta disminucion de la velocidad de hidrolisis del acrilonitrilo.
Ejemplo 6. Preparacion de una solucion concentrada de acrilamida en el reactor que tiene un volumen de 3 litros usando las celulas producidas mediante cultivo en un fermentador
Se cargaron 1,4 litros de una suspension celular de la cepa de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en el agua desalada que tiene una actividad de la enzima nitrilo hidratasa de 280 U/mg en un reactor de 3 litros dotado de un mezclador mecanico y camisa para la eliminacion de calor, y controlado termostaticamente en el intervalo de temperaturas de 14-23°C; asf, el reactor comprendfa 1 g (en peso seco) de las celulas biocatalfticas. Las celulas fueron obtenidas segun se ha descrito en el Ejemplo 3. El pH de la solucion de reaccion fue 7,8. El acrilonitrilo fue introducido en la solucion de reaccion mientras ocunia su transformacion de modo que la concentracion de
acrilonitrilo, tanto inicial como actual, no superara el 0,1%. La acrllamlda y el acrilonitrilo en la solucion fueron anallzados con un metodo de cromatograffa de gases con una periodicidad de una vez por hora. Despues de 7,0 horas, la reaccion se detuvo debido a una disminucion de la velocidad de hidrolisis del acrilonitrilo. La concentracion de acrilamida en la solucion (es decir, el producto final) fue del 49%. No habfa presencia de acrilonitrilo residual.
5 Ejemplo 7. Preparacion de una solucion concentrada de acrilamida en el reactor que tiene un volumen de 1 litro usando las celulas producidas mediante cultivo en un fermentador que tiene un volumen de 24 litros
Se desarrollo una biomasa de la cepa bacteriana segun se ha descrito en los ejemplos previos, salvo que se uso un fermentador que tema un volumen de 24 litros. La biomasa fue usada para preparar acrilamida, segun se ha descrito en los ejemplos previos usando un reactor que tema un volumen de 1 litro. La concentracion de acrilamida en el 10 producto final obtenido fue del 49,5%.
Resulta obvio para una persona experta en la tecnica que, con el avance de la tecnologfa, la idea basica de la invencion puede ser implementada de diversas maneras. As^ la invencion y sus realizaciones no estan limitadas a los ejemplos descritos en lo que antecede, sino que pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (22)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    reivindicaciones
    1. Una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D.
  2. 2. La cepa bacteriana segun la reivindicacion 1 que es productora de nitrilo hidratasa.
  3. 3. Un metodo de produccion de acrilamida mediante hidratacion de acrilonitrilo usando una biomasa de una
    cepa perteneciente al genera Rhodococcus y que tiene actividad de la nitrilo hidratasa, en el que la hidratacion se lleva a cabo a una concentracion de trabajo de acrilonitrilo que no es mayor del 0,5%, usando una biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D.
  4. 4. El metodo de produccion de acrilamida segun la reivindicacion 3 en el que el acrilonitrilo se mezcla en una suspension acuosa de una biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D para formar una solucion de reaeeion; y la hidratacion se lleva a cabo de modo que la concentracion de trabajo de acrilonitrilo en la solucion de reaccion se mantenga a no mas del 0,5%.
  5. 5. El metodo de produccion de acrilamida segun la reivindicacion 3 o 4 en el que la hidratacion es seguida por el aislamiento del producto final de acrilamida.
  6. 6. El metodo de produccion de acrilamida segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 - 5 en el que la
    biomasa de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D se encuentra en aproximadamente
    100-1000 g, o 2o0-1000 g, o 200-800 g, o 300-600 g, o aproximadamente 400-500 g, o menos de 1o00 g, o menos de 500 g, o menos de 400 g en peso seco de la cepa por tonelada del producto final.
  7. 7. El metodo de produccion de acrilamida segun la reivindicacion 6 en el que el producto final contiene
    acrilamida en una concentracion de al menos el 40%; o al menos el 41%; o al menos el 42%; o al menos el 43%; o al menos el 44%; o el 40-55%; o el 41-55%; 42-55%; o el 43-55%; o el 44-55%; o al menos el 45%; o al menos el 46%; o al menos el 47%; o el 45-55%; o el 45-54%; o el 45-53%; o el 45-52%; o el 45-51%; o el 45-50%; o el 4549%; o el 46-55%; o el 46-54%; o el 46-53%; o el 46-52%; o el 46-51%; o el 46-50%; o el 46-49%; o el 47-55%; o el
    47-54%; o el 47-53%; o el 47-52%; o el 47-51%; o el 47-50%; o el 47-49%.
  8. 8. El metodo de produccion de acrilamida segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 - 7 en el que la
    hidratacion de acrilonitrilo se lleva a cabo a una temperatura de 10-23°C.
  9. 9. El metodo de produccion de acrilamida segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 - 8 en el que la hidratacion de acrilonitrilo se lleva a cabo a un pH de 6,8-8,4.
  10. 10. Un metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D en el que las celulas de la cepa son cultivadas usando un medio nutriente que comprende
    un tampon acuoso de fosfato que comprende iones de sodio y potasio;
    una fuente de carbono;
    una fuente de nitrogeno;
    opcionalmente, un inductor enzimatieo;
    opcionalmente, una sal de cobalto;
    una sal de magnesio;
    una sal de cine;
    una sal de ealeio; y
    una sal de Fe(ll).
  11. 11. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun la reivindicacion 10 en el que las celulas de la cepa bacteriana son cultivadas hasta que el desarrollo de las celulas de la cepa bacteriana entre en la fase estaeionaria o hasta que se logra una produccion predeterminada de celulas.
  12. 12. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun la reivindicacion 10 u 11 en el que el pH del medio nutriente es 6,3-8,3 o 7,0-7,4.
  13. 13. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 -12 en el que el proeedimiento se lleva a cabo a una temperatura de 26-31°C o a una temperatura de 28-30°C.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
  14. 14. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 -13 en el que las celulas de la cepa bacteriana son cultivadas hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40.
  15. 15. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 - 14 en el que el tampon acuoso de fosfato comprende una sal fosfato seleccionada del grupo constituido por Na2HP04 NaH2P04, KH2PO4, K2HPO4 y cualquier mezcla de los mismos.
  16. 16. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 - 15 en el que la fuente de carbono es seleccionada del grupo constituido por glucosa, celobiosa, fructosa, galactosa, maltosa, manosa, sacarosa, trehalosa, ribosa, glicerol, manitol, sorbitol, salicina, inulina, citrato, piruvato, succinato, fumarato y cualquier mezcla de los mismos.
  17. 17. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 -16 en el que la fuente de nitrogeno y el inductor son carbamida.
  18. 18. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 -17 en el que la sal de cobalto es C0CI2, C0SO4 0 una mezcla de los mismos.
  19. 19. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 -18 en el que la sal de magnesio es MgS04; y/o la sal de cine es ZnS04; y/o la sal de ealeio es seleccionada del grupo constituido por CaCl2, CaHPO4'2H20, Ca(H2PO4)2'2H2O, Ca3(P04)2, CaCl2'2H20, CaC03, CaS04, Ca(C3H5O3)2'3H2O, Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2'H2O y cualquier mezcla de los mismos; y/o la sal de Fe(ll) es FeS04'7H20 en forma de eomplejo de quelato.
  20. 20. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 - 19 en el que las celulas de la cepa son sembradas en un medio nutriente solido y cultivadas durante 24-48 horas, despues se lava la biomasa, y la suspension resultante es usada para la inoeulaeion de un primer reeipiente que comprende el medio nutriente, y el proeedimiento se lleva a eabo durante 24-48 horas eon agitaeion para lograr una densidad optica de la suspension en el intervalo de 2-16 unidades a una longitud de onda de 540 nm y un grosor de la eapa optica de 5 mm; a eontinuaeion, la suspension resultante es usada para la inoeulaeion de un segundo reeipiente que tiene un volumen que es 10-100 veees mayor que el volumen del primer reeipiente, eomprendiendo el segundo reeipiente un nuevo medio nutriente, para lograr una densidad optica de 0,1-0,3 en el segundo reeipiente; el proeedimiento eontinua durante 48-120 horas eon aireaeion hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40 y un pH de 7,5-7,8; a eontinuaeion, se separa la biomasa producida.
  21. 21. El metodo de cultivo de una cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 - 20 en el que las celulas de la cepa son sembradas en una rampa de agar eon earne y peptona y cultivadas durante 24-48 horas, despues se lava la biomasa eon una solucion fisiologiea esteril que tiene un pH de 7,0-7,4, y la suspension resultante es usada para la inoeulaeion de un primer reeipiente que comprende un medio nutriente de la siguiente composieion, g/l:
    Na2HP04-12H20
    6,06
    KH2PO4
    1,3
    glucosa
    10,0-20,0
    carbamida
    2,0-6,0
    MgS04-7H20
    1,0
    ZnS04-7H20
    0,08-0,2
    CaCl2H20
    0,2
    C0CI26H2O
    0,01-0,02
    FeS04'7H20 en forma de eomplejo de quelato
    0,01-0,025
    agua destilada
    hasta 1 I
    ph
    7,0-7,4;
    y el proeedimiento se lleva a eabo durante 24-48 horas a una temperatura de 28-30°C eon agitaeion circular a una veloeidad de 140-160 rpm para lograr una densidad optica de la suspension en el intervalo de 2-16 unidades a una longitud de onda de 540 nm y un grosor de la eapa optica de 5 mm, despues la suspension resultante es usada para
    5
    10
    15
    20
    la inoculacion de un segundo recipiente que tiene un volumen que es 10-100 veces mayor que el volumen del primer reciplente, comprendiendo el segundo recipiente un nuevo medio nutriente de la siguiente composicion, g/l:
    Na2HPO4-12H2O
    6,20
    KH2PO4
    1,65
    glucosa
    20,0-60,0
    carbamida
    10,0-24,0
    MgS04-7H20
    0,8-1,0
    ZnS04-7H20
    0,08-0,4
    una sal de calcio
    0,2-0,6
    una sal de cobalto
    0,04-0,085
    FeS04'7H20 en forma de complejo de quelato
    0,025-0,05
    agua destilada
    hasta 1 I
    ph
    7,0-7,4;
    para lograr una densidad optica de 0,1-0,3 en el segundo recipiente; el procedimiento continua durante 48-120 horas a una temperatura de 26-31°C, una aireacion de 0,5-1,0 de volumen de aire/volumen de medio por minuto hasta el logro de una densidad optica de la suspension de 36-40 y un pH de 7,5-7,8; a continuacion, se separa la biomasa producida.
  22. 22. El metodo de cultivo de la cepa bacteriana de Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D segun la reivindicacion 21, en el que el medio nutriente en el segundo recipiente comprende una de las sales siguientes como una sal de calcio:
    CaHPO4-2H2O
    Ca(H2PO4)2'2H2O
    Ca3(P04)2
    CaCl2-2H20
    CaC03
    CaS04
    Ca(C3H5O3)2'3H2O Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2H2O; y una de las siguientes sales como una sal de cobalto:
    C0CI26H2O,
    C0SO47H2O.
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