JP2022008224A - 乳酸生産能が増加した組換え耐酸性酵母 - Google Patents
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Abstract
【課題】乳酸生産能が増加した組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法を提供する。【解決手段】耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失し、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の位置にスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株を提供する。【効果】既存バクテリア発酵の中和剤の使用量を顕著に少なく使用しながらもバクテリア発酵と類似の乳酸生成能で乳酸発酵を行うことができるため、発酵費用を大きく節減でき、副産物であるエタノール及びグリセロールの生成能を下げて後段精製工程費用も節減することができる。【選択図】図１
Description
本発明は、乳酸生産能が増加した組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法に関し、より詳細には、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失した位置に特定バクテリア由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されている組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法に関する。
ＰＬＡ（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ）は、乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）をラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）に転換し、これを開環重合して作る生分解性ポリマーであり、その原料である乳酸発酵によって生産している。ＰＬＡは、使い捨て食品容器に広範囲に利用可能であり、単独或いは組成物や共重合体の形態で自動車、繊維産業を含む様々な産業的プラスチックとしても使用可能な強度を持っている。また、最近では３Ｄプリンティングにも用いられる代表的なポリマーであり、特に、３Ｄプリンタ使用時に有害ガス及び臭いの発生が少ない、環境にやさしいポリマーである。
伝統的な乳酸生産工程は、乳酸菌を用いて生産するが、乳酸菌によって生成される乳酸の蓄積によって酸による菌株死滅或いは成長止めが発生することを防止するために、様々な形態のＣａ塩／Ｍｇ塩又はアンモニアのような中和剤を用いて、ｐＨを中性ｐＨの６～８に合わせながら発酵を行う。発酵が終了すると微生物を分離するが、塩（ｓａｌｔ）形態では水での分離及びラクチド転換が難しいため、硫酸を添加してラクテートを乳酸に転換させながらＣａ塩はＣａＳＯ4の形態で除去する。このような過程は、乳酸よりも多い量の副産物であるＣａＳＯ4を発生させ、工程経済性の低下を招く。
ＰＬＡは、発酵によって乳酸を生産した後、生産された乳酸を精製工程を経てラクチドに転換する工程が一般的である。ラクチド転換のためには、乳酸を水素化された形（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｆｏｒｍ）に転換する工程が必要であり、通常の中性発酵へのｐＨは６～７である点から、多量の硫酸を用いて酸性ｐＨに転換する。この過程で多量の中和塩が発生し、このような中和塩を除去するための工程投資費、及び中和塩の低い価値により、経済性が低下する。
一方、乳酸は、Ｌ型とＤ型の光学異性体がある。Ｌ型を主に生産する乳酸菌も約５～１０％のＤ型を共に生産する場合が多く、Ｄ型を主に生産する菌株は、Ｄ型とＬ型を共に生産する形態及びＤ型とエタノールを共に生産する形態で存在するなど、多くの多様性を有する微生物群がある（非特許文献１）。
一方、自然界で乳酸を生産するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の場合、乳酸を商業的レベルに生産するためには、多量の高価栄養分（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）を培地として使用しなければならず、このような過量の栄養成分は、後段工程の重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）工程、或いはラクチドを中間体とする場合にはラクチド転換工程に大きな阻害を与え、高収率、高純度のポリマー又はその前駆体を得るためには、吸着、蒸留、イオン交換のような精製工程費用がかかり、同様に、高い生産費用の原因となる。このような問題を解決するための方法として、酵母（Ｙｅａｓｔ）を用いた研究が提示されている。酵母の場合、安価の栄養分を使用しても円滑に成長／発酵するものと知られており、酸性における耐性も高いと知られている。
一方、自然界で乳酸を生産するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の場合、乳酸を商業的レベルに生産するためには、多量の高価栄養分（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）を培地として使用しなければならず、このような過量の栄養成分は、後段工程の重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）工程、或いはラクチドを中間体とする場合にはラクチド転換工程に大きな阻害を与え、高収率、高純度のポリマー又はその前駆体を得るためには、吸着、蒸留、イオン交換のような精製工程費用がかかり、同様に、高い生産費用の原因となる。このような問題を解決するための方法として、酵母（Ｙｅａｓｔ）を用いた研究が提示されている。酵母の場合、安価の栄養分を使用しても円滑に成長／発酵するものと知られており、酸性における耐性も高いと知られている。
酸性においてよく育つ酵母（以下、耐酸性酵母）を用いて乳酸を生産する場合、発酵時に中和剤を用いて培地をｐＨ６～７に保つ必要がないので、発酵工程が単純となり、且つ後で中和剤を除去する精製工程が不要である。また、酵母は、代謝に必要な多くの成分を自ら作るため、細菌、特に、ラクトバシラスに比べて比較的栄養レベルの低い培地でも培養可能であり、多くの後段の精製工程を省くことができ、生産単価を大幅に下げることができる。
しかしながら、酵母を用いる乳酸生産技術には前提条件があるが、それは、商業化に適用するためには菌株発酵性能指標である収率、生産性、乳酸の濃度が、乳酸菌の性能に類似するレベルに高く維持される必要があるということである。
酵母を用いた耐酸性乳酸技術の開発が試みられているが、実際には、発酵中に中和反応を伴ってｐＨを乳酸のｐＫａ値以上である３．７以上に維持しつつ発酵をしてこそ高性能の発酵能が得られる場合が多いため、実質的に耐酸性技術とは言い難く、工程における生産費節減の効果も得難い（非特許文献２）。
酵母を用いた耐酸性乳酸技術の開発が試みられているが、実際には、発酵中に中和反応を伴ってｐＨを乳酸のｐＫａ値以上である３．７以上に維持しつつ発酵をしてこそ高性能の発酵能が得られる場合が多いため、実質的に耐酸性技術とは言い難く、工程における生産費節減の効果も得難い（非特許文献２）。
したがって、工程費用が節減できる耐酸性酵母は、中和剤を使用しないか或いは最小量で使用しながらｐＨがｐＫａ値以下の発酵液で発酵を終える必要があり、発酵の３代指標を乳酸菌と類似するレベルにしてこそ商業的適用の意味がある。
一般の酵母は、グルコースを発酵するとエタノールを主に生産し、主副産物としてはグリセロールを生産し、乳酸を生産する場合はごく稀である。また、高い耐酸性を持つ微生物から乳酸を生産する菌株を選択する確率が非常に低いため、本発明者らは、耐酸性に優れた酵母菌株を選別し、選別された菌株を遺伝工学的な方法で改良することによって、乳酸生産能を有するとともに、エタノール及びグリセロールの生成能が抑制された菌株を製造しようとした。
そこで、本発明者らは、乳酸生産能（乳酸の生産速度及び濃度）がバクテリア菌株の生産能と類似するとともに、副産物であるエタノール及びグリセロールの生成が抑制され、しかも強い耐酸性を有する酵母菌株を製造しようと鋭意努力した結果、耐酸性酵母においてピルべート転換酵素遺伝子の位置にＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する場合、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性増加によって乳酸収率が向上することを確認し、本発明を完成するに至った。
そこで、本発明者らは、乳酸生産能（乳酸の生産速度及び濃度）がバクテリア菌株の生産能と類似するとともに、副産物であるエタノール及びグリセロールの生成が抑制され、しかも強い耐酸性を有する酵母菌株を製造しようと鋭意努力した結果、耐酸性酵母においてピルべート転換酵素遺伝子の位置にＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する場合、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性増加によって乳酸収率が向上することを確認し、本発明を完成するに至った。
Ｅｌｌｅｎ Ｉ．Ｇａｒｖｉｅ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０６－１３９，１９８０
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２７：２２９－２５６，２０１０
本発明の目的は、乳酸生成能を有する組換え耐酸性酵母菌株において高濃度乳酸に対する耐性を増加させて乳酸生産速度及び生産濃度を増加させた組換え菌株を提供することにある。
本発明の他の目的は、適応進化（ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）方法を用いた、乳酸耐性が増加した乳酸生成能を有する組換え酵母菌株の製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、上記方法で製造された高濃度乳酸培地で乳酸生成能が向上した組換え酵母菌株を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失し、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の位置にスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株を提供する。
本発明は、また、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子；ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子；アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子；及び、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株であって、
前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＡＤＨ遺伝子；ＰＤＣ遺伝子；及び、ＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されており、
前記ＰＤＣ遺伝子の位置に導入されているラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする組換え菌株を提供する。
前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＡＤＨ遺伝子；ＰＤＣ遺伝子；及び、ＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されており、
前記ＰＤＣ遺伝子の位置に導入されているラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする組換え菌株を提供する。
本発明は、また、（ａ）乳酸生成能を有する組換え酵母菌株を低濃度乳酸培地から高濃度乳酸培地へと順次培養し、前記組換え酵母菌株を高濃度乳酸濃度に適応進化させる段階；（ｂ）高濃度乳酸培地で乳酸生成能が向上した組換え酵母菌株を選別する段階；及び、（ｃ）前記選別された菌株のゲノムのＰＤＣ遺伝子の位置に、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入する段階を含む、乳酸耐性が増加した乳酸生成能を有する組換え酵母菌株の製造方法を提供する。
本発明は、また、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株を高濃度乳酸濃度に適応進化させて得た組換え菌株＃２６－５（寄託番号：ＫＣＴＣ１４２１５ＢＰ）を提供する。
本発明は、また、前記組換え菌株＃２６－５（寄託番号：ＫＣＴＣ１４２１５ＢＰ）のゲノムのＰＤＣ遺伝子の位置に、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されており、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）又はＹＢＣ５菌株に比べて、高濃度乳酸において乳酸生成能が向上し、エタノール及びグリセロールの生成が低下した組換え酵母ＹＢＣ６菌株を提供する。
本発明は、また、（ａ）前記菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び、（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階を含む乳酸の製造方法を提供する。
本発明に係る組換え耐酸性酵母を使用して乳酸を生産する場合、既存バクテリア発酵の中和剤の使用量を顕著に少なく使用しながらも、バクテリア発酵と類似する乳酸生成能で乳酸発酵を行うことができるので、発酵費用を大きく節減でき、副産物であるエタノール及びグリセロールの生成能が下がるので、後段の精製工程費用も節減することができる。
特に断らない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
耐酸性酵母は、酸性ｐＨでも糖を速い速度で消耗し、且つ高い成長率を示し、発酵条件では、消耗した糖を産物に転換する特徴を有する。本発明者らの先行研究では、このような特徴を有する酵母として、複数の酵母ライブラリーから耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）を選別し、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）は、乳酸濃度が４０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌである条件でも高い成長性及び糖消耗速度を示す菌株である（大韓民国特許出願１０－２０１８－００４４５０９号）。
本発明者らの先行出願では、前記耐酸性酵母ＹＢＣ菌株を対象にして、乳酸生成能を上げ、エタノール生成能を下げるための代謝回路調節を行うことにより、ＹＢＣ菌株からアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株からラクテートをピルべートに転換するシトクロムｂ２酵素をコードする遺伝子を欠失させて組換え菌株を作製した。
なお、本発明者らは、前記作製された組換え菌株においてグリセロール生成を抑制するために、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換するグリセロール－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失した組換え菌株を作製したことがある。
本発明では、前記組換え菌株の乳酸耐性を回復させるために、～８０ｇ／Ｌまでの様々な乳酸濃度を含む培地で前記組換え菌株を継代培養しながら乳酸耐性の高い菌株を選別し、選別された菌株のＰＤＣ遺伝子位置に置換されていた外来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子に置換して新しい組換え菌株を作製し、該組換え菌株が高い乳酸耐性と高い乳酸生成能を同時に有するとともに、エタノール生成能及びグリセロール生成能が抑制されることを確認した。
したがって、本発明は、一観点において、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失し、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の位置にスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株に関する。
本発明において、前記スタフィロコッカスエピデルミディス由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１で表示されることを特徴とし得る。
本発明において、前記組換え菌株は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化していることを特徴とし、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化していることを特徴とし得る。
本発明において、前記組換え菌株は、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化していることを特徴とし得る。
本発明は、他の観点において、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株であって、
前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＡＤＨ遺伝子、ＰＤＣ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されており、
前記ＰＤＣ遺伝子の位置に導入されているラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、スタフィロコッカスエピデルミディス由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする組換え菌株に関する。
前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＡＤＨ遺伝子、ＰＤＣ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されており、
前記ＰＤＣ遺伝子の位置に導入されているラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、スタフィロコッカスエピデルミディス由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする組換え菌株に関する。
本発明において、前記スタフィロコッカスエピデルミディス由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号１で表示され、そのタンパク質配列は配列番号２で表示され、この遺伝子は、耐酸性ＹＢＣ菌株において発現のためにコドン使用頻度（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を調整したことを特徴とし得る。
本発明において、前記欠失したＡＤＨ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されているラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、スタフィロコッカスエピデルミディス由来又はラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来であることを特徴とし得る。
乳酸生成能を有する組換え菌株は、高い乳酸収率及び乳酸生成能を有するが、細胞内部で大量に生成される乳酸及び細胞内部炭素流（Ｃａｒｂｏｎ ｆｌｕｘ）の大きな変化によって、酸化還元バランス、細胞成長及び調節機序に影響が及び、これによって、細胞成長速度及び糖消耗速度（結論的に、乳酸生成速度）などが弱化する変化が発生する。遺伝工学で誘発された乳酸耐性の減少理由は、次の通りである。既存の野生型微生物は、高濃度（４０～８０ｇ／Ｌ）の乳酸が細胞外部に存在し、そのｐＨがｐＫａよりも低いｐＨ２～３においても円滑に成長をする菌株であった。この菌株が遺伝子操作を経て内部で活発に乳酸を生産するようになりながら、細胞内部の生成された乳酸及び細胞外部の乳酸が、細胞膜を透過した（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ）乳酸による影響の他にも内部で発生する乳酸によって二重的阻害を受けることになり、増加した細胞内部の乳酸濃度は細胞のｐＨを減少させ、細胞内部の遺伝子複製及びタンパク質生産を含む様々な細胞内活動に対して阻害効果を及ぼすことになり、乳酸耐性が低くなる。
また、このような阻害効果は、外部乳酸農度が増加したり或いは外部ｐＨが酸性化して全乳酸中に多い分率が水和した形態で存在する場合には一層大きくなる。このような組換え菌株に誘発される問題を解決するために、適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）／強制進化のように、菌株を目的環境で持続培養し、環境に適応して変異した菌体を持続的に選別しながら性能を向上させる方法を用いる（Ｚｈｅｎｇｍｉｎｇ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０２：４６１５－４６２７，２０１８；Ｅｕｇｅｎｅ Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３９（２０１７）１９－２８，２０１７；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ Ｌｏｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：２０９－２１５，２０１８）。このような強制進化方法を適用するとき、変異を起こす化合物又はＵＶなどの物理的変異物質（Ｚｈｅｎｇｍｉｎｇ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１８）１０２：４６１５－４６２７．）を使用することもでき、本発明においても前記適応進化に加えて他の試みとしてこれを適用しようとした。しかし、無作為に発生する変異のうち、目的とする性能の増加（一例として、耐酸性）と共に、他の性能（一例として、生産性）の同時増加を起こす場合が極めて希であり、約１００ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）を個別点検したにもかかわらず有用菌の選別は難しかったし、選別対象群を拡大しようとする試みは、１０8ｃｏｌｏｎｙ／ｍｌ以上の個体で培養され、変異する菌体群から、自動化したシステムで優れたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を選別できる自動化したシステム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｙｓｔｅｍ）及び優秀コロニーを検出できる遺伝子システム（一例として、ＬＤＨの発現量に比例する蛍光レポーター）の開発の必要性からすれば、適用が困難であった。
したがって、変異体を活用する方法よりは適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）法を利用し、組換え酵母菌株を高濃度糖と乳酸濃度で菌体の培養を継続し、成長が円滑であれば乳酸濃度を上げていった。また、培養の中間段階で、乳酸を含む固体培地に当該菌体を塗抹し、当該固体培地から成長速度に優れた（サイズの大きい）コロニーを選別し、このコロニーの乳酸生成能を別途にフラスコテストする方法を反復し、選別された菌株を当該培養の親菌株と直接比較した。このような反復作業により、目的とする乳酸耐性を有するとともに、乳酸生成能が増加した菌株ストレインが選定できたし、増加した発酵性能を発酵器培養によって確認した（図７参照）。
したがって、他の観点において、本発明は、（ａ）乳酸生成能を有する組換え酵母菌株を、低濃度乳酸培地から高濃度乳酸培地へと順次に培養し、前記組換え酵母菌株を高濃度乳酸濃度に適応進化させる段階；（ｂ）高濃度乳酸培地で乳酸生成能が向上した組換え酵母菌株を選別する段階；及び、（ｃ）前記選別された菌株のゲノムのＰＤＣ遺伝子の位置にスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入する段階を含む、乳酸耐性が増加した乳酸生成能を有する組換え酵母菌株の製造方法に関する。
本発明において、前記（ａ）段階の乳酸生成能を有する組換え酵母菌株は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株であって、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＡＤＨ遺伝子、ＰＤＣ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されているＹＢＣ５菌株であることを特徴とし得る。
さらに他の観点において、本発明は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株を、高濃度乳酸濃度に適応進化させて得た組換え菌株＃２６－５（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）に関する。
さらに他の観点において、本発明は、前記組換え菌株＃２６－５（寄託番号：ＫＣＴＣ１４２１５）のゲノムのＰＤＣ遺伝子の位置にスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されており、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）又はＹＢＣ５菌株に比べて、高濃度乳酸において乳酸生成能が向上し、エタノール及びグリセロール生成が低下した組換え酵母ＹＢＣ６菌株に関する。
適応進化（ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）は非常に強力なツールであるが、それに伴う反作用も発生する。適応進化のうち、本発明で採択したものは、高濃度の乳酸でよく成長できるように適応したストレインの選定である。このような過程で選定された適応微生物は、遊離乳酸の濃度が高い状態でも成長でき、選定過程で乳酸生成能の高い菌株を選別するので、乳酸濃度に対する防御メカニズムが発達しており、乳酸存在下でも糖の代謝が促進される菌株が選定される。選定された菌株のこのような特性は、発酵培養において反応器内に乳酸濃度が蓄積される状況でも反応器内の微生物の濃度を上げることができ、このような高い微生物濃度は、全体乳酸生産速度を増加させる。特に、この適応進化過程は、本発明で使用している親菌株が遺伝子操作を進行する前の特性により高濃度の乳酸で非常に速い速度で成長し且つ高い糖消耗速度を有する菌株であるため、遺伝子操作によって炭素流（ｃａｒｂｏｎ ｆｌｕｘ）をエタノールから乳酸へと変更する過程でこのような乳酸耐性が減って乳酸存在下で成長速度が減少したことを、適応進化によって回復させる過程である。しかし、このような適応進化過程を微生物の立場で考えると、いくつかの微生物が必須に選択する方向がある。微生物の立場では、ｐＫａよりも低い酸性ｐＨ状態では、外部に乳酸濃度が高くなると、イオン化していない状態の水和された乳酸が細胞内部に伝達浸透して細胞内部のｐＨを下げるという影響を及ぼし、このような乳酸による影響が大きい状態でＤＮＡ複製とタンパク質生産などを行いながら、成長基質である糖を転換し、ＡＴＰ及びＮＡＤＨを生産できる発酵産物（炭素流）を選択するとき、外部ストレスと同じ影響を与える乳酸生産性能（一例として、生産速度）を強化させながら成長が促進され、糖代謝速度が速くなる進化をする方向は、自然的な選択の方向と言えず、乳酸よりは現ストレス因子に影響を少なく与える発酵産物を生成させる方向を選択することが自然である。また、本発明で使用した親菌株において乳酸生成経路は外部から導入された経路であり、そもそも野生型微生物はエタノールを主な生産物として成長する微生物であったので、自然に乳酸の耐性増加と共に成長を促進するために強化させた炭素経路（ｃａｒｂｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）はエタノールであり、このため、乳酸生成工程の副産物であるエタノールが増加することを確認した。
適応進化により誘発された副産物の増加と、乳酸耐性の増加を促進した遺伝的要因について分析をするために、適応進化進行前と後の微生物を対象にｑＰＣＲ分析を行った（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）。ｑＰＣＲ分析の以外に全体遺伝体に対する分析を行って差異を分析することもできるが、遺伝体内の変異によって変形された遺伝子は非常に多いものの、その中で実際にタンパク質発現やその調節機序を経て表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）として現れた因子は一部であるため、耐性増加及び成長速度増加のような表現型として現れた遺伝要因を探すには、ｑＰＣＲ分析がより適切であると判断した。
転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の分析において、発現差が出る遺伝子を明らかにするために、全体分析されたＲＮＡ配列のうち、野生型菌株における発現率と適応進化菌株における発現率との差（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）が２倍以下或いは以上に減少／増加した遺伝子を区分した後、アノテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）で当該遺伝子を分析した（表６参照）。
発現が減少した遺伝子プール（Ｐｏｏｌ）のうち特異な遺伝子は、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードするＬＤＨ遺伝子である。これは、前述したように、乳酸濃度を増加させ、成長速度及び乳酸生産速度が最も速い（場合によっては、生産された乳酸農度が最も高い）微生物を選別したが、乳酸による酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）又は酸性ｐＨによる阻害に対して微生物の立場で対応可能な優先的方案が、内部で生産する乳酸の生産量を減らす方向であるはずなので、このような発現減少が適応進化過程で微生物内に蓄積されたものである。もちろん、選別菌株は乳酸生産性にも優れるが、これは、主に速い成長速度によって微生物の濃度が速く上がる効果と、糖の消耗或いは糖の細胞内移送速度が上がりながら発生する効果と考えられ、上のような発現型の減少から、細胞糖乳酸生産能は低下したと判断される。
発現が増加した遺伝子プールに対して分析した結果、いくつかの同じ役割を担当する遺伝子群の発現が共に増加することが観察された。これらをカテゴリー化すれば次の通りである。
カテゴリーＡは、発酵生産物と関連したものであり、上述したラクテートデヒドロゲナーゼの発現減少の他に、成長速度を達成するための炭素流（ｃａｒｂｏｎ ｆｌｕｘ）の強化を目的に発生したエタノールの生産と関連した遺伝子である。特に、既存ＰＤＣ（ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子）及びＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）活性を確認時に、候補（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）としてはテストしたが、予測した活性が確認できなかった遺伝子が、今回の適応進化によって強化されたことが確認できた。カテゴリーＥは、ヘキソーストランスポーター（ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）であり、これらは、初期に外部でＣ６糖、すなわち、グルコース、マンノースのような糖に作用してそれを細胞内に輸送するタンパク質と関連した遺伝子群である。カテゴリーＢは、ジンクフィンガー（ Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）タンパク質類である。乳酸によって誘発された酸化ストレスは、ジンクフィンガータンパク質と関連した機能基に影響を与えたり、或いはジンクフィンガータンパク質関連強化が活性酸素種（ＲＯＳ）の影響緩和に作用するという研究があるなど（Ｄｅｒｅｋ Ａ．Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３２０－２３２５，２００９）、乳酸含有酸化ストレスとジンクフィンガータンパク質の関連性が非常に高く（Ｘｉｘｉ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｉｍｓｔｒｙ，２９０：１８３６１－１８３６９，２０１５；Ｂ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，５：ｅ１３３４，２０１４；Ａｎａｎｄａ Ｓ．Ｐｒａｓａｄ ａｎｄ Ｂｉｎ Ｂａｏ，Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ８：１６４，２０１９）、選別菌株の耐酸性のうち一部は、このようなジンクフィンガータンパク質と関連があると推定される。カテゴリーＤは、硫酸塩／亜硫酸（Ｓｕｌｆａｔｅ／Ｓｕｌｆｉｔｅ）と関連した遺伝子であり、特に、硫酸塩／亜硫酸レダクターゼの発現増加が観察されたが、これは、乳酸による酸化ストレスによってこれらの硫酸塩／亜硫酸による酸化ストレスを緩和するメカニズムが作用して発現が高くなったものと推定される。その他、外部ストレスに対して遺伝子構造及び細胞構造を支持しようとする遺伝子の発現が確認され、これらはカテゴリーＤストレス反応と総称した。
前記転写体分析により、本発明の菌株の様々な特性を確認し、将来、リバースエンジニアリング（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｅｎｇｉｅｅｒｉｎｇ）を含む追加研究によって各遺伝子の特性を研究すれば、追加の性能開発方案を作ることができる。
前記転写体分析ではグリセロール生成に関連した遺伝子の発現増加は確認できなかったが、発酵培養によって確認した表現型では、適応進化によって選別された菌株は、グリセロール生成能も親菌株に比べて増加したということが確認できた。
したがって、この増加したグリセロールは、関連遺伝子の発現よりはＬＤＨの弱化によってＮＡＤＨ再生力が不足してグリセロール生成経路を通じてＮＡＤＨを再生して発生したものであり、ＬＤＨの強化時に再び減ると判断された。
結論的に、乳酸耐性増加による同一時間に発酵器内でより多くの微生物を得ることができ、糖代謝速度が増加して発酵速度が増加したが、これと同時に、乳酸耐性増加による乳酸工程の副産物増加も観察され、これは、耐性増加に伴うＬＤＨの発現減少及びこれによるグリセロール増加とエタノール生成関連遺伝子の発現による現象であった。これを解決するための方案として、ＬＤＨの強化及び誘発エタノール遺伝子の除去を考慮することができ、本発明では、ＬＤＨの追加発現を行って各細胞内における生産速度を上げて全般的な（ｏｖｅｒａｌｌ）生産速度をさらに増加させながら、補酵素であるＮＡＤＨの還元をＬＤＨで行って、グリセロール経路で担当していたＮＡＤＨ還元を減少させ、結論的にグリセロールの増加レベルも下げ、代謝経路でピブリン酸を前駆体ノードにしてエタノール生産と直接競合する乳酸生成能を強化してエタノール生成を減少させる方法をまず試みた。その後、必要によっては、追加発現したエタノール生成遺伝子を除去する方案も実施することができる。
本発明の一態様において、適応進化を進行した菌株はＹＢＣ５菌株であり、当該菌株には、ゲノムのｇ４４２３（ＡＤＨ）、ｇ３００２－１（ＰＤＣ）、ｇ２９４７（ＣＹＢ２）の位置にラクトバシラスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のＬＤＨ遺伝子が置換されており、二倍体（Ｄｉｐｌｏｉｄ）であるＹＢＣ菌の特性の上、総６コピー（ｃｏｐｙ）の遺伝子が挿入されている菌株である。多くの場合、同一の遺伝子が挿入されると、細胞のフィードバック阻害によって同一遺伝子の発現は抑制され、コピー数と同じ効果を発揮できず、しかも同じ遺伝子の存在はゲノムの安定性に影響を与える可能性もある。このような理由と共に、本発明ではＬＤＨを強化させる目的で新しい方案を見出した。本発明者の先行特許出願（大韓民国特許出願２０１８－００４４５０９及び大韓民国特許出願２０１９－０１２４７０１）に記載の通り、ＹＢＣ５菌株のｇ４４２３（ＡＤＨ）位置に挿入されたＬＤＨは非常に高い活性を示し、ｇ２９４７（ＣＹＢ２）位置に挿入されたＬＤＨもｇ２９４７プロモーターの影響によって発酵後半にも持続した活性を示した。しかし、ｇ３００２－１（ＰＤＣ）位置に挿入されたＬＤＨは、相対的に表現型において乳酸生産力を上げる程度が大きくなく、特に、ＹＢＣの内在されたＰＤＣは、当該ｇ３００２－１（ＰＤＣ）の高活性プロモーターによって高い発現率を示すことを、ｑＰＣＲで確認したことがあり、関連現象に対して追加研究を行った。
まず、野生型ＹＢＣ菌株にｇ３００２－１を除去しながらＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨを導入して乳酸生成能を確認した。当該菌株は、ＰＤＣの除去による表現型はよく見られたが、乳酸は非常に少なく生成することが確認できた。ｇ４４２３によってＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨが強く発現することを考慮するとき、同一菌株内で異なる遺伝体内位置における同一遺伝子の極端な発現力の差異は、一般的な現象ではなかった。万一、当該ＬＤＨがＲＮＡにまで発現したとすれば、タンパク質への翻訳段階は円滑に進行されると推論され、結論的には、同一遺伝子が当該ＰＤＣ位置では転写されなかったと推定される。このような現象の解決のために、本発明者らは様々な仮説を立ててみたが、これを解決する仮定は見いだせなかった。そこで、本発明者らは、当該遺伝体位置とＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨの遺伝子構造的問題によって円滑な発現が抑制されると仮定し、これを解消するために、他の菌株由来のＬＤＨを導入して遺伝体構造を変え、ＬＤＨ発現を促進させようとした。
導入しようとする対象ＬＤＨは、可能な限り耐酸性菌株の特性に合うように酸性で最適ｐＨを有しているとともに、酵母で発現が高い遺伝子を選別しようとした。自然界に存在する数多くの遺伝子からこのような遺伝子をスクリーニングだけで探すことは、必要リソースからして不可能に近く、多くの仮定と共にゲノムマイニング（Ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ）及び実験的確認が必要な作業である。本発明者らは、このようなゲノムマイニング作業よりは、文献上で類似の特性がある遺伝子を選別し、当該耐酸性菌株のｇ３００２－１の位置に入れて活性を確認することをまず試みた。文献調査によって類似条件に対して既確認の遺伝子を探そうとし、対象文献（Ｊａｅ Ｗｏｎ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４１，２０１７）でテストした遺伝子のうち効果があったスタフィロコッカスエピデルミディス由来ＬＤＨとボースタウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）由来ＬＤＨ遺伝子を対象にした。
対象３種遺伝子を野生型であるＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）のｇ３００２－１位置に導入した後、乳酸生成能を比較した結果、非常に興味深い事実が確認された。３種の遺伝子の活性の差異が非常に大きかったが、そのうち、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ＬＤＨ（ＳｅＬＤＨ）遺伝子はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ（ＬｐＬＤＨ）に比べて、乳酸収率基準で３９倍の活性増加が確認され、その結果としてＳｅＬＤＨ遺伝子単独でｇ３００２－１位置で収率０．３９ｇ／ｇが達成できた。これは、既存ｇ４４２３位置のＬｐＬＤＨに比肩できる活性であり、これによって、ｇ３００２－１位置でも高い活性を確保しながら適応進化した菌株のＬＤＨ活性を回復するための方案も確保した。
ただし、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＬＤＨ遺伝子は、様々なＬＤＨのうち補酵素としてＦＤＰを要求するＦＤＰ活性化ＬＤＨ（ＦＤＰ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＬＤＨ）（Ｅ．Ｉ Ｇａｒｖｉｅ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９８０）形態であり、このＦＤＰは解糖過程の中間産物である。したがってＬｐＬＤＨ遺伝子の活性は、ＦＤＰの可用性に影響を受ける可能性が高く、一般のグルコース、フルクトース、スクロースなどの糖を基質として使用する場合に比べて、別の糖を使用する場合には活性に影響を受ける可能性が存在する。しかし、商用工程で主に使用する基質が前記のグルコース、フルクトース、スクロースなどが主成分であるトウモロコシ澱粉（ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ）及びその糖化産物、サトウキビ汁（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｊｕｉｃｅ）及びその副産物などであるので、このような制約事項は最小化する。
本発明の一様態では、前記ＳｅＬＤＨ遺伝子を、適応進化を用いて選別した菌株に挿入し、当該菌株は、予想した通り、副産物が大きく減少しながら速度もより増加した結果を得た。
本発明で確保された菌株の培養において、既存文献（Ａｎｔｏｎｉｕｓ Ｊ．Ａ．ｖａｎ Ｍａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７０；２８９８，２００４）に記載の通り、耐酸性菌株の発酵に対するＡＴＰ要求事項、すなわち、細胞外部に乳酸農度が増加するにつれて内部乳酸を外部に移送するためにエネルギーが必要であり、このため、ＡＴＰを消耗することによるＡＴＰ供給が発酵時に必要であるいうことが確認された。これは、一般の発酵が生産菌株に酸素を遮断しながら乳酸を生産するように強制しながら確保できる２ＡＴＰ／グルコースに、さらに耐酸性乳酸生成によるＡＴＰの消耗が発生することであり、これにより、一般発酵の嫌気条件では細胞維持に必要なエネルギーが不足することになる。これを補充するために酸素供給が必要であり、この酸素は、基質をＴＣＡ回路で完全酸化させて、エネルギーであるＡＴＰを供給するが、同時に一部の基質が乳酸ではなくＣＯ2に転換されながら乳酸収率の減少を招くことになる。したがって、細胞が活性は維持しながらも乳酸収率の損失は最小化する最適のエアレーション（ａｅｒａｔｉｏｎ）条件の設定が必要である。
なお、本発明の菌株が酵母であるとともにグラム陽性菌株であるため、これを考慮した発酵方法を設定しなければならない。周知の如く、グラム陽性菌株は、高濃度糖の存在時に、好気条件下でもＴＣＡの他にエタノール発酵や乳酸発酵のような嫌気性発酵反応が起きる。これに対し、グラム陰性菌株は好気条件で発酵産物生産が抑制されることがあり、菌体のみが増え、菌体成長期と発酵産物生産期を区分して実行することができる。しかし、このようなグラム陰性菌株は、好気条件では細胞成長を起こし、発酵器で高い細胞濃度を確保することができるが、好気条件で消耗される多くの基質は細胞成長と共にＣＯ2に転換されるため、発酵速度増加のために無制限に細胞を増やすことはできない（しかも、培地の栄養分及び制限基質によって細胞濃度が制限されることも当然の事実である）。これに対し、グラム陽性菌株は、好気条件で細胞成長が起き、また発酵産物も生産されるため、発酵産物が乳酸である場合、乳酸生成酵素であるＬＤＨが消耗するＮＡＤＨによって解糖過程に必要なＮＡＤの供給が続き、相対的にグラム陰性菌株においてＴＣＡで呼吸によって基質をＣＯ2に転換しながら供給する（酸化させる）ＮＡＤに比べてＣＯ2への炭素損失を抑えながら乳酸を増やすことができるので、乳酸収率に有利であり得る。しかし、反応器内の速い発酵産物蓄積は、相対的に成長阻害が発生する乳酸濃度に早く到達させることがあり、これにより、目的とする細胞濃度まで増殖するのに制限があり得る。したがって、これを克服するためには、最適のシード（Ｓｅｅｄ）濃度及び発酵初期成長速度を最大にしながらも、過量の酸素による基質のＣＯ2への過剰転換を防ぎ得る最適酸素供給速度の調節が必要である。また、成長が止める乳酸の濃度に到達すると直ちに酸素供給速度を下げ、前述したように、乳酸を細胞外部に排出できるエネルギーであるＡＴＰを供給しながら過量のＣＯ2損失が発生しない微好気（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）状態を維持するように酸素供給速度を調節することが必要である。したがって、本発酵は中和のための化合物の投入とこれを混合するための発酵器内の高い混合速度（ｈｉｇｈ ｍｉｘｉｎｇ ｒａｔｅ）を維持する必要はないが、過量の酸素によるＣＯ2損失は減らしながら、発酵初期には十分の細胞成長が起き、発酵後半には十分のＡＴＰ供給が発生できる最小の酸素供給速度に調節することが必要であり、これは重要なスケールアップファクター（Ｓｃａｌｅ－ｕｐ ｆａｃｔｏｒ）である。このような酸素供給速度の最適化は、多くの実験から、適正なエアレーション速度及び混合速度を見出すことができ、また、ＯＵＲ及びＯＴＲのような当該分野に知られた因子（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）などを用いて最適値を見出すこともできる。
本発明の一態様において、適応進化によって選別された菌株は、親菌株であるＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）又は親菌株由来の変異菌株であるＹＢＣ１、ＹＢＣ２／ＹＢＣ３／ＹＢＣ４／ＹＢＣ５菌株に比べて乳酸による耐性が増加し、高い細胞濃度が達成でき、速い乳酸生成速度も達成できる。本発明の他の様態では、前記適応進化によって選別された菌株においてＬＤＨを強化し、エタノール及びグリセロール生成の低減を達成した。
本発明にさらに他の様態では、親菌株であるＹＢＣ菌株のゲノムのＰＤＣ（ｇ３００２－１）遺伝子の位置にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子を導入して現れる乳酸生成能と比較して、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ＬＤＨ遺伝子を導入することによって、乳酸生成能が収率基準で３０倍以上強化することを確認した。
本発明において、前記導入されるラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来ＬＤＨ遺伝子、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ由来ＬＤＨ遺伝子、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ由来ＬＤＨ遺伝子、又はＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ＬＤＨであることが好ましく、より好ましくは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子はｇ４４２３（ＡＤＨ）位置に導入され、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ＬＤＨ遺伝子はｇ３００２－１（ＰＤＣ）位置に導入されることが好ましい。
本発明の一様態では、ＹＢＣ５菌株（Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ／Δｇ１５４４）が適応進化によって乳酸耐性が顕著に増加した＃２６－５菌株は、より速い乳酸生成能及び乳酸生成濃度を得、当該工程の経済性を大きく増加させることが分かる。また、このような＃２６－５菌株のｇ３００２－１のＬＤＨをＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ＬＤＨに置換したＹＢＣ６菌株（Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ／Δｇ３００２－１：：ＳｅＬＤＨ／Δｇ２９４７：：ＬｐＬＤＨ／Δｇ１５４４）は、ＹＢＣ５及び＃２６－５に比べてより生産速度及び生産濃度が増加し、エタノール及びグリセロールの生成が抑制され、収率も増加することを確認した。このようなＹＢＣ６の発酵性状は、耐酸性菌株として収率、生産速度及び生産濃度が商業化可能なレベルまで到達したことが確認できる。
したがって、本発明は、他の観点において、（ａ）前記組換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階を含む乳酸の製造方法に関する。
本発明によって、ラクテート生産性、生産濃度及び生産収率が大きく増加して商業化レベルに到達し、エタノール生産が大きく減少し、しかもグリセロール副産物も大きく減少した優れた耐酸性菌株を確保することができる。
本発明において、‘耐酸性酵母’とは、有機酸のｐＫａ値未満のｐＨにおいて、培地に有機酸が含まれていない場合に比べて、培地に１Ｍ以上の有機酸（特に、乳酸）が含まれている場合、少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の非生長率を維持できる酵母と定義する。より具体的に、本発明において、‘耐酸性酵母’とは、ｐＨ５以上の場合に比べて、ｐＨ２～４において少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の非生長率を維持できる酵母と定義する。
本発明に係る組換え酵母は、通常の方法によって前記遺伝子を宿主酵母の染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）上に挿入させたり、或いは前記遺伝子を含むベクターを宿主酵母に導入させることによって製造できる。
前記宿主酵母は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が通常用いられ、本発明の一実施例では耐酸性酵母を用いているが、これに限定されず、目的ＤＮＡが十分に発現するものであればいかなる種類の酵母でも構わない。
前記組換え酵母は、任意の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法によって製造できる。“形質転換”とは、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体の因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることであり、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味し、通常の形質転換方法には電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＰＥＧ法などがある。
また、本発明において遺伝子を宿主微生物の染色体上に挿入する方法には、通常知られた任意の遺伝子操作方法を用いることができ、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルス性ベクターなどを利用する方法がある。“ベクター”は、適当な宿主内でＤＮＡを発現させ得る適当な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは関係なく複製し機能してもよく、或いは、一部の場合にはゲノム自体に統合されてもよい。現在、プラスミドがベクターの最も多用されている形態であり、また、線形化ＤＮＡ（Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ＤＮＡ）も酵母のゲノム集積（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のために一般に使用する形態である。
典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりにプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選抜可能にする抗生剤耐性遺伝子又は栄養要求マーカー遺伝子（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）、及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片を挿入可能にする制限酵素切断部位を含む構造を有する。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができ（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、必要によっては、所望の全シーケンスを合成して使用する方法も一般に用いられている。
なお、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合される時に遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現する場合にポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合にコーディング配列に作動可能に連結される。
一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダの場合、接触しリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーション（連結）によって行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いる。
勿論、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現させる上で同等に機能を発揮するわけではなく、同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して同一に機能を発揮するわけではない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担無しで本発明の範囲から逸脱しない状態で、他の様々なベクター、発現調節配列及び宿主の中から適宜選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその宿主内で複製される必要があるためであり、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力、及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮される必要がある。
本発明において、炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、ガラクトース、グルコースオリゴマー及びグリセロールで構成された群から選ばれる一つ以上であることを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明において、培養は、微生物、例えば大腸菌などがそれ以上働かないようにする（例えば、代謝体生産不可能にする）条件で行われてよい。例えば、培養は、ｐＨ１．０～６．５、好ましくはｐＨ１．０～６．０、より好ましくはｐＨ２．６～４．０であることを特徴とし得るが、これに限定されない。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：耐酸性酵母菌株ＹＢＣの適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）＃１
本発明者らは、先行研究において様々な酵母菌株に対するテストにより、耐酸性を有する菌株を選別し、酵母菌に対して乳酸を培養初期に培地に添加して微生物の成長及び糖消耗速度を確認しながら、耐酸性に最も優れた菌株であるＹＢＣ菌株を選定し、韓国生命工学研究院生物資源センターにＫＣＴＣ１３５０８ＢＰとして寄託したことがある。
系統分析から、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに類似する菌株であり、２倍体の遺伝子を有し（Ｄｉｐｌｏｉｄ）、クラブツリー陽性特性があることを確認した。
本発明者らは、先行研究において様々な酵母菌株に対するテストにより、耐酸性を有する菌株を選別し、酵母菌に対して乳酸を培養初期に培地に添加して微生物の成長及び糖消耗速度を確認しながら、耐酸性に最も優れた菌株であるＹＢＣ菌株を選定し、韓国生命工学研究院生物資源センターにＫＣＴＣ１３５０８ＢＰとして寄託したことがある。
系統分析から、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに類似する菌株であり、２倍体の遺伝子を有し（Ｄｉｐｌｏｉｄ）、クラブツリー陽性特性があることを確認した。
当該ＹＢＣ菌株を遺伝工学的に変形したＹＢＣ５菌株は、エタノール生産が最小限に抑えられながら、乳酸消耗が抑制され、グリセロール生成が抑制され、商業化可能な収率を達成した（大韓民国特許出願１０－２０２０－００４６７７９）。
前記ＹＢＣ５菌株は、ＹＢＣ菌株からＡＤＨ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入したＹＢＣ１菌株に、さらにｇ３００２－１遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）が除去されながらＬＤＨが発現した菌株であって、エタノール生成能が封鎖されながら乳酸を高効率で生産するＹＢＣ２菌株に、ラクテートを消耗する遺伝子であるｇ２９４７を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入して乳酸消耗能が除去されたＹＢＣ４菌株を作製し、該ＹＢＣ４菌株からＧＰＤ１（ｇ１５４４）遺伝子を除去して（２倍体（Ｄｉｐｌｏｉｄ）の菌株としてＡｌｌｅｌｅ １及びＡｌｌｅｌｅ ２を全て除去）作製した。
前記菌株の作製方法は次の通りである：
前記ＹＢＣ１菌株は、ＹＢＣ菌株の主ＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３遺伝子を除去し、前記ｇ４４２３位置にラクトバシラスプランタルム由来の配列番号３のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ４４２３及びこれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲを含む遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ）として使用した。ｇ４４２３の各アレル（ａｌｌｅｌｅ）に対して、相応する５’ＵＴＲは配列番号４及び配列番号５で示し、３’ＵＴＲは配列番号６及び配列番号７で示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。ｇ４４２３のＯＲＦ位置に配列番号３のＬＤＨを合成した後に導入してドナーＤＮＡを作製し、これをＹＢＣに導入して組換え菌株ＹＢＣ１を作製した。
前記ＹＢＣ１菌株は、ＹＢＣ菌株の主ＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３遺伝子を除去し、前記ｇ４４２３位置にラクトバシラスプランタルム由来の配列番号３のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ４４２３及びこれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲを含む遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ）として使用した。ｇ４４２３の各アレル（ａｌｌｅｌｅ）に対して、相応する５’ＵＴＲは配列番号４及び配列番号５で示し、３’ＵＴＲは配列番号６及び配列番号７で示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。ｇ４４２３のＯＲＦ位置に配列番号３のＬＤＨを合成した後に導入してドナーＤＮＡを作製し、これをＹＢＣに導入して組換え菌株ＹＢＣ１を作製した。
なお、ｇ３００２－１遺伝子は、ＹＢＣ菌株のゲノムシーケンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）においてスキャフォールド７２位置にある遺伝子であり、ＰＤＣ遺伝子として作動する遺伝子である。ＹＢＣ１菌株のｇ３００２－１遺伝子（スキャフォールド７２に位置している遺伝子）を除去しながら配列番号３のＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ２を作製した。
このようなｇ３００２の遺伝子を置換するためのカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）は、当該ＵＴＲを組み換え（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）位置として用いて作製した。上記のＹＢＣ１のｇ４４２３遺伝子（ＡＤＨ）の位置にＬＤＨを導入する方法と類似に、ｇ３００２－１のＵＴＲを用いて作製した。ただし、当該遺伝子の置換では、過程の単純化のために、アレル変化（ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を考慮しないで一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。また、遺伝子置換に使用するプライマーに対しても、上記の欠失菌株作製に使用したプライマーの他に、次のようにｇ３００２－１のＵＴＲとＬＤＨを共に確認できるプライマー対を別個に使用して遺伝子置換確認の正確度を上げた。
ｇ３００２－１ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｆｗｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号８）
ｇ３００２－１ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｒｅｖ：ＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号９）
ｇ３００２－１ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｒｅｖ：ＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号９）
また、ＹＢＣ４菌株は、ＹＢＣ２菌株のＣＹＢ２遺伝子であるｇ２９４７遺伝子を除去し、前記ｇ２９４７位置にラクトバシラスプランタルム由来の配列番号３のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ２９４７遺伝子はＹＢＣ菌株のゲノムシーケンシングにおいてスキャフォールド４１位置にある遺伝子である。ｇ２９４７及びそれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲを含む遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡとして使用した。ｇ２９４７の各アレルに対して、相応する５’ＵＴＲは配列番号１０及び配列番号１１に示し、３’ＵＴＲは配列番号１２及び配列番号１３に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリ、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。
ただし、当該遺伝子の置換では、過程の単純化のために、アレル変化を考慮しないで一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。
前記ＹＢＣ５菌株は、ＹＢＣ４菌株のＧＰＤ１遺伝子であるｇ１５４４遺伝子を除去した菌株であり、ｇ１５４４遺伝子はＹＢＣ菌株のゲノム配列分析においてスキャフォールド１９位置にある遺伝子である。ｇ１５４４及びそれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーを持つ遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡとして用いた。ｇ１５４４の各アレルに対して、相応する５’ＵＴＲは配列番号１４及び配列番号１５に示し、３’ＵＴＲは配列番号１６及び配列番号１７に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリー、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。
ただし、当該遺伝子の置換では過程の単純化のために、アレル変化を考慮しないで一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。また、抗生剤マーカーも、現在商用化された遺伝工学技術（ＣＲＩＳＰＲ）を適用する場合、それを使用しない形態で作製及び適用することも可能である。
前記作製した組換え菌株の遺伝型は次の通りである：
ＹＢＣ２：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ
ＹＢＣ４：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ
ＹＢＣ５：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ／Δｇ１５４４
ＹＢＣ２：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ
ＹＢＣ４：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ
ＹＢＣ５：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ／Δｇ１５４４
しかし、商業化時に経済性を確保するためには、組換え菌株が２．５ｇ／Ｌ／ｈｒ以上の生産速度と１２０ｇ／Ｌ以上の乳酸農度をｐＨ ３．７以下で達成しなければならない。したがって、以下の実施例では、ＹＢＣ５菌株の乳酸生産速度を増加させるために、乳酸に対する耐性を高める処理を行った。
ＹＢＣ５菌株を、表１に示すように、乳酸濃度を１０ｇ／Ｌ－＞８０ｇ／Ｌへと順次に上げながら継代培養をした。継代培養をしながら自然的変異によって菌体内に変異体が発生し、中でも高濃度乳酸への適応力が高い菌株が相対的に速く成長しながら、次第に全菌叢内で優占種化する。このような過程を乳酸濃度を上げながら反復し、全菌叢の成長速度を確認した。また、適切な時点で、乳酸を含む寒天プレートに菌叢を塗抹して生成されたコロニーを分離した。このとき、コロニー選定基準は、乳酸を含む固体培地上で速い成長によって最も大きくなったコロニーを選定する。このような過程によって液状濃度４０、５０、６０、７０、８０ｇ／Ｌで成長した菌叢からコロニーを４２個選定した。
この過程で各乳酸含有培養培地おいて菌叢によって生産された乳酸濃度の変化は、表２に示す。
前記選定された４２個のコロニーを５ｍｌのコニカルチューブに接種した。小規模培養であるので、接種ＯＤは極力均一な量をコロニーから取って直接接種し、使用した培地は、ｍ－ＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース６％（１次）又は１２％（２次）を添加して使用し、３０℃、１５０ｒｐｍ条件で９６時間培養した。
前記５ｍｌ培養結果を表３に示す。この培養において乳酸生産濃度、細胞濃度、又は乳酸生産収率が高いコロニー１５個を選定し、次のフラスコ培養評価を行った。
前記５ｍｌ培養結果を表３に示す。この培養において乳酸生産濃度、細胞濃度、又は乳酸生産収率が高いコロニー１５個を選定し、次のフラスコ培養評価を行った。
選定されたコロニーは、次の通りである。３、５、６、８、１０、２２、２４、２６、２７、３１、３２、３５、３７、３８、４１
選定されたコロニーを対象にフラスコ培養評価を行ったが、培養条件は次の通りである。ｍ－ＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース１０％（１次）を添加して総体積５０ｍｌとなるように調製した後に微生物を接種し、３０℃、１５０ｒｐｍ条件で７２時間培養した。また、培養１日後に、ＣａＣＯ3溶液を糖注入濃度の２０％が注入されるように追加した。
フラスコ培養に対する分析結果を表４に示す。
フラスコ培養の結果については総合的な判断が必要であり、評価ロジック（ｌｏｇｉｃ）を導入した。まず、生産速度、乳酸収率、成長速度、エタノール濃度（低い順序）、グリセロール濃度（低い順序）の各項目に対して上位５個のコロニーをそれぞれ選定し、選定されたコロニーを対象に項目別成績順点数と加重値を与えて合算した。加重値は、適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の目的上、乳酸生産速度を最優先とし、成長速度は速いが乳酸生成能が毀損されたコロニーは排除した。このような評価過程及び結果を表５に示す。
フラスコ培養の結果については総合的な判断が必要であり、評価ロジック（ｌｏｇｉｃ）を導入した。まず、生産速度、乳酸収率、成長速度、エタノール濃度（低い順序）、グリセロール濃度（低い順序）の各項目に対して上位５個のコロニーをそれぞれ選定し、選定されたコロニーを対象に項目別成績順点数と加重値を与えて合算した。加重値は、適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の目的上、乳酸生産速度を最優先とし、成長速度は速いが乳酸生成能が毀損されたコロニーは排除した。このような評価過程及び結果を表５に示す。
表５に示すように、２６番コロニー（以下、“＃２６菌株”という。）が選定されたが、主な理由は、乳酸生成能の増加に比して副産物の増加が最小化されたコロニーであったためである。副産物の増加を排除して乳酸生成能及び収率だけを考慮すれば、３番コロニーが相対的に優れた結果を示したが、一応、第１ラウンド目では全体的な性能を考慮した。このような副産物の増加傾向に対しては、以降に進行された適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）でも確認できた。
実施例２：耐酸性酵母菌株ＹＢＣの適応進化＃２
実施例１の適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）１ラウンドで選ばれた＃２６番菌株は、ＹＢＣ５に比べて性能の増加があったが（表４のＹＢＣ５との比較結果を参考）、商業化考慮性能には及ばず、更なる改善作業を行った。
実施例１の適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）１ラウンドで選ばれた＃２６番菌株は、ＹＢＣ５に比べて性能の増加があったが（表４のＹＢＣ５との比較結果を参考）、商業化考慮性能には及ばず、更なる改善作業を行った。
＃２６菌株は、乳酸濃度に対する耐性の増加があったため、高濃度の乳酸から始めて各濃度で継代培養回数を増やす方向に進行したし、中和剤であるＣａＣＯ3の投入無しで培養を行って極限条件内で成長性を高めようとした。
使用した乳酸は、実際の発酵で生産した培地を０．２μｍフィルターで不純物を除去した後に濃縮して４０～５０％の溶液を製造した後、目的とする乳酸濃度に合わせてＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス）と混合し、糖濃度は１０％にし、継代された培養培地を新しい培地全体積の１０％で接種して培養した。
図１の（ａ）に＃２６菌株の継代培養結果を示した。６０ｇ／Ｌの乳酸濃度下でも円滑な菌叢の成長を確認し、２３日目の培地でＹＰ培地に菌叢を希釈培養して１２個のコロニーを分離した。コロニーはサイズ基準で選別した。
選定されたコロニーに対して、実施例１と同じ条件でフラスコ培養を行った。この時の基準性能は＃２６菌株の性能を対象にした。実施例１と類似の選定過程によって５番コロニーが選定され、第１ラウンド目（１ｓｔ Ｒｏｕｎｄ）の結果と区分するために、＃２６－５菌株と命名した。＃２６－５の培養結果を図２に示した。
＃２６－５菌株に比して更なる耐性増加を目標に第３ラウンド目の適応進化を行った。対象菌株は＃２６－５菌株と既存第２ラウンド目から培養してきた菌叢を使用した。第３ラウンド目の初期に両フラスコの成長を比較した結果、第２ラウンド目から連続して培養した菌叢の成長が相対的に優れており、これは、当該菌叢から選定された＃２６－５菌株よりも耐性の強い変異体の存在可能性が高いので、＃２６－５菌株を開始培養とする適応進化は中断した。第３ラウンド目の結果は、図１の（ｂ）に示した。乳酸濃度は８０ｇ／Ｌまで上げ、菌体成長が観察されたが、相対的に、成長速度が６０ｇ／Ｌに対比しては大きく低下することを確認したので、成長速度が円滑な７０ｇ／Ｌに乳酸農度を下げて継代培養を行った。第３ラウンド目の終了後、当該菌叢を寒天プレートに塗抹してコロニーを選別した。この時、乳酸濃度４５ｇ／Ｌが含まれたＹＰＤＵ寒天プレートと乳酸農度がそれぞれ５０ｇ／Ｌ及び６０ｇ／Ｌであるプレートも準備して共に塗抹し、前記乳酸が含まれた寒天プレートでもコロニーが生成された。
しかし、追加の第３ラウンド目で生成されたコロニーは、＃２６－５に比べて乳酸耐性が高くなって高濃度乳酸で成長できる能力が増大したが、＃２６－５と比較して、発酵産物において乳酸の占める比率がより低くなっており、エタノール及びグリセロールの副産物生成はより増加した。ここで、将来、＃２６－５菌株と第３ラウンド目で分離した菌株のうちいずれの菌株を対象に商業化菌株用追加開発をするかは選択の問題であり、中長期に乳酸耐性の高い菌株を用いて追加開発（乳酸生成能復帰及び高い副産物低減研究）をするか、或いは、相対的な乳酸耐性はやや低いが、依然として良好な乳酸耐性を有しており、副産物生成も低い＃２６－５を対象に進行するかの案件について決定が必要であった。本発明では、開発予想期間が早いと予想される＃２６－５を対象に追加研究を進行した。
実施例３：適応進化前後の遺伝子発現比較
本実施例では、ＹＢＣ５と＃２６－５に対してｑＰＣＲベースで適応進化による遺伝子発現率の変化を確認した。各ＹＰＤＵ培地、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養したサンプルから全ＲＮＡを抽出した後、当該ＲＮＡをＮＧＳによって分析して同一遺伝子の発現量の変化を分析し、表６に示した。
本実施例では、ＹＢＣ５と＃２６－５に対してｑＰＣＲベースで適応進化による遺伝子発現率の変化を確認した。各ＹＰＤＵ培地、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養したサンプルから全ＲＮＡを抽出した後、当該ＲＮＡをＮＧＳによって分析して同一遺伝子の発現量の変化を分析し、表６に示した。
選別されたコロニーの菌株において、様々な遺伝子が適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）によって発現量が増加又は減少したが、最も目立つ相異は、乳酸生成を担当するＬｐＬＤＨ（ラクトバシラスプランタルム由来ＬＤＨ）の弱化部分であり、別のＬＤＨ強化研究が必要であることをはっきり示している。しかし、このようなＬＤＨの弱化にもかかわらず、発明者によって乳酸生成が速くなる菌株だけを選別した結果、＃２６－５の菌株では、外部から糖を細胞内に移送する多数のトランスポータ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）遺伝子の発現が強化されたことが分かり、これが、ＬｐＬＤＨの弱化にもかかわらず早い乳酸生成能を示した主な理由と判断される。
耐酸性組換え＃２６－５菌株は、ＫＣＴＣに２０２０年６月１５日付で寄託した（寄託番号ＫＣＴＣ１４２１５）。
実施例４：選定適応進化菌株を用いた発酵器運転
本実施例では、実施例３で適応進化によって選定された＃２６－５菌株を対象にバイオリアクターで培養して乳酸発酵性能を確認した。
本実施例では、実施例３で適応進化によって選定された＃２６－５菌株を対象にバイオリアクターで培養して乳酸発酵性能を確認した。
＃２６－５菌株をｍＹＰ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｇ／Ｌウラシル）に１次シード培養４０ｍｌ、２次シード培養３８０ｍｌとし、３０℃、２００ｒｐｍで２日間培養した後、全ての細胞を収穫して１．１８Ｌ ｍＹＰ培地に接種し、３０℃で培養した。ただし、ｍＹＰ培地の濃度は、追加糖溶液及びＣａＣＯ3液が全て注入される１．７Ｌ体積において前記成分の濃度となるように調整した。接種ＯＤは１．７３に培養を開始し、６２．５％糖溶液４５０ｍｌに４２．３３％ ＣａＣＯ3 １００ｍｌを別のフィーディングボトル（ｆｅｅｄｉｎｇ ｂｏｔｔｌｅ）で混合し、当該ボトルをマグネチックスターラー（ｓｔｉｒｒｅｒ）で４００ｒｐｍで混合し続けてＣａＣＯ3を溶液中に均一に維持させながら糖とＣａＣＯ3混合液をバイオリアクターに注入した。ＣａＣＯ3の注入方法は、このように糖と混合して注入する方法の他に、一部の発酵では糖液とは別個に一定量（５～１０ｍｌ）を２時間に１回ずつ注入する方式も利用したが、可能な限り均等に少量ずつ注入する方がＣａＣＯ3投入によるＣＯ2濃度増加効果を最小化して発酵性能向上に有利であると判断され、糖液と混合して注入した。商業化発酵では、ＣａＣＯ3を水と混合しないで直接注入してもよく、これによって追加の水による乳酸濃度の希釈が発生しないが、実験室スケールでは、滅菌されたＣａＣＯ3を注入できる方法で溶液相として注入した。また、前記糖とＣａＣＯ3の混合液の比率においてＣａＣＯ3を全発酵過程で均等に注入してもよく、場合によっては、初期菌株成長が活発に起きる接種後２４時間以内にＣａＣＯ3の大部分を投入し、その後には糖液だけを注入する方法を用いることもできる（発酵ＩＤ ６０基準）。糖とＣａＣＯ3混合液の注入速度とエアレーション速度は、各バッチ（Ｂａｔｃｈ）ごとに異ならせたが、表７の発酵ＩＤ Ｆ６０基準では、混合液の注入速度は、初期２時間では混合液を１３．５ｍｌ／ｈｒ、その後は１５．３ｍｌ／ｈｒで注入した。Ｆ６０基準では、エアレーション速度は細胞成長期には０．７ｌｐｍで７００ｒｐｍの攪拌速度（ｓｔｉｒｒｅｒｉｎｇ ｒａｔｅ）で培養をし、２０時以降では６００ｒｐｍ、０．３５ｌｐｍに漸次転換して培養した。
＃２６－５菌株を用いた発酵培養結果を図３に示した。
＃２６－５菌株発酵は、乳酸の生産速度は２．５４ｇ／Ｌ／ｈｒであり、収率は０．６７ｇ／ｇ、乳酸濃度は１２３ｇ／Ｌを示し、速度及び濃度結果には優れているが、ＹＢＣ５に比して収率の減少が著しいことが分かる。これは、当該発酵においてエタノール及びグリセロールがそれぞれ７ｇ／Ｌずつ発生して生じる問題であり、適応進化において乳酸に対する耐性とこれによる発酵速度増加の効果がある代わりに、反対給付として発生したＬＤＨ弱化及びエタノール生成遺伝子の発現効果によるものであり、これを相殺できる方案は、ＬＤＨの強化及び当該エタノール生成遺伝子を除去することがあるが、このうち、ＬＤＨの強化方法を実施例５～７で行った。図３に表示された糖の濃度は、糖とＣａＣＯ3の混合物を流加回分（Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）で注入する過程で反応器内の糖濃度を表示したものであり、商業発酵時にはＣａＣＯ3を別個に注入しながら糖は初期に全て注入するバッチでも運転でき、同様に、流加回分或いはこれを適切に組み合わせて一部の糖は発酵中間に投入するセミ流加回分（Ｓｅｍｉ－ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）でも運転及び最適化が可能である。
＃２６－５菌株とＹＢＣ５菌株を対象にした発酵において乳酸濃度だけを比較した結果を図４に示した。＃２６－５菌株は、ＹＢＣ５菌株に対比して発酵速度と乳酸生産濃度の側面で増加があり、これは、乳酸の耐性増加による効果と判断される。しかし、前述したように、ＹＢＣ５菌株の乳酸収率が０．８１～０．８３ｇ／ｇのレベルであるのに対し、＃２６－５菌株の乳酸収率は０．６３～０．７２ｇ／ｇに留まり、特にｐＨ３近傍での収率は０．６７～０．６８ｇ／ｇであった（表６のＦ５９、Ｆ６０参考）。
耐酸性発酵において、エアレーションの役割及び重要性については既に説明しており、細胞成長期である２４時間までは可能な限りエアレーションを最大にしなければならず、その後には最小値に維持しなければならない。ただし、細胞成長期にも過剰のエアレーションでは乳酸収率の減少が確認でき（表７のＦ５７発酵参考）、２４時間以降の細胞の活性維持のためのエアレーション値と収率に及ぼす影響が非常に敏感であるため、２Ｌ培養基準０．３５ｌｐｍで最適であるものを０．３ｌｐｍ以下に下げる場合、乳酸生成速度が顕著に遅くなるか、深刻な場合には乳酸生成が止まることも確認したし、０．４ｌｐｍ以上で進行する場合は、反比例して収率が減少することも確認できた。エアレーション速度は、酸素移送速度又は細胞の酸素流入速度と表示してもよいが、反応器の構造やスターラー（ｓｔｉｒｒｅｒ）の形状及びスパージャ（ｓｐａｒｇｅｒ）の空気排出形態の両方に影響を受けるため、上記の事項が変わる場合、再び最適化が必要であり、これは、微生物の細胞培養に関する諸般知識を有する業者が行うに大した困難はない。
様々な条件変化に対する発酵結果を、下記表７に示す。
実施例５：ＹＢＣ菌株のｇ３００２－１位置に導入されたＬＤＨ効果比較
ＹＢＣ菌株のＰＤＣ（ｇ３００２－１）位置にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬｐＬＤＨ（配列番号３）、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来ＬＤＨ（ＢｔＬＤＨ）（配列番号５８）、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ＬＤＨ（ＳｅＬＤＨ）（配列番号１）をそれぞれ２コピーずつ導入した。
ＹＢＣ菌株のＰＤＣ（ｇ３００２－１）位置にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬｐＬＤＨ（配列番号３）、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来ＬＤＨ（ＢｔＬＤＨ）（配列番号５８）、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来ＬＤＨ（ＳｅＬＤＨ）（配列番号１）をそれぞれ２コピーずつ導入した。
前記菌株の作製方法は、次の通りである：
ＹＢＣ菌株の主ＰＤＣ遺伝子であるｇ３００２－１遺伝子を除去し、前記ｇ３００２－１位置にラクトバシラスプランタルム由来の酵母コドン最適化された配列番号３のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ３００２－１及びこれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去されながらその位置にＬｐＬＤＨが導入され、ｇ３００２－１の５’及び３’ＵＴＲを含む遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡとして使用した（図５遺伝子カセットの一例参考）。なお、ｇ３００２－１遺伝子は、ＹＢＣ菌株のゲノムシーケンシングにおいてスキャフォールド７２位置にある遺伝子であり、ＰＤＣ遺伝子として作動する遺伝子である。当該遺伝子の置換では、過程の単純化のために、アレル変化（ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を考慮しないで一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。ｇ３００２－１の各アレルに対して相応する５’ＵＴＲは、配列番号５９と配列番号６０に示し、３’ＵＴＲは配列番号６１と配列番号６２に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリーを用いた方法が用いられてもよいが、当該遺伝子シーケンスを全体合成して使用してもよい。この組換え菌株は、ＹＢＣｌｐと命名した。
ＹＢＣ菌株の主ＰＤＣ遺伝子であるｇ３００２－１遺伝子を除去し、前記ｇ３００２－１位置にラクトバシラスプランタルム由来の酵母コドン最適化された配列番号３のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ３００２－１及びこれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去されながらその位置にＬｐＬＤＨが導入され、ｇ３００２－１の５’及び３’ＵＴＲを含む遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡとして使用した（図５遺伝子カセットの一例参考）。なお、ｇ３００２－１遺伝子は、ＹＢＣ菌株のゲノムシーケンシングにおいてスキャフォールド７２位置にある遺伝子であり、ＰＤＣ遺伝子として作動する遺伝子である。当該遺伝子の置換では、過程の単純化のために、アレル変化（ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を考慮しないで一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。ｇ３００２－１の各アレルに対して相応する５’ＵＴＲは、配列番号５９と配列番号６０に示し、３’ＵＴＲは配列番号６１と配列番号６２に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリーを用いた方法が用いられてもよいが、当該遺伝子シーケンスを全体合成して使用してもよい。この組換え菌株は、ＹＢＣｌｐと命名した。
当該遺伝子操作が正確に行われたかを確認するために、次のプライマーを用いて当該転換体（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を確認し、必要時に当該遺伝体部分に対するシーケンシングを通じて修正転換体（Ｃｏｒｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を確認した。
同様に、ＢｔＬＤＨ遺伝子を導入した菌株はＹＢＣｂｔ、ＳｅＬＤＨ遺伝子を導入した菌株はＹＢＣｓｅと命名し、当該遺伝体を確認するために使用したプライマーは、次の通りである。
３００２－１ＯＲＦ確認用ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ （配列番号６３）
３００２－１ＯＲＦ確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧ（配列番号６４）
３００２－１ＵＴＲ確認用ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号６５）
３００２－１ＵＴＲ確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＡＧＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号６６）
ＬｐＬＤＨ、ＢｔＬＤＨ、ＳｅＬＤＨ導入確認用ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号６７）
ＬｐＬＤＨ導入確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号６８）
ＢｔＬＤＨ導入確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＣＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＧＣ （配列番号６９）
ＳｅＬＤＨ導入確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＣ（配列番号７０）
３００２－１ＯＲＦ確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧ（配列番号６４）
３００２－１ＵＴＲ確認用ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号６５）
３００２－１ＵＴＲ確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＡＧＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号６６）
ＬｐＬＤＨ、ＢｔＬＤＨ、ＳｅＬＤＨ導入確認用ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号６７）
ＬｐＬＤＨ導入確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号６８）
ＢｔＬＤＨ導入確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＣＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＧＣ （配列番号６９）
ＳｅＬＤＨ導入確認用ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＣ（配列番号７０）
遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が確認された転換体に対して、接種ＯＤは０．１、培地は、ＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス）にグルコース６％を使用し、ウラシル１５０ｍｇ／Ｌを添加して、５０ｍｌのフラスコ培養で３０℃、１５０ｒｐｍ条件で実験を行った。
その結果を表８に示す。
表８に示すように、同一の遺伝体内でＬＤＨの変更によって克明な乳酸生成の差異が見られており、特に、ＬｐＬＤＨでは、ＹＢＣのｇ４４２３遺伝体位置に置換した場合、収率０．５ｇ／ｇ以上の非常に強い発現を示したが、ｇ３００２－１の位置ではほとんど発現しない特別な現象を示すことと、このＬＤＨの由来をＳｅＬＤＨに変えてｇ３００２－１位置でｇ４４２３位置に匹敵するＬＤＨ活性を獲得したことは、今まで報告されたことのない新しい現象である。
実施例６：ＹＢＣ１とＹＢＣ５菌株のｇ３００２－１位置に置換されたＳｅＬＤＨ効果
前記実施例で確認したｇ３００２－１位置のＳｅＬＤＨの高い活性を確認するために、ＹＢＣ１と＃２６－５（ｆｒｏｍ ＹＢＣ５）菌株を対象に同一の遺伝子操作を実施した。
前記実施例で確認したｇ３００２－１位置のＳｅＬＤＨの高い活性を確認するために、ＹＢＣ１と＃２６－５（ｆｒｏｍ ＹＢＣ５）菌株を対象に同一の遺伝子操作を実施した。
対象ＹＢＣ１とＹＢＣ５の遺伝子型は、下の通りである。
ＹＢＣ１：Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ
＃２６－５（ｆｒｏｍ ＹＢＣ５）：Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ３００２－７２：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ２９４７：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ１５４４
ＹＢＣ１：Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ
＃２６－５（ｆｒｏｍ ＹＢＣ５）：Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ３００２－７２：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ２９４７：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ１５４４
使用したカセット及び方法は、実施例５に類似しているが、ＹＢＣ５の場合、目的位置にあるＬｐＬＤＨをＳｅＬＤＨに置換しなければならないが、２個のＬＤＨ配列間に類似性の低い部分を増幅して修正転換体（ｃｏｒｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を確認するためにプライマーは次のように変更した。
ＬｐＬＤＨの存在を確認するためのｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号７１）
ＬｐＬＤＨの存在を確認するためのｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡ（配列番号７２）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｆｏｒｗａｒｄ１：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号７３）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｒｅｖｅｒｓｅ１：ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣ（配列番号７４）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｆｏｒｗａｒｄ２：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号７５）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｒｅｖｅｒｓｅ２：ＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＡＡＣ（配列番号７６）
ＬｐＬＤＨの存在を確認するためのｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡ（配列番号７２）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｆｏｒｗａｒｄ１：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号７３）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｒｅｖｅｒｓｅ１：ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣ（配列番号７４）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｆｏｒｗａｒｄ２：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号７５）
ＳｅＬＤＨの置換を確認するためのｒｅｖｅｒｓｅ２：ＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＡＡＣ（配列番号７６）
ＹＢＣ１菌株のｇ３００２位置にＳｅＬＤＨが導入された菌株は、ＹＢＣ２ｓｅと命名し、ＹＢＣ５菌株のｇ３００２位置にＳｅＬＤＨが導入された菌株は、ＹＢＣ６と命名し、それらの遺伝子型は下の通りである。
ＹＢＣ２ｓｅ：Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ３００２－７２：：ＳｅＬＤＨ
ＹＢＣ６；Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ３００２－７２：：ＳｅＬＤＨ、Δｇ２９４７：：ＬｐＬＤＨ 、Δｇ１５４４
ＹＢＣ６；Δｇ４４２３：：ＬｐＬＤＨ、Δｇ３００２－７２：：ＳｅＬＤＨ、Δｇ２９４７：：ＬｐＬＤＨ 、Δｇ１５４４
遺伝子型が確認された転換体に対して、接種ＯＤは０．１、培地は、ＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス）にグルコースは、ＹＢＣ２とＹＢＣ２ｓｅでは５％、ＹＢＣ５とＹＢＣ６では１０％を使用し、ウラシル１５０ｍｇ／Ｌを添加して、５０ｍｌのフラスコ培養で３０℃、１５０ｒｐｍ条件で実験を行った。
その結果を次の表９及び表１０に示す。
表９及び表１０に示すように、ＹＢＣ１菌株のＰＤＣ遺伝子位置に位置したＹＢＣ２ｓｅは、同じ位置にＬｐＬＤＨが置換されたＹＢＣ２に比べて、類似の条件で著しく高い収率を示しており、これは、ＰＤＣの遮断の他にＳｅＬＤＨの強いＬＤＨ追加発現によってエタノール生産能に比べて乳酸生産能が大きく強化して、耐酸性条件で乳酸を細胞外部に移送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）するのに必要なＡＴＰ生産と関連した収率低減を勘案するとき、理論収率と略同一の値を示している。また、既存適応進化（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）によって生産性が強化したが、収率が弱化した＃２６－５菌株においても、同じ条件で大きな収率増加を示し、適応進化によって弱化したＬＤＨを、ｇ３００２－１の位置で強く発現するＳｅＬＤＨによってＬＤＨ活性が大きく増加し、補完させたということが確認できた。
実施例７：ＹＢＣ６菌株を用いた発酵器運転
本実施例では、前記ＹＢＣ６を対象にバイオリアクターで培養して乳酸発酵性能を確認した。
本実施例では、前記ＹＢＣ６を対象にバイオリアクターで培養して乳酸発酵性能を確認した。
ＹＢＣ６菌株をｍＹＰ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３ｇ／Ｌウラシル）に１次シード培養４０ｍｌ、２次シード培養３８０ｍｌとし、３０℃、２００ｒｐｍで２日間培養した後、全ての細胞を収穫し、１．１８Ｌ ｍＹＰ培地に接種して３０℃で培養した。ただし、ｍＹＰ培地の濃度は、追加の糖溶液及びＣａＣＯ3液が全て注入される１．７Ｌ体積で前記成分の濃度となるように調整した。接種ＯＤは、１．７４に培養を開始し、６４．４％糖溶液４５０ｍｌに４２．３３％ ＣａＣＯ3 １００ｍｌを別のフィーディングボトルで混合し、てマグネティックスターラーで４００ｒｐｍで撹拌し続けてＣａＣＯ3を溶液中に均一維持させながら注入した。ＣａＣＯ3の注入方法は、均等に注入する方が、ＣａＣＯ3投入によるＣＯ2濃度増加効果（酸素の伝達妨害）を最小化して発酵性能向上に有利であると判断され、糖液と混合して注入した。商業化発酵では、ＣａＣＯ3を水と混合しないで直接注入してもよいが、実験室スケールでは、滅菌されたＣａＣＯ3を注入できる方法を考慮して溶液相として注入した。また、前記糖とＣａＣＯ3の混合液の比率においてＣａＣＯ3を全発酵過程で均等に注入してもよいが、今回の発酵では、初期菌株成長が活発に起きる接種後２４時間以内にＣａＣＯ3の大部分を投入し、その後には糖液だけを注入する方法を利用した。糖とＣａＣＯ3混合液の注入速度は、初期８時間では４．５ｍｌ／ｈｒから１８ｍｌ／ｈｒに上げ、その後２２．５ｍｌ／ｈｒで注入した。エアレーション速度は、細胞成長期には０．５ｌｐｍで６００ｒｐｍの攪拌速度で培養し、１２時間以降では０．３５ｌｐｍ、６００ｒｐｍで漸次転換して培養し、３３時間以降では０．４ｌｐｍで６００ｒｐｍで培養した。
ＹＢＣ６菌株を用いた発酵培養結果を図６に示した。
図６に示された糖の濃度は、糖とＣａＣＯ3の混合物を流加回分で注入する過程で反応器内の糖濃度を表示したものであり、商業発酵時にはＣａＣＯ3を別個に注入しながら糖は初期に全て注入するバッチでも運転でき、同様に、流加回分或いはこれを適切に組み合わせて一部の糖は発酵中間に投入するセミ流加回分でも運転及び最適化が可能である。
図６に示された糖の濃度は、糖とＣａＣＯ3の混合物を流加回分で注入する過程で反応器内の糖濃度を表示したものであり、商業発酵時にはＣａＣＯ3を別個に注入しながら糖は初期に全て注入するバッチでも運転でき、同様に、流加回分或いはこれを適切に組み合わせて一部の糖は発酵中間に投入するセミ流加回分でも運転及び最適化が可能である。
前記培養結果は、ｐＨ ３．１６に乳酸収率０．７５ｇ／ｇ、２．５６ｇ／Ｌ／ｈの発酵速度、１３０ｇ／Ｌの乳酸濃度を示し、これは、現在まで発表された耐酸性菌株の性能のうち最も優れた結果である。Ｃａｒｇｉｌｌ社の耐酸性菌株培養特許（米国登録特許第７，２３２，６６４号）には、耐酸性乳酸菌株の商業化性能の基準として、０．７５ｇ／ｇの収率、２．５ｇ ｐｒｏｄｕｃｔ／Ｌ／ｈの発酵速度、１２０ｇ／Ｌの乳酸濃度を提案しているが、本実施例の結果は、全ての指標において前記基準を達成した。前記米国登録特許第７，２３２，６６４号の実施例では、総収率０．６７ｇ／ｇ、０．８ｇ乳酸／ｇ－ｃｅｌｌ／ｈの平均発酵速度と１１４ｇ／Ｌの濃度が明示されているが、この実施例の収率及び濃度を超える性能が本発酵結果から得られた。
ＹＢＣ５菌株と＃２６－５菌株及びＹＢＣ６菌株の乳酸生成能だけを比較した結果を図７に示しており、適応進化（ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）とゲノムのＰＤＣ位置のＬＤＨ強化との複合効果によるＹＢＣ６の乳酸生成の優秀性が確認できる。
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４２１５ＢＰ
受託日：２０２００６１５
受託番号：ＫＣＴＣ１４２１５ＢＰ
受託日：２０２００６１５
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (13)
- 耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失し、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の位置にスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株。
- 前記スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
- アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化していることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
- ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化していることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
- ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化していることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
- 耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株であって、
前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＡＤＨ遺伝子、ＰＤＣ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されており、
前記ＰＤＣ遺伝子の位置に導入されているラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする組換え菌株。 - 前記スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１で表示されることを特徴とする、請求項６に記載の組換え菌株。
- 前記欠失したＡＤＨ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されているラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来又はラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来であることを特徴とする、請求項６に記載の組換え菌株。
- 次の段階を含む、乳酸耐性が増加した乳酸生成能を有する組換え酵母菌株の製造方法：
（ａ）乳酸生成能を有する組換え酵母菌株を低濃度乳酸培地から高濃度乳酸培地へと順次培養し、前記組換え酵母菌株を高濃度乳酸濃度に適応進化させる段階；
（ｂ）高濃度乳酸培地で乳酸生成能が向上した組換え酵母菌株を選別する段階；及び
（ｃ）前記選別された菌株のゲノムのＰＤＣ遺伝子の位置に、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入する段階。 - 前記（ａ）段階の乳酸生成能を有する組換え酵母菌株は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株であって、
前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＡＤＨ遺伝子、ＰＤＣ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子の位置に導入されているＹＢＣ５菌株であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。 - 耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株を高濃度乳酸濃度に適応進化させて得た組換え菌株＃２６－５（ＫＣＴＣ１４２１５ＢＰ）。
- 組換え菌株＃２６－５（ＫＣＴＣ１４２１５ＢＰ）のゲノムのＰＤＣ遺伝子の位置に、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されており、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）又はＹＢＣ５菌株に比べて、高濃度乳酸において乳酸生成能が向上し、エタノール及びグリセロール生成が低下した組換え酵母ＹＢＣ６菌株。
- 次の段階を含む乳酸の製造方法；
（ａ）請求項１～６、請求項１１及び請求項１２のいずれか一項に記載の菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階。
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