CN105274153A - 一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法 - Google Patents

一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法 Download PDF

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本发明公开了一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法利用黑曲霉来源的酸诱导的启动子，在土曲霉中引入黑曲霉的侧呼吸链蛋白AOX，增强胞内NAD+库的供给，进而增强糖酵解途径，从而提高衣康酸的产量。本发明方法得到的重组土曲霉菌株，其衣康酸产量提高了20％左右，达到60g/L。本发明为衣康酸的生产提供了新思路。

Description

一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
衣康酸是一种五碳二元羧酸，含有一个亚甲基，这个不饱和键赋予衣康酸行使聚合反应的功能，因此衣康酸被广泛应用于树脂和合成纤维的生产，此外，衣康酸作为生物活性成分可以应用于农业和医药行业，作为酶法转化的初始化合物用于合成多功能的平台化合物。
目前衣康酸的生产主要依赖于利用土曲霉进行深层有氧发酵。土曲霉产衣康酸的代谢途径为葡萄糖通过糖酵解途径和TCA循环合成柠檬酸，并进而合成顺乌头酸，顺乌头酸进入细胞质在乌头酸脱羧酶的催化下合成衣康酸。糖酵解途径和TCA循环的调控严谨，而乌头酸脱羧酶的活性在衣康酸发酵中保持很高的水平，表达单一的蛋白难以达到增强代谢途径的目的，但有文献报道表达解除反馈抑制的截短的pfkA蛋白，可以提高衣康酸产量。
衣康酸发酵需要很高的溶氧，随着溶氧的增加，衣康酸产量增加。这和黑曲霉产柠檬酸需要高溶氧相似。在黑曲霉中由于糖酵解途径的加强，合成过量的NADH，如果通过氧化磷酸化途径使NADH通过产生ATP来形成NAD+，会造成ATP的过剩。土曲霉合成衣康酸的途径与黑曲霉产柠檬酸相比，仅增加了2步反应，且都是不需要能量的反应，因此，衣康酸发酵同样面临NAD+库的补充和ATP形成解偶联的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种利用酸诱导的启动子在产酸阶段启动AOX表达，进而提高土曲霉衣康酸产量的方法。由于黑曲霉通过侧呼吸链蛋白AOX来行使NADH到NAD+的转变，不产生能量，借鉴这一原理，本发明实现AOX在土曲霉中的表达，以实现NAD+库的补充。然而，在菌体生长需要ATP供能的阶段需要AOX蛋白表达沉默，因此本发明进一步利用酸诱导的启动子Pgas，使AOX仅在产酸阶段表达。
本发明的第一个目的是一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法，所述方法是将黑曲霉的AOX基因整合到土曲霉基因组上得到重组土曲霉菌株，利用重组菌发酵生产衣康酸；所述AOX基因的表达受酸诱导型启动子的调控，在酸性条件下诱导表达。
所述AOX基因是a)或者b)：
a)编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的序列；
b)具有使NADH在与ATP产生解偶联的条件下生成NAD+的功能，其编码的氨基酸序列是在a)的基础上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述AOX基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述土曲霉菌株是AspergillusterreusHAT418，或者购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CICC2433、CICC40205或CICC40832的土曲霉菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述酸诱导型启动子是Pgas，其核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在35℃、250r/min下发酵96h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵使用的发酵培养基，每L含有：180g葡萄糖，0.1gKH2PO4，3gNH4NO3，1gMgSO4·7H2O，5gCaCl2·2H2O，0.00167gFeCl3·6H2O，0.008gZnSO4·7H2O和0.015gCuSO4·7H2O；培养基pH3.1。
本发明的第二个目的是提供一种重组土曲霉菌株。
所述重组土曲霉菌株基因组上含有AOX基因，且AOX基因的表达受到酸诱导型启动子Pgas的调控；所述AOX基因在酸性条件下诱导表达。
在本发明的一种实施方式中，所述Pgas启动子的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列；所述AOX基因编码的的氨基酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述重组土曲霉菌株还整合表达了潮霉素抗性基因，以便转化子的筛选。
本发明的第三个目的是提供一种所述重组土曲霉菌株的构建方法，包括：
(1)构建AOX蛋白表达框Pgas-AOX-trp，所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子；构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp，包含元件gpdA启动子、hph基因和trp终止子，便于阳性克隆子的筛选；
(2)将AOX蛋白表达框和抗性基因表达框一起转化到土曲霉中，得到2个表达框同时整合到土曲霉基因组中的重组土曲霉。
在本发明的一种实施方式中，所述构建方法中，步骤(1)具体是：将trp终止子序列通过PstI和HindIII酶切，连接到pUC19上，得到pUC-trp载体；将Pgas启动子序列通过EcoRI和KpnI酶切，连接到pUC-trp载体上，得到pUC-Pgas-trp载体；再将AOX序列用KpnI和PstI双酶切，片段连接到pUC-Pgas-trp载体上，得到pUC-Pgas-AOX-trp表达框；抗性基因表达框以pAN7-1为模板克隆得到。
在本发明的一种实施方式中，所述构建方法中，步骤(2)具体是：将AOX蛋白表达框和抗性基因表达框经PEG介导法转入土曲霉原生质体中，在潮霉素抗性的高渗软琼脂PDA平板上培养得到阳性克隆，再将经培养4-7天的阳性克隆转移至含1g/L潮霉素的平板上进一步培养得到阳性克隆，验证正确的即为重组土曲霉。
在本发明的一种实施方式中，所述trp终止子的序列如SEQIDNO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述gpdA启动子的序列如SEQIDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述hph的序列如SEQIDNO.5所示。
本发明的第四个目的是提供一种AOX蛋白表达框，所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子，按照Pgas-AOX-trp的顺序排布。
本发明还要求保护含有所述AOX蛋白表达框的菌株以及所述AOX蛋白表达框在提高衣康酸产量方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用酸诱导型启动子启动AOX蛋白在土曲霉中表达，通过增强胞内NAD+库的供给，增强糖酵解途径，从而提高衣康酸的产量。本发明方法对产衣康酸的土曲霉菌株具有普遍适用性，可使土曲霉发酵生产衣康酸产量提高近20％，利用AspergillusterreusHAT418作为宿主，衣康酸产量提高了20％、产量达到60g/L以上。
附图说明
图1所示为土曲霉中衣康酸的产量；■为AOX转化子的衣康酸产量，□为野生型的衣康酸产量，▲为AOX转化子的葡萄糖浓度，△为野生型的葡萄糖浓度。
具体实施方式
实施例1：黑曲霉RNA的提取
将黑曲霉孢子接种到柠檬酸发酵培养基中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司RNeasyPlantMiniKit提取黑曲霉总RNA。用TAKARA公司PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser将RNA反转录成cDNA。
实施例2：黑曲霉基因组DNA的提取
将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝状真菌基因组。
实施例3：AOX蛋白表达框的构建
利用引物trp-F(序列如SEQIDNO.7所示)和trp-R(序列如SEQIDNO.8所示)以pAN7-1为模板扩增trp终止子，序列上下游含PstI和HindIII位点，连接到pMD19上测序，用这两个限制性内切酶酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19上，得到pUC19-trp。利用引物Pgas-F(序列如SEQIDNO.9所示)和Pgas-R(序列如SEQIDNO.10所示)从黑曲霉基因组DNA中扩增Pgas启动子，序列两头含EcoRI和KpnI酶切位点，酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19-trp，得到pUC-Pgas-trp。利用引物AOX-F(序列如SEQIDNO.11所示)和AOX-R(序列如SEQIDNO.12所示)从黑曲霉cDNA中扩增AOX基因，基因两头含KpnI和PstI酶切位点，连接到同样酶切的pUC-Pgas-trp，形成gas-AOX-trp表达框。潮霉素抗性表达框通过引物gpd-F(序列如SEQIDNO.13所示)和Ttrp-R-2(序列如SEQIDNO.14所示)从质粒pAN7-1中扩增得到。
用到的引物如下：
trp-F：ctgcagGATCCACTTAAACGTTACTGAAATC
trp-R：aagcttCTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
Pgas-F：gaattcCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCT
Pgas-R：ggtaccGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAGAC
AOX-F：ggtaccATGAACTCGTTAACAGCC
AOX-R：ctgcagTCAGATCACCTCCTCCC
gpd-F：CAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG
Ttrp-R-2：CTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
实施例4：土曲霉原生质体的制备和转化
按3×105/ml的浓度接种土曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/min培养过夜。用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球。称取一定量的Caylase-4，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌。称取一定量菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养约3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μLSTC，混匀。100μL土曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μLPEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mLPEG，室温放置10min，依次加入4mLSTC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有1g/L潮霉素的下层培养基上。平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代。每个菌落进行3次单孢子继代。
实施例5：土曲霉转化子产量的验证
土曲霉接种于PDA培养基上35℃生孢培养5-7天，刮取孢子，以107/mL的接种量接种于种子培养基，37℃、250r/min培养16h，以1/10接种量转接发酵培养基，35℃、250r/min发酵96h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测衣康酸含量。
衣康酸酸的含量用高效液相色谱(HPLC)进行检测。仪器：Agilent1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站)；色谱条件：HPX87H色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为5mM硫酸溶液，流量为0.6mL/min，进样量为10μL，柱温为30℃，210nm波长紫外光检测。
结果表明，与野生型土曲霉菌株相比，本发明的重组土曲霉菌株的衣康酸产量提高了20％左右，产量达到60g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法，其特征在于，所述方法是将黑曲霉的AOX基因整合到土曲霉基因组上得到重组土曲霉菌株，利用重组菌发酵生产衣康酸；所述AOX基因的表达受酸诱导型启动子的调控，在酸性条件下诱导表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AOX基因是a)或者b)：
a)编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的序列；
b)具有使NADH在与ATP产生解偶联的条件下生成NAD+的功能，其编码的氨基酸序列是在a)的基础上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸诱导型启动子为Pgas，核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组土曲霉菌株的构建方法是：(1)构建AOX蛋白表达框Pgas-AOX-trp，所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子；构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp，包含元件gpdA启动子、hph基因和trp终止子；(2)将AOX蛋白表达框和抗性基因表达框一起转化到土曲霉中，得到2个表达框同时整合到土曲霉基因组中的重组土曲霉。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵是在35℃250r/min下发酵96h。
6.一种衣康酸产量提高的重组土曲霉菌株，其特征在于，所述重组土曲霉菌株基因组上含有AOX基因，且AOX基因的表达受到酸诱导型启动子Pgas的调控；所述AOX基因在酸性条件下诱导表达。
7.一种AOX蛋白表达框，其特征在于，所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子，按照Pgas-AOX-trp的顺序排布。
8.根据权利要求7所述的AOX蛋白表达框，其特征在于，所述Pgas启动子的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列；所述AOX蛋白编码基因编码的的氨基酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。
9.含有权利要求7所述AOX蛋白表达框的菌株。
10.权利要求7所述AOX蛋白表达框在提高衣康酸产量方面的应用。
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