CN104762338A - 一种红球菌催化生产烟酰胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化工领域，公开了一种红球菌催化合成烟酰胺的方法。本发明采用红球菌产生的产腈水合酶与底物3-氰基吡啶进行催化反应生成烟酰胺。反应过程中采用分批添加底物和催化剂的措施，提高了转化率。本发明采用新型的腈水合酶物种，操作过程简单方便，环境污染小，产物易于分离，产品纯度高，有着很好的工业应用前景。

Description

一种红球菌催化生产烟酰胺的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种红球菌催化合成烟酰胺的方法。

背景技术

烟酰胺(VB3)，又名尼克酰胺(Nicotinamide)，分子式C6H6N2O，分子量122.13，为白色针状结晶或粉末，熔点129～131℃。易溶于水、能溶于醇和甘油，不溶于醚，微毒。其结构式如下：

烟酸、烟酰胺属B族维生素，统称维生素PP，在实际应用中可等量替代，自然界的烟酸存在于肝、肾、酵母和米糠中，是生物体内脱氢辅酶I或II的组分，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。它们在医药中可用于治疗糙皮病等，还可以添加到食品和面粉中用以补充人体所需的维生素，其最大的应用领域是用作饲料添加剂。

工业上，烟酰胺、烟酸主要是以吡啶类化合物为原料生产的，世界烟酰胺、烟酸的生产主要集中在西欧和美国，日本也有少量生产。全球烟酰胺、烟酸主要生产国有瑞士、比利时、美国、日本及中国等。主要生产厂家有瑞士龙沙(1.5万t/a)、比利时德固赛、美国Reilly、日本Yuyigosei公司以及美国内贝塔公司等。国内生产厂家受原料进口限制，生产规模普遍较小，主要有广州龙沙(属于瑞士龙沙)、江苏南通醋酸化工、浙江新昌制药厂等。我国烟酸、烟酞胺的产量很少，只用于制药工业，饲料工业中大量所需的烟酸、烟酞胺主要依赖进口。因此，开发和建设具有一定经济规模的烟酸、烟酰胺生产装置，不仅有很大的市场空间，还有巨大的社会意义。

烟酰胺、烟酸的合成工艺有化学合成法和生物催化法两种。化学合成法主要有对3-甲基吡啶(PIC)进行氨氧化得到3-氰基吡啶(NSN)，3-氰基吡啶经水解得到烟酰胺或烟酸。生化法主要工艺为：采用腈水合酶的固定化细胞将3-氰基吡啶水解为烟酰胺。

近年来，国内对产腈水合酶生物催化合成烟酰胺进行了较深入的研究及部分的工业化应用。主要有上海农药所，浙江工业大学，清华大学和中科院生命有机化学国家重点实验室等。其中上海农药所成功开发出了烟腈微生物催化为烟酰胺技术，并与浙江医药股份有限公司合作建立了规模化的烟酰胺生产装置。瑞士龙沙股份有限公司采用固定化的红球菌属rhodochrous微生物进行3-氰基吡啶的催化水合反应，并取得的一定的成果。上述专利均采用生化法，以3-氰基吡啶为底物，以产腈水合酶为生物催化剂进行水合反应。以上传统生物催化剂虽取得了一定的成果，不足之处在于产物浓度较低。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术的不足，提供一种新的红球菌进行生物催化生产烟酰胺；后处理方便，产品纯度高。

本发明采用的技术方案如下：

一种红球菌催化合成烟酰胺的方法，其特征在于，利用红球菌产生的腈水合酶与底物3-氰基吡啶进行催化反应合成烟酰胺，其合成工艺如下：以3-氰基吡啶为底物，以红球菌为生物催化剂在温度10～40℃，搅拌转速60～600rpm下进行催化水合得到烟酰胺。

所述的红球菌催化合成烟酰胺的方法，其特征在于该方法包含下列步骤：

 (1) 红球菌生物催化剂的制备：

向三角瓶A中装入20%-80%的种子培养基，灭菌后接入1-10%的红球菌菌种，在20-40℃下，以60-300rpm的转速搅拌震荡培养24-72h，向三角瓶B中装入20%-80%的发酵培养基，消毒后接入1-10%的种子液，在通气量0.1-0.5V.V.M；压力0.01-0.05MPa；搅拌转速：60-300rpm；温度：20-40℃，光照强度：3000Lx下发酵24-120h, 即可制得红球菌的细胞发酵液，细胞发酵液再进行离心分离，收集沉淀物，所得到的沉淀物以1:（9-11）的质量比加去离子水进行稀释，得到的悬浊液为生物催化剂液，备用；

种子培养基配方: 5-20%葡萄糖，0.5-5%酵母膏，0.05-0.5%NaCl，0.05-0.3%K2HPO4，0.01-0.03%MgSO4，0.1-1%尿素、0.01-0.03%钼酸铵，pH 7.0-7.5；

发酵培养基配方：5-30%葡萄糖，0.5-5%酵母膏，0.1-1%尿素，0.03-0.3%K2HPO4，0.01-0.1%MgSO4，0.1-0.2%CaCl2，0.01-0.04%硫酸锌，pH 6.5-7.5；

 (2) 产腈水合酶的催化反应

   在反应釜中，先添加容器量的30-40%的去离子水，调pH到7.0，采用分批加料的方式先向反应釜中首次添加底物 3-氰基吡啶和生物催化剂液，在20-40℃，50-300rpm的搅拌速度下进行生物催化转化反应，每1-2小时对反应液中的3-氰基吡啶浓度进行检测，当浓度低于0.5g/L时，同时开始补加底物和生物催化剂液，补加的量与起始量一致，底物烟腈反应一定时间后，用HPLC法测定转化液中烟腈残留量,当烟腈残留量接近零时，即为生物催化反应的终点，所述的3-氰基吡啶和生物催化剂液的每批添加质量比为（9-11）：1；

 (3) 纯化处理

将转化液置于1-4℃的冷冻环境下保持2h以上，产物烟酰胺在低温下逐渐出现大量结晶体，将结晶体和水的混合液通过冷冻离心进行分离后将结晶体在40-60℃下进行真空干燥，最终制得烟酰胺成品。

本发明相对现有技术的具有下列特点：

本发明提供的红球菌产腈水合酶的总酶活力高，是生化法合成烟酰胺的一种优良菌种之一。同时本发明采用底物和产腈水合酶分批加料的方式多次补加，提高的生化反应的酶活性及产物收率，减少了浓缩处理，简便了后期的分离提纯的工艺。

具体实施方式

实施例1  一种红球菌催化合成烟酰胺的方法，包括以下步骤：

（1）、生物催化剂制备

向1L三角瓶A中装入60%的种子培养基，灭菌后接入5%的菌种，在30℃下搅拌（120rpm）震荡培养72h。向1L三角瓶B中装入60%的发酵培养基，消毒后接入6%的种子液进行发酵，在通气量0.5；压力0.05MPa；搅拌转速：120rpm；温度：30℃，光照强度：3000Lx下发酵72h进行离心分离，收集离心分离后的沉淀物，备用，

其中，每升种子培养基含有下列质量的组分（g ）：葡萄糖15，酵母膏2，尿素0.6，K₂HPO₄0.15，MgSO₄0.03，NaCl0.15，钼酸铵0.02，用浓度为3%的HCl调 pH =7.5,

每升发酵培养基含有下列质量的组分（g ）：葡萄糖15，酵母膏3，尿素0.6，K₂HPO₄0.15，MgSO₄0.03，CaCl₂0.15，硫酸锌0.02，用浓度为3%的 HCl调pH 7.0，

  （2）离心分离后的沉淀物以1：10的质量比加去离子水进行稀释，得到的悬浊液为生物催化剂液，向1L反应釜加350ml去离子水，调pH到7.0，温度为30℃，向反应釜中添加50g 3-氰基吡啶，5g 生物催化剂液，每隔1.5小时对反应液中的3-氰基吡啶浓度进行检测，当浓度低于0.5g/L后同时开始补加底物和生物催化剂，补加的量与起始量一致，连续补加10次。第十次补加完反应5h后检测反应液中3-氰基吡啶的浓度，当底物浓度小于0.02g/L时即可终止反应。将反应液于3000rpm离心20min，取上清液在0℃下冷冻结晶3h，待产物烟酰胺结晶结束后通过冷冻离心分离，分离后将结晶体在60-100℃下真空干燥，最终制得的高纯度的烟酰胺。烟酰胺纯度为98.2％，烟酰胺质量为833g，收率达90.9％。

实施例2

本实施例保持反应条件及参数均与实施例1一致，仅改变底物和生物催化剂的加料次数，考察加料次数对该催化反应的影响。其余本实施例中先向反应釜中添加100g 3-氰基吡啶，10g生物催化剂。当浓度低于0.5g/L时开始补加，补加的量与起始量一致，连续补加5次。第五次补加完反应5h后检测反应液中3-氰基吡啶的浓度，当底物浓度小于0.02g/L时即可终止反应。将反应液于3000rpm离心20min，取上清液在0℃下冷冻结晶3h，待产物烟酰胺结晶结束后通过冷冻离心分离，分离后将结晶体在60-100℃下真空干燥，最终制得的高纯度的烟酰胺。烟酰胺纯度为98.0％，烟酰胺质量为822g，收率达89.5％。

Claims (2)

1.一种红球菌催化合成烟酰胺的方法，其特征在于，利用红球菌产生的腈水合酶与底物3-氰基吡啶进行催化反应合成烟酰胺，其合成工艺如下：以3-氰基吡啶为底物，以红球菌为生物催化剂在温度10～40℃，搅拌转速60～600rpm下进行催化水合得到烟酰胺。

2.根据权利要求1所述的红球菌催化合成烟酰胺的方法，其特征在于该方法包含下列步骤：

   (1) 红球菌生物催化剂的制备：

向三角瓶A中装入20%-80%的种子培养基，灭菌后接入1-10%的红球菌菌种，在20-40℃下，以60-300rpm的转速搅拌震荡培养24-72h，向三角瓶B中装入20%-80%的发酵培养基，消毒后接入1-10%的种子液，在通气量0.1-0.5V.V.M；压力0.01-0.05MPa；搅拌转速：60-300rpm；温度：20-40℃，光照强度：3000Lx下发酵24-120h, 即可制得红球菌的细胞发酵液，细胞发酵液再进行离心分离，收集沉淀物，所得到的沉淀物以1:（9-11）的质量比加去离子水进行稀释，得到的悬浊液为生物催化剂液，备用；

种子培养基配方: 5-20%葡萄糖，0.5-5%酵母膏，0.05-0.5%NaCl，0.05-0.3%K2HPO4，0.01-0.03%MgSO4，0.1-1%尿素、0.01-0.03%钼酸铵，pH 7.0-7.5；

发酵培养基配方：5-30%葡萄糖，0.5-5%酵母膏，0.1-1%尿素，0.03-0.3%K2HPO4，0.01-0.1%MgSO4，0.1-0.2%CaCl2，0.01-0.04%硫酸锌，pH 6.5-7.5；

 (2) 产腈水合酶的催化反应

   在反应釜中，先添加容器量的30-40%的去离子水，调pH到7.0，采用分批加料的方式先向反应釜中首次添加底物 3-氰基吡啶和生物催化剂液，在20-40℃，50-300rpm的搅拌速度下进行生物催化转化反应，每1-2小时对反应液中的3-氰基吡啶浓度进行检测，当浓度低于0.5g/L时，同时开始补加底物和生物催化剂液，补加的量与起始量一致，底物烟腈反应一定时间后，用HPLC法测定转化液中烟腈残留量,当烟腈残留量接近零时，即为生物催化反应的终点，所述的3-氰基吡啶和生物催化剂液的每批添加质量比为（9-11）：1；

 (3) 纯化处理

将转化液置于1-4℃的冷冻环境下保持2h以上，产物烟酰胺在低温下逐渐出现大量结晶体，将结晶体和水的混合液通过冷冻离心进行分离后将结晶体在40-60℃下进行真空干燥，最终制得烟酰胺。