CN108410842A

CN108410842A - 一种重组菌及其在生产纤维素酶中的应用

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Publication number: CN108410842A
Application number: CN201710075958.0A
Authority: CN
Inventors: 董志扬; 林洁; 陈秀珍; 张吓妹; 黄振邦; 秦丽娜
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2037-02-10
Also published as: CN108410842B

Abstract

本发明公开了一种重组菌及其在生产纤维素酶中的应用。本发明保护的重组菌是将特异DNA分子导入里氏木霉得到的。所述特异DNA分子具有gpdA启动子和透明颤菌血红蛋白的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述透明颤菌血红蛋白的编码基因的表达。本发明提供的重组菌纤维素酶产量高，与出发菌株相比，滤纸酶活力提升了54.87％，且胞外总蛋白产量也有显著提高。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于缓解能源危机和环境污染具有重要意义。

Description

一种重组菌及其在生产纤维素酶中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组菌及其在生产纤维素酶中的应用。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭，开发可持续利用的化石能源替代品尤为重要。木质纤维素生物质是地球上最为丰富的可再生资源，纤维素酶在木质纤维素资源转化中起着关键性作用，其产量和活性高低直接关系着新的生物能源开发及应用。利用纤维素酶将木质纤维素生物质降解成为寡糖和单糖，再高效转化成为化石能源的替代品-液体燃料，具有重要的战略意义。

丝状真菌里氏木霉是生产纤维素酶的主要工业菌株，具有较强的纤维素酶和半纤维素酶分泌能力，全球大约90％以上的纤维素酶产品是通过里氏木霉生成的。目前工业上主要是应用丝状真菌深层发酵技术来生产纤维素酶。影响丝状真菌深层发酵效率的一个重要瓶颈是丝状真菌发酵液非常粘稠，局部供氧不足，而且里氏木霉纤维素酶的合成是一个耗能过程，对氧的需求很大，供氧不足会直接导致纤维素酶产量降低。传统解决方法比如提高搅拌转速或者增加通气量，能耗大、成本高且不能有效解决供氧不足的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组菌及其在生产纤维素酶中的应用。

本发明提供了一种促进里氏木霉生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：向里氏木霉中导入特异DNA分子，从而促进里氏木霉生产纤维素酶；所述特异DNA分子中具有gpdA启动子和透明颤菌血红蛋白的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述透明颤菌血红蛋白的编码基因的表达。

本发明还保护一种提高里氏木霉生产纤维素酶的产量方法，包括如下步骤：向里氏木霉中导入特异DNA分子，从而提高里氏木霉生产纤维素酶的产量；所述特异DNA分子中具有gpdA启动子和透明颤菌血红蛋白的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述透明颤菌血红蛋白的编码基因的表达。

本发明还保护一种特异DNA分子，具有gpdA启动子和透明颤菌血红蛋白的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述透明颤菌血红蛋白的编码基因的表达。

以上任一所述透明颤菌血红蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由序列表中序列2自5’端第1-146位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a3)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

以上任一所述透明颤菌血红蛋白的编码基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列1自5′末端第1至438位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码所述透明颤菌血红蛋白的DNA分子；

(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述透明颤菌血红蛋白的DNA分子。

本发明还保护所述特异DNA分子或含有所述特异DNA分子的重组表达载体的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)促进里氏木霉生产纤维素酶；

(c2)提高里氏木霉生产纤维素酶的产量。

所述重组表达载体具体可为通过重组克隆的方法将所述透明颤菌血红蛋白的编码基因与带有gpdA启动子的表达载体进行重组得到的重组表达载体。

所述重组表达载体具体可为通过重组克隆的方法将所述透明颤菌血红蛋白的编码基因与pNOM102质粒进行重组得到的重组表达载体。

本发明还保护一种重组菌，是将所述特异DNA分子导入里氏木霉得到的。

所述重组菌的制备方法包括如下步骤：

(d1)将所述特异DNA分子加至里氏木霉原生质体溶液中，再加入PEG 4000溶液，冰浴30min；

(d2)向步骤(d1)得到的混合溶液中加入PEG 4000溶液，室温放置20min；

(d3)将步骤(d2)得到的混合溶液与山梨醇水溶液混合后接种至含有山梨醇的MM固体培养基培养，得到转化子；

(d4)将步骤(d3)得到的转化子接种至PDA固体培养基培养，用无菌水洗脱得到孢子悬液；

(d5)将步骤(d4)得到的孢子悬液接种至含Triton X-100的MM固体培养基培养，得到重组菌。

所述(d1)具体可为将pyr4标记基因片段与特异DNA分子一起加至里氏木霉原生质体溶液中再加入PEG 4000溶液，冰浴30min。

所述pyr4标记基因片段与特异DNA分子的摩尔比具体可为1∶4。

所述pyr4标记基因片段具体可如序列表的序列4所示。

所述pyr4标记基因片段、特异DNA分子和里氏木霉原生质体溶液的配比具体可为1摩尔：4摩尔：0.2mL。所述里氏木霉原生质体溶液中原生质体的浓度具体可为4×10⁷-8×10⁷个/mL。

所述(d1)中，所述PEG 4000溶液具体可为50％(体积百分比)PEG 4000溶液。所述PEG 4000溶液和所述原生质体溶液的配比关系具体可为为0.2mL∶50μL。

所述(d2)中，所述PEG 4000溶液具体可为50％(体积百分比)PEG 4000溶液。所述PEG 4000溶液和所述原生质体溶液的配比关系为具体可为0.2mL∶1mL。

所述(d3)中，所述山梨醇水溶液中山梨醇的浓度具体可为1.0M。所述含有山梨醇的MM固体培养基中的山梨醇的终浓度具体可为1.0M。所述培养温度具体可为30℃。所述培养时间具体可为5天。

所述(d4)中，所述培养温度具体可为30℃。所述培养时间具体可为5天。所述孢子悬液的浓度具体可为10⁷个/mL。

所述(d5)具体可为将(d4)得到的孢子悬液稀释10³-10⁶倍后接种至含Triton X-100的MM固体培养基培养，得到重组菌。所述含有Triton X-100的MM固体培养基中TritonX-100的体积百分含量具体可为0.1％。所述培养度具体可为30℃。所述培养时间具体可为5天。

所述里氏木霉原生质体溶液的制备方法包括如下步骤：

(e1)将里氏木霉接种至产孢培养基中培养，得到孢子悬液；

(e2)将步骤(e2)得到的孢子悬液接种至MM液体培养基中培养，离心收集菌体沉淀；

(e3)将步骤(e2)得到的菌体沉淀用无菌水洗涤3次，用硫酸镁水溶液洗涤1次。

(e4)采用裂解液将步骤(e3)处理后的菌体沉淀重悬进行裂解反应，反应结束后收集原生质体沉淀；

(e5)将步骤(e4)得到的原生质体沉淀用山梨醇水溶液重悬，得到原生质体溶液。

所述(e1)中，所述产孢培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在产孢培养基中的浓度为马铃薯200g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉20g/L；所述溶剂为水。

所述(e1)中，所述孢子悬液的浓度为10⁷-10⁸个/mL。

所述(e2)中，所述孢子悬液和MM液体培养基的体积比为1∶20。所述培养的条件具体可为200rpm、28℃。所述培养的时间具体可为14小时。

所述(e3)中，所述硫酸镁水溶液中硫酸镁的浓度为1.2M。

所述(e4)中，所述裂解液由溶壁酶、纤维素酶的硫酸镁水溶液组成。所述硫酸镁水溶液中硫酸镁的浓度为1.2M。所述溶壁酶、纤维素酶和硫酸镁水溶液的配比关系具体可为150mg∶15mg∶15mL。

所述(e4)中，所述裂解反应的反应温度具体可为30℃。所述裂解反应的反应时间具体可为1.5小时。所述裂解反应结束时采用山梨醇水溶液终止反应。所述山梨醇水溶液中山梨醇的浓度为0.6M。

所述(e4)中，收集原生质体沉淀的方法为取反应体系，用200目筛子过滤除去残余的菌丝，将滤液室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。

所述(e5)中，所述山梨醇水溶液中山梨醇的浓度为1.0M。

本发明还保护以上任一所述重组菌在制备纤维素酶中的应用。

本发明还保护一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：培养以上任一所述的重组菌，得到纤维素酶。

以上任一所述gpdA启动子具体可为序列表的序列3自5′末端第27至2336位核苷酸所示的DNA分子。

以上任一所述特异DNA分子还包括TrpC终止子。

所述TrpC终止子具体可为序列表的序列3自5′末端第2796至3558位核苷酸所示的DNA分子。

以上任一所述特异DNA分子具体可如序列表的序列3所示。

以上任一所述里氏木霉具体可为里氏木霉Tu6。

本发明提供了一种重组菌，是将透明颤菌血红蛋白VHb蛋白的编码基因导入里氏木霉中得到的。本发明提供的重组菌纤维素酶产量高，与出发菌株相比，滤纸酶活力提升了54.87％，且胞外总蛋白产量也有显著提高。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于缓解能源危机和环境污染具有重要意义。

附图说明

图1为pNOM102-VHb质粒示意图。

图2为重组菌Tu6-vgb⁺的PCR扩增产物示意图。

图3为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6的PCR扩增产物电泳结果图。

图4为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6胞内蛋白提取液Western blot检测结果。

图5为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6的VHb活性检测结果。

图6为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6的培养基中的葡萄糖含量检测结果。

图7为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6的菌丝体重量(生物量)检测结果。

图8为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6胞外蛋白SDS-PAGE检测结果。

图9为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6胞外蛋白浓度统计结果。

图10为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6滤纸酶活统计结果。

图11为重组菌Tu6-vgb⁺和里氏木霉Tu6羧甲基纤维素钠酶活统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pNOM102质粒：参考文献：Punt PJ，Dingemanse M A，Kuyvenhoven A，etal.Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulansgpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.[J].Gene，1990，93(1)：101-9.；公众可从中国科学院微生物研究所获得。

pSK-pyr4质粒：在发明专利：一种高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备方法及其应用中公开(申请号：201510684461.X)；参考文献Qin L N，Cai F R，Dong XR，et al.Improved production of heterologous lipase in Trichoderma reesei byRNAi mediated gene silencing of an endogenic highly expressed gene[J].Bioresource technology，2012，109：116-122.；公众可从中国科学院微生物研究所获得。

里氏木霉Tu6：ATCC，编号：MYA-256。

溶壁酶：SIGMA公司，货号：L1412-5G。

纤维素酶(CELLULASE“ONOZUKA”R-10)：日本Yakult公司，货号：130918-01。

重组克隆试剂盒：MultiS重组试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司。

产孢培养基：马铃薯200g、葡萄糖10g、琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min。

MM液体培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄ 0.06g、CaCl₂ 0.06g、FeSO₄·7H₂O 0.5mg、MnSO₄·H₂O 0.16mg、ZnSO₄·7H₂O 0.14mg、CoCl₂ 0.2mg，蒸馏水定容至100mL，调pH值为5.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。

MM固体培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄ 0.06g、CaCl₂ 0.06g、FeSO₄·7H₂O 0.5mg、MnSO₄·H₂O 0.16mg、ZnSO₄·7H₂O 0.14mg、CoCl₂ 0.2mg，蒸馏水定容至100mL，调pH值为5.0，琼脂粉2g，115℃高压蒸汽灭菌20min。

发酵培养基：MM液体培养基中加入1％(质量百分比)微晶纤维素。

微晶纤维素(PH-101)：SIGMA公司，货号：11365-1KG。

Western blot使用的VHb一抗：全式金公司，货号：HT501-01。

Western blot使用的HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗：全式金公司，货号：HS201-01。

以下实施例中用到的引物信息如表1所示。

表1 引物信息

引物名称	引物序列(5’-3’)
		gpd-R	GGTCTAACATTGTGATGTCTGCTCAAGCGG
trpC-F	ATCATCATCATCATCATTAAGGATCCACTTAACGTTACTG
		M13F	GTAAAACGACGGCCAGT
M13R	CAGGAAACAGCTATGACC
		TF	AAGGATTTCGGCACGGCTAC
TR	GCACTCTTTGCTGCTTGGAC

实施例1、重组菌的获得

一、重组表达载体pNOM102-VHb的构建

1、人工合成含有6个his-tag标签的vhb基因片段，如序列表的序列1所示，序列1所示的基因编码序列2所示的蛋白质。

序列表的序列2中，自N端第1-146位氨基酸残基为VHB区段，第147-152位氨基酸残基为组氨酸标签。

序列表的序列1中，自5’端第1-438位核苷酸为VEGF区段的编码基因，第439-456位核苷酸为组氨酸标签的编码序列。

2、以pNOM102质粒为模板，采用引物trpC-F和引物gpd-R进行PCR扩增，得到含有gpdA启动子和TrpC终止子的约5728bp的表达载体。

3、采用重组克隆试剂盒对步骤1得到的vhb基因片段和步骤2得到的表达载体进行重组，得到重组表达载体pNOM102-VHb。重组表达载体pNOM102-VHb示意图如图1所示。

二、里氏木霉原生质体制备

1、将里氏木霉Tu6接种至产孢培养基中培养，去离子水洗脱孢子得到孢子悬液(浓度为10⁷-10⁸个/mL)。

2、将5mL步骤1得到的孢子悬液接种至100mL MM液体培养基中，200rpm、28℃培养14小时，离心收集菌体沉淀。

3、将步骤2得到的菌体沉淀用无菌水洗涤3次，用1.2M硫酸镁水溶液洗涤1次。

4、取步骤3得到的菌体，加入15ml裂解液(在15mL 1.2M硫酸镁水溶液中加入150mg溶壁酶和15mg纤维素酶)，30℃裂解反应1.5小时，然后加入15mL 0.6M山梨醇水溶液终止反应。

5、完成步骤4后，取反应体系，用200目筛子过滤除去残余的菌丝，将滤液室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。

6、将步骤5得到的原生质体沉淀用10mL 1.0M山梨醇水溶液重悬，室温3000rpm离心10分钟，收集原生质体沉淀。

7、重复步骤6。

8、将步骤7得到的原生质体沉淀用200μL 1.0M山梨醇水溶液重悬，得到原生质体溶液(4×10⁷-8×10⁷个/mL)。

三、重组菌的制备

1、以步骤一制备的重组表达载体pNOM102-VHb为模板，采用引物M13F和引物M13R进行扩增，得到PCR产物，将PCR产物进行核酸沉淀，得到vhb表达片段，vhb表达片段如序列表的序列3所示。

序列3中，自5’端第27-2336位核苷酸为gpdA启动子区段，第2337-2795位核苷酸为vhb基因区段，第2796-3558位核苷酸为TrpC终止子区段。

2、以pSK-pyr4质粒为模板，采用引物M13F和引物M13R进行扩增，得到PCR产物，将PCR产物进行核酸沉淀，得到pyr4标记基因片段，pyr4标记基因片段如序列表的序列4所示。

3、将步骤1得到4摩尔的vhb表达片段和1摩尔的步骤2得到的pyr4标记基因片段混合后加入至0.2mL步骤二得到的原生质体溶液中，再加入50μL 50％(体积百分比)PEG 4000溶液，冰浴30min。

4、向步骤3得到的混合溶液中加入1mL 50％(体积百分比)PEG 4000溶液，室温放置20min。

5、向步骤4得到的混合溶液中加入1mL 1.0M山梨醇水溶液。

6、取0.5mL步骤5得到混合溶液，与4mL1.0M山梨醇水溶液混合后铺于含1.0M山梨醇的MM固体培养基上，30℃恒温培养箱培养5天，得到转化子。

7、将步骤6得到的转化子接种至PDA固体培养基上，30℃恒温培养箱培养5天，用无菌水洗脱培养基上的孢子，得到孢子悬液(浓度为10⁷个/mL)，将梯度稀释10³-10⁶倍的孢子悬液涂布与含0.1％(体积百分比)Triton X-100的MM固体培养基上，30℃恒温培养箱培养5天，挑取单个菌落，得到重组菌，命名为重组菌Tu6-vgb⁺。

8、取里氏木霉Tu6和步骤7得到的重组菌Tu6-vgb⁺，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物TF和引物TR进行PCR鉴定。鉴定结果如图2和图3所示。图2为重组菌Tu6-vgb⁺扩增产物(1883bp)示意图。图3为电泳结果图。图3中，泳道1为重组菌Tu6-vgb⁺扩增产物的电泳结果，泳道2为里氏木霉Tu6扩增产物的电泳结果，将泳道1得到的特异性条带回收并测序，测序结果表明，特异性条带长度为1883bp，如序列表序列3自5’端第1060-2942位所示。结果表明，重组菌Tu6-vgb⁺为阳性重组菌。

9、以pNOM102质粒为模板，采用引物M13F和引物M13R进行扩增，得到PCR产物，将PCR产物进行核酸沉淀。

10、采用步骤9处理后的DNA片段替代vhb表达片段，按照步骤3-7进行操作，得到对照重组菌。

四、重组菌Tu6-vgb⁺的VHb蛋白表达鉴定

待测菌株为：里氏木霉Tu6、重组菌Tu6-vgb⁺和对照重组菌。

1、将待测菌株接种至产孢培养基中培养，去离子水洗脱孢子得到孢子悬液(浓度为约10⁷个/mL)。

2、将1mL孢子悬液接种至50mL含有2％(质量百分比)葡萄糖的MM液体培养基中，200rpm、28℃培养48小时，无菌纱布过滤收集菌丝体。

3、将步骤2得到的菌丝体沉淀加液氮研磨，然后使用30mL 50mM、pH7.0的磷酸钾缓冲液重悬菌体，8000rpm离心40min，取上清(即为胞内蛋白提取液)。

4、取步骤3得到的胞内蛋白提取液进行Western blot检测。

结果如图4所示。图4中，泳道1为里氏木霉Tu6检测结果，泳道2为重组菌Tu6-vgb+检测结果。结果表明，重组菌Tu6-vgb⁺在17kDa左右有明显特异条带而里氏木霉Tu6没有特异条带，说明VHb蛋白在重组菌Tu6-vgb⁺中成功表达。对照重组菌也没有特异条带产生。

5、取2mL步骤3得到的胞内蛋白提取液，加入20mg连二亚硫酸钠，通CO气体5min，通过分光光度计光谱扫描测定VHb活性。

结果如图5所示。结果表明，重组菌Tu6-vgb⁺胞内蛋白提取液在419nm波长处有特征吸收峰而里氏木霉Tu6没有，说明vhb基因在里氏木霉中成功表达且能在胞内行使正常功能。对照重组菌在419nm波长处没有特征吸收峰。

实施例2、重组菌的发酵应用

待测菌株：里氏木霉Tu6、重组菌Tu6-vgb⁺和对照重组菌。

1、用去离子水悬浮待测菌株的孢子，得到孢子悬液(浓度为10⁷个/mL)。

2、将4mL步骤1得到的孢子悬液接种至400mL含有2％(质量百分比)葡萄糖的MM液体培养基中，200rpm、28℃培养，在发酵培养的第24h、36h、40h、44h、48h、52h、56h和66h时采用生物传感分析仪检测培养基中的葡萄糖含量。

结果如图6所示。图6中，纵坐标为每mL培养基中的葡萄糖含量(mg)。结果表明，在含葡萄糖的培养基中重组菌Tu6-vgb⁺耗糖速度明显比里氏木霉Tu6快。对照重组菌与里氏木霉Tu6的耗糖速度无显著性差异。

3、将4mL步骤1得到的孢子悬液接种至400mL含有2％(质量百分比)葡萄糖的MM液体培养基中，200rpm、28℃培养，在发酵培养的第24h、35h、40h、44h、52h、60h、和72h时，将发酵液离心收集菌丝体，测定菌丝体重量(生物量)。

结果如图7所示。图7中，纵坐标为每L发酵液得到的菌丝体重量(g)。结果表明，在含葡萄糖的培养基中重组菌Tu6-vgb⁺生长速度明显高于里氏木霉Tu6。对照重组菌与里氏木霉Tu6的生长速度有显著性差异。

综合步骤2和步骤3的结果表明，重组菌Tu6-vgb⁺耗糖速度明显高于里氏木霉Tu6和对照重组菌，且重组菌Tu6-vgb⁺最大干重为28.6g/L，高于里氏木霉Tu6的22.6g/L。

4、将步骤3得到的菌丝体用无菌水冲洗后接种至100mL含1％(质量百分比)结晶纤维素Avicel的发酵培养基中，28℃、200rpm培养，在第48h、72h、96h、120h和144h进行如下测定：

(1)将发酵体系离心取上清，测定上清液中的蛋白浓度(胞外蛋白浓度)并进行SDS-PAGE电泳分析。培养120h时发酵体系上清中的蛋白SDS-PAGE电泳分析结果见图8。胞外蛋白浓度统计结果见图9。

结果表明，胞外蛋白分泌有明显差异，SDS-PAGE结果显示重组菌Tu6-vgb⁺主要胞外蛋白比里氏木霉Tu6明显提高，蛋白浓度测定结果显示重组菌Tu6-vgb⁺胞外蛋白比里氏木霉Tu6明显提高，第72小时是里氏木霉Tu6的2.5倍。对照重组菌与里氏木霉Tu6的统计结果无显著性差异。

(2)将发酵体系离心取上清，测定上清液的滤纸酶活和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)酶活，测定方法参照IUPAC(INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY)标准方法，参考文献：Ghose T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure&AppliedChemistry，1987，59(2)：257-268.。

滤纸酶活统计结果见图10，羧甲基纤维素钠酶活统计结果见图11。

结果表明，重组菌Tu6-vgb⁺发酵液中纤维素酶活也有显著提高，第144小时发酵液滤纸酶活比里氏木霉Tu6提高了约54.87％，然而CMC-Na酶活却没有明显的提高。对照重组菌与里氏木霉Tu6的统计结果无显著性差异。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种重组菌及其在生产纤维素酶中的应用

<160> 4

<210> 1

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60

ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120

cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180

gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240

attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 300

gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 360

gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg 420

tacgctcaag cggttgaaca tcatcatcat catcattaa 459

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

20 25 30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

85 90 95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

115 120 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

130 135 140

Val Glu His His His His His His

145 150

<210> 3

<211> 3597

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcccttgtat ctctacacac aggctcaaat 60

caataagaag aacggttcgt ctttttcgtt tatatcttgc atcgtcccaa agctattggc 120

gggatattct gtttgcagtt ggctgacttg aagtaatctc tgcagatctt tcgacactga 180

aatacgtcga gcctgctccg cttggaagcg gcgaggagcc tcgtcctgtc acaactacca 240

acatggagta cgataagggc cagttccgcc agctcattaa gagccagttc atgggcgttg 300

gcatgatggc cgtcatgcat ctgtacttca agtacaccaa ccctcttctg atccagtcga 360

tcatcccgct gaagggcgct ttcgaatcga atctggttaa gatccacgtc ttcgggaagc 420

cagcgactgg tgacctccag cgtcccttta aggctgccaa cagctttctc agccagggcc 480

agcccaagac cgacaaggcc tccctccaga acgccgagaa gaactggagg ggtggtgtca 540

aggaggagta agctccttat tgaagtcgga ggacggagcg gtgtcaagag gatattcttc 600

gctctgtatt atagataaga tgatgaggaa ttggaggtag catagcttca tttggatttg 660

ctttccaggc tgagactcta gcttggagca tagagggtcc ctttggcttt caatattctc 720

aagtatctcg agtttgaact tattcccgtg aaccttttat tcaccaatga gcattggaat 780

gaacatgaat ctgaggactg caatcgccat gaggttttcg aaatacatcc ggatgtcgaa 840

ggcttggggc acctgcgttg gttgaattta gaacgtggca ctattgatca tccgatagct 900

ctgcaaaggg cgttgcacaa tgcaagtcaa acgttgctag cagttccagg tggaatgtta 960

tgatgagcat tgtattaaat caggagatat agcatgatct ctagttagct caccacaaaa 1020

gtcagacggc gtaaccaaaa gtcacacaac acaagctgta aggatttcgg cacggctacg 1080

gaagacggag aagcccacct tcagtggact cgagtaccat ttaattctat ttgtgtttga 1140

tcgagaccta atacagcccc tacaacgacc atcaaagtcg tatagctacc agtgaggaag 1200

tggactcaaa tcgacttcag caacatctcc tggataaact ttaagcctaa actatacaga 1260

ataagatggt ggagagctta taccgagctc ccaaatctgt ccagatcatg gttgaccggt 1320

gcctggatct tcctatagaa tcatccttat tcgttgacct agctgattct ggagtgaccc 1380

agagggtcat gacttgagcc taaaatccgc cgcctccacc atttgtagaa aaatgtgacg 1440

aactcgtgag ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg catgcggaga gacggacgga 1500

cgcagagaga agggctgagt aataagcgcc actgcgccag acagctctgg cggctctgag 1560

gtgcagtgga tgattattaa tccgggaccg gccgcccctc cgccccgaag tggaaaggct 1620

ggtgtgcccc tcgttgacca agaatctatt gcatcatcgg agaatatgga gcttcatcga 1680

atcaccggca gtaagcgaag gagaatgtga agccaggggt gtatagccgt cggcgaaata 1740

gcatgccatt aacctaggta cagaagtcca attgcttccg atctggtaaa agattcacga 1800

gatagtacct tctccgaagt aggtagagcg agtacccggc gcgtaagctc cctaattggc 1860

ccatccggca tctgtagggc gtccaaatat cgtgcctctc ctgctttgcc cggtgtatga 1920

aaccggaaag gccgctcagg agctggccag cggcgcagac cgggaacaca agctggcagt 1980

cgacccatcc ggtgctctgc actcgacctg ctgaggtccc tcagtccctg gtaggcagct 2040

ttgccccgtc tgtccgcccg gtgtgtcggc ggggttgaca aggtcgttgc gtcagtccaa 2100

catttgttgc catattttcc tgctctcccc accagctgct cttttctttt ctctttcttt 2160

tcccatcttc agtatattca tcttcccatc caagaacctt tatttcccct aagtaagtac 2220

tttgctacat ccatactcca tccttcccat cccttattcc tttgaacctt tcagttcgag 2280

ctttcccact tcatcgcagc ttgactaaca gctaccccgc ttgagcagac atcacaatgt 2340

tagaccagca aaccattaac atcatcaaag ccactgttcc tgtattgaag gagcatggcg 2400

ttaccattac cacgactttt tataaaaact tgtttgccaa acaccctgaa gtacgtcctt 2460

tgtttgatat gggtcgccaa gaatctttgg agcagcctaa ggctttggcg atgacggtat 2520

tggcggcagc gcaaaacatt gaaaatttgc cagctatttt gcctgcggtc aaaaaaattg 2580

cagtcaaaca ttgtcaagca ggcgtggcag cagcgcatta tccgattgtc ggtcaagaat 2640

tgttgggtgc gattaaagaa gtattgggcg atgccgcaac cgatgacatt ttggacgcgt 2700

ggggcaaggc ttatggcgtg attgcagatg tgtttattca agtggaagca gatttgtacg 2760

ctcaagcggt tgaacatcat catcatcatc attaaggatc cacttaacgt tactgaaatc 2820

atcaaacagc ttgacgaatc tggatataag atcgttggtg tcgatgtcag ctccggagtt 2880

gagacaaatg gtgttcagga tctcgataag atacgttcat ttgtccaagc agcaaagagt 2940

gccttctagt gatttaatag ctccatgtca acaagaataa aacgcgtttt cgggtttacc 3000

tcttccagat acagctcatc tgcaatgcat taatgcattg actgcaacct agtaacgcct 3060

tcaggctccg gcgaagagaa gaatagctta gcagagctat tttcattttc gggagacgag 3120

atcaagcaga tcaacggtcg tcaagagacc tacgagactg aggaatccgc tcttggctcc 3180

acgcgactat atatttgtct ctaattgtac tttgacatgc tcctcttctt tactctgata 3240

gcttgactat gaaaattccg tcaccagccc tgggttcgca aagataattg catgtttctt 3300

ccttgaactc tcaagcctac aggacacaca ttcatcgtag gtataaacct cgaaatcatt 3360

cctactaaga tggtatacaa tagtaaccat ggttgcctag tgaatgctcc gtaacaccca 3420

atacgccggc cgaaactttt ttacaactct cctatgagtc gtttacccag aatgcacagg 3480

tacacttgtt tagaggtaat ccttctttct agaagtcctc gtgtactgtg taagcgccca 3540

ctccacatct ccactcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttac 3597

<210> 4

<211> 2151

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg 60

ggccccccct cgaggtcgac ggtatcgata agcttccatc gatctcaccc ccaaagtcgc 120

aatatcgggt atcgccgccg gcattgaatc gccttctccg ctagcatcga ctactgctgc 180

tctgctctcg ttgccagcgc tgctccctag aattttgacc aggggacgag cccgacatta 240

aagcaactcc ctcgcctcga gacgactcgg atcgcacgaa attctcccaa tcgccgacag 300

ttcctactcc tcttcctccc gcacggctgt cgcgcttcca acgtcattcg cacagcagaa 360

ttgtgccatc tctctctttt ttttcccccc ctctaaaccg ccacaacggc accctaaggg 420

ttaaactatc caaccagccg cagcctcagc ctctctcagc ctcatcagcc atggcaccac 480

acccgacgct caaggccacc ttcgcggcca ggagcgagac ggcgacgcac ccgctgacgg 540

cttacctgtt caagctcatg gacctcaagg cgtccaacct gtgcctgagc gccgacgtgc 600

cgacagcgcg cgagctgctg tacctggccg acaagattgg cccgtcgatt gtcgtgctca 660

agacgcacta cgacatggtc tcgggctggg acttccaccc ggagacgggc acgggagccc 720

agctggcgtc gctggcgcgc aagcacggct tcctcatctt cgaggaccgc aagtttggcg 780

acattggcca caccgtcgag ctgcagtaca cgggcgggtc ggcgcgcatc atcgactggg 840

cgcacattgt caacgtcaac atggtgcccg gcaaggcgtc ggtggcctcg ctggcccagg 900

gcgccaagcg ctggctcgag cgctacccct gcgaggtcaa gacgtccgtc accgtcggca 960

cgcccaccat ggactcgttt gacgacgacg ccgactccag ggacgccgag cccgccggcg 1020

ccgtcaacgg catgggctcc attggcgtcc tggacaagcc catctactcg aaccggtccg 1080

gcgacggccg caagggcagc atcgtctcca tcaccaccgt cacccagcag tacgagtccg 1140

tctcctcgcc ccggttaaca aaggccatcg ccgagggcga cgagtcgctc ttcccgggca 1200

tcgaggaggc gccgctgagc cgcggcctcc tgatcctcgc ccaaatgtcc agccagggca 1260

acttcatgaa caaggagtac acgcaggcct gcgtcgaggc cgcccgggag cacaaggact 1320

ttgtcatggg cttcatctcg caggagacgc tcaacaccga gcccgacgat gcctttatcc 1380

acatgacgcc cggctgccag ctgccccccg aagacgagga ccagcagacc aacggatcgg 1440

tcggtggaga cggccagggc cagcagtaca acacgccgca caagctgatt ggcatcgccg 1500

gcagcgacat tgccattgtg ggccggggca tcctcaaggc ctcagacccc gtagaggagg 1560

cagagcggta ccgatcagca gcgtggaaag cctacaccga gaggctgctg cgatagggga 1620

gggaagggaa gaaagaagta aagaaaggca tttagcaaga agggggaaaa gggagggagg 1680

acaaacggag ctgagaaaga gctcttgtcc aaagcccggc atcatagaat gcagctgtat 1740

ttaggcgacc tctttttcca tcttgtcgat ttttgttatg acgtaccagt tgggatgatg 1800

gatgattgta ccccagctgc gattgatgtg tatctttgca tgcaacaaca cgcgatggcg 1860

gaggcgaact gcacattgga aggttcatat atggtcctga catatctggt ggatctggaa 1920

gcatggaatt gtatttttga tttggcattt gcttttgcgc gtggagggaa catatcaccc 1980

tcgggcattt ttcatttggt aggatggttt ggatgcagtt ggaattccgc atatgatcga 2040

tggatccact agttctagag cggccgccac cgcggtggag ctccagcttt tgttcccttt 2100

agtgagggtt aattgcgcgc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct g 2151

Claims

1.一种促进里氏木霉生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：向里氏木霉中导入特异DNA分子，从而促进里氏木霉生产纤维素酶；所述特异DNA分子中具有gpdA启动子和透明颤菌血红蛋白的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述透明颤菌血红蛋白的编码基因的表达。

2.一种提高里氏木霉生产纤维素酶的产量方法，包括如下步骤：向里氏木霉中导入特异DNA分子，从而提高里氏木霉生产纤维素酶的产量；所述特异DNA分子中具有gpdA启动子和透明颤菌血红蛋白的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述透明颤菌血红蛋白的编码基因的表达。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述透明颤菌血红蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述透明颤菌血红蛋白的编码基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

(b2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求3中所述蛋白质的DNA分子；

(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求3中所述蛋白的DNA分子。

5.一种特异DNA分子，具有gpdA启动子和透明颤菌血红蛋白的编码基因，并且由所述gpdA启动子启动所述透明颤菌血红蛋白的编码基因的表达。

6.权利要求5所述的特异DNA分子或含有权利要求5所述的特异DNA分子的重组表达载体的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)促进里氏木霉生产纤维素酶；

(c2)提高里氏木霉生产纤维素酶的产量。

7.一种重组菌，是将权利要求5所述的特异DNA分子导入里氏木霉得到的。

8.权利要求7所述的重组菌在生产纤维素酶中的应用。

9.一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：培养权利要求7所述的重组菌，得到纤维素酶。

10.如权利要求1-4任一所述的方法，或，权利要求5所述的特异DNA分子，其特征在于：所述gpdA启动子为序列表的序列3自5′末端第27至2336位核苷酸所示的DNA分子。