CN106755166B - 高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，属于发酵工程领域。本发明通过建立大肠杆菌高密度发酵的方法，是菌体生长周期大大缩短，从原来原始菌的100h缩短到现在的48h，时间缩短52％；在现有的催化工艺基础上，催化得到的产物浓度比现有重组菌提高110.8％，达到506g/L；生产效率与原始红球菌比较提高212％，达到508g/(L·h)。

Description

高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法
技术领域
本发明涉及高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
腈水合酶(NHase,EC 4.2.1.84)是一种能够催化腈类物质生成酰胺类物质的酶，在工业生产中有广泛的应用。烟酰胺是一种重要的药物和杀虫剂合成中间体，在食品工业中也有广泛的应用。
目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成烟酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，需要100h，并且生产效率不高，只有162g/(L·h)。
目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/L。
发明内容
本发明将旨在缩短微生物发酵生产烟酰胺时的菌体生长周期并提高产物浓度。
为此，本发明提供了一种以高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，包括以下步骤：
(1)接种：向装液量为40％～42％的发酵罐中，以接种量6～8％接入E.coilBL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G的种子培养液，设置初始pH为6.8～7.2，培养温度为36～37℃，初始转速180～200r/min，通气量为4.8～5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在28～30％；
(2)补料：在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.18～0.2h-1进行指数流加补料培养基；
(3)诱导：当OD600达到58～62时，调整温度为28～30℃，以0.20～0.22g/(L·h)的恒速流加140～150mL的诱导剂；
(4)合成烟酰胺：调整温度为25～28℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD600＝150～160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。
在本发明的一种实施方式中，整个发酵过程中，控制pH为6.8～7.2。
在本发明的一种实施方式中，整个发酵过程中通过流加25％的氨水调节pH，使罐内pH始终维持在6.8～7.2。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)，向装液量为40％的发酵罐中，以接种量6％接入种子培养基，设置初始pH为7，培养温度为37℃，初始转速200r/min，通气量为5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在30％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)，在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.2h-1进行指数流加补料培养基。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，当OD600达到60时，调整温度为30℃，以0.22g/(L·h)的恒速流加150mL的诱导剂。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)，调整温度为28～30℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD600＝160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。
在本发明的一种实施方式中，采用5L Winpact全自动发酵罐。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基(g/L)：葡萄糖12.0，磷酸二氢钾13.5，磷酸氢二铵4.0，柠檬酸1.7，硫酸镁1.68，微量元素10mL；微量元素(g/100mL)：七水硫酸亚铁1.0，七水硫酸锌0.525，五水硫酸铜0.3，四水硫酸锰0.05，硼砂0.023，氯化钙0.2，钼酸铵0.01。
在本发明的一种实施方式中，补料培养基(g/L)：葡萄糖500.0，硫酸镁7.33，酵母提取物4.0，胰蛋白胨4.0。
在本发明的一种实施方式中，诱导剂(g/100mL)：乳糖10.0，CoCl2·6H2O 0.8。
本发明通过建立大肠杆菌高密度发酵的方法，是菌体生长周期大大缩短，从原来原始菌的100h缩短到现在的48h，时间缩短52％；在现有的催化工艺基础上，催化得到的产物浓度比现有重组菌提高110.8％，达到506g/L；生产效率与原始红球菌比较提高212％，达到508g/(L·h)。
附图说明
图1BAG 5L发酵罐分批补料培养时细胞密度、葡萄糖含量以及发酵液酶活变化情况。
图2高密度BAG(OD600＝160.0)催化生产烟酰胺时底物烟腈与产物烟酰胺的变化情况。
具体实施方式
菌株与质粒
基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G，该菌构建方法参见申请号为CN201510244547.0，公开号为CN104830747A，发明名称为一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用的专利申请材料。
培养基
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0。
5L发酵罐培养基(g/L)：葡萄糖12.0，磷酸二氢钾13.5，磷酸氢二铵4.0，柠檬酸1.7，硫酸镁1.68，微量元素10mL。
补料培养基(g/L)：葡萄糖500.0，硫酸镁7.33，酵母提取物4.0，胰蛋白胨4.0；
诱导剂(g/100mL)：乳糖10.0，CoCl2·6H2O 0.8。
微量元素(g/100mL)：七水硫酸亚铁1.0，七水硫酸锌0.525，五水硫酸铜0.3，四水硫酸锰0.05，硼砂0.023，氯化钙0.2，钼酸铵0.01。
细胞密度：UV-1800PC型紫外可见分光光度计测量OD600，根据吸光值和OD的关系换算，换算关系：1g/L＝0.3683OD600。
葡萄糖浓度：使用SBA-40E生物传感分析仪测定葡萄糖浓度。
发酵液酶活：将100μL，OD600＝1.0的菌体(磷酸缓冲液溶解)加入400μL，125mmol/L烟腈溶液中，25℃反应10min，500μL乙腈终止反应，加入终止液后立即在4℃，12000r/min条件下离心1min，吸取上清。反应液经0.22μm微孔滤膜过滤，载入C18色谱柱进行HPLC分析，流动相为乙腈水(乙腈：水＝1:2)的混合溶液。烟腈与烟酰胺测定方法：流动相为乙腈水(乙腈：水＝1:2)的混合溶液，流速0.6mL/min，吸光值215nm，采集时间12min。
实施例1
(1)重组型基因工程菌的高密度发酵
种子培养：从-80℃冰箱中取出保存的甘油管，吸取200μL菌液接种于30mL含有50μg/mL卡那青霉素抗性的LB培养基中，置于37℃的恒温摇床中200r/min培养7.5h。
发酵罐培养：采用5L Winpact全自动发酵罐，初始装液量为2L。设置初始pH为7，培养温度为37℃，初始转速200r/min，通气量为5L/min。将上步所得的种子液以6％的接种量接入发酵罐中，同时加入卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在30％，在接种5-6h后出现溶氧反弹现象，此时以比生长速率μ＝0.2h-1进行指数流加补料培养基。每隔2-3h取样一次并测定罐内细胞密度、葡萄糖浓度、乙酸浓度以及细胞酶活。整个发酵过程中通过流加25％的氨水调节pH，使罐内pH始终维持在7左右，当OD600达到60左右时，改变温度为30℃，以0.22g/(L·h)的恒速流加150mL的诱导剂。
(2)烟腈底物分批补料细胞催化工艺
烟腈固体粉末以0.4mol/L(41.64g/L)的终浓度加入到30mL，OD600＝160.0的菌液中并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物，定期取样并测定产物的积累量，体系温度维持在25-28℃范围。
(3)结果
如图1所示，菌体在48h时生物量达到最大值，为73.97gDCW/L(OD600＝200)；单位发酵液酶活在44h左右最高，为2813U/mL。发酵液酶活定义为在26℃条件下，1位体mL发酵液1min可以催化生成的烟酰胺的物质的量。
如图2所示，产物浓度在1h即达到508g/L，生产效率为508g/(L·h)，比红球菌J1的146.4g/(L·h)高247％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种以高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种：向装液量为40％～42％的发酵罐中，以接种量6～8％接入E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G的种子培养液，设置初始pH为6.8～7.2，培养温度为36～37℃，初始转速180～200r/min，通气量为4.8～5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在28～30％；
(2)补料：在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.18～0.2h-1进行指数流加补料培养基；
(3)诱导：当OD600达到58～62时，调整温度为28～30℃，以0.20～0.22g/(L·h)的恒速流加140～150mL的诱导剂；
(4)合成烟酰胺：调整温度为25～28℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD600＝150～160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，整个发酵过程中，控制pH为6.8～7.2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，整个发酵过程中通过流加25％的氨水调节pH，使罐内pH始终维持在6.8～7.2。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)，向装液量为40％的发酵罐中，以接种量6％接入种子培养基，设置初始pH为7，培养温度为37℃，初始转速200r/min，通气量为5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在30％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)，在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.2h-1进行指数流加补料培养基。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)，当OD600达到60时，调整温度为30℃，以0.22g/(L·h)的恒速流加150mL的诱导剂。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)，调整温度为28～30℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD600＝160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基按g/L计：葡萄糖12.0，磷酸二氢钾13.5，磷酸氢二铵4.0，柠檬酸1.7，硫酸镁1.68，微量元素10mL；微量元素按g/100mL计：七水硫酸亚铁1.0，七水硫酸锌0.525，五水硫酸铜0.3，四水硫酸锰0.05，硼砂0.023，氯化钙0.2，钼酸铵0.01。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，补料培养基按g/L计：葡萄糖500.0，硫酸镁7.33，酵母提取物4.0，胰蛋白胨4.0。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导剂按g/100mL计：乳糖10.0，CoCl2·6H2O 0.8。
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