CN106011191B - 一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法 - Google Patents

一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106011191B
CN106011191B CN201610500252.XA CN201610500252A CN106011191B CN 106011191 B CN106011191 B CN 106011191B CN 201610500252 A CN201610500252 A CN 201610500252A CN 106011191 B CN106011191 B CN 106011191B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aminovaleric acid
cell
davb
bacterial strain
coli
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610500252.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN106011191A (zh
Inventor
陈可泉
蔡沛沛
王昕�
应晗笑
王璟
欧阳平凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Tech University filed Critical Nanjing Tech University
Priority to CN201610500252.XA priority Critical patent/CN106011191B/zh
Publication of CN106011191A publication Critical patent/CN106011191A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106011191B publication Critical patent/CN106011191B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12002—Lysine 2-monooxygenase (1.13.12.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/0105—Pentanamidase (3.5.1.50)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用表达了L‑赖氨酸2‑单加氧酶DavB和δ‑戊酰胺水解酶 DavA的大肠杆菌细胞作为催化剂，生物催化生产5‑氨基戊酸的方法，是对表达了DavBA的E.coliBL21（DE3）进行低温诱导表达，集菌，然后将其作为催化剂，在缓冲体系中，使体系中细胞OD600nm为5‑90，赖氨酸浓度为0‑400g/L，并在金属离子及表面活性剂的辅助下，全细胞催化生产5‑氨基戊酸的方法。本发明解决了发酵法生产周期长，代谢产物复杂，底物转化率低，产物分离提取困难，及能耗高的问题，也解决了酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，提高了催化效率，同时省去了繁琐的酶纯化过程，生产成本更低。

Description

一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法
技术领域
本发明涉及一种高效全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，特别是涉及一种利用表达了L-赖氨酸2-单加氧酶DavB和δ-戊酰胺水解酶 DavA的大肠杆菌细胞作为催化剂，生物催化生产5-氨基戊酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
5-氨基戊酸是一种重要的C5平台化合物，在医药方面有着广泛的应用，例如可以作为合成5-羟基戊酸、戊二酸、1,5-戊二醇及其衍生物、戊二酸酐的重要前体，同时，它也可以用于合成尼龙-5,5（尸胺和戊二胺的共聚物）和尼龙-5（5-氨基戊酸均聚物）所以，5-氨基戊酸在纺织工业以及医药合成领域有着广泛的应用。
目前，5-氨基戊酸的制备方法中，已有采用恶臭假单胞菌中来源的L-赖氨酸2-单加氧酶Dav B和δ- 戊酰胺水解酶 DavA双酶催化L-赖氨酸制备5-氨基戊酸的报道（Enzymatic production of5-aminovalerate from L-lysine using L-lysinemonooxygenase and5-aminovaleramide amidohydrolase）。在此过程中，将能表达 L-赖氨酸 2-单加氧酶 DavB 和δ-戊酰胺水解酶 DavA 的工程大肠杆菌发酵培养，并将获得的细胞悬液中蛋白进行分离纯化，分别得到 L-赖氨酸 2-单加氧酶DavB 和 δ-戊酰胺水解酶DavA，将DavBA作为催化剂催化L-赖氨酸生成5-氨基戊酸，但此方法酶的纯化过程相对繁琐，且5-氨基戊酸的最终摩尔收率较低，制备成本较高。
SiJae等人采用来源于恶臭假单胞菌的DavBA片段与表达载体pKE112相连（High-level conversion of L-lysine into 5-aminovalerate that can beused fornylon6,5synthesis），得到重组质粒pKE112-DavBA，构建到E.coli WL3110 中，重组菌经高密度分批培养，待OD至60时补加120g/L L-赖氨酸，96h后，5-氨基戊酸积累至90.59g/L，此方法采用发酵法与全细胞相耦合的催化体系，但此方法耗时较长，且存在继续补加L-赖氨酸时，体系中PH会迅速上升，需立刻加入大量HCl来降低PH，因此限制了5-氨基戊酸的进一步积累。
Park等人采用来源于恶臭假单胞菌的DavBA片段与表达载体pKE112相连，得到重组质粒pKE112-DavBA，构建到E.coliWL3110 中，重组菌在含有10 g/LL-赖氨酸的 MR 培养基中发酵 48 小时，5-氨基戊酸产量达到30.7mM（ Metabolic engineering ofEscherichia coli for the production of5-aminovalerateand glutarate asC5platform chemicals.Metab Eng2013.16,42-47）。 此方法采用全细胞催化反应体系，但5-氨基戊酸产量很低，且反应周期较长。
Jake等人采用来源于恶臭假单胞菌的DavBA片段与表达载体pSTV相连，得到重组质粒pSTV-davBA，构建到E.coli BW25113（DE3） 中，在48h内，重组菌将2.25g/L的L-lys，转化生成了0.86g/L 5-氨基戊酸（Engineering Escherichia coli for RenewableProduction of the 5-Carbon Polyamide Building-BlocksandGlutarate）。此法采用发酵法的催化体系，5-氨基戊酸的产量较低，耗时较长。
经检索，一种高效利用全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明需要解决的问题是提供一种高效全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，包括以下步骤：
（1）构建并筛选过表达DavBA菌株；
（2）将步骤（1）构建的菌株诱导培养并集菌，浓缩至细胞OD600nm为0-90，添加L-赖氨酸、表面活性剂和金属离子催化生产5-氨基戊酸。
步骤（1）所述过表达DavBA菌株的构建方法是：将davA片段与表达载体pET-22b相连，将davB片段与表达载体pRSF-dute相连，分别得到重组质粒pET-22b-DavA和pRSF-davB，将重组质粒pET-22b-DavA和pRSF-davB导入E.coli BL21的感受态细胞中，得到过表达了davBA的重组菌BL-22A-RB；另外将davA及davB片段与表达载体pET-22b相连，得到重组质粒pET22b-DavBA，将重组质粒pET22b-DavBA导入E.coli BL21的感受态细胞中，得到过表达了davBA的重组菌E.coliBL-22AB；将davA片段与表达载体pRSF-dute相连，得到重组质粒pRSF-DavA，将重组质粒pRSF-DavA导入重组菌E.coliBL-22AB的感受态细胞中，得到重组菌株E.coliBL-22AB-RA；最后，将davB片段与表达载体pACYC-dute相连，得到重组质粒pACYC-davB,将重组质粒pACYC-davB导入重组菌BL-22A-RB的感受态细胞中，得到重组菌株E.coliBL-22A-RB-YB。
所述的筛选方法为：将重组菌进行低温诱导培养，得到过表达了davBA的工程菌细胞悬液，将细胞悬液在6000g条件，离心5min，得到静息细胞，将获得的细胞作为催化剂，在相同的催化体系及条件下进行全细胞催化，得到5-氨基戊酸的转化液，采用蒸发光散射检测器（ELSD）检测5-氨基戊酸的浓度并计算最终的摩尔收率，筛选出催化速率最快，摩尔收率最高的菌株作为后续催化菌株。经检测，四株重组菌株中，重组菌株BL-22A-RB-YB催化速率最快并将此重组菌株作为后续催化菌株进行低温诱导培养并收集细胞作为催化剂。
具体地，所述的表面活性剂为SDS，Triton X-100，Tween-20，Tween-80中的一种或几种，优选Triton X-100。
所述的金属离子为Fe2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+中的一种或几种。
所述L-赖氨酸的初始添加量为60~400g/L，优选160g/L。所述的催化反应在通氧速率为2.5vvm，37℃，搅拌转速200rpm条件下反应。
本发明的有益效果在于：这种高效利用全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法中，通过调节DavBA片段的构建方式，筛选出了最优的构建方式，相比于原始菌株BL-22A-RB，菌株E.coliBL-22A-RB-YB使5-氨基戊酸得摩尔收率提高了22.03%，其次通过细胞通透剂的添加，解决了L-赖氨酸向胞内转运的传质阻力问题，使5-氨基戊酸的积累速率有了一定的提升，再者通过金属离子的筛选，筛选出的Ca2+， Mn2+对酶的活性有进一步的提升，使5-氨基戊酸的摩尔收率分别提高了15.11%，15.48%，最后通过分批补料解决了底物L-赖氨酸对酶活的抑制，最终得到了一种高效全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法。
附图说明
图1 OD600nm为40，L-赖氨酸130g/L， 5-氨基戊酸的生成情况。
图2 OD600nm为40，L-赖氨酸150g/L，5-氨基戊酸的生成情况。
图3 OD600nm为40，初始L-赖氨酸160g/L，多次补加赖氨酸盐酸盐后5-氨基戊酸的生成情况。
具体实施方式
实施例1：5-氨基戊酸的液相检测方法
样品的检测：色谱柱：GRACE C18（5ul，5μm，4.6mm×250mm），柱温：28.5℃，流动相：0.7%（v/v）三氟乙酸水溶液，流速：1ml/min，检测器:蒸发光散射检测器（ELSD）；检测器温度：115℃，载气：氮气（纯度99.9%），载气流速：3.2L/min，进样体积：10ul。
实施例2：过表达DavBA菌株的构建过程
E.coliBL-22A-RB菌株的构建过程：
（1）davA由金唯智合成，酶切位点为NdeI和HindIII，将davA片段经限制性内切酶NdeI和HindIII处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pET-22b相连，使用T4DNA连接酶25℃连接30min。
（2）将（1）中的连接液转化大肠杆菌Trans1-T1（由全式金生物技术有限公司提供）的感受态细胞中，涂布在带有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。
（3）挑取（2）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄抗性的LB培养基里，然后提取质粒，再利用限制性内切酶NdeI和HindIII进行酶切验证，最后得到了载体pET-22b-davA。
（4）将步骤（3）中得到的载体pET-22b-davA转入E.coli BL21（DE3）的感受态细胞中，并将其涂布在带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养。
（5）挑取（4）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄抗性的LB培养基里，得到表达了davA的菌株，并将其做成感受态细胞。
（6）davB由金唯智合成，酶切位点为NdeI和XhoI，将davB片段经限制性内切酶NdeI和XhoI处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pRSFDuet-1相连，使用T4DNA连接酶25℃连接30min。
（7）将（6）中的连接液转入大肠杆菌Trans1-T1的感受态细胞中，涂布在带有卡那霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。
（8）挑取（7）中平板上生长的单菌落，转接到含有卡那霉素抗性的LB培养基里，然后提取质粒，再利用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切验证，最后得到了载体pRSFDuet-davB。
（9）将载体pRSFDuet-davB转入到步骤（5）中的表达了davA的感受态细胞中，涂布在带有氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。
（10）挑取（9）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB培养基里培养8-10h后，用30%的甘油保存在-80℃冰箱里，得到了E.coliBL-22A-RB菌株
E.coliBL21(DE3) pET 22b- davAB菌株的构建过程：
（1）酶切位点为XmaI和AgeI的davA片段的获取；
（2）davA由金唯智合成，酶切位点为NdeI和HindIII。
（3）所用引物为：
davA-F：ggCCCGGGcgCCTAGGCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG，含XmaI酶切位点；
davA-R：cccACTAGTggACCGGTCAAAAAACCCCTCAAGACCCG，含AgeI酶切位点。
（4）经过PCR，将得到的PCR产物连接到经过限制性内切酶XmaI和AgeI酶切过的载体pET-22b上，并将连接液转入大肠杆菌Trans1-T1的感受态细胞中，涂布在带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养。
（5）挑取（4）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，然后提取质粒，再利用限制性内切酶XmaI和AgeI进行酶切验证，最后得到了载体pET-22b-davA。
（6）davB由金唯智合成，酶切位点为NdeI和XhoI，将davB片段经限制性内切酶NdeI和XhoI处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pET-22b-davA相连，使用T4DNA连接酶25℃连接30min。
（7）将（6）中的连接液转入大肠杆菌Trans1-T1的感受态细胞中，涂布在带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养。
（8）挑取（7）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄青霉素抗性的LB培养基里，然后提取质粒，再利用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切验证，最后得到了载体pET-22b-davA-davB。
（9）将载体pET-22b-davA-davB转入到E.coliBL21(DE3)的感受态细胞中，涂布在带有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。
（10）挑取（9）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄青霉素抗性的LB培养基里培养8-10h后，用30%的甘油保存在-80℃冰箱里，得到了E.coliBL-22AB菌株
E.coliBL-22A-RB-YB菌株的构建：
（1）davA由金唯智合成，酶切位点为NdeI和HindIII，将davA片段经限制性内切酶NdeI和HindIII处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pRSFDuet-1相连，使用T4DNA连接酶25℃连接30min。
（2）将（1）中的连接液转入大肠杆菌Trans1-T1的感受态细胞中，涂布在带有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养。
（3）挑取（2）中平板上生长的单菌落，转接到含有卡那霉素抗性的LB培养基里，然后提取质粒，再利用限制性内切酶NdeI和HindIII进行酶切验证，最后得到了载体pRSFDuet-davA。
（4）将载体pRSFDuet-davA转入到BL-22AB的感受态细胞里，涂布在带有氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。
（5）挑取（4）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性的LB培养基里培养8-10h后，用30%的甘油保存在-80℃冰箱里，得到了E.coliBL-22AB-RA菌株菌株。
E.coliBL-22A-RB-YB菌株的构建过程：
（1）davB由金唯智合成，酶切位点为NdeI和XhoI，将davB片段经限制性内切酶NdeI和XhoI处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pACYCDuet-1相连，使用T4DNA连接酶25℃连接30min。
（2）将（1）中的连接液转入大肠杆菌Trans1-T1的感受态细胞中，涂布在带有氯霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养。
（3）挑取（2）中平板上生长的单菌落，转接到含有氯霉素抗性的LB培养基里，然后提取质粒，再利用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切验证，最后得到了载体pACYCDuet-1-davB。
（4）将载体pACYCDuet-1-davB转入到E.coliBL-22A-RB的感受态细胞里，涂布在带有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。
（5）挑取（4）中平板上生长的单菌落，转接到含有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB培养基里培养8-10h后，用30%的甘油保存在-80℃冰箱里，得到了E.coliBL-22A-RB-YB菌株。
实施例3：全细胞催化
（1）将实施例2中保存在冻存管中的菌株E.coliBL-22A-RB-YB接种在含有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性以及LB的摇管里 ，37℃ 200rpm 条件下培养8h，转接到含有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的500ML摇瓶里，37℃ 200rpm震荡培养至OD600nm为0.3；
（2）向上述摇瓶中加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，在20℃200rpm 条件下培养12h；
（3）12h后，将上述菌液在6000g 条件下离心5min，弃上清，并将收集的细胞用PH7.0的PBS洗两遍，得到用于催化反应的细胞。
（4）将收集的细胞用PH7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，使体系中OD600nm为40，并加入配制好的PH7.0的L-赖氨酸母液，使体系中的L-赖氨酸终浓度为130g/L，Ca2+终浓度为0.02mol/L,Mn2+终浓度为0.003mol/L，TritonX-100添加量为0.5%。
（5）催化反应体系在通氧速率为2.5vvm，37℃，搅拌转速200rpm条件下反应，并定期取样（样品12000rpm离心3min）并用蒸发光散射检测器（ELSD）检测5-氨基戊酸的积累情况。
（6）经液相检测，130g/L的L-赖氨酸经过22h的全细胞催化反应，基本被消耗完全，5-氨基戊酸积累到103.89g/L，摩尔收率为99%。见图1。
实施例4：全细胞催化
（1）按照实施例3中的方法进行收集细胞。
（2）将收集的细胞用PH7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，使体系中OD600nm为40，并加入配制好的PH7.0的L-赖氨酸母液，使体系中的L-赖氨酸终浓度为150g/L，Ca2+终浓度为0.02mol/L,Mn2+终浓度为0.003mol/L，TritonX-100添加量为0.5%。
（3）催化反应体系在通氧速率为2.5vvm， 37℃，搅拌转速200rpm条件下反应，并定期取样（样品12000rpm离心3min）并用蒸发光散射检测器（ELSD）检测5-氨基戊酸的积累情况。
（4）经液相检测，150g/L的L-赖氨酸经过5h的全细胞催化反应，消耗了82.73%的L-赖氨酸，5-氨基戊酸积累到90.02g/L，34h后，5-氨基戊酸积累至110.46g/L,摩尔收率为91.92%。见图2。
实施例5：分批补料全细胞催化生产5-氨基戊酸
（1）按照实施例3中的方法进行收集细胞。
（2）将收集的细胞用PH7.0的PBS重悬并浓缩加入到催化体系中，使体系中细胞OD600nm为40，并加入配制好的PH7.0的L-赖氨酸母液，使体系中的L-赖氨酸终浓度为160g/L，Ca2+终浓度为0.02mol/L，Mn2+终浓度为0.003mol/L，TritonX-100的添加量为0.5%。
（3）催化反应体系在通氧速率为2.5vvm， 37℃，搅拌转速200rpm条件下反应，并定期取样（样品12000rpm离心3min），并用生物传感仪检测L-赖氨酸的剩余量。
待L-赖氨酸基本耗尽时，向催化体系中补加赖氨酸盐酸盐粉末，使体系中的L-赖氨酸维持在合适的浓度，直至反应达到平衡，并用蒸发光散射检测器检测5-氨基戊酸的积累情况。
（4）经蒸发光散射检测器检测，通过多次补料，48h后反应达到平衡，5-氨基戊酸积累到247.35g/L。见图3。
实施例6：表面活性剂对催化速率的影响
将实施例2构建的重组菌株E.coliBL-22A-RB-YB的细胞作为催化剂。
控制各催化体系中，细胞OD600nm为5，L-赖氨酸终浓度为10g/L，并在各体系中分别加入不同的表面活性剂：SDS，Triton X-100，Tween-20，Tween-80，在相同条件下进行全细胞催化。
每隔3h取样并检测5-氨基戊酸积累情况，发现Triton X-100能显著提高5-氨基戊酸的生成速率。
实施例7：金属离子对5-氨基戊酸生成的影响
（1）同样利用诱导表达了DavBA的重组菌株E.coliBL-22A-RB-YB的细胞作为催化剂。
（2）控制各体系的催化体系相同，然后在体系1中不加金属离子，体系2中加入Fe2+，体系3中加入Ca2+，体系4中加入Mn2+，体系5中加入Zn2+，体系6中加入Cu2+，然后在相同条件下进行催化反应。
（3）反应10h后取样，采用蒸发光散射检测器（ELSD）检测5-氨基戊酸的积累情况。
（4）无金属离子添加的体系1作为空白对照，5-氨基戊酸的产量为6.74g/L，摩尔收率为84.14%，添加了钙离子的体系中3，5-氨基戊酸的产量为7.95g/L，摩尔收率为99.25%，与空白对照相比，摩 尔收率提高了15.11%。添加了锰离子的体系4中，5-氨基戊酸的产量为7.98g/L，摩尔收率为99.62%，与空白对照相比，摩尔收率提高了15.48%。

Claims (9)

1.一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建并筛选过表达DavBA菌株；将davA片段与表达载体pET-22b相连，将davB片段与表达载体pRSF-dute相连，分别得到重组质粒pET-22b-DavA和pRSF-davB，将重组质粒pET-22b-DavA和pRSF-davB导入E.coli BL21的感受态细胞中，得到过表达了davBA的重组菌BL-22A-RB；将davB片段与表达载体pACYC-dute相连，得到重组质粒pACYC-davB，将重组质粒pACYC-davB导入重组菌BL-22A-RB的感受态细胞中，得到重组菌株E.coli BL-22A-RB-YB；
（2）将步骤（1）构建的细胞培养至细胞OD600nm为40-90，添加L-赖氨酸、表面活性剂和金属离子催化反应生产5-氨基戊酸。
2.如权利要求1所述的一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述的筛选方法为：将重组菌进行低温诱导培养，得到过表达了davBA的工程菌细胞悬液，将细胞悬液在6000g条件，离心5min，得到静息细胞，将获得的细胞作为催化剂，在相同的催化体系及条件下进行全细胞催化，得到5-氨基戊酸的转化液，液相检测5-氨基戊酸的浓度并计算最终的摩尔收率，筛选出催化速率最快，摩尔收率最高的菌株作为后续催化菌株。
3.如权利要求1所述一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述的表面活性剂为SDS，Triton X-100，Tween-20，Tween-80中的一种或几种。
4.如权利要求3所述一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述的表面活性剂为Triton X-100。
5.如权利要求1所述一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述的金属离子为Fe2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+中的一种或几种。
6.如权利要求1所述一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述L-赖氨酸的初始添加量为60~400g/L。
7.如权利要求6所述一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述L-赖氨酸的初始添加量为160g/L。
8.如权利要求1所述一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述的过表达DavBA菌株为E.coliBL-22A-RB-YB，将该重组菌株E.coli BL-22A-RB-YB进行低温诱导培养并收集细胞作为催化剂。
9.如权利要求1所述一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法，其特征在于：所述的催化反应在通氧速率为2.5vvm，37℃，搅拌转速200rpm条件下反应。
CN201610500252.XA 2016-06-30 2016-06-30 一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法 Active CN106011191B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610500252.XA CN106011191B (zh) 2016-06-30 2016-06-30 一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610500252.XA CN106011191B (zh) 2016-06-30 2016-06-30 一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106011191A CN106011191A (zh) 2016-10-12
CN106011191B true CN106011191B (zh) 2019-11-19

Family

ID=57105880

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610500252.XA Active CN106011191B (zh) 2016-06-30 2016-06-30 一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106011191B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624632A (zh) * 2017-03-15 2018-10-09 中国科学院微生物研究所 5-氨基戊酸的生物转化方法
CN109295116A (zh) * 2018-11-06 2019-02-01 南京工业大学 一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法
CN113881719A (zh) * 2020-07-02 2022-01-04 中国科学院过程工程研究所 一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433292A (zh) * 2011-12-19 2012-05-02 南京工业大学 一种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌及其应用
CN103146779A (zh) * 2013-04-02 2013-06-12 南京工业大学 一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433292A (zh) * 2011-12-19 2012-05-02 南京工业大学 一种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌及其应用
CN103146779A (zh) * 2013-04-02 2013-06-12 南京工业大学 一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals》;Park SJ等;《Metab Eng》;20121214;第16卷;第42-47页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106011191A (zh) 2016-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101663389B (zh) 敲除酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用
CN104593442B (zh) 一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法
CN110951799B (zh) “一菌多酶”全细胞不对称合成(2s,3r)-对甲砜基苯丝氨酸的方法
CN107475281B (zh) 一种生物转化甲醇代谢途径
CN106011191B (zh) 一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法
US11085059B2 (en) Methylopila sp. and use thereof in selective resolution preparation of (S)-α-ethyl-2-oxo-1-pyrrolidineacetate
CN104152505A (zh) 一种利用重组菌株转化制备4-羟基-l-异亮氨酸的方法
CN105624128B (zh) 一种固定化单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用
CN104152478A (zh) 一种生物转化联产d-精氨酸和胍基丁胺的方法
WO2008046328A1 (fr) Souche produisant une lactonohydrolase lévorotatoire et son utilisation pour la production d'oxyacide chiral
CN106434510A (zh) 一株发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌
CN104152506A (zh) 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法
CN104131048A (zh) 一种r-3-氨基丁醇的生物制备方法
CN102206686B (zh) 生物催化不对称还原制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯的方法
CN104152500A (zh) 一种生物合成(r)-3-羟基戊二酸单酯的新方法
CN207828318U (zh) 一种非天然氨基酸的连续合成系统
CN104212850A (zh) 利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法
CN104862264B (zh) 一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌
CN107245484A (zh) 一种腈水解酶及其应用
CN104830744A (zh) 利用sd-as序列偶联(r)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶制备(r)-苯乙二醇的方法
CN106755166B (zh) 高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法
Wang et al. Improving the biocatalytic performance of co-immobilized cells harboring nitrilase via addition of silica and calcium carbonate
CN105483190A (zh) 酿酒酵母基因工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸产量的方法
CN106191089B (zh) 一种加速5-氨基戊酸生物法生产的方法
CN113930376A (zh) 一种用于催化生产d-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant