BR112017004069B1

BR112017004069B1 - Levedura recombinante produzindo ácido 3-hidroxipropiônico e método para produzir ácido 3-hidroxipropiônico usando o mesmo

Info

Publication number: BR112017004069B1
Application number: BR112017004069-7A
Authority: BR
Inventors: Joong Min Park; Jae Yeon Park; Woo Chan Park; Sang Min Lee; Young Bin Seo; Merja Oja; Outi Koivistoinen; Andrew Conley; Marja Ilmén; Laura Ruohonen; Paula Jouhten
Original assignee: Sk Innovation Co., Ltd
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2024-02-06
Also published as: DE112015003962T5; US10704064B2; CN107002019A; US20170240932A1; JP2017525372A; KR20170025315A; WO2016032279A9; CN107002019B; BR112017004069A2; JP6786477B2; KR102281806B1; WO2016032279A1

Abstract

levedura recombinante produzindo ácido 3-hidroxipropiônico e método para produzir ácido 3-hidroxipropiônico usando o mesmo. são providas uma levedura recombinante produzindo ácido 3-hidroxipropiônico (3-hp) e um método para produzir 3-hp usando o mesmo, mais particularmente, uma levedura recombinante produzindo 3-hp, compreendendo um gene aadh exógeno; um gene acc endógeno ou gene exógeno; um gene mcr exógeno; e um gene hpdh exógeno, produzindo 3-hp através da via biossintética [piruvato -> acetaldeído -> acetil-coa -> malonil-coa -> malonato semialdeído -> 3-hp], e um método para produzir 3-hp usando o mesmo.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere a uma levedura recombinante produzindo ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e um método para produzir 3-HP usando o mesmo, e mais particularmente, a uma levedura recombinante produzindo 3-HP, compreendendo um gene exógeno que codifica AADH; um gene endo- ou exógeno que codifica ACC; um gene exógeno que codifica MCR; e um gene exógeno que codifica HPDH, e produzindo 3-HP através da via de biossíntese de [Piruvato ^ Acetaldeído ^ Acetil-CoA ^ Malonil-CoA ^ Malonato semialdeído ^ 3-HP], e um método para produzir 3-HP usando o mesmo.

Estado da Técnica

[002] 3-HP (ácido 3-hidroxipropiônico, C3) é um isômero de ácido láctico (ácido 2-hidroxipropiônico) que tem um grupo ácido carboxílixo e um grupo hidroxil em ambas as extremidades do mesmo, por meio deste, é um material útil capaz de ser convertido em várias substâncias químicas como 1,3-propanodiol, ácido acrílico, acrilamida, um polímero e semelhantes. Atualmente, devido ao motivo mencionado acima, o 3-HP foi selecionado como uma das substâncias químicas promissoras que podem ser produzidas a partir de biomassa pelo U.S. Department of Energy em 2004. Particularmente, ácido acrílico poderia ser uma forma aplicada principal de 3-HP, como material altamente comerciável usado em um material de revestimento, um adesivo, um aditivo, uma fralda ou semelhantes. O 3-HP pode ser teoricamente produzido a partir de várias biomassas como glicose através da fermentação em um rendimento de 100%, e um processo de fermentação usando micro-organismos é apropriado para satisfazer a demanda por um material renovável e ambientalmente sustentável.

[003] Ainda não há caso de produção comercial de 3-HP utilizando biomassa, mas a pesquisa em vários métodos tem sido conduzida, e a segurança de uma cepa produtora de 3-HP está emergindo como um obstáculo principal. Bactérias são conhecidas como micro-organismos representativos produzindo ácidos orgânicos e são amplamente utilizadas na indústria, tal como indústria alimentícia ou similares. Entretanto, existem desvantagens para a aplicação de produção de ácido orgânico utilizando bactérias industriais, tais como E. coli, em indústria química de grande escala, tal como produção de 3-HP. Conforme a quantidade de produção de ácido orgânico aumenta, uma forma hidrogenada de ácido aumenta e a acidez é aumentada (pH é diminuído), e assim a atividade da maioria da E. coli é diminuída. No caso da produção de um ácido orgânico em uma concentração alta, a bactéria necessita de uma base, tal como hidróxido de sódio (NaOH) e hidróxido de amônio (NH4OH) para manter um pH neutro. Isto causa um aumento no custo do processo de fermentação dependendo de uma base injetada, torna o processo de extração e separação difícil, ou aumenta significativamente o custo.

[004] Em um caso recente de aplicação de produção de ácido orgânico em indústria química, um ácido orgânico é produzido a partir de glicose utilizando levedura. A levedura tem alta resistência contra um ácido orgânico em comparação à bactéria, portanto, a atividade da levedura não é significativamente inibida mesmo em uma acidez alta (pH baixo) tornando a levedura um hospedeiro mais adequado para produção de ácido orgânico. Particularmente, a levedura tem sido convencionalmente amplamente utilizada como um biocatalisador industrial para produção de álcool, etanol industrial ou similares, e pode ser cultivada em massa e não pode ser contaminada com bacteriófagos, de modo que a aplicabilidade da levedura na indústria química é mais excelente como comparado à bactéria. A levedura tem vantagens para produzir um ácido orgânico, mas há várias desvantagens em utilizar a levedura para produzir um ácido orgânico, tal como 3-HP. Primeiro, é mais difícil modificar geneticamente a levedura em comparação com a bactéria, e de modo a expressar uma enzima metabólica específica, a localização subcelular para expressão da via metabólica junto com a enzima metabólica específica deve ser identificada devido à forma das células divididas nos corpos estruturais intracelulares, tais como mitocôndria, peroxissomos ou similares, diferente da bactéria. Por exemplo, um intermediário metabólico representativo, tal como acetil-CoA, é principalmente produzido na mitocôndria em leveduras. Entretanto, se um produto alvo é produzido no citossol, um método para produzir acetil-CoA no citossol também é necessário. Além disso, contanto que não haja um número grande de leveduras diferentes no reino dos fungos e todas as leveduras não atendam as necessidades para produtividade alta, a resistência contra um ácido orgânico e cultivo em massa, um hospedeiro adequado para produzir o ácido orgânico deve ser selecionado de modo eficaz.

[005] Sabe-se que algumas leveduras produzem etanol de modo eficaz a partir de glicose, que é uma hexose, e algumas espécies de levedura também produzem um ácido orgânico. No momento da modificação para produzir um produto alvo utilizando micro-organismos, é importante manter um equilíbrio total de oxidação e redução para uma reação metabólica, e também, uma reação metabólica de fermentação de etanol a partir de glicose é uma reação mantida adequadamente. Mesmo no caso de modificação genética de levedura para produzir um ácido orgânico, o equilíbrio como descrito acima deve ser mantido apropriadamente, e no caso de produção de ácido lático através da modificação de levedura, a introdução equilibrada de ácido lático desidrogenase (LDH) de outra reação de redução para complementar uma reação de redução de produção de etanol a partir de acetaldeído é importante.

[006] O documento de patente US2010248233, intitulado ACETYL-COA PRODUCING ENZYMES IN YEAST revela uma célula de levedura incluindo a exclusão de piruvato descarboxilase (PDC), acetaldeído desidrogenase (ALD) ou acetil-CoA sintetase (ACS) para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-CoA. D1 não ensina nem sugere a conversão direta de acetaldeído em acetil-CoA usando AADH na produção de 3-HP em leveduras. Esse documento não descreve a produção de 3-HP em levedura usando a via que inclui acetaldeído ^ acetil-CoA, usando a enzima AADH.

[007] O documento US2012135481, intitulado COMPOSITIONS AND METHODS FOR 3-HYDROXYPROPIONIC ACID PRODUCTION revela uma célula de levedura que compreende uma via de fermentação ativa de 3 HP tendo genes selecionados de: um gene PPC exógeno; um gene PYC exógeno; um gene AAT exógeno; um gene ADC exógeno; um gene BAAT ou gabT exógeno; e um gene exógeno de 3-HPDH.

[008] O documento de patente JP2008035727, intitulado COMBINATION OF MULTIGENE DISRUPTION IMPROVING LACTIC ACID RESISTANCE OR PRODUCTIVITY OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE descreve uma célula de levedura que compreende a deleção de DSE2, SCW11, EAF3 e SED1.

[009] A publicação "Coupled incremental precursor and cofactor supply improves 3-hydroxypropionic acid production in Saccharomyces cerevisiae", CHEN, YUN et al., Metabolic Engineering, vol. 22, pages 104 - 109 DOI: 10.1016/j.ymben.2014.01.005 revela não divulga uma combinação de genes com sequências específicas que codificam acetilação de acetaldeído desidrogenase (AADH), acetil-CoA carboxilase (ACC), malonil-CoA reductase (MCR) e hidroxipropionato desidrogenase (HPDH). Especialmente, D4 não revela levedura recombinante compreendendo um gene exógeno que codifica AADH.

[010] Sabe-se que uma pequena quantidade de 3-HP é produzida em um número pequeno de micro-organismos, tais como Chloroflexus aurantiacus, e 3-HP é formado parcialmente a partir de um processo de decomposição de dimetilsulfoniopropionato em microorganismos tais como Alcaligenes faecalis ou um processo de decomposição de uracila em levedura. A pesquisa para vias metabólicos de 3-HP e as enzimas correspondentes foi conduzida através da descoberta de 3-HP presente na natureza como descrito acima, e com base na pesquisa, recentemente, a pesquisa para uma tecnologia de produção de 3-HP ou um PHA, que é uma forma de polímero de 3-HP, introduzindo um gene necessário para a biossíntese de 3-HP em E. coli foi conduzida. Além disso, de modo a maximizar a produtividade e rendimento de produção de 3- HP que está presente apenas como um intermediário metabólico ou produzido apenas em uma pequena quantidade na natureza, tecnologias tais como uma tecnologia de engenharia metabólica, sistemas de tecnologia biológica, tecnologia de biologia sintética ou similares, têm sido utilizadas.

[011] De acordo com o desenvolvimento da tecnologia de engenharia metabólica, se torna possível prever vias de produção de vários materiais utilizando micro-organismos, e uma via para produzir 3-HP a partir de glicose pode ser dividida grosseiramente em uma via acriloil-CoA, uma via β-alanina, uma via malonil-CoA, e uma via glicerol dependendo dos intermediários metabólicos.

[012] A via de acriloil-CoA significa uma via metabólica de conversão de piruvato ou fosfoenol piruvato (PEP) obtida a partir da glicólise de glicose em acriloil-CoA através de lactato ou β-alanina e então convertendo o acriloil-CoA em 3-HP através de uma reação de hidratação e uma reação de redução (piruvato ou PEP ^ lactato ou β-alanina ^ acriloil-CoA ^ 3-HP). O acriloil-CoA é um metabólito observado durante o processo de decomposição de ácido propiônico, e uma vez que o valor de energia livre de Gibb para formação do metabólito é positivo, uma reação progressiva é uma reação desfavorável. Além disso, a especificidade de substrato de acriloil-CoA tioesterases é baixa, de modo que o via de acriloil-CoA não é adequada como a via metabólica para produção em massa de 3-HP.

[013] A via β-alanina significa uma via metabólica de conversão de piruvato ou oxaloacetato em aminoácido por uma reação de transaminação e finalmente conversão em 3-HP através β-alanina por uma reação de transaminação (piruvato ou oxaloacetato ^ aminoácido ^ β-alanina ^ 3-HP; US2012/0135481A1). Contato que a reação de transaminação de β- alanina a 3-HP ocorra através de semialdeído malonato, que é altamente tóxico a micro-organismos, uma 3-HP desidrogenase tendo uma atividade alta é necessária. Além disso, geralmente, uma vez que a reação de transaminação forma uma forma radical de uma estrutura molecular de aminoácido em um estado estacionário, uma enzima desta reação tem uma estrutura para aliviar a reatividade do radical. Uma vez que este radical tem reatividade forte com oxigênio, para uma reação de transaminação facilitada, condições anaeróbicas ou uma coenzima para estabilizar as moléculas do radical são essencialmente necessárias.

[014] A via de malonil-CoA é uma via metabólica de conversão de acetil-CoA em malonil-CoA por carboxilação e então a conversão de malonil-CoA em 3-HP por uma reação de redução (acetil-CoA ^ malonil-CoA ^ 3-HP), e a via de glicerol é uma via metabólica de conversão de glicose em glicerol, convertendo glicerol em 3-hidroxipropionaldeído por uma reação de desidratação, e então convertendo 3-hidroxipropionaldeído em 3- HP (glicose ^ glicerol ^ 3-hidroxipropionaldeído ^ 3-HP). Uma vez que a via malonil-CoA e a via glicerol ocorrem através de um intermediário geralmente produzido por micro-organismos, tais como E. coli ou similares, estas vias têm sido principalmente estudadas como a via de produção de 3-HP (US 2013/0071893 A1). Uma vez que malonil-CoA pode ser convertido em 3-HP pela malonato redutase e 3-HP desidrogenase, e glicerol pode ser convertido em 3-HP pela glicerol desidratase e aldeído desidrogenase, um método para converter glicose ou glicerol em 3-HP utilizando E. coli modificada é bem conhecido. Uma reação de desidratação de glicerol, que é uma reação acompanhada com radicais similarmente à reação de transaminação, necessita essencialmente da coenzima B12 para realizar a reação na presença de oxigênio.

[015] Em vista de fermentação industrial, uma vez que é difícil utilizar uma coenzima, tal como coenzima B12, como um material de um meio de cultura devido a seu custo, e micro-organismos tais como leveduras não poderem biossintetizar ou absorver o material correspondente nas células, a via β-alanina ou via glicerol não é adequada como a via metabólica para produzir 3-HP utilizando levedura. Recentemente, a pesquisa modificando as enzimas chave para superar este problema tem sido reportada. [US 7.655.451 B2]

[016] Malonil-CoA é sintetizado a partir de acetil-CoA no citossol, e pode deste modo ser reduzido a 3-HP. No caso de bactérias tais como E. coli, acetil-CoA é formada a partir de piruvato no citossol, e pode assim ser utilizada como um substrato do ciclo TCA ou outra reação metabólica. Entretanto, como descrito acima, em leveduras tendo compartimentos subcelulares independentes, geralmente, acetil-CoA é sintetizada na mitocôndria e é utilizada como um substrato do ciclo TCA, e acetil-CoA no citossol é produzido através de reação de produção de acetato, que é uma reação lateral de uma reação de produção de etanol, ou uma reação de circulação de ácido cítrico. Todas as reações de produção de acetil-CoA a partir de acetato ou ácido cítrico são reações consumindo ATP, e uma vez que leveduras ainda consomem energia de modo a obter acetil-CoA no citossol como comparado à bactéria, a levedura pode ser desvantajosa em vista de estratégia energética.

[017] Em leveduras, ambientes tais como o estado de redução do citossol, dobrando após a síntese de proteína, uso de códon e similares, são diferentes daqueles em bactérias, de modo que no momento da expressão de uma enzima exógena derivada de bactéria, uma atividade da mesma pode não ser exibida ou a atividade pode ser significativamente diminuída. Além disso, uma vez que a atividade pode ser mudada significativamente pela presença ou ausência de oxigênio ou outros íons metálicos, mesmo no caso de enzimas exógenas tendo as mesmas funções, os resultados de expressão das mesmas em leveduras podem ser diferentes de acordo com a origem das enzimas. Na verdade, no caso da xilose isomerase (XI), que é uma enzima importante do metabolismo de xilose, no momento da expressão de XI derivada de bactéria em levedura, principalmente, uma atividade da mesma foi significativamente baixa, mas foi mostrado que a levedura foi modificada com sucesso de modo a realizar o metabolismo de xilose em uma atividade relativamente alta introduzindo XI derivada de fungos anaeróbicos. Portanto, no caso de introdução de uma via metabólica derivado de bactéria ou Archaea tal como a via malonil-CoA em levedura, um gene tendo alta atividade deve ser protegido através de genes que realizam as mesmas funções com várias origens.

[018] Há vários artigos e patentes associadas com um método de modificar geneticamente Saccharomyces cerevisiae dentre várias cepas de levedura para produzir 3-HP, mas no caso de Saccharomyces cerevisiae, uma vez que 3-HP é produzido pelo via [ácido pirúvico ^ acetaldeído ^ ácido acético ^ acetil-CoA ^ malonil-CoA ^ semialdeído malonato ^ 3-HP], existem problemas que este via para produzir 3-HP é complicado, e a produtividade de 3-HP é relativamente baixa (US 2010/0248233A1; Y. Chen et al., Metabolic Engineering, 22:104-109, 2014).

[019] Por conseguinte, como resultado de um esforço para resolver os problemas mencionadas acima, de modo a superar a desvantagem de levedura em que ATP é consumido em um processo de obter acetil-CoA no citossol, os presente inventores conceberam uma via metabólica mais curta de [Piruvato ^ Acetaldeído ^ Acetil-CoA ^ Malonil-CoA ^ Semialdeído Malonato ^ 3-HP], que é converter diretamente acetaldeído em acetil-CoA sem passar através de um acetato intermediário, e confirmaram que no caso de utilizar uma levedura recombinante compreendendo este via, diferente do caso de utilizar E. coli, não apenas o uso de materiais de ajuste de pH é diminuído, e assim a produção de sais é diminuída, mas também 3-HP pode ser produzido de biomassa em uma concentração alta e um rendimento alto mesmo em um pH baixo, assim completando a presente invenção.

Divulgação da Invenção O Problema Técnico

[020] Um objeto da presente invenção é o de fornecer uma levedura recombinante compreendendo uma via biossintética de 3- HP ativo de [Piruvato ^ Acetaldeído ^ Acetil-CoA ^ Malonil-CoA ^ Semialdeído malonato ^ 3-HP], convertendo acetaldeído diretamente a acetil-CoA e não através de acetato.

[021] Outro objeto da presente invenção é fornecer um método para produzir 3-HP utilizando a levedura recombinante.

Solução para o Problema

[022] De modo a alcançar os objetivos expostos acima, a presente invenção fornece uma levedura recombinante compreendendo uma via biossintética de 3-HP ativo de [Piruvato ^ Acetaldeído ^ Acetil-CoA ^ Malonil-CoA ^ Semialdeído malonato ^ 3-HP], em que a levedura compreende: um gene exógeno codificando AADH; um gene endo ou exógeno codificando ACC; um gene exógeno codificando MCR; e um gene exógeno codificando HPDH.

[023] Na presente invenção, a referida levedura é resistente ao ácido e selecionada a partir do grupo que consiste em, por exemplo, os gêneros Saccharomyces, Kazachstania e Candida. Espécies de levedura de interesse particular incluem Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi e Candida humilis em que as espécies não são limitadas apenas a estas.

[024] Além disso, a presente invenção fornece um método de preparar 3-HP compreendendo: (a) cultivar a levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 em um meio incluindo pelo menos uma fonte de carbono, assim produzindo 3-HP; e (b) isolando o 3-HP da cultura.

Breve Descrição das Figuras

[025] A FIG. 1 mostra uma via de produzir 3-HP a partir de glicose da levedura recombinante da presente invenção (via metabólica malonil-CoA modificado) e enzimas principais.

[026] A FIG. 2 mostra a classificação relativa da atividade de ACC1 de enzimas Acetil-CoA carboxilase.

[027] A FIG. 3 mostra os resultados da confirmação de atividade relativa (esquerda) e níveis de expressão (SDS-PAGE) (direita) das variações de MCR archaeal.

[028] A FIG. 4 mostra a expressão de plasmídeos de levedura pSK-084 e pSK-085 para enzimas de expressão relacionadas com a via 3-HP.

[029] A FIG. 5 mostra os resultados dos testes das condições de cultivo que poderiam afetar nos níveis de produção de 3-HP.

[030] A FIG. 6 mostra a produção de 3-HP com uma cepa de produção de 3-HP mais estabelecida utilizando condições de cultivo de batelada alimentado (tablet spiking).

Melhor Modo para Realizar a Invenção

[031] Salvo se definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm os mesmos significados como aqueles geralmente entendidos por especialistas na técnica à qual a presente invenção pertence. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas aqui são bem conhecidas e comumente empregadas na técnica.

[032] Geralmente, em levedura, uma vez que o acetil-CoA é preparado pela via de [acetaldeído ^ acetato ^ acetil-CoA], e acetato é produzido no citossol de levedura, ATP é consumido pela conversão em AMP no processo de produção de acetil-CoA (Fig. 1; Y. Chen et al., Metabolic Engineering, 22:104-109, 2014).

[033] Entretanto, na presente invenção, uma via em que desvantagens de levedura consumindo ATP são superadas e melhoradas preparando diretamente acetil-CoA de acetaldeído, não através de acetato, no processo de produção de acetil-CoA no citossol (Fig. 1) é concebido e aplicado. Como resultado, no caso de utilizar a levedura recombinante da presente invenção, é demonstrado que o 3-HP é produzido em uma concentração alta e um rendimento alto a partir de glicose mesmo em um pH baixo.

[034] Portanto, em um aspecto, a presente invenção é direcionada a uma levedura recombinante compreendendo uma via biossintética de 3-HP ativa de [Piruvato ^ Acetaldeído ^ Acetil- CoA ^ Malonil-CoA ^ Semialdeído malonato ^ 3-HP], em que a levedura compreende: um gene exógeno codificando AADH; um gene endo ou exógeno codificando ACC; um gene exógeno codificando MCR; e um gene exógeno codificando HPDH.

[035] A via biossintética de 3-HP de [Piruvato ^ Acetaldeído ^ Acetil-CoA ^ Malonil-CoA ^ Semialdeído malonato ^ 3-HP] é uma via de produção de 3-HP a partir de uma fonte de carbono, tal como glicose, etc. (i) “Piruvato ^ Acetaldeído” significa uma via de produção de acetaldeído a partir de piruvato utilizando piruvato decarboxilase (PDC) sem produzir um intermediário; (ii) “Acetaldeído ^ Acetil-CoA” significa uma via de produção de acetil-CoA a partir de acetaldeído utilizando acetaldeído desidrogenase acetilante (AADH) sem produzir um intermediário tal como acetato; (iii) “Acetil-CoA ^ Malonil-CoA” significa uma via de produzir malonil-CoA a partir de acetil-CoA utilizando acetil-CoA carboxilase (ACC) sem produzir um intermediário; (iv) “Malonil-CoA^^3-HP ou Malonil-CoA ^ Semialdeído malonato ^ 3-HP” significa uma via de produção de 3-HP a partir de malonil-CoA utilizando uma Malonil-CoA redutase bifuncional (MCR) sem produzir um intermediário ou uma via de produção de 3-HP a partir de semialdeído malonato pela biossintetização de semialdeído malonato utilizando uma malonil-CoA redutase monofuncional (Fig. 1).

[036] Na presente invenção, o gene PDC não é modificado, mas a engenharia do gene PDC para aumentar a taxa de produção de 3- HP, por exemplo, amplificando o gene PDC presente em levedura, aplicando a técnica anterior bem conhecida no campo técnico, pode ser feita.

[037] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, genes codificando enzimas de via que têm funções específicas foram extraídas através de exploração de genoma por bioinformática dos candidatos de enzima da via.

[038] A presente invenção compreende um gene exógeno codificando AADH. Em uma modalidade, o gene codificando AADH é um ácido nucleico codificando AADH tendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido de AADH selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências representadas nas Tabelas 1-3 abaixo, mas não limitada a isto, contanto que tenha função de biossintetizar acetil-CoA a partir de acetaldeído.

[039] A presente invenção compreende um gene codificando ACC. Em uma modalidade, o gene codificando ACC é um ácido nucleico codificando ACC tendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido ACC selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácido representadas na Tabela 4 abaixo, mas não é limitada a isto, contanto que tenha função de biossintetizar malonil-CoA a partir de acetil- CoA.

[040] A presente invenção compreende um gene codificando MCR. Em uma modalidade, um MCR poderia ser bifuncional em que este tem uma função de converter malonil-CoA a semialdeído malonato e uma função de converter semialdeído malonato a 3-HP; ou monofuncional em que este tem uma função de converter malonil-CoA a semialdeído malonato.

[041] Na presente invenção, o gene codificando o referido bifuncional é um ácido nucleico codificando MCR tendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido MDC selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências representadas na Tabela 5 abaixo, mas não é limitada a isto contanto que simultaneamente tendo a função de converter malonil-CoA a semialdeído malonato e a função de converter semialdeído malonato a 3-HP.

[042] Em outra modalidade, o referido gene MCR poderia ser monofuncional tendo a função de converter malonil-CoA a semialdeído malonato, um gene codificando uma enzima que pode converter semialdeído malonato a 3-HP poderia ainda ser compreendida.

[043] Na presente invenção, o referido gene codificando o MCR monofuncional é um ácido nucleico codificando MCR tendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido MCR selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácido representadas na Tabela 6 abaixo, mas não é limitada a isso contanto que tenha função de converter malonil-CoA a semialdeído malonato.

[044] Na presente invenção, o referido gene codificando enzima que pode converter semialdeído malonato a 3-HP é um ácido nucleico codificando uma enzima tendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% ou 100% de identidade de sequência à uma sequência de aminoácido HPDH, HIBADH, HBDH ou BDH selecionada a partir do grupo do grupo que consiste nas sequências de aminoácido representadas nas Tabelas 7-10 abaixo, mas não é limitada a isto contato que a proteína codificando o gene tenha a função de biossintetizar 3-HP a partir de semialdeído malonato.

[045] A sequência de aminoácido HPDH representada na Tabela 7 abaixo, sequências de aminoácido HIBADH representadas na Tabela 8 abaixo, sequências de aminoácido HBDH representadas na Tabela 9 abaixo e sequências de aminoácido BDH representadas na Tabela 10 abaixo são sequências de aminoácido de proteína que funcionam para biossintetizar 3-HP a partir de semialdeído malonato.[Tabela 7] HPDH

[046] Em uma modalidade específica da presente invenção, a levedura recombinante compreendendo uma via biossintética de 3- HP poderia ter os genes listados na Tabela 11, tal como um gene exógeno codificando AADH tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 74 a 98, um gene endo- ou exógeno codificando ACC tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do gripo que consiste nas SEQ ID NOs: 99 a 106, um gene exógeno codificando MCR tendo ma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107 a 116, e um gene exógeno codificando HPDH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 117 a 144.

[047] Na presente invenção, a levedura poderia ser resistente ao ácido, e a referida levedura resistente ao ácido poderia ser selecionada a partir do grupo que consiste em, por exemplo, o gênero Saccharomyces, Kazachstania e Candida. Espécies de levedura de interesse particular incluem Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi e Candida humilis, mas não é limitado a estas.

[048] De acordo com a presente invenção, a levedura recombinante pode ser resistente ao ácido, e de modo a preparar a levedura recombinante resistente ao ácido, é preferencial utilizar um hospedeiro levedura tendo resistência ao ácido contra ácido orgânico (especialmente 3-HP e/ou ácido orgânico produzido como um produto secundáro quando preparando 3-HP).

[049] A levedura resistente ao ácido pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi e Candida humilis, mas não é limitado a este.

[050] O termo “ levedura resistente ao ácido ” utilizado na especificação refere-se à levedura tendo resistência ao ácido contra ácidos orgânicos, tais como 3-HP ou similares, e a resistência ao ácida poderia ser avaliada pela confirmação do crescimento em meio contendo várias concentrações de ácido orgânico. Neste caso, “ levedura resistente ao ácido ” pode ser levedura mostrando alta taxa de crescimento e taxa de consumo de biomassa quanto cultivada em meio contendo alta concentração de ácido orgânico, comparada à levedura geral.

[051] A levedura resistente ao ácido, de acordo com a presente invenção, pode ser levedura que poderia manter pelo menos 10% da taxa de consumo de glicose (ou similar) ou pelo menos 10% da taxa de crescimento específica no meio contendo mais do que 1M ou mais ácido orgânico (particularmente 3-HP) sob pH menos do que o valor de pKa do ácido orgânico (particularmente 3-HP), comparado ao crescimento de levedura no meio não contendo ácido orgânico. Levedura resistente ao ácido, de acordo com a presente invenção, pode ser levedura que poderia manter pelo menos 10% da taxa de consumo de glicose (ou similar) ou pelo menos 10% da taxa de crescimento específica sob pH 2 - 4, comparado ao pH 7.

[052] O micro-organismo modificado geneticamente, de acordo com a presente invenção, poderia ser preparado inserindo um gene em um cromossomo de um micro-organismo ou introduzindo um vetor modificado em um micro-organismo.

[053] Um hospedeiro em que a eficiência de introdução de DNA é alta e a eficiência de expressão do DNA introduzido é alta é comumente utilizado como o referido micro-organismo modificado, e em uma modalidade exemplar da presente invenção, levedura é utilizada, mas não é limitada a esta, qualquer tipo de micro-organismos poderia ser utilizado contanto que expressando suficientemente o DNA alvo.

[054] O referido micro-organismo modificado poderia ser preparado por qualquer método de transformação. “Transformação” significa introduzir DNA em um hospedeiro; assim o DNA é capaz de ser replicado, como um fator de cromossomo ou por cromossomo integrante, que é um fenômeno causando artificialmente uma mudança genética. Em métodos de transformação comuns, há eletroporação, método ácido acético lítio-PEG e similares.

[055] Além disso, na presente invenção, qualquer método de engenharia genética bem conhecido geralmente poderia ser utilizado como um método para introduzir um gene em um cromossomo de um micróbio hospedeiro, e como um exemplo, há um método que utiliza o vetor retrovírus, vetor adenovírus, vetor de vírus adeno-associado, vetor vírus de herpes simples, vetor poxvírus, vetor lentivírus, vetor não viral, etc. “Vetor” significa uma construção de DNA compreendendo uma sequência de DNA a ser ligada operacionalmente a uma sequência controle adequada que pode expressar DNA dentro de um hospedeiro. Um vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago ou simplesmente uma inserção genômica latente. Quando um vetor é transformado em um hospedeiro adequado, este pode ser replicado ou funcional independente de um genoma hospedeiro, ou em alguns casos, pode ser integrado em um genoma próprio. Um plasmídeo é o tipo mais geralmente utilizado como um vetor.

[056] Um vetor plasmídeo típico que pode ser utilizado para o objeto tem uma estrutura compreendendo (a) uma origem de replicação que permite que a replicação seja realizada de modo eficaz para incluir vetores plasmídeo por célula hospedeira, (b) um gene de resistência ao antibiótico ou um gene marcador auxotrófico que permite uma célula hospedeira transformada com um vetor plasmídeo ser selecionada, e (c) um sítio de restrição da enzima de restrição que pode ser inserido com um fragmento de DNA estranho. Mesmo se não há restrição adequada de uma enzima de restrição, um vetor e DNA estranho podem ser facilmente ligados quando utilizando o ligante ou adaptador de oligonucleotídeo sintético de acordo com um método geral.

[057] Ácido nucleico é “ligado operacionalmente” quando este é arranjado com uma relação funcional com outras sequências de ácido nucleico. Estes podem ser um gene e sequências de controle que são ligados em um processo que permite a expressão gênica quando uma molécula apropriada (por exemplo, proteína de ativação de transcrição) é ligada às sequências de controle. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou um líder de secreção é ligado operacionalmente ao DNA por um polipeptídeo quando expressando uma pré-proteína participando na secreção de um polipeptídeo; um promotor ou um potencializador é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação quando afetando a transcrição de uma sequência; um domínio de ligação de ribossomo é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação quando afetando a transcrição de uma sequência; ou um domínio de ligação de ribossomo é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação quando esta é arranjada para ser facilmente traduzida.

[058] Geralmente, “ligado operacionalmente” refere-se a um contato de uma sequência de DNA ligada, ou que o líder de secreção está em contato e presente na estrutura principal. Entretanto, o potencializador não é necessário para o contato. A ligação da sequência potencializadora é realizada em um sítio de enzima de restrição conveniente. Quando o domínio não está presente, um adaptador de oligonucleotídeo sintético ou ligante de acordo com o método geral é utilizado.

[059] Claro, deve ser entendido que todos os vetores não funcionam igualmente para expressar as sequências de DNA de acordo com a presente invenção. Do mesmo modo, todas as células hospedeiras não funcionam igualmente para o mesmo sistema de expressão. Entretanto, os especialistas na técnica podem selecionar apropriadamente um vetor, sequência de controle de expressão e célula hospedeira sem se afastar do escopo da presente invenção e sem experimentação indevida. Por exemplo, na seleção de um vetor, uma célula hospedeira deve ser considerada. Isto é porque o vetor deve ser replicado nela. Também, o número de replicação e a capacidade para controlar o número de replicação de um vetor e expressão de outras proteínas codificadas pelo vetor, por exemplo, marcador antibiótico, devem ser considerados.

[060] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de preparar 3-HP compreendendo: (a) cultivar a levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em um meio incluindo pelo menos uma fonte de carbono, assim produzindo 3-HP; e (b) isolando o 3-HP da cultura.

[061] Na presente invenção, a fonte de carbono poderia ser uma ou mais selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, xilose, arabinose, sacarose, frutose, celulose, oligômeros de glicose e glicerol, mas não é limitada a estes.

[062] Na presente invenção, a cultura é realizada preferencialmente sob uma condição que micróbios, tais como E. coli, não trabalham mais (por exemplo, produzindo metabólito, etc.). Em uma modalidade, a cultura é realizada em pH 1,0 a 6,5, preferencialmente em pH 1,0 a 6,0, mais preferencialmente em pH 2,6 a 4,0, mas não é limitada a isto.

Exemplos de Realização da Invenção

[063] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes Exemplos. Entretanto, os seguintes Exemplos são fornecidos por modo de exemplo como para explicar facilmente a descrição e escopo do espírito técnico da presente invenção. Por conseguinte, o escopo da presente invenção não é assim restrito ou mudado a partir destes. Além disso, várias modificações e mudanças podem ser feitas pelos especialistas na técnica à qual a presente invenção pertence a partir desta descrição.

[064] Exemplo 1: Seleção das cepas de leveduras hospedeiras baseadas em tolerância a 3-HP

[065] Uma característica essencial de um organismo de produção de 3-HP é a boa tolerância a altas concentrações de 3- HP, que permite o acúmulo de produto durante a fermentação com perda mínima de desempenho da cepa. Um grande conjunto diverso de 718 cepas de levedura tipo selvagem foi triado para identificar aquelas cepas que podem tolerar altas concentrações de 3-HP em pH baixo e que podem crescer e metabolizar glicose sob estas condições (Tabela 12).

[066] Um número de placas de Agar e placa de microtitulação de meio líquido baseadas em testes de crescimento foram inicialmente utilizadas para triar o conjunto todo de cepas para tolerância à ácido. Depois, um subconjunto de cepas foi avaliado para sua capacidade para tolerar altas quantidades de 3-HP em pH baixo em culturas de balão de agitação. Em isolamento, nenhuma destas abordagens de triagem é um indicador perfeito de tolerância a 3-HP em um conjunto industrial, mas a combinação de várias abordagens fornece meios completos e robustos de estabelecer cepas de leveduras produzindo 3-HP promissoras.

[067] Inicialmente, o crescimento das 718 cepas de levedura foi avaliado em meio de ágar baseado em YPD sólido contendo quantidades variadas de 3-HP: 0 g/L de 3-HP (pH 6,62), 50 g/L de 3-HP (pH 3,44), 75 g/L de 3-HP (pH 3,28), 100 g/L de 3-HP (pH 3,17) e 125 g/L de 3-HP (pH 3,08). As cepas foram então classificadas com base em suas capacidades para tolerar as quantidades variadas de 3-HP neste teste de triagem.

[068] O crescimento das 718 cepas de levedura foi então avaliado na ausência (meio baseado em SCD, 0 g/L de 3-HP, pH 6,0) ou presença (meio baseado em SCD, 70 g/L de 3-HP, pH 3,5) de 3-HP em culturas líquidas de placas de microtitulação utilizando máquinas Bioscreen C que podem incubar automaticamente, agitar e medir a turbidez das culturas. O software existente para modelar as curvas de crescimento microbiano foi então adaptado para estabelecer a fase lag, taxa de crescimento máximo e densidade de célula final para cada cepa em cada uma das condições experimentais. Para este teste de triagem, cada cepa foi classificada com base em sua taxa de crescimento máximo na ausência de 3-HP, sua taxa de crescimento máximo na presença de 3-HP e a diferença relativa entre estes dois valores de taxa de crescimento máximo.

[069] Utilizando um robô de manuseio líquido, as taxas de crescimento e utilização de glicose das 718 cepas de levedura foram avaliadas em meio líquido baseado em YPD contendo 85 g/L de 3-HP (pH 3,5) em placas de microtitulação. Um fluxo de trabalho automático foi utilizado para inocular placas em crescimento, para diluir amostrar para medição de OD em pontos de tempo designados e para centrifugar e coletar sobrenadantes para análise de HPLC que foi utilizada para medir as quantidades de glicose residual nos pontos de tempo designados. Em contraste aos testes de crescimento Bioscreen C, o teste de placa de microtitulação robótica permitiram maior aeração e densidades de célula máximas maiores serem alcançadas enquanto também permitiu taxas de utilização de glicose serem avaliadas ao invés de apenas avaliar a taxa de crescimento como os dois testes anteriores. Para este teste de triagem, cada cepa foi classificada com base em sua densidade de célula máxima obtida na presença de 3-HP e sua capacidade de consumir glicose na presença de 3-HP em pH baixo.

[070] As classificações individuais a partir dos vários ensaios de tolerância a 3-HP avaliativos foram tiradas a média juntas para obter a classificação de tolerância a 3-HP final para cada uma das cepas (Tabela 12). Estas triagens indicaram que as espécies de levedura Candida apicola, Candida humilis, Issatchenkia orientalis, Kazachstania bulderi, Kazachstania exigua, Pichia membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytica tiveram boa tolerância geral a 3-HP em pH baixo sob condições variadas.

[071] Estas oito espécies de levedura tolerantes a 3-HP foram então ainda analisadas para sua tolerância a 3-HP em pH baixo em cultivos de balão de agitação. Para estes cultivos (meio baseado em SCD definido, alta biomassa inicial, baixa aeração), a capacidade da cepa para crescimento, consumo de glicose e produção de etanol foram avaliados na presença de níveis variados de 3-HP em pHs variados: 100 g/L de 3-HP (pH 4,0), 100 g/L de 3-HP (pH 3,5), 100 g/L de 3-HP (pH 3,0) e 80 g/L de 3-HP (pH 2,6). Estes cultivos em balão de agitação revelaram que certas cepas de levedura C. humilis, K. bulderi, K. exigua e S. cerevisiae têm tolerância muito robusta a altos níveis de 3-HP em pH baixo uma vez que estas tiveram as taxas de utilização de glicose, taxas de produção de biomassa e taxas de produção de etanol mais rápidas dentre as várias cepas de levedura sob estas condições rigorosas. Por outro lado, as cepas de levedura C. apicola, I. orientalis, P. membranifaciens e Y. lipolytica foram incapazes de realizar bem sob estas condições de crescimento muito restritivas. Estas análises de acompanhamento detalhadas utilizando várias culturas em balão de agitação confirmaram que certas cepas de levedura C. humilis, K. bulderi, K. exigua e S. cerevisiae mostram grande potencial como hospedeiros de produção de 3-HP, conforme exibem uma alta tolerância natural a 3-HP sob condições industrialmente relevantes.

[072] Exemplo 2: Exploração de genoma por bioinformática para vias de enzimas candidatas

[073] Pesquisas de bancos de dados baseadas em homologia foram conduzidas para identificar enzimas cadidatas para uma funcionalidade particular. Em cada caso, os bancos de dados foram pesquisados com um número de sequências investigadas. Adcionalmente, membros da família de proteína relevante foram recuperados do Uniprot/SwissProt com base nas anotações do domínio InterPro. As pesquisas com base em homologia foram conduzidas contra os bancos de dados de proteína Uniprot (SwissProt e TrEMBL) e GenBank (nr, pat e env_nr) utilizando blastp, e contra as bases de dados de nucleotídeo GenBank (tsa_nt, env_nt e pat) utilizando tblastn. As sequências com E-valor menor do que 1e-30 foram extraídas; entretanto, em alguns casos, análise adicional foi conduzida nas sequências com Evalor menor do que 1e-80. Os hits de nucleotídeos foram traduzidos para sequências de proteína com GeneWise utilizando a sequência investigada como um guia na tradução. A tarefa de traduzir as sequências ACC longas foi muito difícil para GeneWise, então ao invés a sequência de proteína (porção correspondente à sequência investigada) foi extraída do resultado blast-xml. Para remover sequências redundantes, as sequências recuperadas foram agrupadas, utilizando BLASTCLUST ou CD-HIT, para grupos contendo sequências acima de 80% idênticas umas às outras. Apenas uma sequência representativa foi mantida em cada grupo. O conjunto não redundante de sequências foi alinhado, tanto do domínio PFAM da família de proteína quanto utilizando MAFFT. O alinhamento global por MAFFT foi criado em casos em que a família de proteína não foi associada com qualquer PFAM ou se a sequência da proteína foi dividida em vários domínios PFAM. Uma árvore filogenética foi criada com base no alinhamento de sequência múltiplo utilizando PHYLIP ou FASTTREE. A árvore foi anotada com números E.C., nome do organismo, E-valores blast e visualizada utilizando o software Geneious.

[074] 2-1: Acetaldeído desidrogenase acetilante

[075] A redução de acetaldeído para acetil-CoA pode ser realizada por uma acetaldeído desidrogenase acetilante (AADH, E.C. 1.2.1.10). AADHs podem ser divididas em três grupos homólogos funcionais (Wei et al., Nat. Commun. 4:2580, 2013),incluindo 1) proteínas bifuncionais tendo atividades AADH e álcool desidrogenase (E. coli genes tipo adhE, GenBank No: NP_415757, sequência investigada), 2) proteínas envolvidas no catabolismo de etanolamina (E. coli genes tipos eutE, GenBank No: AAG57564, sequência investigada) e 3) proteínas bifuncionais que são parte de um complexo aldolase-desidrogenase envolvido no catabolismo de 4-hidroxi-2-quetovalerato (E. coli genes tipo mphF, GenBank No: NP_414885). De interesse particular são as enzimas do grupo 1 (tipo adhE) e grupo 2 (tipo eutE).

[076] O domínio de N-terminal da proteína AdhE é altamente homólogo à aldeído:NAD+ oxidoredutases, enquanto a região de C- terminal é homóloga a uma família de etanol:NAD+ oxidoredutases dependentes de Fe2+ (Membrillo-Hernandez et al., J. Biol. Chem. 275:33869-33875, 2000). A atividade da acetaldeído desidrogenase acetilante pode também ser introduzida na célula truncando a proteína AdhE bifuncional para apenas possuir o domínio aldeído redutase de N-terminal removendo o domínio álcool desidrogenase. Genes adicionais tendo esta atividade AADH bifuncional foram inferidos com base em análises por bioinformáticas e homologia de sequência. Os vários genes são sumarizados na Tabela 1.

[077] Muitas enterobactérias podem utilizar etanolamina como uma fonte de carbono e nitrogênio (Stojiljkovic et al., J.Bacteriol. 177:1357-1366, 1995). Esta via catabólica envolve uma etapa em que acetaldeído é convertido pela acetaldeído desidrogenase acetilante, EutE, a acetil-CoA. Genes novos tendo esta atividade AADH foram inferidos com base em análises de bioinformática e homologia de sequência. Os vários genes são sumarizados na Tabela 2.

[078] Além disso, com base nas análises de bioinformática e homologia de sequência para os genes tipo adhE e eutE, há um grupo de genes anotado como aldeído desidrogenases que podem ser inferidos para ter atividade AADH. Os vários genes são sumarizados na Tabela 3.

[079] 2-2: Acetil-CoA carboxilase eucariótica

[080] Acetil-CoA carboxilase (ACC, EC 6.4.1.2) é uma carboxilase dependente de biotina multifuncional que é uma enzima chave de biossíntese de ácido graxo. Esta utiliza os cofatores ATP e biotina para catalisar a conversão de acetil-CoA a malonil-CoA. A reação ocorre em duas etapas. Primeiro, a biotina carboxilase catalisa a carboxilação dependente de ATP de biotina com bicarbonato. Segundo, a carboxil transferase transfere o grupo carboxil da biotina para acetil-CoA para formar malonil-CoA. Enzimas eucarióticas são enzimas de multidomínio grandes enquanto enzimas procarióticas correspondentes consistem em múltiplas subunidades codificadas por genes distintos.

[081] A atividade de ACC é controlada no nível transcricional e também no nível pós-transcricional (por exemplo, por fosforilação e agregação) de modo a sustentar a homeostase de acetil-CoA. A modificação de ACC em espécies de levedura diferentes resultou em atividade ACC aumentada e produção aumentada de produtos derivados de malonil-CoA. Genes codificando enzimas tendo atividade ACC foram demonstrados ou postulados em Saccharomyces cerevisiae (GenBank No: CAA96294.1, sequência investigada), Yarrowia lipolytica (GenBank No: XP_501721.1, sequência investigada) e Mucor circinelloides (GenBank No: EPB82652.1, sequência investigada). Genes acetil- CoA carboxilase candidatos foram identificados nos genomas sequenciados recentemente de Kazachstania exigua (SEQ ID NO: 1) e Candida humilis (SEQ ID NO: 2) e clonados em nossos plasmídeos de expressão de levedura. Genes adicionais tendo atividade ACC foram inferidos com base na análise por bioinformática e homologia de sequência. Os vários genes ACC de multidomínio eucariótico são sumarizados na Tabela 4.

[082] 2-3: Malonil-CoA redutase bifuncional

[083] A redução de malonil-CoA a 3-HP (através de um intermediário semialdeído malonato) pode ser realizada por uma malonil-CoA redutase bifuncional grande que possui ambas funcionalidades de domínio aldeído desidrogenase de N-terminal e domínio álcool desidrogenase de N-terminal. Uma enzima de substrato altamente específico e dependente de NADPH com esta atividade foi caracterizada na bactéria não enxofre verde fototrófica Chloroflexus aurantiacus (GenBank No: AAS20429.1; sequência investigada) que participa em uma via de fixação de CO2 autotrófica denominada o ciclo 3-hidroxipropionato (Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410, 2002). Genes adicionais tendo esta atividade malonil-CoA redutase bifuncional foram inferidos com base em análises por bioinformática e sequência de homologia. Os vários genes são sumarizados na Tabela 5.

[084] 2-4: Malonil-CoA redutase

[085] Em contraste às malonil-CoA redutases bifuncionais discutidas acima, o malonil-CoA pode também ser catalisado a 3- HP por duas enzimas separadas. Por esta rota, malonil-CoA é primeiro reduzido a semialdeído malonato pela malonil-CoA redutase (MCR; EC 1.2.1.75) ou uma semialdeído malonato desidrogenase CoA-acilante e então subsequentemente reduzido a 3-HP por uma 3-hidroxipropionato desidrogenase (3-HPDH; EC 1.1.1.59 ou EC 1.1.1.298). MCR é uma enzima dependente de NADPH utilizada por algumas archaea termoacidofílicas para fixar carbono autotroficamente no material orgânico através de um ciclo 3-hidroxipropionato/4-hidroxibutirato (Berg et al., Science, 318:1782-1786, 2007). Genes codificando enzimas tendo esta atividade MCR são caracterizados em Metallosphaera sedula (GenBank No: ABP94884.1, sequência investigada) e Sulfolobus tokodaii (GenBank No: BAB67276.1, sequência investigada). Apesar destas MCRs dividirem uma atividade aldeído desidrogenase similar às enzimas malonil-CoA redutase bifuncionais de Chloroflexus aurantiacus, estas não exibem similaridade de sequência significativa sugerindo que as vias autotróficas em Chloroflexus e Sulfolobaceae evoluíram convergentemente e que genes diferentes foram recrutados para executar processos metabólicos similares nestes grupos taxonômicos (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559, 2006). Em particular, as MCRs archaeal mostram alta similaridade de sequência a aspartato- semialdeído desidrogenases. Genes adicionais tendo esta atividade MCR foram inferidos com base em análise por bioinformática e homologia de sequência. Os vários genes são sumarizados na Tabela 6.

[086] 2-5: 3-Hidroxipropionato desidrogenase

[087] Semialdeído malonato pode ser reduzido a 3-HP por uma 3-hidroxipropionato desidrogenase reversível (HPDH; EC 1.1.1.59, dependente de NADH) ou uma semialdeído malonato redutase (EC 1.1.1.298, dependente de NADPH). Estas enzimas participam naturalmente no metabolismo de beta-alanina, metabolismo de propanoato ou degradação e uracila em bactérias e plantas. Além disso, estas enzimas são necessárias para algumas archaea termoacidofílicas para fixar carbono através do ciclo 3- hidroxipropionato/4-hidroxibutirato (Kockelkorn and Fuchs, J. Bacteriol. 191:6352-6362, 2009). Genes codificando enzimas tendo atividade 3-hidroxipropionato desidrogenase ou semialdeído malonato redutase foram demonstrados ou postulados em Escherichia coli (GenBank No: EFV00080.1, sequência investigada), Saccharomyces cerevisiae (GenBank No: DAA10125.1, sequência investigada), Metallosphaera sedula (GenBank No: ABP96133.1, sequência investigada), Sulfolobus tokodaii (GenBank No: BAK54608.1, sequência investigada) e Escherichia coli (GenBank No: ACR64730.1, sequência investigada). Genes adicionais tendo atividade 3-hidroxipropionato desidrogenase ou semialdeído malonato redutase foram inferidos com base em análises por bioinformática e homologia de sequência. Os vários genes são sumarizados na Tabela 7.

[088] 2-6: 3-Hidroxiisobutirato desidrogenase

[089] 3-Hidroxiisobutirato desidrogenase (HIBADH; EC 1.1.1.31) é uma enzima chave envolvida no metabolismo de valina e os outros aminoácidos de cadeia ramificada. A HIBADH catalisa a conversão reversível dependente de NADH ou NADPH de 3- hidroxiisobutirato a semialdeído metilmalonato. Entretanto, como resultado de sua ampla especificidade de substrato, a HIBADH também exibiu atividade 3-hidroxipropionato desidrogenase (isto é, EC 1.1.1.59) convertendo semialdeído malonato a 3-HP (Yao et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 160:694-703, 2010). Enzimas com atividade HIBADH foram identificadas em Pseudomonas putida (GenBank No: ADR61938.1, sequência investigada), Pseudomonas aeruginosa (GenBank No: AAG06957.1, sequência investigada), Bacillus cereus (GenBank No: AAP10961.1, sequência investigada) e Alcaligenes faecalis (GenBank No: EJC65559.1, sequência investigada). Genes adicionais tendo esta atividade HIBADH foram inferidos com base em análises por bioinformática e homologia de sequência. Os vários genes são sumarizados na Tabela 8.

[090] 2-7: 4-Hidroxibutirato desidrogenase

[091] 4-Hidroxibutirato desidrogenase (HBDH; EC 1.1.1.61) é uma enzima naturalmente envolvida no metabolismo de butanoato. A HBDH catalisa a conversão dependente de NAD+ reversível de 4- hidroxibutanoato a semialdeído succinato. Entretanto, a HBDH pode também converter semialdeído malonato a 3-HP como a reação enzimática é similar. Enzimas com atividade HBDH foram identificadas em Cupriavidus necator (GenBank No: AAC41425.1, sequência investigada) e Clostridium kluyveri (GenBank No: EDK35022.1, sequência investigada). Genes adicionais tendo esta atividade HBDH foram inferidos com base em análises por bioinformática e homologia de sequência. Os vários genes são sumarizados na Tabela 9.

[092] 2-8: 3-Hidroxibutirato desidrogenase

[093] 3-Hidroxibutirato desidrogenase (BDH; EC 1.1.1.30) é uma enzima que está naturalmente envolvida no metabolismo de butanoato. A BDH catalisa a conversão dependente de NAD+ reversível de 3-hidroxibutirato a acetoacetato, mas esta pode também oxidar outros ácidos 3-hidroximonocarboxílicos. Por exemplo, a BDH pode converter semialdeído malonato a 3-HP como a reação enzimática é similar. Uma enzima com atividade BDH foi identificada em Pseudomonas aeruginosa (GenBank No: GAA17557.1, sequência investigada). Genes adicionais tendo esta atividade BDH foram inferidos com base em análises por bioinformática e homologia de sequência. Os vários genes são sumarizados na Tabela 10.

[094] Exemplo 3: Medição das atividades enzimáticas

Testes de enzima espectrofotométricos ACC

[095] Ensaios ACC espectrofotométricos são ensaios acoplados em que um produto produzido pela reação ACC é ainda consumido em uma reação que necessita o cofator NAD(P)H cuja oxidação pode ser monitorada com um espectrofotômetro.

[096] Kroeger et al. (2011, Anal. Biochem. 411:100-105) descreveram um teste acoplado em que malonil-CoA produzido por ACC1 é convertido ainda a semialdeído malonato pela malonil-CoA redutase purificada (MCR) em uma reação que necessita de NADPH como um cofator. A atividade ACC foi medida pela oxidação de NADPH seguinte.

[097] Diacovich et al. (2002, J. Biol. Chem. 277:3122831236) combinaram a conversão de ADP, um produto de hidrólise de ATP que é utilizado como um cofator na reação ACC, para uma reação piruvato quinase necessitando de ADP que foi ainda acoplada à formação de piruvato utilizando lactato desidrogenase. A última enzima necessita de NADH como um cofator cuja oxidação foi seguida.

Testes de enzima radioativa ACC

[098] O teste ACC in vitro mais comumente utilizado é baseado no uso de carbonato 14C radioativo. A incorporação de carbonato radioativo em um material ácido e um não volátil (isto é, malonil-CoA) é seguida. O bicarbonato de sódio marcado 14C que não foi convertido a malonil-CoA é removido por um tratamento ácido e de calor que converte o NaH14CO3 restante e os possíveis produtos laterais da reação em CO2 marcado 14C.

[099] Este ensaio descrito por Diacovich et al. (2002, J. Biol. Chem. 277:31228-31236) tem sido utilizado para detectar atividade ACC a partir de lisados de levedura (Shi et al. 2014, mBIO 5:3 e01130-14) com modificações leves. Os lisados de célula foram preparados a partir de células de levedura coletadas durante a fase exponencial tardia ou estacionária. As células foram lavadas e então resuspensas em tampão de lise contendo 100 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 2 mM de MgCl2, 1 mM de ditiotreitol e 1x de inibidor de protease completa livre de EDTA (Roche). As células foram rompidas por grânulos de vidro e o sobrenadante foi coletado após centrifugação a 4 °C.

[0100] A mistura de reação do ensaio da enzima ACC incluiu 100 mM de fosfato de potássio (pH 8, 0), 300 μg de BSA, 3 mM de ATP, 5 mM de MgCl2, 10 mM de NaH14CO3 [atividade específica 200 μCi mmol-1 (7400 kBq mmol)] e 0,5 mM de acetil-CoA. O volume total da reação foi 100 μL que incluiu 20 μL de extrato de célula.

[0101] A reação foi incubada a 30°C por 15 min, e interrompida pela adição de 50 μL de HCl 5 M. Os conteúdos dos tubos foram evaporados para secar a 95 °C e o resíduo foi ressuspenso em 100 μL de água e misturado com 3 mL de coquetel de cintilação (Ultima Gold AB, PerkinElmer). O conteúdo de 14C das amostras foi determinado utilizando um contador de cintilação líquida (PerkinElmer Tri-Carb 2810TR).

Ensaio de enzima AADH

[0102] A atividade AADH foi medida como descrito por Kozak et al. (2014, Metab. Eng. 21:46-59) monitorando a redução de NAD+ a 340 nm a 30 °C. As células de levedura para os lisados de célula foram coletadas, lavadas com água e então ressuspensas em tampão de lise contendo 100 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5) e 1X de coquetel inibidor de protease livre de EDTA (Roche). As células foram lisadas com grânulos de vidro em um homogeneizador Precellys 24 a 5500 rpm por 3x40 segundos e mantidas em gelo entre os ciclos. Os lisados foram centrifugados a 16 000 g por 20 min a 4 °C e os sobrenadantes foram coletados. A concentração de proteína total foi determinada utilizando o método Bradford.

[0103] A mistura de reação de ensaio da enzima continha 0,1 mM de Coenzima A, 50 mM de tampão CHES (pH 9,5), 0,8 mM de NAD+, 0,2 mM de DTT e 10 μL de extrato de célula em um volume de reação total de 200 μL. A reação foi iniciada adicionando 10 mM de solução de acetaldeído preparada recentemente e a redução de NAD+ foi seguida com um analisador Thermo Konelab 20XT.

Lisados de célula de levedura do teste de enzima MCR

[0104] A atividade de enzima MCR foi medida de acordo com o método descrito por Chen et al. (2014, Metab. Eng. 22:104-109) com modificações leves. O método é baseado no monitoramento da oxidação de NAD(P)H a 340 nm.

[0105] As células foram coletadas e lavadas com tampão de lavagem frio contendo 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM de NaN3 e então ressuspensas em 1 mL de tampão de quebra contendo 50 mM de HEPES (pH 7,5), 150 mM de KCl, 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA, 0,5% de Triton X-100 e 1X de coquetel inibidor de protease livre de EDTA (Roche). As células foram lisadas com grânulos de vidro em um homogeneizador Precellys 24 a 5500 rpm por 3x40 segundos e mantidas em gelo entre os ciclos. Os lisados foram centrifugados a 16 000 g por 20 min a 4 °C e os sobrenadantes foram coletados. A concentração de proteína total foi determinada utilizando o método Bradford.

[0106] A mistura do ensaio de MCR continha 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de MgCl2 e 0,3 mM de NADPH ou NADH. Após adicionar 20 μL do lisado celular em um volume de reação total de 200 μL, a reação foi pré-incubada por cinco minutos a 30 °C, após isso a reação foi iniciada pela adição de 0,15 mM de malonil-CoA. O ensaio foi monitorado a 340 nm com um analisador Thermo Konelab 20XT.

Geração de vetores de expressão de levedura

[0107] Uma série de plasmídeos de expressão de levedura foi gerada de modo a avaliar os genes candidatos para sua expressão e capacidades de atividade na levedura. Primeiro, um novo sítio de clonagem múltipla baseado em pBlueScript (MCS) foi designado de modo que todas as combinações de sítio de enzima de restrição (RE) possíveis puderem ser utilizadas. Este MCS modificado foi então colocado na série baseada em pRS de plasmídeos centroméricos e multicópia de levedura. Depois, um conjunto de 10 sítios RE únicos, nove conjuntos diferentes de promotores e terminadores foram clonados nestes vetores de expressão de levedura baseados em pRS. Portanto, este sistema de plasmídeo poderia ser utilizado para expressar constitutivamente até 9 genes simultaneamente em ou um número de cópia baixo ou alto em uma cepa de levedura adequada de modo a avaliar uma variedade de combinações de via de enzima para a produção de 3-HP.

Clonagem dos genes ACC

[0108] Genes ACC1 que foram transformados na cepa S. cerevisiae VSK-128 industrial com e sem deleção de SNF1 são apresentados na Tabela 13. Os genes ACC foram expressos a partir de um plasmídeo multicópia em que estiveram sob o controle do promotor PDC1. Os genes ACC1sc mutados descritos em uma publicação por Shi et al. (2014) foram construídos com um Kit de Mutagênese Direcionada a Sítio QuikChange II (Agilent Technologies).Tabela 13. Genes Acetil-CoA carboxilase transformados em S. cerevisiae VSK-128.

Ensaios de enzima ACC

[0109] Na literatura, ensaios espectrofotométricos têm sido utilizados para detectar atividade de enzima ACC com enzimas ACC purificadas ou parcialmente purificas. Os ensaios de espectrofotometria foram testados com lisados de célula de levedura em que ACC tinha sido sobre-expressa, mas nenhuma mudança na absorbância foi detectada comparado aos controles.

[0110] O ensaio de enzima ACC radioativo é muito sensível, mesmo atividades em pmol/mg/min podem ser detectadas. O método foi primeiro testado com enzima ACC humana purificada que está disponível comercialmente. Uma atividade clara foi detectada, o método foi ainda otimizado para detectar atividade ACC a partir de lisados de células de levedura. As cepas listadas na Tabela 13 foram testadas para sua atividade ACC1 e com base nos resultados, uma lista descrevendo a classificação relativa das ACC1s foi feita (Figura 2). A candidata mais promissora, ACCyl foi mais estudada e os resultados da cepa tipo selvagem S. cerevisiae S-128 e a mesma cepa em que ACC1 foi sobre-expressa são apresentados na Tabela 14.Tabela 14. Sobre-expressão do gene ACCyl resultou em um aumento de 2,9 vezes na atividade da enzima ACC1 comparada à atividade de ACC1 endógena da cepa S. cerevisiae VSK-128 tipo selvagem.

Ensaios de atividade de enzima AADH in vitro

[0111] Cinco genes AADH foram escolhidos originalmente (isto é, ADHEpm, ADHEec, EUTec, EUTdz e LIN1129li) e transformados na cepa de laboratório CEN.PK. Estes AADHs foram expressados a partir de um plasmídeo de multicópia em que estavam sob o controle do promotor TEF1. Todos os cinco genes AADH mostraram atividade AADH, mas os três genes AADH tipo eutE (isto é, EUTec, EUTdz e LIN1129li) geraram atividade AADH muito maior em levedura comparados aos AADHs tipo adhE (isto é, ADHEpm e ADHEec).

[0112] Vinte novos genes AADH adicionais foram escolhidos a partir da exploração de genoma para serem avaliados para expressão e atividade de enzima em levedura. Estes vinte novos genes AADH foram testados para atividade de enzima in vitro e quatro deles (isto é, AADHmm, AADHab, AADHbw e AADHvs) mostraram ter atividade AADH.

Ensaios de crescimento AADH in vivo

[0113] Todas as cópias do gene ACS2 foram deletadas da cepa S. cerevisiae VSK-128 industrial de modo a gerar uma cepa com um desvio de PDH defeituoso que foi incapaz de crescer em meio baseado em glicose. Os vetores de expressão carregando as 25 variações de AADH diferentes foram então transformados nesta cepa de deleção ACS2 para avaliar sua capacidade de recuperar o crescimento desta cepa em glicose.

[0114] Vinte variações de AADH diferentes (isto é, EUTEec, EUTEdz, LIN1129li, AADHmm, AADHtl, AADHab, AADHta, AADHbs, AADHbw, AADHvs, AADHhs e ADHEec) foram capazes de recuperar a deficiência de crescimento da cepa de deleção ACS2 com base em sua capacidade para crescer nas placas de ágar baseado em glicose. Houve uma boa correlação entre os testes de atividade de enzima AADH in vitro e as análises de recuperação de crescimento in vivo.

[0115] A taxa de crescimento das primeiras nove cepas variantes AADH que demonstrou ser capaz de recuperar o crescimento da cepa de deleção ACS2, foi então avaliada em cultivos em balão de agitação líquidos e comparadas à cepa tipo selvagem contendo o desvio PDH intacto. Todas as noves destas variantes AADH foram capazes de manter >50% da taxa de crescimento anaeróbico da cepa S. cerevisiae VSK-128 quando o crescimento em glicose e seis destas variantes AADH foram capazes de manter >80% da taxa de crescimento aeróbico da cepa S. cerevisiae VSK-128.

Ensaios de enzima MCR em leveduras

[0116] Os oito homólogos de MCR de Chloroflexus de comprimento total foram truncados em seus dois domínios funcionais e os domínios específicos de MCR foram testados para atividade de enzima em levedura junto com as seis MCRs archaeal. Estas MCRs foram sobre-expressas a partir de um plasmídeo multicópia em que estavam sob o controle do promotor TEF1 e transformadas na cepa de laboratório CEN.PK.

[0117] MCRca (Chloroflexus aurantiacus) e seu homólogo MCRrc (Roseiflexus castenholzii) foram os únicos homólogos MCR Chloroflexus que geraram atividades de enzima MCR maiores do que a cepa de tipo selvagem quando utilizando NADPH como um cofator. Nenhuma atividade de enzima foi observada a partir destes oito homólogos MCR Chloroflexus MCR quando utilizando NADH como cofator.

[0118] Três das MCRs archaeal [Sulfolobales archaeon, Sulfolobus acidocaldarius (x2)], geraram atividades de enzima MCR maiores do que a cepa tipo selvagem quando utilizando NADPH como cofator e todas as seis de MCRs archaeal geraram atividades de enzima MCR maiores do que a cepa tipo selvagem, quando utilizando NADH como cofator.

Expressão heteróloga e caracterização das MCRs archaeal

[0119] As construções de expressão baseadas no promotor pBAT T7 foram preparadas para quatro MCRs archaeal diferentes, Metallosphaera sedula (MCRms), Sulfolobus tokodai (MCRst), Candidatus caldiarchaeum (MCRcc) e Sulfolobales archaeon (MCRsa1). Estas construções não contêm um tag de purificação e foram otimizadas por códon de E. coli e expressas sob as condições descritas anteriormente neste relatório (Tabela 15).Tabela 15. Visão geral das construções de MCRs archeal MCRs para expressão em E. coli. (ca - Chloroflexus aurantiacus, ms - Metallosphaera sedula, st - Sulfolobus tokodaii, cc - Candidatus caldiarchaeum, sal- Sulfolobales archaeon, sa2 - Sulfolobales acidocaldarius)

[0120] Suas atividades foram analisadas utilizando as seguintes condições: 0,4 mM de NAD(P)H; 0,15 mM de Malonil-CoA; Tris-HCl pH 7; 2 mM de MgCl2. Ensaios nos lisados diluídos 20 vezes foram realizados em formato de placa de microtitulação (MTP) em RT. A oxidação de NADPH ou NADH em A365 no tempo foi acompanhada. Dentre os quatro genes archaeal genes testados, MCRsa1 e MCRst mostraram a maior atividade MCR. Entretanto, as atividades MCR foram menores do que aquelas medidas para o MCRca taggeado. Nenhuma atividade em NADPH ou NADH pode ser medida (no lisado de célula de E. coli) para Candidatus caldiarchaeum MCR (MCRcc).

[0121] Quando analisando estas construções utilizando géis SDS-PAGE, MCRsa1 mostrou os maiores níveis de expressão no lisado de E. coli, enquanto o MCRcc não pode ser expresso em uma forma solúvel; veja o gel (sa1 > ca > st > ms > cc) (Figura 3). As construções MCRsa1 e MCRst parecem ter preferência por cofator duplo e mostraram cerca de 40 - 50% de atividade NADH relativa quando comparada àquela medida em NADPH. Em termos de atividade específica, MCRst pode ser a enzima mais ativa das quatro MCRs archaeal testadas, uma vez que mostrou um nível de atividade alto relativo em um nível de expressão relativamente baixo.

[0122] Exemplo 4: Produção de 3-HP cultivando uma levedura recombinante Cultivos de balão de agitação para S. cerevisiae

[0123] Uma pequena alça de células foi tomada das cepas cultivadas recentemente em placas baseadas em ágar e utilizada para inocular 20 mL de meio seletivo baseado em SC (20 g/L de glicose) em um balão de 250 mL e cultivada por 2 dias (30 oC, 250 rpm) até que toda a glicose e etanol tivesse sido consumido. A densidade de célula final e as culturas foram centrifugadas por 5 min a 4000 rpm. Os sobrenadantes foram então analisados por HPLC ou GC/MS para determinar o acúmulo de 3-HP e outros metabólitos principais na cultura de sobrenadantes. Entretanto, outras condições de cultivo foram também testadas dependendo na cepa particular e objetivo (por exemplo, quantidade inicial de glicose, quantidade de aeração, tipo de meio e adição de substâncias adicionais no meio, etc.).

[0124] Exemplo 5: Cultivos de biorreator para S. cerevisiae

[0125] As culturas foram conduzidas em biorreatores Multifors (volume de trabalho máximo 500 mL, 2 impulsores de turbina Rusthon de 4 pás, Infors HT, Suíça) contendo 250 - 500 mL de meio. As culturas foram mantidas a 30°C, 300 ou 900 - 950 rpm, com 1,2, 2,4 ou 3,6 de volume de gás (volume de cultura)-1 min-1 (vvm) inicialmente. O pH da cultura foi mantido constante em pH 5,5 ± 0,2 pela adição de 2 M NaOH ou 2 M H3PO4 estéril. O antiespumante Clerol FBA 3107 (Cognis France, Ponthierry Paris; 0,03% v/v) foi adicionado para controlar a produção de espuma. A concentração de gás (CO2,O2,N2 e Ar) foi analisada continuamente em um espectrômetro de massa Prima Pro Process (Thermo Scientific, UK) calibrado com 3% de CO2 em Ar, 5% de CO2 com 0,99% de Ar e 15% de O2 em N2, 20% de O2 mais 20% de Ar em N2, e 0,04% de etanol em N2.

[0126] As cepas foram pré-cultivadas durantes a noite em balões de agitação em meio seletivo baseado em SCD e utilizadas para inocular os biorreatores. A fase de lote das culturas (20 g/L de glicose inicial) foi deixada continuar por 14 a 20 h e a alimentação de glicose foi iniciada apenas após a glicose ter sido consumida, mas ou depois ou antes de o etanol ter sido consumido (dependendo do objetivo do cultivo). A taxa de alimentação de glicose foi mantida a 0,38 - 0, 65 g L—1 h-1 (dependendo do objetivo do cultivo). Amostras sobrenadantes foram então analisadas por HPLC para determinar o acúmulo de 3- HP e outros metabólitos principais nas culturas.

[0127] Exemplo 6: análise de 3-HP dos sobrenadantes de cultura de célula por HPLC

[0128] As amostras de sobrenadante da cultura foram analisadas com o sistema HPLC Waters Alliance e2695 (Waters, Milford, EUA) em que o volume de injeção foi 10 μl. Uma Coluna de Ácido Orgânico Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) (Bio-Rad, EUA) ligada a uma Coluna de Análise de Ácido Rápida (100 mm x 7,8 mm) (Bio-Rad, EUA) foi utilizada como uma fase estacionária no HPLC. As colunas foram mantidas a +55 °C e 5,0 mM de H2SO4 (Merck KgaA, Alemanha) foi utilizado como um eluente com a taxa de fluxo de 0,3 ou 0,5 ml min-1. O detector UV de comprimento de onda duplo Waters 2489 (210 nm) (Waters, Milford, EUA) e refractômetro diferencial Waters 2414 (Waters, Milford, EUA) foram utilizados para a detecção de ácido 3-hidroxipropiônico, glicose, acetato, succinato, piruvato, glicerol e etanol.

[0129] Exemplo 7: análise de 3-HP dos sobrenadantes da cultura de célula por GC/MS

[0130] As amostras de teste e curva padrão foram preparadas do seguinte modo: o sobrenadante (0,5 ml) foi acidificado com 50 μl de HCl (6N) e bloqueado com 3-HPA (TCI) padrão (em acetato de etila). 5 μl de solução padrão interna de ácido lático (Sigma Aldrich (ISOTEC) L-lactato-3,3,3-d3 de sódio 98% em átomo; 5,5 g/l) e aproximadamente 0,2 g de NaCl foram adicionados. Uma vez que 3-HP marcado não está disponível comercialmente, este produto isótopo estável em ácido lático foi escolhido como o padrão interno uma vez que este foi o composto mais estruturalmente/quimicamente similar ao 3-HP que estava disponível que não está presente na matriz de amostra. A mistura foi agitada por aproximadamente 3 min em um misturador de vórtex. A amostra foi então extraída duas vezes com 0,5 ml de acetato de etila misturando por aproximadamente 3 min em um misturador de vórtex. As camadas foram separadas por centrifugação a 10.000 rpm por 5 min. As camadas superiores foram coletadas em um frasco GC e evaporadas. Os resíduos secos foram derivatizados com MSTFA (50 μl) contendo 1% de TMCS incubando a 60 °C por 1 h. Os padrões para a curva de calibração foram extraídos do mesmo modo como as amostras de modo a minimizar erros.

[0131] As amostras foram corridas em um cromatógrafo gasoso da Agilent 6890 (GC) combinado com o detector seletivo de massa Agilent 5973 (MSD). O injetor (volume de injeção 1 μl com proporção de divisão 20:1) e temperaturas de interface MSD foram 280 °C, e o programa de temperatura do forno foi de 50 °C a 280 °C em uma taxa de 20°C/min. As análises foram realizadas em uma coluna capilar Agilent HP-5MS (30 m, ID 200 μm, espessura de filme 0,25 μm; Agilent 19091S-433). As identificações dos compostos foram com base em uma pesquisa espectral a partir da biblioteca NIST. 3-HP foi detectado monitorando m/z 147 e m/z 219 e o dímero 3-HP foi detectado monitorando m/z 177. Cinco pontos de curvas de calibração (c = 1 - 400 mg/l) foram construídos utilizando as respostas 3-HP e um padrão interno foi utilizado para normalização. A quantificação se provou linear nesta faixa de concentração. Amostras em branco foram analisadas junto com as amostras.

[0132] Exemplo 8: Avaliação das cepas de expressão de plasmídeo de S. cerevisiae

[0133] As cepas de expressão de plasmídeo 3-HP expressaram simultaneamente uma, duas ou três enzimas de via de 3-HP (isto é, AADH, ACC1, MCR e HPDH) a partir de dois plasmídeos de expressão diferentes (isto é, pSK-084 e/ou pSK-085) (Figura 4).Estas cepas foram utilizadas para avaliar os efeitos das diferentes enzimas de via 3-HP (e combinações destas enzimas) na produção de 3-HP na cepa S. cerevisiae tolerante a ácido VSK- 128. As cepas foram cultivadas em 20 mL de meio baseado em SC seletivo (20 g/L de glicose) em balões de 250 mL e cultivadas por 2 dias (30 oC, 250 rpm) até que toda a glicose e etanol tivesse sido consumida.

Exemplo 9: Sumário das análises de atividade de enzima de via in vivo

[0134] Vinte e cinco AADHs, 8 ACC1s, 10 HPDH-MCRs bifuncionais, 6 MCRs Archaeal e 28 HPDHs na Tabela 16 foram analisadas para sua capacidade de produzir 3-HP em várias cepas S. cerevisiae que também expressaram enzimas da via 3-HP adicionais se necessário. Muitas enzimas da via de 3-HP novas (obtidas das análises exploração de genoma) se mostraram ativas em levedura e muitas delas mostraram possuir propriedades superiores (isto é, atividades maiores, preferência de cofator melhor) quando comparadas às enzimas de via 3-HP publicadas anteriormente.[Tabela 16]

Exemplo 10: Estudos de cultivo de balão de agitação de S. cerevisiae para produção de 3- HP Condições de cultivo

[0135] Várias condições de cultivo diferentes foram avaliadas em um par de cepas de teste inicial para ver como as várias condições de cultura afetam a capacidade da cepa para produzir 3-HP. A cepa S. cerevisiae VSK-128 (Δura3, Δhis3) expressou dois plasmídeos em que um dos plasmídios continha ou o gene HIBADHpa ou o HPDHec e o segundo plasmídeo continha o gene MCRsa2. Ambas as cepas se comportaram similarmente durante os cultivos e tiveram perfis de metabólitos muito similares.

[0136] Seis condições de cultivo de balão de agitação diferentes foram testadas:

[0137] 1. Aeróbica, processo em lote, glicose inicial alta (120 g/L). Outros 100 g/L de glicose foram adicionados no Dia 3.

[0138] 2. Anaeróbica, processo em lote, glicose inicial alta (100 g/L). Os balões foram vedados e a agitação foi menor a 100 rpms.

[0139] 3. Aeróbica, processo em lote, bloqueio de glicose repetida. A glicose inicial foi 20 g/L, então 40 g/L foi adicionado a cada dia subsequente.

[0140] 4. Aeróbica, processo de batelada alimentada simulado, muitos comprimidos de glicose inicial. 5 comprimidos foram adicionados inicialmente, outros 5 comprimidos foram adicionados no Dia 3. Quantidades variadas da solução de Enzima A (50 - 150 μl por dia) foram adicionadas cada dia.

[0141] 5. Aeróbica, processo de batelada alimentada simulado, bloqueio repetido de comprimidos de glicose. 1 comprimido foi adicionado inicialmente, 2 comprimidos foram adicionados nos Dias 1 e 2, 3 comprimidos foram adicionados nos Dias 3 e 4. Quantidades variadas de uma solução de Enzima A (50 - 150 μl por dia) foram adicionadas cada dia.

[0142] 6. Aeróbica, processo em lote, bloqueio de galactose repetido. A galactose inicial foi 20 g/L, então 40 g/L foi adicionada cada dia subsequente.

[0143] Para os cultivos de batelada alimentada simulado, acredita-se que cada comprimido libere 0,5 g de glicose (que iguala para 20 g/L de glicose para volumes de cultura de 25 mL). Os comprimidos consistem essencialmente em glicose (isto é, amido) e uma solução de Enzima A (isto é, amilase) permitindo a liberação lenta controlada de glicose no meio durante os cultivos em balão de agitação. Foi uma hipótese de que condições de batelada alimentada de glicose limitada podem promover fluxo em direção ao crescimento e subsequentemente produção de 3-HP.

Crescimento celular

[0144] Todos os cultivos baseados em glicose regulares cresceram similarmente e a cultura alimentada de galactose cresceu mais lentamente. Por outro lado, as condições de batelada alimentada promoveram mais crescimento celular comparadas às outras condições de cultivo. Em particular, as condições de batelada alimentada (bloqueio de comprimido) realmente promoveram muito do crescimento precoce no cultivo.

Produção de 3-HP

[0145] Para estes cultivos, a maioria do crescimento geralmente ocorreu no final do Dia 2 e a grande maioria do 3-HP também foi produzida pelo Dia 2, portanto indicando que o crescimento e produção de 3-HP estão ligados um ao outro. A condição de cultivo de batelada alimentada (bloqueio de comprimido) produziu a maioria do 3-HP (~0,85 g/L) e as cultivos de alimentação de galactose produziram a menor quantidade de 3- HP (~0,12 g/L) e as outras condições de cultivo todas produziram cerca de 0,3 a 0,4 g/L de 3-HP. Estes resultados demonstraram que as condições de cultivo podem ter um grande efeito nos níveis de produção de 3-HP (Figura 5).

[0146] Consumo de glicose

[0147] A glicose foi consumida rapidamente em todos os estudos de cultivo até os Dias 2 - 3, então as taxas de consumo de glicose diminuíram significativamente (durantes os dias 4 - 5) junto com o crescimento de produção de 3-HP. Para os cultivos de batelada alimentada, a glicose parece ter sido consumida tão rápido quanto foi liberada dos comprimidos, sugerindo que estes cultivos foram realizados sob condições limitadas de glicose.

[0148] Acúmulo de glicerol, acetato e etanol

[0149] O acúmulo de glicerol foi bem alto para os cultivos alimentados com glicose e foi muito menor para os cultivos alimentados com galactose. O acúmulo de acetato foi bastante similar dentre as condições de cultivo diferentes, mas as condições de batelada alimentada (muitos comprimidos) produziram muito mais acetato.

[0150] Altas quantidades de etanol acumuladas para a maioria destes cultivos de balão de agitação, especialmente para os cultivos de lote de glicose e os cultivos de bloqueio de glicose. Os cultivos de batelada alimentada visaram representar condições limitadas de glicose para reduzir o excesso de superfluxo de metabolismo de etanol e esta abordagem parece ter tido sucesso, uma vez que o acúmulo de etanol foi significativamente menor nos cultivos de batelada alimentada.

[0151] Cultivo de uma cepa de produção de 3-HP mais estabelecida

[0152] Uma cepa de produção de 3-HP adicional [(EutEec, HPDH- MCRca, ACC1sc_S1157A) e (HIBADHpa, MCRsa2)] foi cultivada de acordo com as condições de cultivo de batelada alimentada mais promissoras (bloqueio de comprimido) para verificar seu desempenho.

[0153] Novamente, a maioria do crescimento ocorreu pelo Dia 3 e a maioria da produção de 3-HP ocorreu pelo Dia 3. A produção de 3-HP excedeu 1,2 g/L com esta cepa sob esta condição de cultivo, (Figura 6).

[0154] Embora das modalidades específicas da presente invenção tenham sido descritas em detalhes, será aparente aos especialistas na técnica que a descrição específica é meramente uma modalidade exemplar desejável e não deve ser interpretada como limitante do escopo da presente invenção. Portanto, o escopo substancial da presente invenção é definido pelas reivindicações em anexo e equivalentes das mesmas.

[0155] Aplicabilidade Industrial

[0156] O uso da levedura recombinante e o método para preparar 3-HP da presente invenção permite a produção de 3-HP em uma alta concentração e um alto rendimento em um pH baixo a partir de um açúcar útil, tal como glicose, assim contribuindo bastante para a produção econômica de 3-HP a partir de biomassa e seus produtos aplicados.

Claims

1. Levedura recombinante selecionada dentre Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi, e Candida humilis compreendendo uma via biossintética 3-HP ativa de [Piruvato ^ Acetaldeído ^ Acetil-CoA ^ Malonil- CoA ^ Malonato semialdeído ^ 3-HP], caracterizada por compreender: - um gene exógeno que codifica a acetilação de acetaldeído desidrogenase (AADH), que converte acetaldeído diretamente em acetil-CoA compreendendo: AADHab (SEQ ID NO: 74), AADHbs (SEQ ID NO: 76), AADHbw (SEQ ID NO: 77), AADHhs (SEQ ID NO: 80), AADHmm (SEQ ID NO: 83), AADHta (SEQ ID NO: 90), AADHtl (SEQ ID NO: 91), AADHvs (SEQ ID NO: 93), AADHec(SEQ ID NO: 94), EUTEdz (SEQ ID NO: 96), EUTEec (SEQ ID NO: 97) or LIN1129li (SEQ ID NO: 98); - um gene endógeno ou exógeno que codifica uma acetil-CoA carboxilase (ACC) compreendendo: ACC1sc_S659A (SEQ ID NO: 99), ACC1sc_S659A/S1157A (SEQ ID NO: 100), ACC1sc_S1157A (SEQ ID NO: 101), ACC1ke (SEQ ID NO: 102), ACC1mc (SEQ ID NO: 103), ACC1sc (SEQ ID NO: 104), ACCyl (SEQ ID NO: 105) ou ACC1ch (SEQ ID NO: 106); - um gene exógeno que codifica uma malonil-CoA redutase (MCR) compreendendo: HPDH-MCRbs (SEQ ID NO: 107), HPDH-MCRca (SEQ ID NO: 108), HPDH-MCRcag (SEQ ID NO: 109) e HPDH-MCRsl (SEQ ID NO: 114), MCRsa1 (SEQ ID NO: 202), MCRsa2 (SEQ ID NO: 203), MCRsa3 (SEQ ID NO: 204) ou MCRst (SEQ ID NO: 201); e - um gene exógeno que codifica uma hidroxipropionato desidrogenase (HPDH) que compreende: BDHcm, BDHkp, HBDHos, HBDHps, HIBADHas, HIBADHbc, HIBADHma, HIBADHpa, HIBADHxc, HPDHam, HPDHbs, HPDHca, HPDHcag, HPDHct, HPDHec (SEQ ID NO: 117 a SEQ ID NO: 131) e HPDHgb, HPDHhw, HPDHka, HPDHms, HPDHot, HPDHps, HPDHra, HPDHrc, HPDHsi, HPDHsl, HPDHsm e HPDHst (SEQ ID NO: 133 a 144), ou HPDHecl (SEQ ID NO: 234).

2. Método de preparar 3-HP caracterizado por compreender: (a) cultivar a levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em um meio incluindo pelo menos uma fonte de carbono, por meio do qual produzindo 3-HP; e(b) isolar 3-HP a partir da cultura.

3. Método de preparar 3-HP, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a fonte de carbono ser uma ou mais selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, xilose, arabinose, sacarose, frutose, galactose, celulose, oligômeros glicose e glicerol.

4. Método de preparar 3-HP, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a cultura ser realizada em um pH na faixa de 2,6 a 4,0.