CN1902319A - 产乳酸酵母 - Google Patents
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Abstract
本文公开了酵母,当培养它们时能够产生相对高浓度的乳酸。本文还公开了当产乳酸酵母于其中培养时产生相对更低水平的副产物杂质的培养基。
Description
背景领域
本发明一般涉及的是酵母(例如真菌),它们在培养时可以产生相对高浓度的乳酸。本发明还涉及培养基,当在其中培养产乳酸酵母时,与在本领域内已知的某些培养基中培养该酵母相比,将产生相对更低水平的副产品杂质。
乳酸(2-羟基丙酸,CH3CHOHCOOH)是天然存在的、可以通过发酵或者化学合成产生的羟基酸。乳酸是具有旋光活性的最简单的羟基酸。L(+)-乳酸可以通过发酵直接产生,而不含有D(-)-乳酸(例如已知的化学合成产生两种异构体的外消旋混合物)。同样,D(-)-乳酸也可以通过发酵产生而不含有L(+)-乳酸。乳酸可以用于食物中作为防腐剂和增香剂。乳酸衍生物可以用在工业应用中,例如涂料和电沉积涂层、药物和化妆品。通过乳酸脱水可以产生的重要化合物是多聚(乳酸)塑料。L(+)-乳酸是可生物降解塑料应用中的优选聚合原料。
可以通过成批方式培养某些微生物,例如某些乳杆菌(Lactobacillus),芽孢杆菌(Bacillus),乳球菌(Lactococcus),或者根霉(Rhizopus)进行L(+)-乳酸发酵。在乳酸发酵中可能遇到的一个问题是由于未解离的酸的积累(例如降低发酵培养液的pH)导致的生长和代谢的抑制(Buchta,1983;Hongo et al.,1985;Benninga,1990)。在某些情况下,可以通过在发酵中加入试剂如Ca(OH)2,CaCO3,NaOH,或者NH4OH控制发酵过程的pH在中性或者接近中性。结果是产生的发酵培养液可能含有高浓度的各种不同的盐类,从培养液中回收未解离的乳酸可能是非常昂贵的。而且,某些乳杆菌为产生乳酸可能具有复杂的营养需求(WO 99/19503),它们需要复杂的氮源,例如酵母提取物或者玉米浆(CSL)。这些复杂的氮源可能包含额外的有机和无机杂质,它们可能使乳酸的回收复杂化。
另外一种解除由培养基中乳酸积累造成的抑制的方法涉及在例如某些根霉种的发酵过程中从培养液中连续除去乳酸。树脂,例如聚乙烯吡啶,可以用于这种连续清除。
在用作聚合物级别的原料时,优选地将乳酸回收和纯化到最高可能的纯度水平。优选地,有机杂质(例如来自复合氮源),无机杂质(与培养基组分和中和物质有关)以及生产有机体在发酵过程中分泌的代谢中间产物都被除去。
转化了携带乳酸脱氢酶(例如携带LDH)的质粒的野生型酿酒酵母在培养时可以生产一些乳酸。但是,该重组酵母细胞同时从葡萄糖形成乙醇,这会导致三个问题。首先,在乳酸发酵中用于产生乙醇的葡萄糖是一种碳的流失,在以每克葡萄糖计算乳酸产量时会降低乳酸产量。第二,乙醇在培养液中的积累降低了乳酸生产的发酵效率。第三,乙醇实际上是一种杂质,需要在乳酸纯化过程中去除。
在某些酵母、主要是克雷树(crabtree)效应阳性的酵母中,丙酮酸脱羧化的主要途径涉及丙酮酸脱羧酶。克雷树效应阳性的酵母在有氧条件下在过量糖(例如葡萄糖)存在时或者当培养物的生长速率高于临界生长速率时就会从丙酮酸产生醇。克雷树效应阳性酵母的示例有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。为了将向乙醇的碳流动改道,以提高来自丙酮酸的乳酸的产量,需要限制酵母中的丙酮酸脱羧化。
在酿酒酵母中,丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)催化丙酮酸向乙醛的转化,这是发酵代谢中的第一步。当酿酒酵母中的丙酮酸脱羧酶结构基因被破坏,则酵母不能产生乙醇(Hohmann,1997)。已经提出,除了分解代谢活性,丙酮酸脱羧酶还有生物合成的功能。在本领域内已知丙酮酸脱羧酶阴性(Pdc-)(例如没有可以检测量的丙酮酸脱羧酶活性)的酿酒酵母菌株,如果葡萄糖作为唯一碳源,不加入少量乙醇或者乙酸盐(例如生长所需的5%的碳)时,不能在在合成培养基上在葡萄糖受限制的恒化器中需氧生长。
发明公开
本发明的某些实施方案涉及的是耐酸(AT)的酵母菌株。AT酵母株在培养基中培养时基本上不产生乙醇,它们包含有包括了外源性乳酸脱氢酶(LDH)基因的基因组。优选地,该外源LDH基因是L-乳酸脱氢酶基因。所述外源LDH基因可以是AT酵母的至少一条染色体上的元件和/或AT酵母中的至少一个质粒可以包含该外源LDH基因。该LDH可以在AT酵母株中表达,且其表达产生了具有乳酸脱氢酶活性的乳酸脱氢酶蛋白。在一些实施方案中,AT酵母株没有可以检测量的丙酮酸脱羧酶活性。在某些实施方案中,AT酵母株的野生型菌株是克雷树效应阳性的。而且,AT酵母株能够在基本培养基中,在低于其亲本酵母株的pH下产生乳酸。AT酵母株的亲本株在培养基中培养时也基本上不产生乙醇,其基因组中包括能够被表达的外源乳酸脱氢酶(LDH)基因,这样产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性。但是亲本菌株未经过能使其耐酸的处理(例如选择)。
AT酵母株优选能够在pH低于大约3.5、更优选在pH低于大约2.8、最优选在pH低于大约2.3的条件下产生乳酸。还优选AT酵母株能够在基本培养基(例如在分批培养中,在分批补料培养中或者恒化器)中需氧培养时,在培养基中产生大于大约500mM的乳酸。优选地,AT酵母株能够在pH大约2.3和2.4之间在培养液中生产500mM乳酸。更为优选地,AT酵母株在基本培养基中需氧培养时,能够产生多于大约565mM的乳酸,最优选多于大约665mM的乳酸。在一些实施方案中,AT酵母株在含有葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时,能够每100克葡萄糖产生大于约50克乳酸。在某些实施方案中,优选地,在含有葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时,AT酵母株能够每100克葡萄糖产生50克到85克乳酸,更为优选地,AT酵母株能够每100克葡萄糖产生约70克到85克乳酸。优选地,AT酵母株产生的乳酸是L-(+)乳酸。优选地,该AT酵母株属于选自下列的属:酵母属(Saccharomyces),假丝酵母属(Candida),裂殖酵母属(Schizosaccharomyces),有孢圆酵母属(Torulaspora),克鲁维酵母属(Kluyveromyces),接合酵母属(Zygosaccharomyces)和德克酵母属(Dekkera)。更为优选地,AT酵母株属于酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,或克鲁维酵母属。更为优选地,AT酵母株属于酵母属,例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在某些实施方案中,AT酵母株可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH的酿酒酵母。在某些实施方案中,酵母株可以选自耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans),Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母(Schizosaccharornyces pombe),和光滑假丝酵母(Candidaglabrata)。
在某些实施方案中,AT酵母株的生长依赖于具有C2碳源,这样,在一些情况下,该AT酵母株能够在包含基本上由葡萄糖和至少一种C2碳源组成的碳源的第二种基本培养基中生长。在某些实施方案中,AT酵母株可以是不依赖于C2碳源的(例如CI酵母株)。在某些实施方案中,CI酵母株能够在包含至少一种选自下述的确定碳源的另一种基本培养基中生长:葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖。在某些实施方案中,CI酵母能够在以葡萄糖作为唯一碳源的第二种基本培养基中生长。
AT酵母株能够在基本上由至少一种确定的碳源、至少一种确定的氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成的第二种基本培养基中生长。所述确定的氮源可以包含至少一种选自由尿素、磷酸铵、硝酸铵和硫酸铵组成之组中的化合物。
在某些实施方案中,属于AT酵母株基因组一部分的外源性乳酸脱氢酶基因可以是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),牛,干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium),米根霉(Rhizopus oryzae),或者嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophylus)的乳酸脱氢酶基因。这些基因的核苷酸序列的示例可以在GenBank中分别以登录编号AJ293008,NP776524,M76708,M22305,Q9P4B6,和M19396得到。在一些实施方案中,外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。优选地,外源LDH基因是L-乳酸脱氢酶基因。优选地,外源乳酸脱氢酶基因与启动子有效连接。所述启动子优选是强的组成型启动子。在某些实施方案中,该优选的启动子是选自由下列各项组成之组中的启动子:磷酸丙糖异构酶启动子、丙酮酸脱羧酶启动子、乙醇脱氢酶启动子和L-苏氨酸脱氢酶启动子。优选地,启动子是磷酸丙糖异构酶启动子。在某些实施方案中,启动子可以是丙酮酸脱羧酶启动子,例如克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶启动子。
本发明的某些实施方案涉及在培养基中培养时基本上不产生乙醇的耐酸(AT)酿酒酵母,其基因组包含了能够在AT酿酒酵母中表达的外源乳酸脱氢酶基因。在某些实施方案中,AT酿酒酵母没有可检测量的丙酮酸脱羧酶活性。优选地,外源LDH基因是L-乳酸脱氢酶基因。所表达的乳酸脱氢酶蛋白具有乳酸脱氢酶活性,且与其亲本酿酒酵母株相比,AT酿酒酵母能够在更低的pH下在基本培养基中产生乳酸。优选地,外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。优选地,在AT酿酒酵母中至少一个质粒包含外源的乳酸脱氢酶基因。在某些实施方案中,AT酿酒酵母可以具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxPpdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH。
优选地,在第二种基本培养基中需氧培养时,AT酿酒酵母能够在培养液中产生大于约500mM的乳酸。优选地,第二种培养液的pH在大约2.3和2.4之间。
本发明的某些实施例涉及具有包含外源乳酸脱氢酶基因的基因组的重组酵母株,所述外源乳酸脱氢酶基因能够在该重组酵母株中表达。优选地,外源LDH基因是L-乳酸脱氢酶基因。表达产生的乳酸脱氢酶具有乳酸脱氢酶活性,且该重组酵母株在基本培养基中培养时能够产生至少大约565mM的乳酸,更优选至少大约665mM的乳酸。重组酵母株能够在低于大约3.5、优选低于大约2.8、更优选低于大约2.3、最优选低于大约2.0的pH下产生乳酸。在某些实施方案中,重组酵母株的野生型菌株是克雷树效应阳性。优选重组酵母是酿酒酵母。
本发明的某些实施方案涉及耐酸的不依赖于C2碳源(CI)的酵母株。CI酵母在培养基中培养时基本上不产生乙醇,其基因组包含能够被表达的外源乳酸脱氢酶基因。优选地,外源LDH基因时L-乳酸脱氢酶基因。表达产生的乳酸脱氢酶蛋白具有乳酸脱氢酶活性。CI酵母株能够在葡萄糖作为唯一碳源的第一种基本培养基中在需氧条件下培养时产生乳酸,并且在比亲本株培养更低的pH条件下在第一种基本培养基中产生乳酸。优选地,亲本株是依赖于C2碳源的。在某些实施方案中,CI酵母没有可检出量的丙酮酸脱羧酶活性。在某些实施方案中,同一菌株的野生型酵母株是克雷树效应阳性的。在一些实施方案中,CI酵母株可以包含植物乳杆菌,牛,干酪乳杆菌,巨大芽孢杆菌,米根霉,或者嗜热脂肪芽孢杆菌的外源乳酸脱氢酶基因。优选地,CI酵母株包含植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。CI酵母株染色体可以包含外源乳酸脱氢酶基因和/或至少一个包含外源乳酸脱氢酶基因的质粒可以存在于CI酵母株内。在某些实施方案中,外源乳酸脱氢酶基因可以是2μ质粒的一部分。
在某些实施方案中,CI酵母株能够在低于大约2.8、更优选低于大约2.3的pH下产生乳酸。在某些实施方案中,CI酵母株培养在基本培养基中,能够每100克葡萄糖产生大于大约50克的乳酸;在一些实施方案中,产生大约50克到85克的乳酸/100克葡萄糖;在一些实施方案中,产生大约70克到85克的乳酸/100克葡萄糖。在一些实施方案中,CI酵母株在基本培养基中需氧培养时能够在培养液中产生多于大约565mM的乳酸。优选地,CI酵母株在大约pH2.3-2.4下培养。更为优选地,CI酵母株能够产生多于大约665mM的乳酸。优选地,CI酵母株属于选自下列各项的属:酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,有孢圆酵母属,克鲁维酵母属,接合酵母属和德克酵母属。更为优选地,CI酵母株属于选自由酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属和克鲁维酵母属组成之组中的属。在一些实施方案中,CI酵母株属于选自由酿酒酵母,耐热克鲁维酵母,Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母和光滑假丝酵母组成之组的种。在某些实施方案中,CI酵母可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH的酿酒酵母。CI酵母株能够在需氧分批培养、需氧分批补料培养或者需氧恒化器中生长。
CI酵母株能够在包含至少一种确定碳源的第二种基本培养基中生长,所述碳源选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖组成之组。某些CI酵母株能够在基本上由至少一种确定的碳源(选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖组成之组)、至少一种确定的氮源(选自由尿素、磷酸铵、硝酸铵和硫酸铵组成之组)、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成的基本培养基中生长。
本发明的某些实施方案涉及包含基础培养基的基本培养基,所述基础培养基基本上由至少一种确定的碳源、至少一种确定的氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成。在某些实施方案中,基本培养基基本上由基础培养基组成。在某些实施方案中,确定的碳源包含C2碳源,并可选地包含至少一种选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖组成之组中的化合物。或者,在一些实施方案中,基本培养基中包含葡萄糖作为唯一碳源。在某些实施方案中,氮源是选自由尿素、磷酸铵、硝酸铵和硫酸铵组成之组中的化合物。在一些实施方案中,基本培养基包含大约0.5-5g硫酸铵/升;更优选大约0.5-2g/升的硫酸铵;最优选大约1-2g/升的硫酸铵。在某些实施方案中,基本培养基包含大约0.1-2g/升的尿素;更优选大约0.1-1g/升的尿素;最优选大约0.5-2g/升的尿素。在某些实施方案中,基本培养基可以包含碳酸钙。在某些实施方案中,基本培养基可以包含大约2.78g/升的碳酸钙。在某些实施方案中,基本培养基包含大约1000ppm Ca+2。在某些实施方案中,基本培养基包含大约5g-10g/升的葡萄糖。在某些实施方案中,基本培养基包含大约0.2g-2g/升的磷酸二氢钾;大约0.1g-1g/升的硫酸镁;大约5-50微克/升的硫酸铜;大约0.05-0.25mg/升的氯化铁;大约0.05-0.5mg/升的硫酸锰;大约0.05-0.25mg/升的钼酸钠;大约0.05-0.5mg/升的硫酸锌;大约0.5-2.5微克/升的生物素;大约0.5-4mg/升的肌醇;大约0.05-0.5mg/升的硫胺素。
在一些实施方案中,本发明的基本培养基可以包含大约5g-100g/升的葡萄糖或者大约0.1-1wt%乙醇,大约5g/升的硫酸铵或者大约1g/升的尿素,大约1g/升的磷酸二氢钾,大约0.5g/升的硫酸镁;大约40微克/升的硫酸铜;大约0.2mg/升的氯化铁;大约0.4mg/升的硫酸锰;大约0.2mg/升的钼酸钠;大约0.4mg/升的硫酸锌;大约2微克/升的生物素;2mg/升的肌醇;以及大约0.4mg/升的硫胺素。在某些实施方案中,基本培养基还包含大约0.1-1wt%乙醇。
本发明的某些实施方案涉及基本上由水、大约70g/升的葡萄糖,大约0.5wt%乙醇,大约1g/升的尿素,大约1g/升的磷酸二氢钾,大约0.5g/升的硫酸镁七水合物;大约2.78g/升碳酸钙,大约62.5微克/升五水硫酸铜;大约200微克/升氯化铁;大约450微克/升的一水硫酸锰;大约235微克/升的二水钼酸钠;大约712微克/升的七水硫酸锌;2微克/升的生物素;2000微克/升的肌醇;以及400微克/升的硫胺素盐酸盐组成的培养基。
本发明的某些实施方案涉及包含下述的培养基:大约400-1100ppm的N,大约215-287ppm的K+,大约525-700ppm的PO4 -2,大约49ppm的Mg+2,大约195ppm的SO4 -2,大约1100ppm的Ca+2,大约0.07ppm的Fe+3,大约0.145ppm的Mn2+,大约0.09ppm的Mo-4,大约0.16ppm的Zn+2,大约0.015ppm的Cu+2,大约0.002mg/升的生物素,大约2mg/升的肌醇,大约0.4mg/升的硫胺素盐酸盐,和水。
本发明的某些实施方案涉及具有包含外源性乳酸脱氢酶基因的基因组的重组酵母株,所述外源乳酸脱氢酶基因能够在重组酵母株中表达。表达产生的乳酸脱氢酶具有乳酸脱氢酶活性,并且为该重组酵母株在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时,它能够每100克葡萄糖产生至少大约50克的乳酸。优选地,该重组酵母株能够每100克葡萄糖产生大约50-85克的乳酸,最优选地,重组酵母株在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时,能够每100克葡萄糖产生大约70-85克的乳酸。该重组酵母株能够在低于大约3.5、优选低于大约2.8、更优选低于大约2.3、最优选低于大约2的pH下生长。
本发明的某些实施方案涉及生产乳酸的方法,包括在第一种培养基中需氧培养具有包含外源乳酸脱氢酶基因的基因组的重组酵母株,所述外源乳酸脱氢酶基因能够在该重组酵母株中表达,其中表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,所述重组酵母株在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时,它能够产生至少大约50克乳酸/100克葡萄糖,并且其中所述重组酵母株能够在低于大约3.5的pH下生长。
本发明的某些实施方案涉及通过选择过程回收的耐酸(AT)酵母株,所述选择过程包括在第一种需氧培养液中培养第一种酵母株(例如亲本株)。通过用第一种酵母株接种第一种基本培养基开始第一种需氧培养,所述第一种酵母株在培养基中培养时基本上不产生乙醇,并且包含具有能够表达的外源乳酸脱氢酶基因的基因组。在某些实施方案中,该第一种酵母株缺少丙酮酸脱羧酶活性或者乙醇脱氢酶活性中的至少一种。表达产生的乳酸脱氢酶蛋白具有乳酸脱氢酶活性。在某些实施方案中,第一种酵母株的野生型酵母株是克雷树效应阳性的。在第一种需氧培养物生长的过程中,培养液的pH下降。选择过程还包含确定第一种酵母株仍然能够在第一种基本培养基中生长的最低pH的步骤,以及在第一种需氧培养物仍然在生长、而pH在最低值附近时从第一种需氧培养物中回收至少一种第二种酵母株的步骤。在某些实施方案中,选择步骤还可以包含步骤(1)通过用回收的第二种酵母株接种新鲜的基本培养基开始培养第二种需氧培养物。在第二种需氧培养物生长过程中,培养液的pH下降。接下来,(2)在第二种需氧培养物仍然在生长、而培养物的pH低于第一种需氧培养物的大约最低pH时,从第二种需氧培养物中回收至少一种第三种酵母株。在一些实施方案中,步骤(1)和(2)重复至少一次,包括用从前一个重复中回收的酵母株接种新鲜的培养基。优选地,在最后一次重复中AT酵母株保持生长的需氧培养物的大约最低pH,要低于在前一个重复中AT酵母株保持生长的需氧培养物的大约最低pH。
本发明的某些实施方案涉及通过如下过程筛选出的不依赖于C2碳源(CI)的耐酸酵母株,该过程包含用其生长需要包含C2碳源的基本培养基的AT酵母株接种基本培养基。酵母株在使用第二种基本培养基的系列分批需氧培养物中培养。在系列培养开始时,第二种基本培养基包含葡萄糖和C2碳源作为唯一碳源,其浓度足以使酵母培养物生长。在系列分批培养进行中,C2碳源的浓度降低,每一次后续的分批培养都用在系列培养中前面的分批培养中生长的酵母进行接种。从系列分批培养中回收至少一个能够在没有C2碳源、使用葡萄糖作为唯一碳源的情况下生长的CI酵母株。在某些实施方案中,该AT株缺少丙酮酸脱羧酶活性或者乙醇脱氢酶活性中的至少一种。在一些实施方案中,该AT株可以是克雷树效应阳性的。
本发明的一些实施方案涉及生产乳酸或者其盐的方法。该方法包括在基本培养基中培养AT酵母株或者CI酵母株。所述酵母株和基本培养基如上所述。在一些实施方案中,由培养AT或者CI酵母株产生的培养液,与在基本上相同的基本培养基中在基本相同的培养条件下培养亲本株得到的培养液相比,包含更少ppm的下列各项中至少一种:甘油、赤藓醇、马来酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富马酸。
在其中培养AT或者CI酵母株以产生乳酸及其盐的培养基可以是基本培养基,其中包含至少一种选自以下各项的确定碳源:葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖。在某些实施方案中,其中的酵母株是不依赖于C2碳源的,该基本培养基包含葡萄糖作为唯一碳源。在其他实施方案中,AT酵母株是C2碳源依赖性的,且基本培养基包含基本上由葡萄糖和至少一种C2碳源组成的碳源。在某些实施方案中,基本培养基基本上由至少一种确定的碳源、至少一种确定的氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成,其中所述氮源选自由尿素、硫酸铵、磷酸铵和硝酸铵组成之组。在一些实施方案中,从得到的培养液中回收和纯化乳酸。纯化可以包含蒸馏、离子交换、纳米过滤(nanofiltration)或者溶剂提取中的至少一项。
在一些实施方案中,培养产生的培养液包含大于大约500mM的乳酸,更优选565mM的乳酸,最优选大于大约665mM乳酸。在某些实施方案中,AT或者CI酵母株能够在低于大约3.5、更优选低于大约2.8、最优选低于大约2.3的pH下产生乳酸。优选地,所产生的乳酸基本上由L-乳酸组成。在某些实施方案中,AT或者CI酵母株可以属于选自由以下各项组成之组中的属:酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,和克鲁维酵母属;更为优选地,该AT或者CI酵母株可以是酿酒酵母。在某些实施方案中,该AT或者CI酵母株可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH的酿酒酵母。AT或者CI酵母株可以在需氧分批培养、需氧补料分批培养或者需氧恒化器中培养。在某些实施方案中,来自AT酵母株培养的培养液与在基本上相同的基本培养基中在基本相同的培养条件下培养其亲本株得到的培养液相比,包含更少ppm的下列各项中的至少一种:甘油、赤藓醇、马来酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富马酸。乳酸或者其盐的生产方法还可以进一步包括通过例如蒸馏、离子交换、纳米过滤或者溶剂提取中的至少一项,对培养液进行纯化的步骤。
本发明的一个实施方案涉及保藏号为NRRL Y-30696的耐酸酵母株。本发明的另一个实施方案涉及保藏号为NRRL Y-30697和Y-30698的C2碳源非依赖性耐酸酵母株。
某些实施方案涉及包含至少500mM乳酸和第一组化合物的发酵培养液。更优选地,培养液包含至少大约565mM的乳酸,最优选至少大约665mM的乳酸。发酵中乳酸的mM数与第一组化合物的mM数的比例至少是大约54,更优选至少大约66,最优选至少大约184。第一组化合物由甘油、赤藓醇、甘露醇、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富马酸组成。优选地,发酵培养液的pH在大约2.3和2.4之间。优选地,发酵培养液是酿酒酵母的发酵产物,更为优选的是如上所述的重组酿酒酵母的发酵产物。产生发酵的培养可以在需氧分批培养、需氧分批补料培养或者需氧恒化器中进行。
本发明的某些实施方案涉及包含复制起点和与启动子有效连接的乳杆菌乳酸脱氢酶基因的质粒。该复制起点优选是本领域内已知的酵母复制起点,例如2μ复制起点。优选地,乳酸脱氢酶基因是L-乳酸脱氢酶基因。乳杆菌乳酸脱氢酶基因可以是任何一个在与启动子有效连接时能够在酵母中表达的乳酸脱氢酶基因。优选地,乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。启动子可以是被酵母识别的本领域内已知的任何启动子。优选地,启动子可被酿酒酵母识别。在某些实施方案中,启动子可以是磷酸丙糖异构酶启动子。在某些实施方案中,启动子可以是丙酮酸脱羧酶启动子,例如克鲁维酵母丙酮酸脱羧酶启动子。在其他实施方案中,启动子选自乙醇脱氢酶启动子和L-苏氨酸脱氢酶启动子。
日用品应用需要有经济合算的乳酸生产过程的开发。理想的是能够有酿酒酵母株,以及其它酵母,它们不产生乙醇但是产生乳酸。这些能够在化学成分确定的基本培养基中在低pH环境下、不需要C2化合物进行生长的酵母是合乎需要的。
附图的简要描述
图1是本发明一个实施方案的工艺流程图。
图2是YEpLpLDH的质粒图谱。
图3图示了包含外源乳酸脱氢酶基因的Pdc阴性酿酒酵母菌株的乳酸生产。
图4图示了本发明的耐酸酿酒酵母菌株的乳酸生产。
本发明的最佳实施方式
“丙酮酸脱羧酶”(Pdcp)指的是可以催化丙酮酸向乙醛转化的任何蛋白质(例如酶)。“PDC”指的是野生型的丙酮酸脱羧酶基因。″pdc″指的是突变型丙酮酸脱羧酶基因。“没有可检测量的丙酮酸脱羧酶活性”指的是使用以前描述的方法(van Maris,et al.2003),酵母中的丙酮酸脱羧酶活性低于0.005微摩尔·分钟-1·毫克-1蛋白的检测限度。可以使用本领域内已知的方法降低或者基本上去除酵母株中的丙酮酸脱羧酶活性。例如,可以突变、破坏丙酮酸脱羧酶结构基因、丙酮酸脱羧酶结构基因的启动子、调控丙酮酸脱羧酶结构基因表达的基因或者该调控基因的启动子,或者缺失该基因的至少一部分。而且,可以使用本领域内已知的其他方法改变基因的表达。例如,可以向酵母株中引入反义构建体,其降低丙酮酸脱羧酶mRNA向丙酮酸脱羧酶蛋白质的翻译。
“乳酸脱氢酶”(Ldhp)指的是催化丙酮酸向乳酸转化的蛋白质(例如酶)。″LDH″指的是野生型基因,它在表达时产生具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。″ldh″指的是突变型乳酸脱氢酶基因。如本发明中使用的,LDH可以包括本领域内名称不是乳酸脱氢酶、但在表达时产生具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因。乳酸脱氢酶基因可以是立体特异的。即乳酸脱氢酶基因可以催化反应而只产生L-乳酸或者D-乳酸。其他乳酸脱氢酶催化既产生L-乳酸又产生D-乳酸的反应。L-乳酸脱氢酶基因催化丙酮酸向L-乳酸的转化。
“Pdc阴性酵母株”指的是没有可检测的丙酮酸脱羧酶活性并且不能在需氧环境中在合成培养基中以葡萄糖作为唯一碳源生长的酵母。至少有一些Pdc阴性的菌株在基本培养中中在需氧环境中生长时不产生可检测量的乙醇(例如低于大约1ppm)。在需氧的葡萄糖限制型恒化器中在合成培养基中生长的Pdc阴性酿酒酵母,需要添加少量的C2碳源(例如乙醇、乙醛和/或乙酸盐)。Pdc阴性菌株的同基因野生型菌株是克雷树效应阳性的,具有可检测的丙酮酸脱羧酶活性(参见下面的讨论)。从克雷树效应阳性的野生型菌株中去除丙酮酸脱羧酶活性(例如通过破坏或者突变结构基因,或者破坏基因表达的调控等等)后可以产生不能在包含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中生长的Pdc阴性菌株。
“野生型酵母”指的是这样的酵母,当在其基因组中引入可遗传的遗传改变时,导致突变型酵母的产生。需要重申的是,突变酵母株具有与其野生型株不同的基因型,该不同表现在其基因组中引入了在野生型酵母株基因组中不存在的某些突变、删除或者插入。因此,野生型酵母株缺少在突变体酵母株基因组中存在的改变。在一些情况下,突变体酵母株可以与野生型菌株具有不同的基因型。突变体酵母株可以通过本领域内已知的方法制备,包括那些涉及同源重组、定向诱变或者随机诱变等等的方法。在某些情况下,突变体酵母株可以通过包括自然选择的过程回收。
“亲本酵母”指的是从中直接衍生新型酵母株的酵母。例如,亲本株可以包含在其基因组中具有外源乳酸脱氢酶基因、生长需要C2碳源(参见下面)的酵母。具有乳酸脱氢酶基因的耐酸酵母株可以通过对耐酸的选择过程而由自亲本株衍生得到。耐酸的依赖于C2碳源的酵母株继而又可以成为通过对耐酸酵母株进行不依赖于C2碳源的选择过程得到具有乳酸脱氢酶基因的、不依赖于C2碳源的耐酸酵母株的亲本株。在一些情况下,亲本酵母株也是野生型株,尽管这并不是必需的。
″不依赖于C2碳源的酵母株”指的是基本上不产生乙醇并且在以葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基上培养时不需要C2碳源的酵母。不依赖于C2碳源的酵母株可以通过处理(例如选择或者定点诱变等等)在其中葡萄糖是仅有的另一碳源的基本培养基中在需氧培养下生长需要C2碳源的亲本株(基本上不产生乙醇)而产生。
“耐酸酵母”指的是在低于其亲本株能够产生乳酸的pH下能够产生乳酸的酵母。耐酸酵母在需氧环境下生长时不能产生可检测量(例如低于1ppm)的乙醇。对于分批培养中的酿酒酵母,本发明的某些耐酸酿酒酵母能够产生乳酸的pH低于大约4。
“克雷树效应(crabtree effect)”定义为酵母株在(a)包含过量氧气和过量糖(例如碳水化合物)的环境下(在某些实施方案中“过量糖”是大约1mM以上的浓度)或者(b)酵母株的特异生长速率高于在葡萄糖上的临界特异生长速率(例如在葡萄糖上最大特异生长速率的大约三分之二)的培养基中进行的乙醇发酵。如果一个酵母株表现出克雷树相应,则它是“克雷树效应阳性”,并且克雷树效应阳性的酵母株在存在过量的糖时使用丙酮酸脱羧酶途径作为其主要的丙酮酸脱羧途径。克雷树效应阳性的酵母的示例可以在酿酒酵母,光滑假丝酵母(也被称为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)等),Zygosaccharomyces bailii和粟酒裂殖酵母等等中找到。“克雷树效应阴性酵母株”使用丙酮酸脱氢酶复合反应作为其丙酮酸脱羧的主要机制。当在需氧情况下糖过量时生长,在克雷树阴性酵母株中几乎没有乙醇发酵,主要进行的是呼吸型丙酮酸代谢途径。在克雷树阴性酵母株中去除丙酮酸脱羧酶活性看起来对于利用糖进行需氧生长没有影响。克雷树阴性酵母的示例可以在产朊假丝酵母(Candida utilis),马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中找到。
属于“培养基”指的是包含充足营养物质(包括至少一种碳源)、微生物(例如酵母)可以在其上生长的固体或者液体培养基。在恒化器、分批补料或者分批培养中,培养基是液体。
“碳源”指的是有机化合物(例如确定的碳源,如葡萄糖等等)或者有机化合物的混合物(例如酵母提取物),它们可以被微生物(例如酵母)同化,用于制造新的细胞物质。有机化合物混合物可以是复合碳源(其中的确切组分和/或有机成分的量是未知的)或者是由已知的有机化合物(例如葡萄糖、果糖、麦芽糖等等)以已知的量组成的确定碳源。在某些情况下,复合碳源也可以用作复合氮源。复合碳源的示例包括淀粉、麦芽葡萄糖、纤维素水解物以及淀粉水解物等等,它们与酶组合在一起产生葡萄糖。确定的碳源优选是至少大约90wt%纯,更为优选是大约95wt%纯,最优选是大约98wt%纯。例如,如果葡萄糖是唯一的碳源,则该碳源将包含至少大约90%的葡萄糖。如果葡萄糖和果糖是确定碳源的组分,则至少大约90%的碳源是葡萄糖和果糖。确定的碳源优选地包含最少量的高级糖类。
“C2碳源”指的是具有两个碳的碳源。C2碳源的示例有乙酸盐、乙醛和乙醇。
“基本培养基”或者“合成培养基”指的是用于培养微生物(例如酵母)、包含氮源、盐类、微量元素、维生素以及碳源的培养基,这些成分都是确定的。碳源可以包含葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖或者果糖等中的至少一种。基本培养基包含非蛋白质氮源。合成培养基不包含例如组成不确定的营养物来源,例如玉米浆、酵母提取物或者蛋白胨等等,它们可以用在复合培养基中。
“能够在液体培养基中生长”指的是微生物(例如酵母)在引入到液体培养基中后在适当的培养条件下(例如pH和温度等)进行复制、从而使培养物的生长阶段内培养物的生物量增加的能力。
“在液体培养基中培养”指的是在液体培养基中微生物的生长和/或微生物产生的乳酸的连续积累。
“恒化器”指的是使微生物(例如酵母)可以进行连续培养的装置,其中的特异生长速率和细胞数目可以被独立地控制。连续培养基本上是恒定体积的流动系统,向其中连续加入培养基,并且可以有任何溢流的连续取出。这样的系统一旦处于平衡中,则细胞数目和营养物的状态保持恒定,系统处于稳定状态之中。恒化器可以通过稀释速率和改变限制性营养物如碳或氮源的浓度而对培养物的细胞群密度和特异生长速率进行控制。
本领域内已知恒化器可以用于微生物突变体的选择中。当培养物生长在恒化器中时,通过改变条件(例如降低接种菌株生长所需的第二种碳源的浓度等),那些在改变后的条件下在群体中能够生长更快的微生物将被选择出来,其生长优于在新的条件下生长不好的微生物。通常,这种选择需要在恒化器培养的生长阶段内持续增加或者减少至少一种培养基的组分。
“分批培养”指的是密闭的微生物培养,其生长在固定体积的培养基中进行,培养基由于生长中的微生物的作用而连续改变,直至不再适于生长。在分批培养中,除了在需氧培养中的分子氧之外,在培养之前所有微生物生长所需的营养物质都存在于培养基中。在本领域内已知在分批培养中对微生物进行延长培养(例如摇瓶)可以用于选择在接种菌株不能生长或者生长不好的条件下生长相对较好的自发突变体。
“系列分批培养”包括将第一种酵母株的第一个分批培养物接种于具有至少一种确定组分(即某种碳源的浓度)的培养基中,这种组分将要在该系列的过程中被改变。将已经生长的第一个分批培养物的一份用于接种第二个分批培养基。然后已经生长的第二个分批培养物的一份用于接种第三个分批培养基,等等。在一个系列中步骤的数目可以不同。在系列培养的过程中,增加或者降低该确定组分的浓度。选择那些在该系列中的一个给定步骤(例如分批培养)中的条件下能够生长最好的微生物(例如比在该特定培养条件下生长不如它好的其他微生物)更好地生长,用作下一个分批培养的接种物。这样,在整个系列过程中,可以选择能够在第一种酵母株不能生长的条件下生长或者在相同的生长条件下其生长优于第一种酵母株的微生物。在本领域内已知接下来从已经选择的培养物中分离单个的纯菌株。这可以通过取少量培养生物划线涂平板进行,或者通过本领域内已知的其他方法进行。
“分批补料培养”指的是一种培养技术,其中在微生物培养过程中向培养容器或者发酵罐中的培养基中加入一种或者更多营养物质。与恒化器相反,在培养过程中微生物一直保留。在一些情况中,所有的营养物质均逐步加入到发酵罐中。时间条件、温度条件、pH条件、通气条件和特定营养物质加入到发酵罐中的速率取决于使用的具体菌株。
“选择”指的是将酵母置于有利于具有一个特定基因型或者多个特定基因型的细胞生长的条件下。特定基因型(通常是遗传突变的结果)使被选择的酵母在某些环境条件下具有优势,这样被选择的酵母的后代能够优于亲本生长和/或取代亲本。
术语“基因”指的是染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成的DNA或者其他编码肽、多肽、蛋白质或者RNA分子的DNA,以及编码序列侧翼的参与表达调控的区域。
“突变”指的是核酸序列的任何改变或变化。存在几种类型,包括点突变、移框和剪接的改变。可以特异地或者随机进行突变。
“开放阅读框(ORF)″指的是编码肽、多肽或者蛋白质的DNA或RNA区域。
术语“启动子”或者“启动子区域”指的是包含通过提供RNA聚合酶的识别位点和/或在正确位点起始转录所需要的其他因子,控制信使RNA(mRNA)产生的元件的DNA序列。
“质粒”指的是环形的、染色体外的自我复制型DNA段。
术语“基因组”包括宿主细胞内的染色体和质粒。
“2μ质粒”指的是能够在某些酵母细胞(例如酿酒酵母)中复制的酵母克隆载体。某些可能位于质粒上的基因在质粒上与被酵母宿主细胞(例如转化了该2μ质粒的酵母)识别和使用的启动子有效连接后可以被表达。
“转录”指的是从DNA模板产生互补RNA的过程。
“翻译”指的是从信使RNA产生蛋白质。
“浓度至少是”指的是在特定的酵母培养物中能够达到的最低浓度(例如克乳酸/升或者mM)。
如在本发明中的使用,“乳酸”包括未解离的乳酸和乳酸盐。这样,Xg乳酸/100g葡萄糖指的是相对于向发酵中补饲的每100g葡萄糖而言,未解离的乳酸和乳酸阴离子组合的总量。如果发酵物的pH值在3.0和4.5之间,则会有相当大量的乳酸以未解离的形式存在。实际上,在25℃、pH3.0时,未解离的乳酸与乳酸根的摩尔比是大约7.0;在25℃、pH大约4.5时,这个比例是大约0.23。在溶液中存在的未解离乳酸的总量是溶液pH和混合物中乳酸总浓度的函数。溶液pH越低,以未解离的形式存在的乳酸的百分比就越高,例如,当培养基的pH等于乳酸的pKa(大约3.8)时,50%的乳酸以未解离的形式存在。在pH4.2时,大约31%的乳酸未解离,在pH4.0和3.9时,分别有大约41%和47%的乳酸未解离。在更高的pH下,未解离的乳酸的分数更低,在pH4.5时是18%,在pH5.0时是6.6%。
“发酵培养液”指的是当微生物(例如酵母)在液体发酵培养基中培养后产生的培养液。发酵培养液包含液体发酵培养基中任何未利用的组分以及生物体发酵产生的任何代谢物或者产物。
应当注意,这里提到的某些物种的名称,例如光滑球拟酵母,可以指的是Barnet,Payne和Yarrow(1)在物种描述中给出的名称。
本发明的某些实施方案可以参考图1更好地理解。在培养基中培养时基本上不产生乙醇的酵母株(例如Pdc-酵母株)10可以具有引入到其基因组中的外源性L-乳酸脱氢酶基因,产生酵母株20。优选地,外源LDH基因是L-乳酸脱氢酶基因。在某些实施方案中,酵母10是没有丙酮酸脱羧酶活性的克雷树效应阳性的酵母。在某些实施方案中,酵母10属于选自由酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,有孢圆酵母属,克鲁维酵母属,接合酵母属和德克酵母属组成之组中的属。更为优选地,酵母株属于酵母属。酵母株可以是属于耐热克鲁维酵母,Zygosaccharomyces bailii,酿酒酵母,粟酒裂殖酵母,Torulaspora globosa,Torulaspora delbruckii,Dekkerabruxellensis,或者光滑假丝酵母(也被称为光滑球拟酵母)的种,优选地,酵母株属于酿酒酵母或光滑假丝酵母;更优选地,酵母株属于酿酒酵母。优选地,酵母株属于酿酒酵母,该酵母株具有的基因型是pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP。在一些实施方案中,酵母是具有基因型pdc1,5,6Δ(例如部分或者完全破坏了PDC 1,5,6结构基因)的酿酒酵母。
优选地,酵母是非致病性的。酵母能够在需氧分批培养中或者在需氧的恒化器中,在适当的生长培养基中生长。
在一些实施方案中,酵母株10可以是对于ura、leu或者his等等营养缺陷的。在某些实施方案中,酵母株是ura-。
酵母株10具有至少一个外源乳酸脱氢酶基因(例如编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质)引入其基因组中产生trLDH(使用LDH转化的)酵母株20。外源乳酸脱氢酶基因的引入可以使用本领域内已知的方法进行(例如转化和电穿孔等等)。tr-LDH酵母株20的基因组包含外源乳酸脱氢酶基因。即,酵母株20的至少一条染色体可以包含至少一个外源乳酸脱氢酶基因和/或该酵母株中至少一个质粒可以包含外源乳酸脱氢酶基因。如果酵母株10是营养缺陷的,则外源乳酸脱氢酶基因的引入可以这样进行,同时引入使tr-LDH酵母株20不再是营养缺陷型的另一基因。这可以使用本领域内已知的方法进行。
如这里所使用的,外源乳酸脱氢酶基因可以是(1)来自另一个生物体的基因,(2)来自相同物种或者菌株(例如亲本株酵母10)的基因,或者(3)已经进行了遗传修饰的(1)或(2)的基因(例如改变了密码子用于改善在酵母株10中的表达,定位或者随机突变等等)。优选地,外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌,牛,干酪乳杆菌,巨大芽孢杆菌,米根霉,或嗜热脂肪芽孢杆菌的经修饰或者未经修饰的乳酸脱氢酶基因,更为优选地,它是未经修饰的乳酸脱氢酶基因。更为优选地,外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。优选地,乳酸脱氢酶基因是L-乳酸脱氢酶基因。
优选地,外源乳酸脱氢酶基因与启动子有效连接。启动子可以被例如酵母株10识别。即,该启动子可以启动外源乳酸脱氢酶基因在被转化的酵母20中的转录。在某些实施方案中,启动子可以是磷酸丙糖异构酶启动子(tpi)。其他可以在某些实施方案中使用的启动子包括丙酮酸脱羧酶启动子,乙醇脱氢酶启动子,以及L-苏氨酸脱氢酶启动子。优选地,使用的启动子是在宿主生物体中强的组成型启动子。在某些实施方案中,与外源乳酸脱氢酶基因连接的启动子是克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶启动子。
当tr-LDH酵母20中的至少一个质粒包含外源乳酸脱氢酶基因时,该质粒优选地是高拷贝的质粒。在某些实施方案中,质粒可以是2μ质粒或者低拷贝数着丝粒质粒。优选地,具有外源乳酸脱氢酶基因的质粒是具有与外源乳酸脱氢酶(LDH)基因有效连接的磷酸丙糖异构酶启动子(tpi)的2μ质粒。在某些实施方案中,使用包含与tpi启动子有效连接的植物乳杆菌L-乳酸脱氢酶基因的2μ质粒转化(例如通过现有技术中已知的方法)酵母株10(例如Pdc阴性酿酒酵母菌株)。在一些实施方案中,乳酸脱氢酶基因是L-乳酸脱氢酶基因。
使用多拷贝数的质粒转化可以使转化后的酵母株20基因组内具有一拷贝以上的外源乳酸脱氢酶基因。在某些实施方案中,可以向酵母株的染色体中引入多拷贝的乳酸脱氢酶基因(例如通过同源重组或者插入等等)。可以向一条染色体中引入多拷贝或者将多拷贝引入不同染色体上的位点。在某些实施方案中,外源乳酸脱氢酶基因可以位于tr-LDH菌株20内的染色体和质粒二者上。
可以对tr-LDH菌株20进行选择以得到耐酸的(AT)酵母株30。对于选择过程,将tr-LDH菌株20需氧生长在包含葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖中至少一种的基本培养基中。在某些实施方案中,tr-LDH酵母株20是C2碳源依赖性的,基本培养基中可以包含C2碳源。优选地,基本培养基中包含葡萄糖和C2碳源。
在某些实施方案中,使用tr-LDH酵母株20接种分批培养的培养基。监测培养物的生长过程以及pH的改变和所产生的乳酸(以及其盐)的量。估计tr-LDH酵母株20仍然能够生长并产生乳酸的最低pH。培养tr-LDH酵母株20的培养物,在培养物达到其仍然能够生长的最低pH时取出一份培养物。将取出的该份培养物接种下一个分批培养,在酵母细胞仍然能够生长并产生乳酸的(a)与前一个分批培养相同的低pH下或者(b)低于前一个分批培养的pH下取出一份培养物。可以使用这小份接种下一个分批培养。重复该步骤多次,直至回收的酵母株(例如耐酸酵母)30能够生长的pH低于tr-LDH亲本株20能够生长的pH。与亲本株(例如Pdc阴性的tr-LDH酵母株20)相同,耐酸的(AT)酵母株30基本上不产生乙醇,且其基因组包含能够在AT酵母株30中有效表达的外源乳酸脱氢酶基因。
在某些实施方案中,AT酵母株30可以从恒化器中回收。需氧培养的恒化器培养物使用基本培养基从tr-LDH酵母株20开始。在一些实施方案中,基本培养基包含C2碳源。在酵母培养物的培养过程中,基本培养基的pH逐渐降低,然后可以从恒化器中回收可以在低于tr-LDH酵母株20生长的pH下生长的AT酵母株30。在某些实施方案中,AT酵母株30可以在培养物达到在培养物中的酵母仍然能够生长时的最低pH下回收。AT酵母株30如上面描述。
在某些实施方案中,如上面描述选择的C2碳源依赖型AT酵母株30,在包含C2碳源以及至少一种碳源(例如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖中至少一种)的基本培养基中培养时,能够在pH2.3和2.4之间产生多于大约500mM的乳酸。在某些实施方案中,基本培养基可以包含葡萄糖和C2碳源作为唯一碳源。在某些实施方案中,C2碳源依赖型AT酵母株30在包含C2碳源以及至少一种其他碳源的基本培养基中培养时,可以产生多于565mM的乳酸。C2碳源依赖型AT酵母株能够在pH低于大约3.5、优选在pH低于大约2.8,更为优选pH低于大约2.3时产生乳酸。
可以使用C2碳源依赖型AT酵母株30接种基本培养基进行一系列需氧分批培养。在系列开始时,基本培养基中可以包含葡萄糖和C2碳源作为唯一碳源,其浓度足以使酵母培养物生长。C2碳源的浓度在系列分批培养过程中降低,每一个后续的分批培养物都可以使用来自该系列中更早的分批培养物中生长的酵母进行接种。可以从系列分批培养液中回收能够在没有C2碳源、具有葡萄糖作为唯一碳源时生长的、耐酸的C2碳源非依赖型(CI)的酵母株40。
或者,可以使用C2碳源依赖型AT酵母株30接种含有如上描述的基本培养基的需氧恒化器(例如包含C2碳源),C2碳源的浓度可以随着恒化器中AT酵母株的培养进程降低。一旦C2碳源耗尽,就可以从恒化器中回收CI酵母株40。
由于CI酵母株40来自AT酵母株30,它可以包含外源乳酸脱氢酶基因,该基因是植物乳杆菌,牛,干酪乳杆菌,巨大芽孢杆菌,米根霉,或者嗜热脂肪芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因。外源乳酸脱氢酶基因可以位于CI酵母株40的染色体和/或质粒(例如2μ质粒)上。优选地,CI酵母株40能够在低于大约3.5的pH下、更优选在低于大约2.8的pH下、最优选在低于大约2.3的pH下产生乳酸。优选地,CI酵母株40在基本培养基中需氧培养时能够在培养液中产生多于大约565mM的乳酸,更为优选多于大约665mM的乳酸。CI酵母株40可以选自由酿酒酵母,耐热克鲁维酵母,Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母和光滑假丝酵母组成之组。在某些实施方案中,CI酵母株可以是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH的酿酒酵母。CI酵母株能够在需氧的分批培养中、需氧分批补料培养中或者需氧恒化器中生长。
本发明的一个方面涉及能够在化学成分确定的基本培养基中生长的酿酒酵母及其它酵母的特征。加入最少量的营养物质,产生的发酵培养液中将含有更少量的不需要的残留有机和无机杂质以及生物体分泌的代谢中间物。在某些实施方案中,从加入最少量营养物质产生的发酵培养液中回收和纯化乳酸可以显著降低生产成本。因此,优选地使用基本培养基用于乳酸发酵工艺。提供的营养物质足以使生长进行并且维持代谢,而没有营养物质的过量。AT和CI酵母可以在基本培养基中生长。
本发明的基本培养基可以包含基础培养基,该基础培养基基本上由至少一种确定的碳源、至少一种确定的氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成。在某些实施方案中,基本培养基基本上由该基础培养基组成。当某些C2碳源依赖型AT酵母株在这种培养基中培养时,培养基中可以包含至少一种C2碳源。在培养AT或CI菌株时可以属于培养基一部分的其他碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖。在某些实施方案中,在基本培养基中培养CI菌株或者不依赖C2碳源的AT菌株时,葡萄糖可以是唯一碳源。
在某些实施方案中,基本培养基中包含水、大约5-100g/升的葡萄糖。在某些实施方案中,培养基中还包含0.1-1wt%的乙醇。在某些实施方案中,基本培养基中还包含碳酸钙,优选是大约2.78g/升的碳酸钙。在某些实施方案中,基本培养基中包含大约1000ppmCa+2。在某些实施方案中,基本培养基中的氮源可以是选自由尿素、硫酸铵、硝酸铵和磷酸铵组成之组中的化合物。在某些实施方案中,基本培养基中包含大约0.5-5g/升的硫酸铵;更优选大约0.5-2g/升的硫酸铵;最优选大约1-2g/升的硫酸铵。在某些实施方案中,基本培养基中包含大约0.1-2g/升的尿素;更优选大约0.1-1g/升的尿素;最优选大约0.5-2g/升的尿素。
在某些实施方案中,基本培养基中包含水,大约0.2-2g/升的磷酸二氢钾;大约0.1-1g/升的硫酸镁;大约5-50微克/升的硫酸铜;大约0.05-0.25mg/升的氯化铁;大约0.05-0.5mg/升的硫酸锰;大约0.05-0.25mg/升的钼酸钠;大约0.05-0.5mg/升的硫酸锌;大约0.5-2.5微克/升的生物素;大约0.5-4mg/升的肌醇;以及大约0.05-0.5mg/升的硫胺素。
在一些实施方案中,本发明的基本培养基可以包含水,大约5-100g/升的葡萄糖或者大约0.1-1wt%的乙醇,大约5g/升的硫酸铵或者大约1g/升的尿素,大约1g/升的磷酸二氢钾,大约0.5g/升的硫酸镁;大约40微克/升的硫酸铜;大约0.2mg/升的氯化铁;大约0.4mg/升的硫酸锰;大约0.2mg/升的钼酸钠;大约0.4mg/升的硫酸锌;大约2微克/升的生物素;大约2mg/升的肌醇;以及大约0.4mg/升的硫胺素。
如上面的解释,AT或者CI酵母可以在基本培养基中培养以产生乳酸。所产生的发酵培养液可以具有2.3和2.4之间的pH。在某些实施方案中,发酵培养液包含至少大约500mM的乳酸和由甘油、赤藓醇、甘露糖醇、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富马酸组成的第一组化合物。发酵培养液中乳酸的mM数与第一组化合物的mM数的比例可以是至少大约54。优选地,发酵培养液包含至少大约565mM的乳酸,更优选地至少大约665mM的乳酸。在某些实施方案中,在pH2.3-2.4下生产乳酸。优选地,乳酸的mM数与第一组化合物的mM数的比例大于大约66,最优选大于大约184。优选地,与在基本上相同的基本培养基中、在基本上相同的培养条件下培养其亲本株产生的培养液相比,培养AT酵母株产生的培养液将包含更低ppm的甘油、赤藓醇、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富马酸中的至少一种。可以使用本领域内已知的方法纯化AT或CI酵母发酵产生的发酵培养液,回收乳酸。纯化可以包含蒸馏、离子交换、纳米过滤或者溶剂提取中的至少一项。
包含了以下实施例以示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员应当理解,在下文实施例中公开的技术代表的是发明者发现的在本发明实施中运行良好的技术,因此可以被认为是实施本发明的优选方法。但是,根据本公开内容,本领域内的技术人员应当理解,在公开的具体实施方案中可以进行许多改变,仍得到同样或者类似的结果,而不偏离本发明的精神和范畴。
在接下来的实施例中使用以下的菌株。
表1使用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株
菌株 描述
CEN.PK 113.7D MATa URA3 PDCI PDC5 PDC6
具有丙酮酸脱羧酶活性的野生型酵母
CEN.PK182 MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷
loxP pdc6(-6,-2)∷loxP
Pdc阴性酵母
CEN.PK111-61A MATa ura3-52 leu2-112 his3-Δ1
ura-酵母
RWB837 MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)
∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52
Pdc阴性ura-酵母
RWB876 MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)
∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH
具有外源乳酸脱氢酶活性的Pdc阴性酵母
m850-a MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)
∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH
具有外源乳酸脱氢酶活性的Pdc阴性酵母,
耐酸的
Lp4和Lp4f MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)
∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH
具有外源乳酸脱氢酶活性的Pdc阴性酵母,
耐酸的,C2碳源非依赖型
LDH来自植物乳杆菌,参见图2中YELpLDH的图谱
一方面,本发明公开并请求保护下述内容:本文所公开的生产乳酸、酸耐受以及C2碳源非依赖型的真菌细胞和细胞培养物,尤其是酿酒酵母菌株的细胞,这些细胞包括RWB876及其衍生物,包括m850-a、Lp4和Lpf,特别是那些产生乳酸的细胞;那些产生乳酸并且也耐酸的细胞;或者是那些产生乳酸、耐酸并且不依赖于C2碳源的细胞。
这些细胞和细胞培养可以是基本上生物纯的培养物,其中包含、基本上由或者由单一菌株组成。本发明例证性的菌株生物纯培养物实施方案有具有外源乳酸脱氢酶活性的RWB876(MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH)Pdc阴性酵母;具有外源乳酸脱氢酶活性、耐酸的m850-a(MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52 YEpLpLDH)Pdc阴性酵母;具有外源乳酸脱氢酶活性、耐酸、不依赖于C2碳源的Lp4和Lp4f(MATa pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6.-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH)Pdc 阴性酵母,它们已经以生物纯培养物的形式,已经按照一定的条件作了保藏,该条件能够确保在本专利申请的待审期间,由美国专利商标委员会确定根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122的规定有此权利的人可以获得这些培养物。在提出了本申请的同族申请或子申请的国家,根据外国专利法需要,也可以获得这些保藏物。但是,应当理解,这种保藏物的可获得性不应构成由违背政府行为授予的专利权而实施本发明的许可。
此外,此处的培养物保藏物是按照微生物保藏布达佩斯条约的规定作出保藏并向公众提供的,即它们将以足够的小心进行贮存,能够使它们在最近一次请求提供保藏物样品之后保持存活和未被污染状态至少五年的时间,并且在任一情形下,能够自保藏为起保持这种状态至少30年,或者是可能授权的、公开该培养物的任何专利的任何有效期内。保藏人认可,在保藏机构按请求提供样品时,由于保藏物的状况而无法如此时,替换保藏物的责任。所有关于这些保藏物对公众可获得性的限制在公开它们的专利授权之后均不可撤销地消除了。
培养物RW876,m850-a,Lp4和Lp4f于2003年10月21日根据布达佩斯协约保藏于Northern Regional Research Center(NRRL),Agricultural Research Service Culture Collection(NationalCenter for Agricultural Utilization Research,US Department ofAgriculture,1815 North University Street,Peoria,Illinois61604,U.S.A)的永久收藏中,并分别给予登录编号Y-30696,Y-30697,和Y-30698。以前已经保藏了CEN.PK113.7D,CEN.PK182,CEN.PK111-61A,RWB837,它们分别具有登录编号NRRL Y-30646,NRRLY-30647,NRRL Y-30648,和NRRL Y-30649。
实施例1在化学成分确定的基本培养基中摇瓶培养生产乳酸
使用RWB876菌株和M1培养基进行发酵,M1培养基的组成在下面的表2中列出。
表2 M1培养基
碳源 | |
葡萄糖 | 70g/L |
乙醇 | 0.5% |
氮源和盐类 | |
尿素 | 1.0g/L |
KH2PO4 | 1.0g/L |
MgSO4·7H2O | 0.5g/L |
CaCO3 | 2.78g/L |
微量元素溶液 | |
CuSO4·5H2O | 62.5μg/L |
FeCl3 | 200μg/L |
MnSO4·H2O | 450μg/L |
Na2Mo4·2H2O | 235μg/L |
ZnSO4·7H2O | 712μg/L |
维生素 | |
生物素 | 2μg/L |
肌醇 | 2000μg/L |
硫胺素盐酸盐 | 400μg/L |
制备50%的葡萄糖储液,与培养基的其他成分分开高压灭菌,最后在培养基中加入葡萄糖溶液达到70g/升的终浓度。在冷却的高压灭菌培养基中加入乙醇。
在培养基中加入Ca+2源,以使细胞更好地保持其活性和生理状态。在本实施例中,总共加入了1112ppm的Ca+2。M1培养基的pH未调整。
在含有100ml(终体积)M1培养基的250ml装有三层挡板的摇瓶中进行发酵。在32℃下,在New Brunswick G-25摇床中发酵,振荡速度180rpm。菌株RW876在M1培养基中发酵的结果描绘于图3中。随着乳酸浓度的升高,RW876培养液的pH持续下降。该生物体能够在pH大约3.0时生长,但是随着pH进一步降低,培养物的生长停止,细胞开始死亡。在OD660nm处测定的细胞密度的降低表明了细胞的死亡。
酿酒酵母细胞一般在pH低于大约3.0的培养基中不生长。在低pH下(例如随着乳酸的积累)能够持续产生乳酸的细胞是合意的。将发酵结束时(其中培养基的pH已经降低到2.80)存活的细胞转移到新鲜培养基中,选择在pH低于大约3.0下持续生长的耐酸细胞。重复转移过程,并且转移时的pH逐渐从2.80降低到2.70,最后降低到2.60。在每一次转移之后,让存活的细胞生长并产生乳酸长达48小时。总共进行21次连续转移,以获得耐酸的突变体,称为m850-a。再进行另外五次连续转移,以稳定突变体。
实施例2耐酸突变体m850-a及其亲本株RWB876发酵的比较
在本实施例中,将生长在M1培养基中的耐酸突变体m850-a的乳酸产生能力与其亲本株RWB876的乳酸产生能力进行比较。在M1培养基中于摇瓶中进行发酵,使用实施例1中描述的条件。结果总结于下面的表3中。在pH低于大约3.0时耐酸突变体m850-a继续生长的能力使得它与其亲本株RW876相比,在其发酵培养液中积累更高浓度的乳酸。
表3
RWB876的发酵 | m850-a的发酵 | ||||||||
时间(hr) | OD | pH | glu.(g/L) | lact.(g/L) | OD | pH | glu.(g/L) | lact.(g/L) | |
0 | 3.34 | 5.72 | 70.40 | 0 | 3.36 | 5.70 | 71.70 | 0 | |
22 | 8.09 | 3.11 | 47.36 | 21.24 | 7.18 | 3.07 | 44.45 | 23.78 | |
39 | 8.69 | 2.90 | 31.58 | 35.24 | 8.57 | 2.78 | 25.87 | 42.13 | |
63 | 7.39 | 2.71 | 18.02 | 48.65 | 9.31 | 2.65 | 7.52 | 58.54 | |
76 | 6.47 | 2.68 | 15.23 | 50.56 | 9.00 | 2.60 | 3.34 | 62.35 |
*glu.=葡萄糖;lact.=乳酸
实施例3当耐酸突变体m850-a及其亲本株RWB876都在初始pH低的M1培养基中培养时,二者的比较
在摇瓶中,使用M1培养基,在实施例1中描述的条件下进行本实验,区别在于培养基的初始pH调整到3.50且不加入碳酸钙。结果总结于表4中。两个菌株都能够在没有碳酸钙时在pH3.50下开始生长。在低pH下,耐酸的突变体m850-a在发酵培养液中比其亲本株表现出生长并产生更高浓度乳酸的能力。
表4
RWB876的发酵 | ||||
时间(hr) | OD | pH | glu.(g/L) | lact.(g/L) |
0 | 3.04 | 3.50 | 73.80 | 0 |
21 | 5.85 | 2.43 | 57.00 | 11.45 |
31 | 6.54 | 2.36 | 54.61 | 16.35 |
44 | 6.68 | 2.34 | 50.45 | 20.76 |
68.5 | 6.67 | 2.33 | 45.12 | 24.12 |
79.5 | 6.69 | 2.33 | 43.67 | 24.99 |
m850-a的发酵 | |||
OD | pH | glu.(g/L) | lact.(g/L) |
3.00 | 3.50 | 73.50 | 0 |
6.04 | 2.41 | 56.40 | 12.60 |
6.76 | 2.34 | 50.61 | 18.24 |
7.20 | 2.31 | 45.40 | 24.52 |
8.16 | 2.27 | 38.16 | 30.36 |
6.72 | 2.27 | 36.15 | 32.62 |
*glu.=葡萄糖;lact.=乳酸
实施例4对实施例2的发酵培养液进行分析
生产聚合物级别乳酸的最终成本与去除发酵培养液中生成的杂质的成本是相关的。分析实施例2中的发酵培养液中乳酸的浓度和某些杂质的浓度。
向实施例2中进行的发酵中输入的营养物质(不包括乙醇和葡萄糖)是2.504g/升,对于菌株RWB876和菌株m850-a的发酵而言分别产生557.9mM和686.4mM的乳酸。对最后发酵培养液(例如菌株RWB876和菌株m850-a的培养液)进行多元醇和有机酸的HPLC分析,结果总结于表5中。RWB876的发酵产生出557.9mM的乳酸,以及总计为15.634mM的多元醇和其他有机酸。m850-a菌株的发酵培养液产生了总计为12.740mM的多元醇和其他有机酸,以及686.4mM的乳酸。这些发酵副产物(例如多元醇和有机酸)和某些未利用的培养基组分的至少部分去除是获得高纯度(例如聚合物级别)的乳酸是必要的。本发明的菌株在乳酸发酵过程中产生的杂质低于本领域内已知的某些产生乳酸的重组大肠杆菌菌株所产生的杂质(Chang,et al.1999)。
表5
菌株 | 葡萄糖(g/L) | 乳酸(g/L) | 甘油(ppm) | 赤藓醇(ppm) | 甘露醇(ppm) | 苹果酸(ppm) | 丙酮酸(ppm) | 琥珀酸(ppm) | 甲酸(ppm) | 富马酸(ppm) |
RWB876 | 15.10 | 50.21 | 895 | 114 | 0 | 20 | 214 | 198 | 32 | 2 |
m850-a | 3.38 | 61.78 | 798 | 123 | 0 | 21 | 121 | 78 | 39 | 2 |
实施例5 PDC阴性的酿酒酵母突变体能够使用葡萄糖作为唯一碳源(不依赖于C2)进行细胞生长和乳酸生产。
在摇瓶中,使用M1培养基,在实施例1中描述的条件下进行本实验,区别在于没有加入0.5%的乙醇。从C2碳源依赖型m850-a中分离两种耐酸的C2碳源非依赖型酿酒酵母菌株。使用一系列的分批培养分离这两个菌株,培养中的C2碳源浓度在系列中逐渐降低。如表6表示的,分离出了两个突变体菌株(例如Lp4(NRRL Y-30697)和Lp4f(NRRL Y-30698)),它们能够使用葡萄糖作为唯一碳源用于生长和乳酸的生产。在30次转移后分离出Lp4,在45次转移后分离出Lp4f。Lp4比Lp4f更不耐酸。这些突变体保持了它们在确定的培养基中(即使培养基不包含乙醇)在低pH下生长和产生乳酸的能力。
表6
Lp4的发酵 | Lp4f的发酵 | ||||||||
时间(hr) | OD | pH | glu.(g/L) | lact.(g/L) | OD | pH | glu.(g/L) | lact.(g/L) | |
0 | 3.56 | 5.65 | 67.60 | 0 | 3.48 | 5.57 | 67.60 | 0 | |
24 | 8.16 | 3.44 | 51.80 | 13.01 | 7.68 | 3.28 | 47.20 | 17.34 | |
44 | 10.48 | 3.08 | 34.64 | 25.72 | 8.96 | 2.90 | 23.70 | 37.32 | |
62.5 | 11.20 | 2.96 | 23.70 | 35.24 | 9.04 | 2.78 | 8.41 | 50.85 | |
71.5 | 12.80 | 2.90 | 18.60 | 38.22 | 10.88 | 2.75 | 5.35 | 53.85 |
*glu.=葡萄糖;lact.=乳酸
实施例6对实施例5的发酵培养液进行分析
对于实施例5中进行的发酵的营养物质输入(除了葡萄糖)是2.504g/升,菌株Lp4和菌株Lp4f的发酵分别产生410mM和577mM的乳酸。对最后的发酵培养液(例如菌株Lp4和Lp4f的培养液)进行多元醇和有机酸的HPLC分析,其结果总结于表7中。Lp4的发酵产生了410mM的乳酸,以及总计为6.214mM的多元醇和其他有机酸。Lp4f菌株的发酵培养液产生了总计为3.139mM的多元醇和其他有机酸,以及577mM的乳酸。这些发酵副产物(例如多元醇和有机酸)和某些未利用的培养基组分的至少部分去除将可获得高纯度(例如聚合物级别)的乳酸。这些不依赖于C2的突变体(例如Lp4和Lp4f)在乳酸发酵过程中产生的经分析的总杂质低于RWB876或者m850-a发酵产生的杂质。
表7
菌株 | 葡萄糖(g/L) | 乳酸(g/L) | 甘油(ppm) | 赤藓醇(ppm) | 甘露醇(ppm) | 苹果酸(ppm) | 丙酮酸(ppm) | 琥珀酸(ppm) | 甲酸(ppm) | 富马酸(ppm) |
Lp4 | 19.78 | 36.87 | 0 | 121 | 86 | 64 | 80 | 146 | 95 | 7 |
Lp4f | 6.44 | 51.90 | 0 | 73 | 0 | 33 | 108 | 123 | 0 | 3 |
实施例7在10L搅拌罐中培养耐酸突变体m850-a用于乳酸生产
在New Brunswick Bioflow 10-L发酵罐中进行发酵,工作容积是6L。培养基(M1)如实施例1所示。通气是0.33vvm,振荡是250rpm。温度控制在32℃。不对pH进行控制。
在罐内接种后,前22-24小时出现生长期。在生长期期间,保持乙醇浓度(通过补充25%的乙醇溶液)在3-4g/升。当细胞密度(OD660nm)达到10.0时,通过加入大约70g/升的葡萄糖和2.78g/升碳酸钙开始乳酸生产阶段。
随着发酵进行,pH继续降低,如图4所示。当葡萄糖浓度达到大约20g/升时,停止乙醇补饲,这样乙醇的浓度从3-4g/升逐渐降低到2-3g/升,最后降低到1-2g/升。发酵结束时,葡萄糖和乙醇都被耗尽。使用描述的条件,在81小时内从74g/升的葡萄糖得到大约61g/升的乳酸,最终的pH是2.60。
参考文献
以下的参考文献提供了示例性的步骤或者其他详情,对这里列出的步骤给予补充,这些参考文献在这里特别引用作为参考。
Buchta,K.1983.Lactic Acid,p.409-417.In Biotechnology,Vol.3,H.Delleweg(编).Verlag Chemie,Weinheim Germany.
Hongo,M.,Y.Nomura,and M.Iwahara 1986.Novel methodsof lactic acid production by electrodialysis fermentation.Appl.Environ.Microbiol.32:227-234.
Benninga,H.A.1990.A history of lactic acid making.Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,The Netherlands.
Hohmann,S.1997.p.187-211.In Yeast Sugar Metabolism,F.K.Zimmermann et al编.由Technomic Publishing Company,Inc.Lancaster,Pennsylvania,17604 U.S.A出版.
WO 99/19503 Carlson,et al.Low pH lactic acid fermentation(Priority date:14 Oct.1997)Barnett Payne and Yarrow.1995.Yeasts:characterization and identification,第二版,Cambridge University Press ISBN 052135056.
van Maris,A J.A.,M.A.H.Luttik,A.A.Winkler,J.P.van Dijken,and J.T.Pronk.2003.Overproduction of ThreonineAldolase Circumvents the Biosynthetic Role of PyruvateDecarboxylase in Glucose-grown Saccharomyces cerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.69:2094-2099.
Claims (128)
1.生产乳酸的方法,包括:将在培养基中培养时基本上不产生乙醇的耐酸(AT)酵母株在第一种培养基中进行需氧培养,其中所述AT酵母株包含含有能够在该AT酵母株中表达的外源性乳酸脱氢酶基因的基因组,其中表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,该AT酵母株能够在较其亲本酵母株生长的pH更低的pH下在基本培养基中生长。
2.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依赖于C2碳源的,能够在低于大约3.5的pH下产生乳酸。
3.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依赖于C2碳源的,能够在低于大约2.8的pH下产生乳酸。
4.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依赖于C2碳源的,能够在低于大约2.3的pH下产生乳酸。
5.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时能够每100克葡萄糖产生多于大约50克的乳酸。
6.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时能够每100克葡萄糖产生大约50-85克的乳酸。
7.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时能够每100克葡萄糖产生大约70-85克的乳酸。
8.权利要求1的方法,其中培养AT酵母株产生的培养液,与在基本上相同的基本培养基中在基本相同的培养条件下培养亲本株得到的培养液相比,包含更少ppm的下列各项中的至少一种:甘油、赤藓醇、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富马酸。
9.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株属于选自下述组中的属:酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,和克鲁维酵母属。
10.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株是酿酒酵母。
11.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxP ura3-52YEpLpLDH的酿酒酵母。
12.权利要求1的方法,其中的培养在需氧分批培养、需氧分批补料培养或者需氧恒化器中进行。
13.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株是不依赖于C2碳源的。
14.权利要求13的方法,其中所述第一种培养基是包含至少一种选自下述的确定碳源的基本培养基:葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖。
15.权利要求14的方法,其中葡萄糖是唯一的碳源。
16.权利要求1的方法,其中所述AT酵母株是依赖于C2碳源的,并且第一种培养基是包含基本上由葡萄糖和至少一种C2碳源组成的碳源的基本培养基。
17.权利要求1的方法,其中所述第一种培养基基本上由至少一种确定的碳源、至少一种氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成,其中所述氮源选自由尿素、硫酸铵、磷酸铵和硝酸铵组成之组。
18.权利要求1的方法,其中AT酵母株的染色体包含外源乳酸脱氢酶基因。
19.权利要求1的方法,其中在AT酵母株中存在至少一个包含该外源乳酸脱氢酶基因的质粒。
20.权利要求1的方法,其中所述外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌,牛,干酪乳杆菌,巨大芽孢杆菌,米根霉,或者嗜热脂肪芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因。
21.权利要求1的方法,其中所述外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。
22.权利要求1的方法,其中还包括回收和纯化乳酸或者其盐的方法。
23.权利要求22的方法,其中所述纯化步骤包含蒸馏、离子交换、纳米过滤或者溶剂提取中的至少一项。
24.在培养基中培养时基本上不产生乙醇的耐酸(AT)酵母株,其中所述AT酵母株包含含有能够在该AT酵母株中表达的外源乳酸脱氢酶基因的基因组,其中表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,该AT酵母株能够在比其亲本酵母株生长的pH更低的pH下在基本培养基中产生乳酸。
25.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株没有可检测量的丙酮酸脱羧酶活性。
26.权利要求25的AT酵母株,其中所述AT酵母株的野生型菌株是克雷树效应阳性的。
27.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够在pH低于大约3.5下产生乳酸。
28.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够在pH低于大约2.8下产生乳酸。
29.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够在pH低于大约2.3下产生乳酸。
30.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株在基本培养基中需氧培养时能够在培养液中产生大于大约500mM的乳酸。
31.权利要求30的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够产生大于大约565mM的乳酸。
32.权利要求30的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够产生大于大约665mM的乳酸。
33.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株属于选自由以下各项组成之组中的属:酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,有孢圆酵母属,克鲁维酵母属,接合酵母属和德克酵母属。
34.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株属于选自由以下各项组成之组中的属:酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,和克鲁维酵母属。
35.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株属于酵母属。
36.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是酿酒酵母。
37.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxPura3-52 YEpLpLDH的酿酒酵母。
38.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是耐热克鲁维酵母、Zygosaccharomyces bailii、粟酒裂殖酵母或者光滑假丝酵母。
39.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是不依赖于C2碳源的。
40.权利要求39的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够在包含选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖组成之组中的至少一种确定碳源的基本培养基上生长。
41.权利要求39的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中生长。
42.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株是依赖于C2碳源的,且该AT酵母株能够在包含基本上由葡萄糖和至少一种C2碳源组成的碳源的基本培养基上生长。
43.权利要求24的AT酵母株,其中AT酵母株能够在基本上由至少一种确定的碳源、至少一种确定的氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成的基本培养基上生长,其中所述确定的氮源选自由尿素、硫酸铵、磷酸铵和硝酸铵组成之组。
44.权利要求24的AT酵母株,其中AT酵母株的染色体包含外源乳酸脱氢酶基因。
45.权利要求24的AT酵母株,其中在AT酵母株中存在至少一个包含该外源乳酸脱氢酶基因的质粒。
46.权利要求24的AT酵母株,其中所述外源乳酸脱氢酶基因与启动子有效连接。
47.权利要求46的AT酵母株,其中所述启动子是磷酸丙糖异构酶启动子。
48.权利要求46的AT酵母株,其中所述启动子选自由丙酮酸脱羧酶启动子、乙醇脱氢酶启动子和L-苏氨酸脱氢酶启动子组成之组。
49.权利要求46的AT酵母株,其中所述启动子是克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶启动子。
50.权利要求24的AT酵母株,其中所述外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌,牛,干酪乳杆菌,巨大芽孢杆菌,米根霉或者嗜热脂肪芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因。
51.权利要求24的AT酵母株,其中所述外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。
52.权利要求24的AT酵母株,其中所述AT酵母株能够产生基本上由L-乳酸组成的乳酸。
53.在培养基中培养时基本上不产生乙醇的耐酸(AT)酿酒酵母,其中所述AT酿酒酵母包含含有能够在该AT酿酒酵母中表达的外源乳酸脱氢酶基因的基因组,其中表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,该AT酿酒酵母能够在比其亲本酿酒酵母株生长的pH更低的pH下在基本培养基中产生乳酸。
54.权利要求53的耐酸(AT)酿酒酵母,其中所述AT酿酒酵母没有可检测量的丙酮酸脱羧酶活性。
55.权利要求53的耐酸(AT)酿酒酵母,其中所述外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。
56.权利要求53的耐酸(AT)酿酒酵母,其中AT酿酒酵母中的至少一个质粒包含该外源乳酸脱氢酶基因。
57.权利要求53的AT酿酒酵母,其中所述AT酿酒酵母具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxPura3-52 YEpLpLDH。
58.权利要求53的AT酿酒酵母,其中所述AT酿酒酵母在基本培养基中需氧培养时能够在培养液中产生多于大约500mM的乳酸。
59.在培养基中培养时基本上不产生乙醇的C2碳源非依赖型(CI)耐酸酵母株,其中所述酵母株包含含有能够被表达的外源乳酸脱氢酶基因的基因组,其中表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,该酵母在需氧条件下在包含葡萄糖作为唯一碳源的第一种基本培养基中培养时能够产生乳酸,并且该CI酵母株能够在比其亲本株生长的pH更低的pH下在第一种基本培养基中产生乳酸。
60.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株没有可检测量的丙酮酸脱羧酶活性。
61.权利要求60的CI酵母株,其中该相同菌株的野生型酵母是克雷树效应阳性的。
62.权利要求59的CI酵母株,其中所述外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌,牛,干酪乳杆菌,巨大芽孢杆菌,米根霉,或者嗜热脂肪芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因。
63.权利要求59的CI酵母株,其中所述外源乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。
64.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株的染色体包含该外源乳酸脱氢酶基因。
65.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株中存在至少一个包含该外源乳酸脱氢酶基因的质粒。
66.权利要求65的CI酵母株,其中所述至少一个质粒是2μ质粒。
67.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能够在低于大约2.8的pH下产生乳酸。
68.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能够在低于大约2.3的pH下产生乳酸。
69.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在基本培养基中培养时能够产生多于大约50克乳酸/100克葡萄糖。
70.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在基本培养基中培养时能够产生大约50-85克的乳酸/100克葡萄糖。
71.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在基本培养基中培养时能够产生大约70-85克的乳酸/100克葡萄糖。
72.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株在第二种基本培养基中需氧培养时,能够在培养液中产生多于大约565mM的乳酸。
73.权利要求72的CI酵母株,其中所述CI酵母株能够产生多于大约665mM的乳酸。
74.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株属于选自由以下各项组成之组中的属:酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属,有孢圆酵母属,克鲁维酵母属,接合酵母属和德克酵母属。
75.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株属于选自由以下各项组成之组中的属:酵母属,假丝酵母属,裂殖酵母属和克鲁维酵母属。
76.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株选自由酿酒酵母,耐热克鲁维酵母,Zygosaccharomyces bailii,粟酒裂殖酵母和光滑假丝酵母组成之组。
77.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株是具有基因型pdc1(-6,-2)∷loxP pdc5(-6,-2)∷loxP pdc6(-6,-2)∷loxPura3-52 YEpLpLDH的酿酒酵母。
78.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能够在包含选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖组成之组中的至少一种确定碳源的第二种基本培养基中生长。
79.权利要求59的CI酵母株,其中所述CI酵母株能够在基本上由选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖组成之组中的至少一种确定碳源、选自由尿素、硫酸铵、磷酸铵和硝酸铵组成之组中的至少一种氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成的第二种基本培养基中生长。
80.基本上由至少一种确定的碳源、至少一种氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌、生物素、肌醇、硫胺素和水组成的基本培养基。
81.权利要求80的基本培养基,其中所述确定的碳源包含C2碳源。
82.权利要求81的基本培养基,其中所述确定的碳源还包含选自由葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖组成之组中的至少一种化合物。
83.权利要求80的基本培养基,其中葡萄糖是唯一的碳源。
84.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约5-100g/升的葡萄糖。
85.权利要求84的基本培养基,其中所述基本培养基包含0.1wt%-1wt%的乙醇。
86.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含碳酸钙。
87.权利要求80的基本培养基,其中所述氮源包含选自由尿素、硫酸铵、磷酸铵和硝酸铵组成之组中的至少一种化合物。
88.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约0.5-5g/升的硫酸铵。
89.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约0.5-2g/升的硫酸铵。
90.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约1-2g/升的硫酸铵。
91.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约0.1-2g/升的尿素。
92.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约0.1-1g/升的尿素。
93.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约0.5-2g/升的尿素。
94.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约0.2-2g/升的磷酸二氢钾;大约0.1-1g/升的硫酸镁;大约5-50微克/升的硫酸铜;大约0.05-0.25mg/升的氯化铁;大约0.05-0.5mg/升的硫酸锰;大约0.05-0.25mg/升的钼酸钠;大约0.05-0.5mg/升的硫酸锌;大约0.5-2.5微克/升的生物素;大约0.5-4mg/升的肌醇;以及大约0.05-0.5mg/升的硫胺素。
95.权利要求80的基本培养基,其中所述基本培养基包含大约5-100g/升的葡萄糖或者大约0.1-1wt%的乙醇,大约5g/升的硫酸铵或者大约1g/升的尿素,大约1g/升的磷酸二氢钾,大约0.5g/升的硫酸镁;大约40微克/升的硫酸铜;大约0.2mg/升的氯化铁;大约0.4mg/升的硫酸锰;大约0.2mg/升的钼酸钠;大约0.4mg/升的硫酸锌;大约2微克/升的生物素;大约2mg/升的肌醇;以及大约0.4mg/升的硫胺素。
96.具有包含外源乳酸脱氢酶基因的基因组的重组酵母株,所述外源乳酸脱氢酶基因能够在该重组酵母株中表达,其中所述表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性;当在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时,该重组酵母株能够产生至少大约50克乳酸/100克葡萄糖,并且该重组酵母株能够在低于大约3.5的pH下生长。
97.权利要求96的重组酵母株,其中所述重组酵母株在基本培养基中生长时能够产生大约50-85克的乳酸/100克葡萄糖。
98.权利要求96的重组酵母株,其中所述重组酵母株在基本培养基中生长时能够产生大约70-85克的乳酸/100克葡萄糖。
99.权利要求96的重组酵母株,其中所述重组酵母株能够在低于大约2.8的pH下产生乳酸。
100.权利要求96的重组酵母株,其中所述重组酵母株能够在低于大约2.3的pH下产生乳酸。
101.权利要求96的重组酵母株,其中所述重组酵母株能够在低于大约2.0的pH下产生乳酸。
102.一种生产乳酸的方法,其中包括:在第一种培养基中需氧培养具有包含外源乳酸脱氢酶基因的基因组的重组酵母株,所述外源乳酸脱氢酶基因能够在该重组酵母株中表达,所述表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,该重组酵母株在包含葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时,能够产生至少大约50克乳酸/100克葡萄糖,并且该重组酵母株能够在低于大约3.5的pH下生长。
103.通过包含下述步骤的选择过程回收到的耐酸(AT)酵母株:(a)在第一种需氧培养物中培养第一种酵母株,其中该第一种需氧培养物是通过用第一种酵母株接种第一种基本培养基而开始的,该第一种酵母株在培养基中培养时基本上不产生乙醇,并且该第一种酵母株具有包含能够在所述第一种酵母株中表达的外源乳酸脱氢酶基因的基因组,其中所述表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,在第一种需氧培养物生长的过程中,培养物的pH下降,(b)确定第一种酵母株仍然能够在第一种基本培养基中生长的大致最低pH,以及(c)在第一种需氧培养物仍然生长、pH大约在最低值时从第一种需氧培养物中回收至少一种第二种酵母株。
104.权利要求103的AT酵母株,其中所述第一种酵母株缺少丙酮酸脱羧酶活性或者乙醇脱氢酶活性中的至少一种。
105.权利要求104的AT酵母株,其中所述第一种酵母株的野生型酵母菌株是克雷树效应阳性的。
106.权利要求103的AT酵母株,其中所述选择过程还包括以下步骤:(d)培养第二种需氧培养物,其中所述第二种需氧培养物是通过用所回收的第二种酵母株接种新鲜的基本培养基而开始的,其中在第二种需氧培养物生长过程中,培养物的pH下降,以及(e)在第二种需氧培养物仍然生长、且pH低于第一种需氧培养物的大约最低pH时,从第二种需氧培养物中回收至少一种第三种酵母株。
107.权利要求106的AT酵母株,其中所述选择过程还包括重复步骤(d)和(e)至少一次,包括使用从前一次重复中回收的酵母株接种新鲜的基本培养基。
108.权利要求107的AT酵母株,其中最后一次重复中AT酵母株保持生长的需氧培养物的大约最低pH低于前一次重复中AT酵母株保持生长的需氧培养物的大约最低pH。
109.通过包括以下步骤的筛选过程回收的耐酸的C2碳源非依赖型(CI)酵母株:(a)用第一种酵母株接种基本培养基,该酵母株在培养基中培养时基本上不产生乙醇,并且当葡萄糖是基本培养基中唯一的其他碳源时需要C2碳源,其中该酵母株的基因组包含能够被表达的外源乳酸脱氢酶基因,其中所述表达产生的蛋白质具有乳酸脱氢酶活性,其中所述酵母在需氧条件下在包含葡萄糖和C2碳源的第一种基本培养基中培养时能够产生乳酸或其盐;并且其中所述第一种酵母株能够在低于其亲本株生长的pH下在第一种基本培养基中生长;(b)使用第二种基本培养基在一系列的需氧分批培养中培养第一种酵母株,其中在该系列开始时,第二种基本培养基包含葡萄糖和C2碳源作为唯一碳源,其浓度足以使得酵母培养物生长,并且该C2碳源的浓度随着分批培养系列的进行而下降,且其中每一后续的分批培养都使用在该系列中较早的分批培养中生长的酵母进行接种;以及(c)从分批培养系列中回收至少一个能够不需要C2碳源、使用葡萄糖作为唯一碳源进行生长的CI酵母株。
110.权利要求109的CI酵母株,其中所述第一种酵母株缺少丙酮酸脱羧酶活性或者乙醇脱氢酶活性中的至少一种。
111.权利要求109的CI酵母株,其中所述第一种酵母株的野生型酵母菌株是克雷树效应阳性的。
112.保藏号为NRRL Y-30696的酵母株。
113.保藏号为NRRL Y-30698的酵母株。
114.一种培养基,其基本上由水,大约70g/升的葡萄糖,大约0.5wt%的乙醇,大约1g/升的尿素,大约1g/升的磷酸二氢钾,大约0.5g/升的七水硫酸镁;大约2.78g/升的碳酸钙,大约62.5微克/升的五水硫酸铜;大约200微克/升的氯化铁;大约450微克/升的一水硫酸锰;大约235微克/升的二水钼酸钠;大约712微克/升的七水硫酸锌;2微克/升的生物素;2000微克/升的肌醇;以及400微克/升的硫胺素盐酸盐组成。
115.一种培养基,其包含大约400-1100ppm的N,大约215-287ppm的K+,大约525-700ppm的PO4-2,大约49ppm的Mg+2,大约195ppm的SO4-2,大约1100ppm的Ca+2,大约0.07ppm的Fe+3,大约0.145ppm的Mn+2,大约0.09ppm的Mo-4,大约0.16ppm的Zn+2,大约0.015ppm的Cu+2,大约0.002mg/升的生物素,大约2mg/升的肌醇,以及大约0.4mg/升的硫胺素盐酸盐。
116.一种发酵培养液,其中包含:
至少大约500mM的乳酸和第一组化合物,
其中发酵中乳酸的mM数与第一组化合物的mM数的比例至少是大约54,其中所述第一组化合物由甘油、赤藓醇、甘露醇、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸和富马酸组成。
117.权利要求116的发酵培养液,其中所述发酵培养液的pH在大约2.3和2.4之间。
118.权利要求116的发酵培养液,其中所述培养液包含至少大约565mM的乳酸。
119.权利要求116的发酵培养液,其中所述培养液包含至少大约665mM的乳酸。
120.权利要求116的发酵培养液,其中所述比例大于大约66。
121.权利要求116的发酵培养液,其中所述比例大于大约184。
122.权利要求116的发酵培养液,其中所述发酵培养物是酿酒酵母菌株的发酵产物。
123.包含酵母复制起点以及与启动子功能性连接的乳杆菌乳酸脱氢酶基因的酵母质粒。
124.权利要求122的质粒,其中所述复制起点是2μ复制起点。
125.权利要求122的质粒,其中所述乳酸脱氢酶基因是L-乳酸脱氢酶基因。
126.权利要求122的质粒,其中所述乳酸脱氢酶基因是植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。
127.权利要求122的质粒,其中所述启动子是磷酸丙糖异构酶启动子。
128.权利要求122的质粒,其中所述质粒是YEpLpLDH。
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Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102199553A (zh) * | 2011-05-06 | 2011-09-28 | 江南大学 | 一株耐酸酵母及其代谢工程构建产l-乳酸重组菌的方法 |
CN102212489A (zh) * | 2011-04-13 | 2011-10-12 | 江南大学 | 一种高产乳酸的酿酒酵母工程菌的构建及其应用 |
CN102498209A (zh) * | 2009-08-21 | 2012-06-13 | 旭硝子株式会社 | 转化体及其制造方法以及乳酸的制造方法 |
CN102715235A (zh) * | 2012-07-10 | 2012-10-10 | 武汉光明乳品有限公司 | 一种活性植物乳杆菌饮品及其制备方法 |
CN104031948A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-10 | 华东理工大学 | 利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法及其培养基 |
CN104911118A (zh) * | 2015-06-29 | 2015-09-16 | 江南大学 | 一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法 |
CN106459881A (zh) * | 2014-05-09 | 2017-02-22 | Cj第制糖株式会社 | 乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法 |
CN106536474A (zh) * | 2014-07-10 | 2017-03-22 | 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 | 新颖的乳酸回收方法 |
CN108138193A (zh) * | 2015-06-12 | 2018-06-08 | Cj第制糖株式会社 | 产乳酸微生物及使用其生产乳酸的方法 |
CN116555062A (zh) * | 2023-03-17 | 2023-08-08 | 江南大学 | 基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产l-乳酸的方法 |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1294728B1 (it) * | 1997-09-12 | 1999-04-12 | Biopolo S C A R L | Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico |
US20070031950A1 (en) * | 1998-09-11 | 2007-02-08 | Winkler Aaron A | Production of D-lactic acid with yeast |
JP4806904B2 (ja) * | 2004-07-09 | 2011-11-02 | トヨタ自動車株式会社 | 乳酸生産方法 |
DK1760156T3 (da) | 2005-08-10 | 2013-03-18 | Univ Florida | Materialer og fremgangsmåder til effektiv mælkesyrefremstilling |
JP2007061024A (ja) * | 2005-08-31 | 2007-03-15 | Neo-Morgan Laboratory Inc | 乳酸耐性に優れた生物および乳酸耐性に優れた生物の作製方法 |
EP1929009A2 (en) * | 2005-09-22 | 2008-06-11 | Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. | Improved strains for the production of organic acids |
WO2009073822A2 (en) * | 2007-12-04 | 2009-06-11 | The Ohio State University Research Foundation | Molecular approaches for the optimization of biofuel production |
ES2407639T3 (es) * | 2008-02-04 | 2013-06-13 | Toray Industries, Inc. | Procedimiento de producción de ácido láctico por fermentación continua |
KR101492011B1 (ko) | 2008-02-06 | 2015-02-10 | 바이오콘 리미티드 | 발효 배지 및 이의 방법 |
WO2009115114A1 (en) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Metabolic Explorer | Polypeptide having glyoxylase iii activity, polynucleotide encoding the same and uses thereof |
EP2128262A1 (en) | 2008-05-28 | 2009-12-02 | Università Degli Studi Di Milano - Bicocca | Improved yeast strains for organic acid production |
EP2316961A4 (en) * | 2008-06-30 | 2012-04-25 | Toyota Motor Co Ltd | PROCESS FOR PREPARING ORGANIC ACID |
IN2012DN00302A (zh) | 2009-07-30 | 2015-05-08 | Metabolic Explorer Sa | |
US20120156717A1 (en) * | 2009-08-28 | 2012-06-21 | Phycal, Inc. | Biofuel from recombinant oleaginous algae using sugar carbon sources |
US9012190B2 (en) | 2011-06-15 | 2015-04-21 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Use of thiamine and nicotine adenine dinucleotide for butanol production |
CN103392004A (zh) * | 2011-02-21 | 2013-11-13 | 旭硝子株式会社 | 乳酸的制造方法 |
CN104334520B (zh) * | 2012-05-22 | 2016-08-24 | 东丽株式会社 | 乳酸的制造方法 |
WO2014003439A1 (ko) * | 2012-06-26 | 2014-01-03 | 한국생명공학연구원 | 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도 |
JP6176251B2 (ja) * | 2012-08-24 | 2017-08-09 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
KR20150073196A (ko) * | 2012-10-17 | 2015-06-30 | 더 코카콜라 컴파니 | 탄수화물이 감소되고 에리쓰리톨이 증가된 음료 조성물 및 방법 |
RU2539092C1 (ru) * | 2013-09-27 | 2015-01-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ |
JP6499587B2 (ja) * | 2013-11-22 | 2019-04-10 | Jmtcエンザイム株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
KR20150065213A (ko) | 2013-12-04 | 2015-06-15 | 삼성전자주식회사 | 감소된 에탄올 생산능을 갖는 효모 세포 및 이의 용도 |
EP3205721B1 (en) | 2014-10-10 | 2019-08-28 | JMTC Enzyme Corporation | Transformant and method for producing same, and method for producing lactic acid |
KR102311681B1 (ko) * | 2015-07-28 | 2021-10-12 | 삼성전자주식회사 | 내산성을 갖는 효모 세포, 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 및 상기 내산성 효모 세포를 생산하는 방법 |
RU2614233C1 (ru) * | 2015-12-22 | 2017-03-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта |
KR102140596B1 (ko) | 2018-04-17 | 2020-08-04 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 유기산 내성 효모 유래 신규 프로모터 및 이를 이용한 목적유전자의 발현방법 |
KR20200040017A (ko) | 2018-10-08 | 2020-04-17 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법 |
CN110845025B (zh) * | 2019-09-11 | 2021-12-28 | 呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司 | 利用复合菌剂降解氨基酸发酵废液中有机质的工艺 |
KR20210041903A (ko) | 2019-10-08 | 2021-04-16 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법 |
KR20210158676A (ko) | 2020-06-24 | 2021-12-31 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 젖산 생산능이 증가된 재조합 내산성 효모 |
CN116855464A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-10-10 | 北京首医临床医学科技有限公司 | 一种利用酵母菌发酵生产乳酸脱氢酶的方法 |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2024565A (en) * | 1931-10-29 | 1935-12-17 | Standard Brands Inc | Process for the production of lactic acid |
US4885247A (en) * | 1988-04-19 | 1989-12-05 | Michigan Biotechnology Institute | Recovery and purification of lactate salts from whole fermentation broth by electrodialysis |
US5068418A (en) * | 1989-05-08 | 1991-11-26 | Uop | Separation of lactic acid from fermentation broth with an anionic polymeric absorbent |
US5464760A (en) * | 1990-04-04 | 1995-11-07 | University Of Chicago | Fermentation and recovery process for lactic acid production |
TW211560B (zh) * | 1991-03-14 | 1993-08-21 | Peilly Ind Inc | |
AT398982B (de) * | 1993-02-18 | 1995-02-27 | Vogelbusch Gmbh | Verfahren zur abtrennung und reinigung von milchsäure |
US6187951B1 (en) * | 1993-06-29 | 2001-02-13 | Cargill, Incorporated | Lactic acid production, separation and/or recovery process |
US5510526A (en) * | 1993-06-29 | 1996-04-23 | Cargill, Incorporated | Lactic acid production, separation and/or recovery process |
US6001255A (en) * | 1993-07-12 | 1999-12-14 | Eyal; Aharon | Process for the production of water-soluble salts of carboxylic and amino acids |
US5503750A (en) * | 1993-10-04 | 1996-04-02 | Russo, Jr.; Lawrence J. | Membrane-based process for the recovery of lactic acid by fermentation of carbohydrate substrates containing sugars |
US6060173A (en) * | 1996-04-17 | 2000-05-09 | Englehard Corporation | Metal honeycomb body |
EP0958372A1 (en) * | 1996-12-23 | 1999-11-24 | Lactascan Aps | Fermentative production and isolation of lactic acid |
BE1011197A3 (fr) * | 1997-06-06 | 1999-06-01 | Brussels Biotech En Abrege Bb | Procede de purification d'acide lactique. |
IT1294728B1 (it) * | 1997-09-12 | 1999-04-12 | Biopolo S C A R L | Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico |
US6475759B1 (en) * | 1997-10-14 | 2002-11-05 | Cargill, Inc. | Low PH lactic acid fermentation |
US6229046B1 (en) * | 1997-10-14 | 2001-05-08 | Cargill, Incorported | Lactic acid processing methods arrangements and products |
AU780135B2 (en) * | 1999-05-21 | 2005-03-03 | Cargill Inc. | Methods and materials for the synthesis of organic products |
FR2799754A1 (fr) * | 1999-10-18 | 2001-04-20 | Roquette Freres | Procede de separation et de purification d'acide lactique a partir d'un milieu de fermentation |
US6268189B1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-07-31 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Fungal lactate dehydrogenase gene and constructs for the expression thereof |
JP2005528112A (ja) * | 2002-05-30 | 2005-09-22 | カーギル ダウ エルエルシー | 酵母におけるd−乳酸の生産方法およびその材料 |
-
2003
- 2003-11-20 US US10/717,993 patent/US20050112737A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-11-17 WO PCT/US2004/038548 patent/WO2005052174A2/en active Application Filing
- 2004-11-17 AU AU2004293781A patent/AU2004293781A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-17 CN CNA2004800342183A patent/CN1902319A/zh active Pending
- 2004-11-17 BR BRPI0416220-0A patent/BRPI0416220A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-11-17 EP EP04811307A patent/EP1689873A2/en not_active Withdrawn
- 2004-11-17 JP JP2006541344A patent/JP2007512018A/ja not_active Withdrawn
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102498209A (zh) * | 2009-08-21 | 2012-06-13 | 旭硝子株式会社 | 转化体及其制造方法以及乳酸的制造方法 |
US9284561B2 (en) | 2009-08-21 | 2016-03-15 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
CN102212489A (zh) * | 2011-04-13 | 2011-10-12 | 江南大学 | 一种高产乳酸的酿酒酵母工程菌的构建及其应用 |
CN102199553A (zh) * | 2011-05-06 | 2011-09-28 | 江南大学 | 一株耐酸酵母及其代谢工程构建产l-乳酸重组菌的方法 |
CN102199553B (zh) * | 2011-05-06 | 2012-07-11 | 江南大学 | 一株耐酸酵母及其代谢工程构建产l-乳酸重组菌的方法 |
CN102715235A (zh) * | 2012-07-10 | 2012-10-10 | 武汉光明乳品有限公司 | 一种活性植物乳杆菌饮品及其制备方法 |
CN106459881B (zh) * | 2014-05-09 | 2020-08-25 | Cj第一制糖株式会社 | 乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法 |
CN106459881A (zh) * | 2014-05-09 | 2017-02-22 | Cj第制糖株式会社 | 乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法 |
CN104031948A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-10 | 华东理工大学 | 利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法及其培养基 |
CN106536474A (zh) * | 2014-07-10 | 2017-03-22 | 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 | 新颖的乳酸回收方法 |
CN108138193A (zh) * | 2015-06-12 | 2018-06-08 | Cj第制糖株式会社 | 产乳酸微生物及使用其生产乳酸的方法 |
CN104911118A (zh) * | 2015-06-29 | 2015-09-16 | 江南大学 | 一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法 |
CN116555062A (zh) * | 2023-03-17 | 2023-08-08 | 江南大学 | 基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产l-乳酸的方法 |
CN116555062B (zh) * | 2023-03-17 | 2023-10-27 | 江南大学 | 基于乙醇代谢流调控提升酿酒酵母生产l-乳酸的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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