JP2007512018A - 乳酸産生酵母 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に、培養した際に比較的高濃度の乳酸を産生し得る酵母(例えば、真菌類)に関する。本発明はまた、当技術分野で公知の特定の培地で乳酸産生酵母を培養した場合よりも、そこで培養した方が、生じる副生成不純物のレベルが相対的に低い培養培地にも関する。
本発明の特定の実施形態は、酸耐性(AT)酵母株に向けられている。これらのAT酵母株は、培養培地中で培養した際に本質的にエタノールを産生せず、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子を含むゲノムを含んでなる。好ましくは、この外因性LDH遺伝はL−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である。この外因性LDH遺伝子はAT酵母の少なくとも一つの染色体の要素であり得、かつ/またはAT酵母に存在する少なくとも一つのプラスミドが外因性LDH遺伝子を含んでいてもよい。このLDHはAT酵母株で発現可能であり、その発現の結果、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質が生じる。いくつかの実施形態では、このAT酵母株は検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持たない。特定の実施形態では、このAT酵母株の野生株はクラブトリー陽性である。さらに、このAT酵母株は、その親酵母株よりも低いpHの最小培地で乳酸を産生し得る。AT酵母株の親株はまた、培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生せず、かつ、発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子を含むゲノムを有することから、その結果生じるタンパク質は乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。しかしながら、その親株はそれが酸耐性となるような操作(例えば、選抜)は受けていない。
特定の実施形態では、CI酵母株は約2.8より低いpH、より好ましくは約2.3より低pHで乳酸を産生し得る。いくつかの実施形態では、このCI酵母株は、最小培地で培養した際にグルコース100g当たり約50gを超える乳酸を;いくつかの実施形態では、グルコース100g当たり約50〜85gの間の乳酸を;また、いくつかの実施形態では、グルコース100g当たり約70〜85gの間の乳酸を産生し得る。いくつかの実施形態では、CI酵母株は、最小培地で好気培養した際に培養液中に約565mMを超える乳酸を産生し得る。好ましくは、このCI酵母株は約2.3〜2.4の間のpHで培養する。より好ましくは、このCI酵母株は約665mMを超える乳酸を産生し得る。CI酵母株はサッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセス、トルラスポラ、クルイベロミセス、ジゴサッカロミセスおよびデッケラからなる群から選択される属に属することが好ましい。より好ましくは、CI酵母株はサッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセスおよびクルイベロミセスからなる群から選択される属に属する。いくつかの実施形態では、このCI酵母株はサッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・サーモトレランス、ジゴサッカロミセス・バイリー、シゾサッカロミセス・ポムベまたはカンジダ・グラブラタからなる群から選択される種に属する。特定の実施形態では、CI酵母株は遺伝子型pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDHを有するサッカロミセス・セレビシエであり得る。このCI酵母株は好気回分培養、好気流加培養または好気ケモスタットにて増殖可能である。
いくつかの実施形態では、培養から得られる培養液は約500mMを超える乳酸、より好ましくは565mMを超える乳酸、最も好ましくは約665mMを超える乳酸を含んでなる。特定の実施形態では、このATまたはCI酵母株は約3.5より低いpHで、より好ましくは約2.8より低いpHで、最も好ましくは約2.3より低いpHで乳酸を産生し得る。好ましくは、産生される乳酸は本質的にL−乳酸からなる。特定の実施形態では、このATまたはCI酵母株はサッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセスおよびクルイベロミセスからなる群から選択される属に属してよく、より好ましくは、このATまたはCI酵母株はサッカロミセス・セレビシエであり得る。特定の実施形態では、このATまたはCI酵母株は遺伝子型pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDHを有するサッカロミセス・セレビシエであり得る。このATまたはCI酵母株は好気回分培養、好気流加培養または好気ケモスタットで培養することができる。AT酵母株の培養から得られる培養液は、特定の実施形態では、本質的に同じ培養条件下、本質的に同じ最小培地で親株を培養することから得られる培養液よりも低いppmの、グリセロール、エリトリトール、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸およびフマル酸のうち少なくとも一種類を含み得る。この乳酸またはその塩の生産方法は、例えば、蒸留、イオン交換、ナノフィルトレーションまたは溶媒抽出のうち少なくとも一つにより培養液を精製する工程をさらに含み得る。
「ゲノム」とは、宿主細胞内にある染色体とプラスミドの双方を包含する。
「翻訳」とは、メッセンジャーRNAからタンパク質を作製することを意味する。
いくつかの実施形態では、最小培養培地は水、約5g〜100g/リットルの間のグルコースまたは約0.1重量%〜1重量%の間のエタノール、約5g/リットルの硫酸アンモニウムまたは約1g/リットルの尿素、約1g/リットルのリン酸一カリウム、約0.5g/リットルの硫酸マグネシウム、約40マイクログラム/リットルの硫酸銅、約0.2mg/リットルの塩化第二鉄、約0.4mg/リットルの硫酸マンガン、約0.2mg/リットルのモリブデン酸ナトリウム、約0.4mg/リットルの硫酸亜鉛、約2マイクログラム/リットルのビオチン、約2mg/リットルのイノシトール、および約0.4mg/リットルのチアミンを含んでなる。
以下の実施例では下記を株を使用した。
RWB876(MATa pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDH) 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するPdc陰性酵母;
m850−a(MATa pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDH) 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ活性、酸耐性を有するPdc陰性酵母;および
Lp4およびLp4f(MATa pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDH) 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ活性、酸耐性、C2炭素源非依存性を有するPdc陰性酵母は、本特許出願の係属中、それらの培養物の入手が、特許商標庁長官がが37C.F.R.§1.14および35U.S.C.§122としてそれらに付与することを定めたもので入手可能であることを保証する条件の下で寄託されている。これらの寄託物は、本願またはその後継出願の副本が提出される国の外国特許法の求めに応じて利用できる。しかしながら、この寄託が利用できることは、政府の行為により付与された特許権の減損上、本発明の実施を許可するものではないと理解すべきである。
RWB876株とM1培地を用いて発酵を行った。培地の組成は下表2に示されている。
本実施例では、M1培地で増殖させた酸耐性変異株m850−aの乳酸産生能を、その親株RWB876の場合と比較した。発酵は、実施例1に記載の条件を用い、M1培地中、振盪フラスコで行った。結果を下表3にまとめる。酸耐性変異株m850−aの、約3.0より低いpHで増殖を続け得る能力により、その発酵液中で、その親株RW876よりも高い濃度の乳酸を集積することが可能であった。
本実験は、培地の最初のpHを3.50に調整し、培地にCaCO3を加えなかったこと以外は実施例1に記載の条件下でM1培地を用い、振盪フラスコで行った。結果を表4にまとめる。両株とも、CaCO3の不在下、pH3.50で増殖を開始できた。低pHにおいて酸耐性変異株m850−aは、増殖し、かつ、発酵液中でその親株よりも高い濃度の乳酸を産生できる能力を示した。
高分子級の乳酸を産生する最終的なコストは、発酵液中で生じる不純物の除去に伴うコストに関係している。実施例2の発酵液を乳酸の濃度と特定の不純物の濃度に関して分析した。
本実験は、0.5%エタノールを除いたこと以外は実施例1に記載の条件下でM1培地を用いて振盪フラスコで行った。2種類の酸耐性C2炭素源非依存性 S.セレビシエ株を、C2炭素源依存性のm850−aから単離した。この2株は、C2炭素源の濃度が一連の培養で低下される一連の回分培養を用いて単離した。表6に示されているように、増殖および乳酸産生のために単一炭素源としてグルコースを利用できた2つの変異株を単離した(例えば、Lp4(NRRL Y−30697)およびLp4f(NRRL Y−30698))。Lp4は30回の移行後に単離され、Lp4fは約45回の移行後に単離された。Lp4はLp4fよりも酸耐性が弱い。これらの変異株は、培地がエタノールを含まなくとも、増殖能と所定の培地中、低pHで乳酸を産生する能力との双方を保持していた。
実施例5で行った発酵のための栄養素の投入(グルコースを除く)は2.504g/リットルであり、収益は、Lp4株およびLp4f株の発酵でそれぞれ乳酸410mMおよび577mMであった。最終的な発酵液(例えば、Lp4株およびLp4f株のもの)の、ポリオールおよび有機酸についてのHPLC分析を表7にまとめる。Lp4による発酵の結果、410mMの乳酸と総量6.214mMのポリオールおよび他の有機酸が産生された。Lp4f株の発酵液では、総量3.139mMのポリオールおよび他の有機酸と577mMの乳酸が得られた。これらの発酵副生成物(例えば、ポリオールや有機酸)および特定の未利用の培地成分を少なくとも部分的に除去すれば、より高純度(例えば、高分子級)の乳酸を得ることができる。これらのC2非依存性変異株(例えば、Lp4およびLp4f)により乳酸発酵中に生じ、分析された全不純物は、RWB876またはm850−aの発酵によって生じるものよりも少ない。
New Brunswick Bioflow 10−L発酵槽にて、実施量6Lで発酵を行った。培地組成(M1)は実施例1に示した。250rpmで振盪し、通気を0.33vvmとした。温度は32℃に制御した。pHは制御しなかった。
Claims (128)
- 乳酸を生産する方法であって、
培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない酸耐性(AT)酵母株を、第一の培養培地中で好気培養することを含み、
該AT酵母株が、AT酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
該AT酵母株が親酵母株よりも低いpHの最小培地で増殖し得る、
方法。 - AT酵母株が、C2炭素源非依存性であり、かつ、約3.5より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、C2炭素源非依存性であり、かつ、約2.8より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、C2炭素源非依存性であり、かつ、約2.3より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、単一炭素源としてグルコースを含む最小培地で培養した際にグルコース100グラム当たり約50グラムを超える乳酸を産生し得る、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、単一炭素源としてグルコースを含む最小培地で培養した際に、グルコース100グラム当たり約50〜85グラムの間の乳酸を産生し得る、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、単一炭素源としてグルコースを含む最小培地で培養した際に、グルコース100グラム当たり約70〜85グラムの間の乳酸を産生し得る、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株の培養から得られる培養液が、本質的に同じ培養条件下、本質的に同じ最小培地で親株を培養することから得られる培養液よりも低いppmの、グリセロール、エリトリトール、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸およびフマル酸のうち少なくとも一種類を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、サッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセスおよびクルイベロミセスからなる群から選択される属に属す、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株が、遺伝子型pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDHを有するサッカロミセス・セレビシエである、請求項1に記載の方法。
- 培養が
好気回分培養、好気流加培養または好気ケモスタットで行われる、請求項1に記載の方法。 - AT酵母株が、C2炭素源非依存性である、請求項1に記載の方法。
- 第一の培養培地が、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトースおよびガラクトースからなる群から選択される少なくとも一種類の所定の炭素源を含んでなる最小培地である、請求項13に記載の方法。
- グルコースが、単一炭素源である、請求項14に記載の方法。
- AT酵母株が、C2炭素源依存性であり、第一の培養培地がグルコースから本質的になる炭素源と少なくとも一種類のC2炭素源とを含んでなる最小培地である、請求項1に記載の方法。
- 第一の培養培地が、少なくとも一種類の所定の炭素源、少なくとも一種類の窒素源、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、ビオチン、イノシトール、チアミン、および水から本質的になり、窒素源が尿素、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- AT酵母株の染色体が、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる少なくとも一つのプラスミドがAT酵母株内に存在する、請求項1に記載の方法。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム、ウシ、ラクトバチルス・カセイ、バチルス・メガテリウム、リゾープス・オリゼまたはバチルス・ステアロサーモフィラスの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラムの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 乳酸またはその塩を回収および精製する工程をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 精製工程が、蒸留、イオン交換、ナノフィルトレーションまたは溶媒抽出の少なくと一つを含んでなる、請求項22に記載の方法。
- 培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない酸耐性(AT)酵母株であって、
AT酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
親酵母株よりも低いpHの最小培地で乳酸を産生し得る、
AT酵母株。 - 検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持たない、請求項24に記載のAT酵母株。
- AT酵母株の野生株が、クラブトリー陽性である、請求項25に記載のAT酵母株。
- 約3.5より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項24に記載のAT酵母株。
- 約2.8より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項24に記載のAT酵母株。
- 約2.3より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項24に記載のAT酵母株。
- 最小培地で好気培養した際に、培養液中に約500mMを超える乳酸を産生し得る、請求項24に記載のAT酵母株。
- 約565mMを超える乳酸を産生し得る、請求項30に記載のAT酵母株。
- 約665mMを超える乳酸を産生し得る、請求項30に記載のAT酵母株。
- サッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセス、トルラスポラ、クルイベロミセス、ジゴサッカロミセスおよびデッケラからなる群から選択される属に属す、請求項24に記載のAT酵母株。
- サッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセスおよびクルイベロミセスからなる群から選択される属に属す、請求項24に記載のAT酵母株。
- サッカロミセス属に属す、請求項24に記載のAT酵母株。
- サッカロミセス・セレビシエである、請求項24に記載のAT酵母株。
- 遺伝子型pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDHを有するサッカロミセス・セレビシエである、請求項24に記載のAT酵母株。
- クルイベロミセス・サーモトレランス、ジゴサッカロミセス・バイリー、シゾサッカロミセス・ポムベまたはカンジダ・グラブラタである、請求項24に記載のAT酵母株。
- C2炭素源非依存性である、請求項24に記載のAT酵母株。
- グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトースおよびガラクトースからなる群から選択される少なくとも一種類の所定の炭素源を含んでなる最小培地で増殖し得る、請求項39に記載のAT酵母株。
- 単一炭素源としてグルコースを含んでなる最小培地で増殖し得る、請求項39に記載のAT酵母株。
- C2炭素源非依存性であり、グルコースから本質的になる炭素源と少なくとも一種類のC2炭素源とを含んでなる最小培地で増殖し得る、請求項24に記載のAT酵母株。
- 少なくとも一種類の所定の炭素源、少なくとも一種類の所定の窒素源、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、ビオチン、イノシトール、チアミン、および水から本質的になり、所定の窒素源が尿素、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムからなる群から選択される、無機培地で増殖し得る、請求項24に記載のAT酵母株。
- AT酵母株の染色体が、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる、請求項24に記載のAT酵母株。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる少なくとも一つのプラスミドが、AT酵母株に存在する、請求項24に記載のAT酵母株。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、プロモーターに機能的に連結されている、請求項24に記載のAT酵母株。
- プロモーターが、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーターである、請求項46に記載のAT酵母株。
- プロモーターが、ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、およびL−トレオニンデヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項46に記載のAT酵母株。
- プロモーターが、クルイベロミセスのピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーターである、請求項46に記載のAT酵母株。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム、ウシ、ラクトバチルス・カセイ、バチルス・メガテリウム、リゾープス・オリゼ、またはバチルス・ステアロサーモフィラスの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項24に記載のAT酵母株。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラムの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項24に記載のAT酵母株。
- L−乳酸から本質的になる乳酸を産生し得る、請求項24に記載のAT酵母株。
- 培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない酸耐性(AT)S.セレビシエであって、
AT S.セレビシエで発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
S.セレビシエ親株よりも低いpHの最小培地で乳酸を産生し得る、
AT S.セレビシエ。 - 検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持たない、請求項53に記載の酸耐性(AT)S.セレビシエ。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラムの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項53に記載の酸耐性(AT)S.セレビシエ。
- AT S.セレビシエ内の少なくとも一つのプラスミドが、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる、請求項53に記載の酸耐性(AT)S.セレビシエ。
- 遺伝子型pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDHを有する、請求項53に記載のAT S.セレビシエ。
- 最小培地で好気培養した際に、培養液中に約500mMを超える乳酸を産生し得る、請求項53に記載のAT S.セレビシエ。
- 培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない酸耐性C2炭素源非依存性(CI)酵母株であって、
その酵母株のゲノムが、発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなり、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
その酵母が、単一炭素源としてグルコースを含む第一の最小培地にて好気条件下で培養した際に乳酸を産生することができ、かつ、
そのCI酵母株が親株より低いpHの第一の最小培地で乳酸を産生し得る、
酵母株。 - 検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持たない、請求項59に記載のCI酵母株。
- 前記株の野生型酵母が、クラブトリー陽性である、請求項60に記載のCI酵母株。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム、ウシ、ラクトバチルス・カセイ、バチルス・メガテリウム、リゾープス・オリゼまたはバチルス・ステアロサーモフィラスの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項59に記載のCI酵母株。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラムの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項59に記載のCI酵母株。
- CI酵母株の染色体が、外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる、請求項59に記載のCI酵母株。
- 外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる少なくとも一つのプラスミドが、CI酵母株に存在する、請求項59に記載のCI酵母株。
- 少なくとも一つのプラスミドが、2ミクロンプラスミドである、請求項65に記載のCI酵母株。
- 約2.8より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- 約2.3より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- 最小培地で培養した際にグルコース100グラム当たり約50グラムを超える乳酸を産生し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- 最小培地で培養した際にグルコース100グラム当たり約50〜85グラムの間の乳酸を産生し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- 最小培地で培養した際にグルコース100グラム当たり約70〜85グラムの間の乳酸を産生し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- 第二の最小培地で好気培養した際に、培養液中に約565mMを超える乳酸を産生し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- 約665mMを超える乳酸を産生し得る、請求項72に記載のCI酵母株。
- サッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセス、トルラスポラ、クルイベロミセス、ジゴサッカロミセス、およびデッケラからなる群から選択される属に属す、請求項59に記載のCI酵母株。
- サッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセス、およびクルイベロミセスからなる群から選択される属に属す、請求項59に記載のCI酵母株。
- サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・サーモトレランス、ジゴサッカロミセス・バイリー、シゾサッカロミセス・ポムベ、およびカンジダ・グラブラタからなる群から選択される、請求項59に記載のCI酵母株。
- 遺伝子型pdc1(−6,−2)::loxP pdc5(−6,−2)::loxP pdc6(−6,−2)::loxP ura3−52 YEpLpLDHを有するサッカロミセス・セレビシエである、請求項59に記載のCI酵母株。
- グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトースおよびガラクトースからなる群から選択される少なくとも一種類の所定の炭素源を含んでなる第二の最小培地で増殖し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトース、およびガラクトースからなる群から選択される少なくとも一種類の所定の炭素源;尿素、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、および硫酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも一種類の窒素源;リン酸一カリウム;硫酸マグネシウム;硫酸銅;塩化第二鉄;硫酸マンガン;モリブデン酸ナトリウム;硫酸亜鉛;ビオチン;イノシトール;チアミン、および水から本質的になる第二の最小培地で増殖し得る、請求項59に記載のCI酵母株。
- 少なくとも一種類の所定の炭素源;少なくとも一種類の窒素源、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化第二鉄、硫酸マンガン、モリブデン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、ビオチン、イノシトール、チアミン、および水から本質的になる最小培養培地。
- 所定の炭素源が、C2炭素源を含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 所定の炭素源が、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、およびマルトースからなる群から選択される少なくとも一種類の化合物をさらに含んでなる、請求項81に記載の最小培養培地。
- グルコースが、単一炭素源である、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約5g/リットル〜100g/リットルの間のグルコースを含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 0.1重量%〜1重量%の間のエタノールを含んでなる、請求項84に記載の最小培養培地。
- 炭酸カルシウムを含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 窒素源が、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、およびリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも一種類の化合物を含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約0.5〜5g/リットルの間の硫酸アンモニウムを含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約0.5〜2g/リットルの間の硫酸アンモニウムを含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約1〜2g/リットルの間の硫酸アンモニウムを含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約0.1〜2g/リットルの間の尿素を含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約0.1〜1g/リットルの間の尿素を含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約0.5〜2g/リットルの尿素を含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約0.2〜2g/リットルの間のリン酸一カリウム;約0.1〜1g/リットルの間の硫酸マグネシウム;約5〜50マイクログラム/リットルの間の硫酸銅;約0.05〜0.25mg/リットルの間の塩化第二鉄;約0.05〜0.5mg/リットルの間の硫酸マンガン;約0.05〜0.25mg/リットルの間のモリブデン酸ナトリウム;約0.05〜0.5mg/リットルの間の硫酸亜鉛;約0.5〜2.5マイクログラム/リットルの間のビオチン;約0.5〜4mg/リットルの間のイノシトール;および約0.05〜0.5mg/リットルの間のチアミンを含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 約5g〜100g/リットルの間のグルコースまたは約0.1重量%〜1重量%の間のエタノール、約5g/リットルの硫酸アンモニウムまたは約1g/リットルの尿素、約1g/リットルのリン酸一カリウム、約0.5g/リットルの硫酸マグネシウム、約40マイクログラム/リットルの硫酸銅、約0.2mg/リットルの塩化第二鉄、約0.4mg/リットルの硫酸マンガン、約0.2mg/リットルのモリブデン酸ナトリウム、約0.4mg/リットルの硫酸亜鉛、約2マイクログラム/リットルのビオチン、約2mg/リットルのイノシトール、および約0.4mg/リットルのチアミンを含んでなる、請求項80に記載の最小培養培地。
- 組換え酵母株において発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなるゲノムを有する組換え酵母株であって、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
単一炭素源としてグルコースを含んでなる最小培地で増殖させた際に、グルコース100グラム当たり少なくとも約50グラムの乳酸を産生することができ、
約3.5より低いpHで増殖可能である、
組換え酵母株。 - 最小培地で増殖させた際にグルコース100グラム当たり約50〜85グラムの間の乳酸を産生し得る、請求項96に記載の組換え酵母株。
- 最小培地で増殖させた際にグルコース100グラム当たり約70〜85グラムの間の乳酸を産生し得る、請求項96に記載の組換え酵母株。
- 約2.8より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項96に記載の組換え酵母株。
- 約2.3より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項96に記載の組換え酵母株。
- 約2.0より低いpHで乳酸を産生し得る、請求項96に記載の組換え酵母株。
- 乳酸を生産する方法であって、
組換え酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなるゲノムを有する組換え酵母株を、第一の培養培地で好気培養することを含んでなり、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、その組換え酵母株が、単一炭素源としてグルコースを含んでなる最小培地で増殖させた際にグルコース100グラム当たり少なくとも約50グラムの乳酸を産生することができ、かつ、その組換え酵母株が約3.5より低いpHで増殖可能である、
方法。 - (a)第一の酵母株を第一の好気培養物として増殖させること、ここで、この第一の好気培養は、第一の最小培地に、培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない第一の酵母株を接種することにより始め、この第一の酵母株は、第一の酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、第一の好気培養物の増殖中にその培養物のpHが低下すること、
(b)第一の酵母株が第一の最小培地中でなお増殖し得る最低付近のpHを決定すること、および
(c)第一の好気培養物がなお増殖し、かつ、pHが最低付近であるときに、第一の好気培養物から少なくとも一つの第二の酵母株を回収すること
を含んでなる選択プロセスにより回収される、酸耐性(AT)酵母株。 - 第一の酵母株が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素活性の少なくとも一方を欠損している、請求項103に記載のAT酵母株。
- 第一の酵母株の野生型酵母株が、クラブトリー陽性である、請求項104に記載のAT酵母株。
- 選択プロセスが、
(d)第二の好気培養物を増殖させること、ここで、この第二の好気培養は新鮮な最小培地に、回収した第二の酵母株を接種することにより始め、第二の好気培養物の増殖中にその培養物のpHが低下すること、および
(e)第二の好気培養物がなお増殖し、かつ、そのpHが第一の好気培養物の最低付近のpHよりも低いときに、第二の好気培養物から少なくとも一つの第三の酵母株を回収する工程
をさらに含んでなる、請求項103に記載のAT酵母株。 - 選択プロセスが工程(d)と(e)を少なくとも一度繰り返すことをさらに含み、それが前の工程から回収した酵母株を新鮮な最小培地に接種することを含んでなる、請求項106に記載のAT酵母株。
- その工程の、AT酵母株が増殖している好気培養物の最低付近のpHが、その前の工程の、AT酵母株が増殖している好気培養物の最低付近のpHよりも低い、請求項107に記載のAT酵母株。
- (a)培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生せず、かつ、グルコースが最小培地における唯一の他の炭素源である場合にC2炭素源を要求する第一の酵母株を最小培地に接種すること、ここで、その酵母株のゲノムが、発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなり、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、その酵母は、グルコースとC2炭素源を含んでなる第一の最小培地中、好気条件下で培養した際に乳酸またはその塩を産生することができ、かつ、第一の酵母株はその親株よりも低いpHの第一の最小培地で増殖することができること、
(b)その第一の酵母株を第二の最小培地を用いて一連の好気回分培養で培養し、ここで、その回の最初の時点で、第二の最小培地は単一炭素源としてグルコースとC2炭素源とを、酵母培養物を増殖させるの十分な濃度で含み、このC2炭素源の濃度はその回の回分培養中に低下し、各連続回分培養に前回の回分培養で増殖させた酵母を接種すること、および
(c)C2炭素源を用いずに、単一炭素源としてグルコースを用いて増殖し得る、その回の回分培養物から少なくとも一つのCI酵母株を回収すること
を含んでなる選択プロセスにより回収される、酸耐性C2炭素源非依存性(CI)酵母株。 - 第一の酵母株が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素活性の少なくとも一方を欠損している、請求項109に記載のCI酵母株。
- 第一の酵母株の野生型酵母が、クラブトリー陽性である、請求項109に記載のCI酵母株。
- 寄託番号NRRL Y−30696を有する、酵母株。
- 寄託番号NRRL Y−30698を有する、酵母株。
- 水、約70g/リットルのグルコース、約0.5重量%のエタノール、約1g/リットルの尿素、約1g/リットルのリン酸一カリウム、約0.5g/リットルの硫酸マグネシウム七水和物、約2.78g/リットルの炭酸カルシウム、約62.5マイクログラム/リットルの硫酸銅五水和物、約200マイクログラム/リットルの塩化第二鉄、約450マイクログラム/リットルの硫酸マンガン一水和物、約235マイクログラム/リットルのモリブデン酸ナトリウム二水和物、約712マイクログラム/リットルの硫酸亜鉛七水和物、2マイクログラム/リットルのビオチン、2000マイクログラム/リットルのイノシトール、および400マイクログラム/リットルの塩酸チアミンから本質的になる、培養培地。
- 約400〜1100ppmの間のN、約215〜287ppmの間のK+、約525〜700ppmのPO4 −2、約49ppmのMg+2、約195ppmのSO4 −2、約1100ppmのCa+2、約0.07ppmのFe+3、約0.145ppmのMn+2、約0.09ppmのMo−4、約0.16ppmのZn+2、約0.015ppmのCu+2、約0.002mg/リットルのビオチン、約2mg/リットルのイノシトール、および約0.4mg/リットルの塩酸チアミンを含んでなる、培養培地。
- 少なくとも約500mMの乳酸と第一の化合物群を含んでなり、
発酵液中の、第一の化合物群mMに対する乳酸mMの比率が少なくとも約54であり、第一の化合物群がグリセロール、エリトリトール、マンニトール、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸およびフマル酸からなる、発酵液。 - 発酵液のpHが約2.3〜2.4の間である、請求項116に記載の発酵液。
- 少なくとも約565mMの乳酸を含んでなる、請求項116に記載の発酵液。
- 少なくとも約665mMの乳酸を含んでなる、請求項116に記載の発酵液。
- その比率が約66より大きい、請求項116に記載の発酵液。
- その比率が約184より大きい、請求項116に記載の発酵液。
- S.セレビシエ株による発酵産物である、請求項116に記載の発酵液。
- 酵母複製開始点とプロモーターに機能的に連結されているラクトバチル属乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる、酵母プラスミド。
- 複製開始点が2ミクロン複製開始点である、請求項122に記載のプラスミド。
- 乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、L−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項122に記載のプラスミド。
- 乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラムの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項122に記載のプラスミド。
- プロモーターが、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーターである、請求項122に記載のプラスミド。
- プラスミドが、YEpLpLDHである、請求項122に記載のプラスミド。
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