CN101250485A - 一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法 - Google Patents

Abstract

一种采用调节通风量控制溶液溶解氧浓度，从而提高里氏木霉(Trichodermareesei)纤维素酶产率的方法。其特征在于产酶过程中调节通风量，使产酶主要阶段溶解氧浓度控制在20％～30％，不但使得产酶液溶解氧浓度不低于临界浓度，而且降低了尾气中二氧化碳浓度，有利于菌体生长。采用这种方法产酶，与固定通风量产酶相比较，滤纸酶活可提高30％，产酶时间可缩短14％。

Description

一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法

一、技术领域

本发明属于生物化学中微生物培养技术领域，特别涉及一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法。

二、背景技术

随着世界石油储备的日益枯竭，乙醇已成为最重要的液体燃料的可选替代物之一。大力开发新的可再生能源，是中国在21世纪保持可持续发展的前提条件。乙醇是通过糖类发酵产生的可再生能源，传统的乙醇发酵是以粮食为原料，但长期依靠粮食生产燃料乙醇变得越来越不现实，地球上最丰富的可再生资源——植物纤维素将是未来生产乙醇的最佳原料。纤维素是由β-1，4-糖苷键连接而成的线性高分子聚合物，其降解成为单糖是进而发酵制取乙醇的关键，这一步需要被称作糖基水解酶的纤维素酶来完成。

纤维素酶是一种复合酶，主要有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成，三种组分协同作用可将纤维素大分子降解为葡萄糖。微生物特别是真菌具有产生这种复合酶的能力，其中产酶活力较强的有木霉、曲霉、根霉和青霉等，尤以木霉属菌种居多。目前，研究得最多的是里氏木霉(Trichodermareesei)，它具有降解纤维素和半纤维素的完全酶系，能产生8种不同的纤维素酶组分。但是，里氏木霉的纤维素酶产率不高，如何提高其纤维素酶产率，一直是科技工作者关注的难题。

里氏木霉是一种需氧微生物，氧是其生长的限制性因素之一。在临界溶解氧浓度以下，溶解氧浓度越低，生长速率越慢。然而，在超过某一极限值后，溶解氧对微生物生长也有毒害和抑制作用。

产酶液中的溶解二氧化碳既是代谢产物，又是合成基本化合物必需的底物。二氧化碳易溶于水，溶解二氧化碳浓度过低对微生物生长有不利的影响，过高对微生物生长有抑制作用，微生物细胞膜脂质双层被溶解二氧化碳疏水分子的占位增加，引起运输功能和穿过膜的流出物的降低。因此，在适宜的溶解二氧化碳浓度时，才能获得最大的生长速率。

到目前为止，寻找合适的提高纤维素酶产量的里氏木霉培养参数和条件，是国内外同行的重要研究方向。

三、发明内容

技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法，该方法应可同时控制溶解氧和溶解二氧化碳的浓度，从而提高纤维素酶的产率。

通风量对溶解氧浓度和溶解二氧化碳浓度都有很强的影响。通常耗氧量大时才需要增加通风量，而此时菌株呼出的二氧化碳量也较高，增加通风量正好能同时降低溶解二氧化碳的浓度。因此，可通过调节通风量的方法控制溶解氧浓度，并同时控制溶解二氧化碳浓度。如果能通过控制通风量将溶解氧和溶解二氧化碳浓度控制在适宜于菌丝生长的水平，就可以提高纤维素酶的产率。

本发明的技术解决方案为：一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法，培养步骤为：

a.里氏木霉液体活化培养基的配制，其中：葡萄糖0.1g/L，蛋白胨1g/L，占总培养液体积0.1％的Mandels微量元素，占总培养液体积10％的Mandels营养盐，占总培养液体积5％的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液，溶剂为水；

b.里氏木霉产酶培养液的配制，其中：葡萄糖1g/L，硫酸盐纸浆10g/L，硫酸铵2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，占总培养液体积的0.1％的Mandels微量元素，溶剂为水；

c.将里氏木霉菌种接入液体活化培养基，在26～32℃、150～250r/min的恒温振荡器中培养28～40h得种子液；

d.按种子液：产酶培养液的体积比为1∶10的接种量接种，通风培养制备纤维素酶，控制发酵罐中的溶解氧浓度，发酵搅拌速度为200～400r/min，培养温度控制为26～32℃，加1％氢氧化钠或1％硫酸控制pH值至4.5～5.0，培养60～85h；

其特征在于用调整通风量的方法控制发酵罐中溶解氧浓度为20％～30％。

选择优良产酶菌株里氏木霉作为纤维素酶产酶菌，在反应初期，微生物菌丝量少，需氧量少，呼出的二氧化碳量少，溶解氧浓度较高，很难也不必降到20％～30％，通风量可控制在较低的水平。微生物进入对数生长期后，菌丝会大量耗氧，溶解氧浓度快速下降，此时控制好溶解氧浓度至关重要，应及时调节通风量使溶解氧浓度控制在20％～30％的水平。在此后的产酶过程中，溶解氧浓度低于临界浓度(一般认为临界溶解氧浓度为20％)时，菌丝摄氧不足，生长受到抑制；溶解氧浓度过高时，不仅氧对菌丝有不利的影响，而且高通风量既浪费能量，又降低了尾气中的二氧化碳量。尾气中二氧化碳量低，溶液中溶解二氧化碳浓度就低，不利于菌丝生长和代谢。因此，调节通风量控制溶解氧浓度至20％～30％，可同时满足菌丝对氧和二氧化碳的需求。

有益效果：采用本技术方案培养里氏木霉所生产得到的纤维素酶，与固定通风量培养里氏木霉所产酶相比较，滤纸酶活可提高30％，产酶时间可缩短14％。

四、附图说明

图1为固定通风量产酶时，尾气中氧和二氧化碳浓度随时间的变化。

图2为固定通风量产酶时，溶液中溶解氧浓度随时间的变化。

图3为调节通风量控制溶氧浓度为20％～30％产酶时，尾气中氧和二氧化碳浓度随时间的变化。

图4为调节通风量控制溶氧浓度为20％～30％产酶时，溶液中溶解氧浓度与通风量的关系变化曲线。

图5为固定通风量和调节通风量产酶时，滤纸酶活随培养时间变化情况的比较。

五、具体实施方式

实施例1：里氏木霉固定通风量产纤维素酶

里氏木霉液体活化培养基为：6g葡萄糖，0.6g蛋白胨，0.6mL的Mandels微量元素，60mL Mandels营养盐，30mL浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液，加入510mL蒸馏水，分装在锥形瓶中灭菌。

里氏木霉产酶培养基为：葡萄糖6g，硫酸盐纸浆60g(干重)，硫酸铵13.2g，尿素3g，磷酸二氢钾12g，氯化钙1.8g，硫酸镁1.8g，6mL的Mandels微量元素，加水至总液量为6L，升温至100℃灭菌。

将里氏木霉菌种接入50mL液体活化培养基，在26～32℃、150～250r/min的恒温振荡器中培养36h，按1∶10接入10L发酵罐，装液量为6L，通风培养制备纤维素酶。固定通风量为20vvh(1vvh为每h每L发酵液通1L空气)，搅拌速度为200～400r/min，培养温度控制为26～32℃，加1％氢氧化钠或1％硫酸控制pH值至4.5～5.0。

产酶过程中测得尾气中氧气和二氧化碳浓度如附图1所示。反应中期尾气中二氧化碳浓度较高，达0.8％以上，是空气中二氧化碳平均浓度的近30倍，对菌丝生长产生不利的影响。

溶液中溶解氧浓度如附图2所示。23～45h期间溶解氧浓度低于临界溶解氧浓度(一般认为临界溶解氧浓度为20％)，菌丝摄氧困难，不利于菌丝生长代谢。

在固定通风量条件下产酶84h，纤维素酶滤纸酶活为2.7IU/mL。

实施例2：里氏木霉调节通风量产纤维素酶

除通风量外，其它条件同实施例1。开始通风量控制为10vvh，监测溶解氧浓度变化情况，当溶解氧浓度下降到20％时即增加通风量，溶解氧浓度上升到30％时即减少通风量。产酶后期溶解氧浓度会上升，应降低通风量，直至降到10vvh为止。

产酶过程中测得尾气中氧气和二氧化碳浓度如附图3所示。尾气中二氧化碳浓度最高为0.4％左右，仅为实施例1的一半，有利于菌丝的生长和代谢。

溶液中通风量的调节和溶解氧浓度如附图4所示。培养过程中调整通风量，使得溶解氧浓度在产酶主要阶段基本维持在20～30％左右，有利于菌丝对溶氧的需求。在此条件下产酶72h，纤维素酶滤纸酶活达3.5IU/mL。附图5比较了实施例1和实施例2滤纸酶活随培养时间变化的情况。实施例2调节通风量控制溶解氧浓度为20％～30％后，最高滤纸酶活为3.5IU/mL，比实施例1的2.7IU/mL提高了30％；产酶至最高酶活的时间为72h，比实施例1的84h缩短了14％。因此，调节通风量控制溶解氧浓度在20％～30％，显著提高了里氏木霉产纤维素酶的效率。

Claims (1)

1.一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法，培养步骤为：

a.里氏木霉液体活化培养基的配制，其中：葡萄糖0.1g/L，蛋白胨1g/L，占总培养液体积0.1％的Mandels微量元素，占总培养液体积10％的Mandels营养盐，占总培养液体积5％的浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液，溶剂为水；

b.里氏木霉产酶培养液的配制，其中：葡萄糖1g/L，硫酸盐纸浆10g/L，硫酸铵2.2g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，占总培养液体积的0.1％的Mandels微量元素，溶剂为水；

c.将里氏木霉菌种接入液体活化培养基，在26～32℃、150～250r/min的恒温振荡器中培养28～40h得种子液；

d.按种子液：产酶培养液的体积比为1∶10的接种量接种，通风培养制备纤维素酶，控制发酵罐中的溶解氧浓度，发酵搅拌速度为200～400r/min，培养温度控制为26～32℃，加1％氢氧化钠或1％硫酸控制pH值至4.5～5.0，培养60～85h；

其特征在于用调整通风量的方法控制发酵罐中溶解氧浓度为20％～30％。

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