CN104911118A - 一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法，属于微生物技术领域和分子生物学技术领域。本发明采用基因同源重组的方法将酿酒酵母编码PDC的基因PDC1，PDC5和PDC6敲除掉，在酿酒酵母中表达来源于人的LDH并用抗霉素A来阻断电子链传递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵来维持糖酵解的进行。本发明顺利实现了人的乳酸脱氢酶的异源表达。本发明得到的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母能够表达人的乳酸脱氢酶，在酿酒酵母pdc1Δ pdc6Δ pdc5Δ三缺陷菌株中表达LDHA或LDHC，加入抗霉素A后，能够生长并检测到乳酸的产生。本发明的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母将可以作为一种潜在的筛选抗癌药物以及能够调节乳酸脱氢酶活性相关基因的工具。

Description

一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法，属于微生物技术领域和分子生物学技术领域。
背景技术
酿酒酵母在无氧条件下利用糖酵解途径来产能并采用乙醇发酵来维持糖酵解途径的进行。乙醇发酵包含两个步骤：首先丙酮酸在丙酮酸脱羧酶(PDC)的作用下转化为乙醛，然后在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下，还原乙醛生成乙醇同时NAD+再生。在有氧条件下，酿酒酵母利用线粒体中的电子传递链来产能。
在有氧条件下，癌细胞能够利用葡萄糖作为碳源经糖酵解代谢途径产生大量的乳酸。糖酵解途径对于肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移是必需的。乳酸脱氢酶(LDH)主要是定位于细胞质中，可逆地催化丙酮酸转化为乳酸同时NADH被氧化为NAD+。因此，乳酸发酵对于维持肿瘤细胞糖酵解途径的进行以及NAD+的再生是必需的。来源于人的LDH有三个亚基组成，分别为LDHA、LDHB和LDHC。LDHA主要存在于厌氧组织，比如骨骼肌；LDHB主要是在有氧组织中表达，比如心肌；LDHC则是专门在睾丸中表达。
LDH是癌细胞增殖和转移的关键酶，在酿酒酵母中异源表达的人的乳酸脱氢酶将可以作为一种潜在的抗癌药物的筛选工具，研究人员可以根据药物对异源表达的人的乳酸脱氢酶的作用情况，对药物性能进行初步评价。此外将人基因文库中的基因导入到LDH酵母人源化系统可以筛选能够调节LDH活性的相关基因。
本发明将酿酒酵母编码PDC的基因PDC1，PDC5和PDC6敲除掉，在酿酒酵母中表达来源于人的LDH并用抗霉素A来阻断电子链传递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵来维持糖酵解的进行。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，所述酿酒酵母缺失了丙酮酸脱羧酶基因，且表达人的乳酸脱氢酶。
所述缺失的丙酮酸脱羧酶基因是PDC1、PDC5和PDC6。
所述PDC1、PDC5和PDC6，在本发明的一种实施方式中，分别是NCBI上Gene ID为850733、850825、852978的基因。
所述人的乳酸脱氢酶是LDHA、LDHB或LDHC。
所述人的乳酸脱氢酶LDHA、LDHB或LDHC，在本发明的一种实施方式中，分别是NCBI上Gene ID为3939、3945、3948的基因。
本发明的第二个目的是一种所述乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母的构建方法。
所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，是：(1)构建PDC1、PDC5和PDC6三基因缺失菌—酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ；(2)将人的乳酸脱氢酶LDHA、LDHB或LDHC连接到酵母表达质粒上，然后转化到酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ中，筛选正确的转化子，即为乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母。
所述三基因缺失菌，在本发明的一种实施方式，是以酿酒酵母W303-1A为出发菌株构建得到的。
所述构建方法，在本发明的一种实施方式，具体是：(1)以酿酒酵母W303-1A为出发菌株，通过同源重组的方法，依次敲出其PDC1、PDC5、PDC6三个基因得到酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ；(2)将LDHA、LDHB或LDHC连接到pRS424TEF质粒上，得到重组质粒pRS424TEF-LDHA，pRS424TEF-LDHB和pRS424TEF-LDHC，然后通过醋酸锂/PEG的转化方法将重组质粒导入酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ中，筛选，测序验证。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母表达人的乳酸脱氢酶的方法。
所述方法是在SD-Trp培养基中培养乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，并用抗霉素A来阻断电子链传递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵来维持糖酵解的进行。
所述方法，在本发明的一种实施方式是：挑取酵母单菌落培养至OD660＝0.8-1.0后，洗涤细胞并重悬于新鲜培养基中，细胞生长至1.5×107-1.7×107个/mL时加入抗霉素A，继续培养22-26h。
所述方法，在本发明的一种实施方式，具体是：挑取酵母单菌落在SD-Trp培养基中生长至OD660＝1.0后，细胞用无菌水洗涤后，重新悬浮新鲜SD-Trp培养基并使细胞数为1.6×107个/mL并加入终浓度为10μg/mL的抗霉素A，继续培养24h。
本发明还要求保护乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母生产的乳酸脱氢酶，以及其在筛选抗癌药物、筛选能够调节乳酸脱氢酶活性的基因等方面的应用。
本发明的有益效果：采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因，将表达人的乳酸脱氢酶的重组质粒转化到酿酒酵母丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株，28℃～32℃培养长出酿酒酵母单菌落，实现了人的乳酸菌脱氢酶的异源表达，在酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株中表达LDHA或LDHC，加入抗霉素A后，能够生长并检测到乳酸的产生。乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母将可以作为一种潜在的筛选抗癌药物以及能够调节乳酸脱氢酶活性相关基因的工具。
附图说明
图1：乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母在含有抗霉素A的平板上的生长情况；
图2：乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母产乳酸情况的测定；
图3：表达产物的western blot。
具体实施方式
实施例1：pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三基因缺陷菌株的构建
乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母的构建，包括以下步骤：
(1)pdc6Δ缺陷型菌株的构建
酿酒酵母PDC6基因序列设计引物如下：
上游引物HXO556(序列如SEQ ID NO.1所示)：
AGTATAAATAAAAAACCCACGTAATATAGCAAAAACATATTGCCAACAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
下游引物HXO557(序列如SEQ ID NO.2所示)：
TAAGTTTATTTATTTGCAACAATAATTCGTTTGAGTACACTACTAATGGCGAATTCGAGCTCGTTTAAAC
利用上游引物和下游引物扩增得到PDC6基因，将来源于质粒pFA6a-HIS3MX6的His片段插入PDC6基因片段内部，获得含酿酒酵母PDC6基因上下游序列的敲除片段，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的His片段导入到酿酒酵母W303-1A单倍体细胞中，并进行筛选；将转化菌株涂布到SD-His缺陷型平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，并以野生型菌株的基因组进行对比，获得pdc6Δ缺陷型菌株。
(2)pdc6Δpdc5Δ双缺陷菌株的构建
根据酿酒酵母PDC5基因序列设计引物如下：
上游引物HXO552(序列如SEQ ID NO.3所示)：
CATAATCAATCTCAAAGAGAACAACACAATACAATAACAAGAAGAACAAATGTACTGAGAGTGCACCATA
下游引物HXO553(序列如SEQ ID NO.4所示)：
AAAGTAAAAAAATACACAAACGTTGAATCATGAGTTTTATGTTAATTAGCATTTCACACCGCATATCGAC
利用上游引物和下游引物扩增得到PDC5基因，将来源于质粒pRS305的Leu片段插入PDC5基因片段内部，获得含酿酒酵母PDC5基因上下游序列的敲除片段，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的Leu片段分别导入到酿酒酵母W303-1Apdc6Δ缺陷型菌株，并进行筛选；将转化菌株涂布到SD-Leu-His缺陷型平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，并以野生型菌株的基因组进行对比，从而得到pdc6Δpdc5Δ双缺陷菌株。
(3)pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株的构建
由于酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株生长比较慢，将把PDC5基因克隆到pRS316TEF(带有强启动子TEF的pRS316质粒)得到的重组质粒pRS316TEF-PDC5转化pdc6Δpdc5Δ双缺陷型菌株，得到相应的酿酒酵母重组菌株，并在此重组菌株的基础上敲除PDC1基因。
根据酿酒酵母PDC1基因序列设计引物如下：
上游引物HXO548(序列如SEQ ID NO.5所示)：
TATTTTCTACTCATAACCTCACGCAAAATAACACAGTCAAATCAATCAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
下游引物HXO549(序列如SEQ ID NO.6所示)：
TACATAAAAATGCTTATAAAACTTTAACTAATAATTAGAGATTAAATCGCGAATTCGAGCTCGTTTAAAC
利用上游引物和下游引物扩增得到PDC1基因，将来源于质粒pFA6a-kanMX6的Kan片段插入到PDC1基因内部，获得含酿酒酵母PDC1基因上下游序列的敲除片段，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的Kan片段导入到酿酒酵母pdc6Δpdc5Δ/pRS316TEF-PDC5缺陷型菌株，并进行筛选；将转化菌株涂布到含有G418抗生素的SD-Leu-His缺陷型平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，并以野生型菌株的基因组进行对比，从而得到pdc1Δpdc6Δpdc5Δ/pRS316TEF-PDC5三缺陷菌株。最后在含有500μg/ml 5-氟乳清酸的SD培养基消除掉pRS316TEF-PDC5质粒，得到pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株。
实施例2：乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母的构建
将通过PCR扩增的LDHA，LDHB和LDHC基因分别插入到pRS424TEF质粒上，得到重组质粒pRS424TEF-LDHA，pRS424TEF-LDHB和pRS424TEF-LDHC。通过醋酸锂/PEG的转化方法分别将重组质粒pRS424TEF-LDHA，pRS424TEF-LDHB和pRS424TEF-LDHC转到酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株，将转化菌株涂布在SD-Trp培养基中，30℃培养长出单菌落，经测序验证，即得到分别表达LDHA、LDHB、LDHC的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母。
实施例3：人的乳酸脱氢酶在pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株中的表达
(1)将表达LDHA、LDHB、LDHC的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，在含有和不含有抗霉素A的平板上划线后培养，以导入pRS424TEF的三缺陷菌株为对照，结果如图1所示。结果显示，加入抗霉素A后，LDHA或LDHC能够维持酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株的生长，LDHB不能弥补酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株的生长。
(2)挑取乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母单菌落在SD-Trp培养基中生长至OD660约为1.0后，细胞用无菌水洗涤后，重新悬浮在5mL新鲜配置的SD-Trp培养基并使细胞数为1.6×107/mL并加入终浓度为10μg/mL的抗霉素A。继续培养24h后，将培养液在转速2,100×g下离心5min，上清液经0.45μm滤膜过滤后，用HPLC进行检测乳酸的产生。HPLC检测条件：Aminex HPX-87H分析柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)，流动相为5mM H2SO4，流速为0.6mL/min，柱温为50℃，二极管阵列检测器，检测波长为210nm。HPLC检测结果如图2所示，结果表明，在酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ三缺陷菌株中表达LDHA或LDHC，加入抗霉素A后，能够检测到乳酸的产生。同时对乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母表达产物进行了western blot检测，结果显示，LDHA、LDHB、LDHC都能得到正常表达(如图3)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母缺失了丙酮酸脱羧酶基因，且表达人的乳酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述缺失的丙酮酸脱羧酶基因是PDC1、PDC5和PDC6；所述人的乳酸脱氢酶是LDHA、LDHB或LDHC。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母，其特征在于，所述PDC1、PDC5和PDC6分别是NCBI上登录号为850733、850825、852978的基因；所述人的乳酸脱氢酶是LDHA、LDHB或LDHC分别是NCBI上登录号为3939、3945、3948的基因。
4.一种权利要求1-3任一所述酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法是：(1)构建PDC1、PDC5和PDC6三基因缺失菌—酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ；(2)将人的乳酸脱氢酶LDHA、LDHB或LDHC连接到酵母表达质粒上，然后转化到酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ中，筛选正确的转化子，即为乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)以酿酒酵母W303-1A为出发菌株，通过同源重组的方法，敲除其PDC1、PDC5、PDC6三个基因得到酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ；(2)将LDHA、LDHB或LDHC连接到pRS424TEF质粒上，得到重组质粒pRS424TEF-LDHA、pRS424TEF-LDHB或pRS424TEF-LDHC，然后通过醋酸锂/PEG的转化方法将重组质粒导入酿酒酵母pdc1Δpdc5Δpdc6Δ中，筛选，测序验证。
6.一种利用权利要求1所述酿酒酵母表达人的乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法是在SD-Trp培养基中培养乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，并用抗霉素A来阻断电子链传递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵来维持糖酵解的进行。
7.权利要求1-3任一所述乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母生产的乳酸脱氢酶。
8.权利要求7所述乳酸脱氢酶在筛选抗癌药物方面的应用。
9.权利要求7所述乳酸脱氢酶在筛选调节乳酸脱氢酶活性的基因的应用。
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