BR112021011629A2 - Via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído - Google Patents

Via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído Download PDF

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Beatriz Leite Magalhaes (Falecida)
Paulo Moises Raduan ALEXANDRINO
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Abstract

via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído. a presente invenção refere-se aos métodos de utilização de micróbios geneticamente modificados para coproduzir ácido 3-hidroxipropiônico (3-hp) e acetil-coa, e derivados destes, a partir de malonato semialdeído como um intermediário único comum. a invenção proporciona adicionalmente micróbio modificado que coproduz os derivados de ácido 3-hidroxipropiônico (3-hp) e acetil-coa a partir de malonato semialdeído.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VIA DE COPRODUÇÃO DE DERIVADOS DE 3-HP E ACETIL-COA A PARTIR DE MALONATO SEMIALDEÍDO".
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDO CORRELATO
[001] Este pedido reivindica prioridade a Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 62/781.511 depositado em 18 de dezembro de 2018, cujo conteúdo é incorporado como referência em sua totalidade neste relatório.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se geralmente à produção de produtos químicos de comodidade e especialidade, e, mais especificamente, um bioprocesso integrado para produção de derivados de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP ou 3-HPA) e acetil-CoA a partir de malonato semialdeído (MSA).
[003] Derivados de 3-HP incluem ácido acrílico, 1-propanol, propeno, polipropileno, etc. Derivados de acetil-CoA incluem acetona, 2-propanol, propeno, polipropileno, etc. Muitas dessas moléculas são produzidas via química sintética juntamente com quantidades consideráveis de refugo químico.
[004] Existe uma necessidade de minimizar o desperdício químico produzido a partir de produção dessas moléculas para buscar uma abordagem mais ecológica e econômica para processos e moléculas que utilizam esses derivados de 3-HP e acetil-CoA.
[005] Conforme descritos neste relatório, a invenção proporciona métodos e composições para a coprodução fermentativa de derivados de 3-HP e acetil-CoA.
DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[006] A listagem de sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto em vez de uma cópia em papel, e é incorporada como referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequências é BRSK_020_01WO_ST25.txt. O arquivo de texto tem 906 kb e foi criado em 18 de dezembro de 2019 e está sendo apresentado eletronicamente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Esta invenção proporciona um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA e/ou derivados dos mesmos, a partir de uma matéria-prima compreendendo uma ou mais fontes de carbono, em que o micro- organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico que catalisa a produção de 3-HP a partir de malonato de semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica a (i) malonato de semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato de semialdeído e/ou (ii) malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato de semialdeído em malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação do oxaloacetato em malonato de semialdeído.
[008] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é capaz de produzir 1-propanol, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma propionil-CoA sintase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/CoA transferase, 3-hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil- CoA redutase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma álcool/aldeído desidrogenase que catalisa a conversão de propionil-CoA de (a) ou (b) em 1-propanol, ou um aldeído desidrogenase (acetilante) e álcool desidrogenase que catalisa juntamente a produção de 1-propanol a partir de propionil-CoA.
[009] Em algumas modalidades, os derivados de 3-HP são selecionados do grupo que consiste de: ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno. Em algumas modalidades, os derivados de acetil-CoA são selecionados do grupo que consiste de: acetona, 2- propanol, propeno e polipropileno. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção de excesso de NAD(P)H gerado na produção de acetil-CoA é utilizada como fonte de equivalentes redutores na produção de 3-HP e/ou derivados de 3-HP.
[0010] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante produz ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP), acetil-CoA, 1-propanol e/ou 2- propanol, em um processo de produção aeróbico ou anaeróbico, de preferência, um processo anaeróbico.
[0011] Em algumas modalidades, o micro-organismo é selecionado a partir de uma bactéria, um fungo ou levedura. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é derivado de um micro-organismo parental selecionado do grupo que consiste de: Clostridium sp., Clostridum ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Candida sp, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum,
Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Candida krusei, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis e Terrisporobacter glycolicus. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma levedura. Em algumas modalidades, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
[0012] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende: MCR-Nterm.Cau (ID SEQ NO: 105), ADH.Ae (ID SEQ NO: 106), MMSB.Bce (ID SEQ NO: 107), YDFG-0.Ec (ID SEQ NO: 108), YMR226C (YDF1) (ID SEQ NO: 109) ou HPD1 (ID SEQ NO: 110). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma desidrogenase do ácido 3- hidroxipropiônico codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo YMR226C (YDF1) (ID SEQ NO: 109). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo HPD1 (ID SEQ NO: 110).
[0013] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonato semialdeído desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo MSD.Pa (ID SEQ NO: 111), MSD.Cal (ID SEQ NO: 112), iolA (ID SEQ NO: 113) , iolA (ID SEQ NO: 114), iolA (ID SEQ
NO: 115), mmsA (ID SEQ NO: 116), dddC (ID SEQ NO: 117) ou iolA (ID SEQ NO: 118). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonato semialdeído desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo MSD.Pa (ID SEQ NO: 111). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonato semialdeído desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo MSD.Cal (ID SEQ NO: 112).
[0014] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo mcr (ID SEQ NO: 278), matA, MLYCD (ID SEQ NO: 279), kivD (ID SEQ NO: 280), kdcA (ID SEQ NO: 281), ARO10 (ID SEQ NO: 282). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo mcr (ID SEQ NO: 278). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo kivD (ID SEQ NO: 280). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo ARO10 (ID SEQ NO: 282).
[0015] Em algumas modalidades, a pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato de semialdeído codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo (ID SEQ NO: 1) ou (ID SEQ NO: 274). Em algumas modalidades, a pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato de semialdeído codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo (ID SEQ NO: 1). Em algumas modalidades, a pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação do oxaloacetato em malonato de semialdeído codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo (ID SEQ NO: 274).
[0016] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetril-CoA; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA e (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
[0017] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo ERG10 (ID SEQ NO: 209), thlA (ID SEQ NO: 210),
atoB (ID SEQ NO: 211), H16_B0759 (ID SEQ NO: 212), Msed_0656 (ID SEQ NO: 213) ou AAT1 (ID SEQ NO: 214). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo ERG10 (ID SEQ NO: 209). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo nphT7 (ID SEQ NO: 285).
[0018] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo atoA/atoD (ID SEQ NO: 215 e 216), ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 219 e 220), ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 221 e 222) ou ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 223 e 224). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo atoA/atoD (ID SEQ NO: 215 e 216).
[0019] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma hidroximetilglutaril-CoA sintase e uma hidroximetilglutaril-CoA liase codificam uma sequência de aminoácidos compreendendo ERG13 (ID SEQ NO: 283) e yngG (ID SEQ NO: 284 ) Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo Adc.Ca (ID SEQ NO: 225), Adc.Cbe (ID SEQ NO: 226), Adc (ID SEQ NO : 227), Adc (ID SEQ NO: 228), Adc (ID SEQ NO: 229) ou Adc.Pp (ID SEQ NO: 230). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo Adc.Pp (ID SEQ NO: 230).
[0020] A invenção proporciona um método de coprodução de 3-HP e/ou derivados dos mesmos e acetil-CoA e/ou derivados da mesma contatando com o micro-organismo recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 com uma fonte de carbono fermentável sob condições e por um período de tempo suficiente para produzir 3-HP ou derivados e acetil-CoA ou derivados. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é selecionada de açúcares, gliceróis, álcoois, ácidos orgânicos, alcanos, ácidos graxos, lignocelulose, proteínas, dióxido de carbono e monóxido de carbono. Em algumas modalidades, o micro- organismo recombinante produz ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP), acetil-CoA, 1-propanol e/ou 2-propanol, em um processo de produção aeróbico ou anaeróbico, de preferência, um processo anaeróbico.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0021] FIGURA 1 representa uma nova via combinada para produção de 3-HP e acetil-CoA com malonato semialdeído como um único intermediário comum. A derivação (offshoot) sombreada identifica a via usual para a produção de malonato semialdeído com malonil-CoA como um intermediário, que é substituído por um malonato semialdeído na via atual.
[0022] FIGURA 2 representa as duas rotas para geração de oxaloacetato em células de levedura, através de atividade do piruvato carboxilase (gene pyc) ou malato desidrogenase (gene mdh).
[0023] FIGURA 3 representa as vias de oxaloacetato para malonato de semialdeído. A via típica utiliza aspartato e beta-alanina como intermediários, e a nova via utiliza uma descarboxilase (oxdc) para produzir diretamente malonato de semialdeído a partir de oxaloacetato.
[0024] FIGURA 4 representa as duas vias para a produção de acetil-CoA, através de malonil-CoA como um intermediário (via padrão) e diretamente com malonato de semialdeído (nova via).
[0025] FIGURA 5 representa as vias para a produção de 1- propanol a partir de 3-HP por um processo de quatro etapas e por um processo de duas etapas.
[0026] FIGURA 6 representa as vias para a produção de acetona a partir de glicose e o excesso de NAD(P)H produzido nas vias.
[0027] FIGURA 7 representa as vias combinadas a partir de oxaloacetato com malonato de semialdeído para 1-propanol e acetona, e o estado redox neutro das vias combinadas.
[0028] FIGURA 8 representa uma via de glicose para malonato de semialdeído, incluindo, enzimas catalíticas e intermediários correspondentes de malonato semialdeído, identificando, particularmente, o oxaloacetato descarboxilase utilizado para produzir malonato de semialdeído a partir de oxaloacetato.
[0029] FIGURA 9 representa uma via de malonato semialdeído para acetona, incluindo, enzimas catalíticas e intermediários correspondentes de malonato semialdeído.
[0030] FIGURA 10 representa uma via de malonato semialdeído para propanol, incluindo, intermediários e cofatores correspondentes de malonato semialdeído.
[0031] FIGURA 11 representa uma via de malonato semialdeído para propanol, incluindo, enzimas catalíticas e intermediários correspondentes de malonato semialdeído.
[0032] FIGURA 12 representa uma via de malonato semialdeído para ácido acrílico, incluindo, intermediários e cofatores correspondentes de malonato semialdeído.
[0033] FIGURA 13 representa uma via e genótipo de levedura relacionando com os mutantes em relação ao Exemplo 2.
[0034] FIGURA 14 representa uma via da coprodução de 1- propanol e acetona que mostra um equilíbrio neutro redox utilizando enzimas relacionadas.
[0035] FIGURA 15 representa a estequiometria de coprodução de 1-propanol e acetona em condições aeróbicas.
[0036] FIGURA 16 representa a estequiometria de coprodução de 1-propanol e acetona em condições anaeróbicas.
[0037] FIGURA 17 representa a estequiometria de coprodução de 1-propanol e 2-propanol em condições aeróbicas.
[0038] FIGURA 18 representa a estequiometria de coprodução de 1-propanol e 2-propanol em condições anaeróbicas.
[0039] FIGURA 19 representa a estequiometria de coprodução de 2-propanol em condições aeróbicas.
[0040] FIGURA 20 representa o fluxo de trabalho de engenharia para projetar um organismo para produzir 3-HP a partir de glicose.
[0041] FIGURA 21 é um gráfico e valores que demonstram parâmetros cinéticos para a enzima N°. 1.
[0042] FIGURA 22 é um gráfico e valores que demonstram parâmetros cinéticos para a enzima N°. 6.
[0043] FIGURA 23 é um gráfico e valores que demonstram parâmetros cinéticos para a enzima N°. 7.
[0044] FIGURA 24 é um gráfico e valores que demonstram parâmetros cinéticos para a enzima N°. 8.
[0045] FIGURA 25 é um gráfico e valores que demonstram parâmetros cinéticos para a enzima N°. 9.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0046] A presente invenção é geralmente desenhada para métodos de utilização de micróbios geneticamente modificados para coproduzir derivados de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e derivados de acetil-CoA de malonato semialdeído como um único intermediário comum. A invenção proporciona adicionalmente micróbios modificados que coproduzem os derivados de 3-HP e acetil-CoA a partir de malonato semialdeído.
[0047] A coprodução de 3-HP e acetil-CoA e seus derivados a partir de malonato de semialdeído é nova, e a coprodução resulta em um conjunto de vias redox equilibradas que coproduzem os produtos sob alto rendimento.
[0048] Conforme utilizado neste relatório e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, referência a "uma enzima" inclui uma pluralidade de tais enzimas e referência ao "o micro-organismo" inclui referência a um ou mais micro-organismos e assim por diante.
[0049] Conforme utilizado neste relatório, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "apresenta", "apresentando", "contém", "contendo" ou qualquer outra variação dos mesmos, pretendem cobrir uma inclusão não exclusiva. Uma composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitada apenas a esses elementos, mas pode incluir outros elementos não listados expressamente ou inerentes a essa composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Adicionalmente, a menos que expressamente indicado ao contrário, "ou" refere-se a um "ou" inclusivo e não a um "ou" exclusivo.
[0050] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "sequência de nucleotídeos", "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são usados alternadamente. Estes se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Polinucleotídeos podem apresentar qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definidos a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, ARN mensageiro (ARNm), ARN de transferência (ARNt), ARN ribossômico (ARNr), ARN interferente curto (ARNsi), ARN em forma de gancho curto (ARNsh), micro-ARN (ARNmi), ribozimas, ADNc, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, ADN isolado de qualquer sequência, ARN isolado de qualquer sequência, sondas de ácidos nucleicos e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presente, modificações para a estrutura nucleotídica podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.
[0051] "Complementaridade" refere-se à capacidade de um ácido nucleico formar ligação(ões) de hidrogênio com outra sequência de ácido nucleico por Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradicionais. Uma complementaridade percentual indica a porcentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de bases Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 fora de 10 sendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares, respectivamente). "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico ligarão o hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácido nucleico. "Substancialmente complementar", conforme utilizado neste relatório, refere-se a um grau de complementaridade que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas. Identidade da sequência, tal como para fins de avaliação da complementaridade percentual, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento adequado, incluindo, mas não limitado ao algoritmo de Needleman-Wunsch (ver, por exemplo, o alinhador EMBOSS Needle disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, opcionalmente, com configurações padrão), o algoritmo BLAST (ver, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com configurações padrão) ou o algoritmo de Smith-Waterman (ver, por exemplo, o alinhador EMBOSS Water disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, opcionalmente com configurações padrão). O alinhamento ideal pode ser avaliado usando quaisquer parâmetros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo, parâmetros padrão.
[0052] Conforme utilizado neste relatório, "expressão" refere-se ao processo por qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de ADN (tal como para ARNm e ou outro transcrito de ARN) e/ou o processo pelo qual um ARNm transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente referidos como "produto genético". Se o polinucleotídeo for derivado de ADN genômico, a expressão poderá incluir junção do ARNm em uma célula eucariótica.
[0053] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados neste relatório alternadamente para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de marcação. Como utilizado neste relatório, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo, glicina e tanto os isômeros ópticos D ou L, quanto análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
[0054] Como utilizado neste relatório, o termo "cerca de" é usado como sinônimo do termo "aproximadamente". Ilustrativamente, o uso do termo "cerca de" em relação a uma quantidade indica que os valores estão ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1% a 10%.
[0055] O termo "cultura biologicamente pura" ou "cultura substancialmente pura" refere-se a uma cultura de uma espécie de micróbio descrita neste relatório que não contém outras espécies de micróbios em quantidades suficientes para interferir com a replicação da cultura ou ser detectada por técnicas microbiológicas normais.
[0056] Conforme utilizado neste relatório, uma "sequência de controle" refere-se a um operador, promotor, silenciador ou terminador.
[0057] Conforme utilizado neste relatório, "introduzido" refere-se à introdução por meios de biotecnologia moderna, e não uma introdução que ocorre naturalmente.
[0058] Conforme utilizado neste relatório, um "promotor constitutivo" é um promotor, que é ativo sob a maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Existem várias vantagens em utilizar promotores constitutivos em vetores de expressão usados em biotecnologia, tais como: alto nível de produção de proteínas usadas para selecionar células ou organismos transgênicos; alto nível de expressão de proteínas repórteres ou marcadores marcáveis, permitindo fáceis detecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcrição que faz parte de um sistema regulador de transcrição; produção de compostos que requerem atividade onipresente no organismo; e produção de compostos necessários durante todas as etapas do desenvolvimento.
[0059] Conforme utilizado neste relatório, um "promotor não constitutivo" é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células e/ou durante certos estágios de desenvolvimento. Por exemplo, promotores induzíveis e promotores sob controle de desenvolvimento são promotores não constitutivos. Conforme usado neste relatório, o promotor "induzível" ou "repressivo" é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, certos produtos químicos, a presença condições de luz, ácidas ou básicas, etc.
[0060] Conforme utilizado neste relatório, o termo "operacionalmente ligado" refere-se à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de uma é regulada pela outra. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de regular a expressão dessa sequência de codificação (isto é, que a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operacionalmente ligadas a sequências reguladoras em uma orientação de sentido ou antissentido. Em outro exemplo, as regiões de ARN complementares da invenção podem ser operacionalmente ligadas, direta ou indiretamente, 5’ ao ARNm alvo, ou 3' ao ARNm alvo, ou no ARNm alvo, ou uma primeira região complementar é 5’ e seu complemento é 3’ do ARNm alvo.
[0061] O termo "sequência de sinal" conforme utilizado neste relatório, refere-se a uma sequência de aminoácidos que direciona peptídeos e polipeptídeos para locais celulares ou para o ambiente extracelular. As sequências de sinais são tipicamente na porção de término N de um polipeptídeo e são tipicamente removidas enzimaticamente. Polipeptídeos que apresentam suas sequências de sinais são referidos como sendo de tamanho completo e/ou não processados. Polipeptídeos que tiveram suas sequências de sinais removidas são referidos como sendo maduros e/ou processados.
[0062] O termo "exógeno", conforme utilizado neste relatório, com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., refere-se a moléculas que não são normalmente ou naturalmente encontradas e/ou produzidas por uma determinada levedura, bactéria, organismo, micro-organismo ou célula na natureza. Por outro lado, o termo "endógeno" ou "nativo", conforme utilizado aqui, com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., refere-se a moléculas que são normalmente ou naturalmente encontradas e/ou produzidas por uma determinada levedura, bactéria, organismo, micro-organismo ou célula na natureza.
[0063] O termo "heterólogo", conforme utilizado neste relatório no contexto de uma célula hospedeira modificada, refere-se a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., em que pelo menos um dos seguintes é verdadeiro: (a) a(s) molécula(s) é/são estranhas ("exógenas") para (isto é, não são naturalmente encontrada(s)) na célula hospedeira; (b) a(s) molécula(s) é/são naturalmente encontrada(s) (por exemplo, é "endógena para") um determinado micro-organismo hospedeiro ou célula hospedeira,
mas é produzida em um local não natural ou em uma quantidade não natural na célula; e/ou (c) a(s) molécula(s) difere(m) em sequência de nucleotídeos ou aminoácidos da(s) sequência(s) de nucleotídeos ou aminoácidos endógenos, de tal modo que a molécula difere na sequência de nucleotídeos ou aminoácidos do nucleotídeo ou aminoácido endógeno como encontrado endogenamente seja produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior que a encontrada naturalmente) na célula.
[0064] O termo "homólogo", conforme utilizado neste relatório em relação a uma enzima ou gene original de uma primeira família ou espécie, refere-se a enzimas ou genes distintos de uma segunda família ou espécie, que são determinados por análises funcionais, estruturais ou genômicas que deve ser uma enzima ou gene da segunda família ou espécie que corresponde à enzima ou gene original da primeira família ou espécie. Os homólogos muito frequentemente têm semelhanças funcionais, estruturais ou genômicas. São conhecidas técnicas pelas quais os homólogos de uma enzima ou gene podem ser facilmente clonados usando sondas genéticas e RCP. A identidade de sequências clonadas como homólogos pode ser confirmada usando ensaios funcionais e/ou por mapeamento genômico dos genes.
[0065] Uma proteína apresenta "homologia" ou é "homóloga" a uma segunda proteína se a sequência de aminoácidos codificada por um gene apresenta uma sequência de aminoácidos similar àquela do segundo gene. Alternativamente, uma proteína apresenta homologia com uma segunda proteína se as duas proteínas tiverem sequências de aminoácidos "semelhantes". Desse modo, o termo "proteínas homólogas" pretende significar que as duas proteínas apresentam sequências de aminoácidos similares. Em certos casos, a homologia entre duas proteínas é indicativa de sua ancestralidade compartilhada,
relacionada por evolução.
Os termos "sequências homólogas" ou "homólogas" pensa-se, são acreditados ou conhecidos serem funcionalmente relacionados.
Uma relação funcional pode ser indicada em qualquer uma de várias maneiras, incluindo, mas não se limitando a: (a) grau de identidade da sequência e/ou (b) a mesma ou função biológica similar.
De preferência, ambos (a) e (b) são indicados.
O grau de identidade de sequência pode variar, mas em um aspecto, é de pelo menos 50% (quando se utiliza programas de alinhamento de sequência padrão conhecidos no estado da técnica), de pelo menos 60%, de pelo menos 65%, de pelo menos 70%, de pelo menos 75% , pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos 98,5% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%. A homologia pode ser determinada usando programas de software prontamente disponíveis no estado da técnica, tais como aqueles discutidos em Current Protocols in Molecular Biology (F.M.
Ausubel e outros, Eds., 1987) Suplemento 30, seção 7.718, Tabela 7.71. Alguns programas de alinhamento são MacVector (Oxford Molecular Ltd., Oxford, Reino Unido) e ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pensilvânia). Outros programas de alinhamento não limitativos incluem Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan), AlignX e Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma função biológica similar pode incluir, mas não se limita a: catalisar a mesma ou similar reação enzimática; apresentar a mesma ou similar seletividade de um substrato ou cofator; apresentar a mesma ou similar estabilidade; apresentar a mesma ou similar tolerância a várias condições de fermentação (temperatura, pH, etc.); e/ou apresentar a mesma ou similar tolerância a vários substratos metabólicos, produtos, subprodutos, intermediários, etc. O grau de similaridade na função biológica pode variar, mas em um aspecto, é de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos 98,5%, ou pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,8%, ou pelo menos 99,9%, de acordo com um ou mais ensaios conhecidos daquele versado no estado da técnica para determinar uma determinada função biológica.
[0066] Genes da presente invenção podem ser referenciados com seus nomes comuns, suas sequências de ácidos nucleicos e as sequências de aminoácidos que são traduzidas a partir das sequências de ácidos nucleicos. Usando as referências fornecidas em números de acesso para genes conhecidos, um profissional é capaz de determinar genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho é realizado utilizando sequências de consenso que podem ser determinadas através da realização de alinhamento de sequências com genes derivados de outros micro-organismos e projetar sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo.
[0067] Conforme utilizado neste relatório, "superexpressão" significa que a expressão de um gene ou de uma enzima é aumentada em comparação com o micro-organismo não modificado. O aumento da expressão de uma enzima é obtido elevando a expressão de um gene que codifica essa enzima. Quando um micro-organismo não modificado não expressou um determinado gene, a modificação do micro-organismo a fim de expressar esse gene é, desse modo, também considerada como sendo uma expressão de aumento desse gene e, portanto, como uma superexpressão. O aumento da expressão de um gene pode ser realizado por todas as técnicas conhecidas daquele versado no estado da técnica. A este respeito, pode-se citar notavelmente a implementação de um forte promotor a montante do ácido nucleico que se pretende superexpressar ou a introdução de uma pluralidade de cópias desse ácido nucleico entre um promotor, especialmente, um forte promotor, e um terminador.
[0068] Conforme utilizado neste relatório, "promotor induzível" significa um promotor cuja atividade é induzida, isto é, aumentada (1) na presença de um ou mais metabólito(s) específico(s) - quanto maior a concentração de metabólitos no meio, mais forte é a atividade promotora; ou (2) na presença de uma baixa concentração, ou na ausência de um ou mais metabólitos. Esses metabólitos são diferentes daqueles cuja presença crescente induz a atividade do promotor. Quanto menor a concentração de metabólitos no meio, mais forte a atividade promotora.
[0069] Conforme utilizado neste relatório, "atividade" e "função" de enzima/proteína são usadas alternadamente e designam, no contexto da invenção, a capacidade de (1) uma enzima catalisar uma reação desejada ou (2) uma proteína agir de uma certa maneira.
[0070] Conforme utilizado neste relatório, "condições aeróbicas" se referem a concentrações de oxigênio no meio de cultura que são suficientes para um micro-organismo aeróbico ou anaeróbico facultativo para usar oxigênio como um aceitador de elétrons terminais.
[0071] Conforme utilizado neste relatório "condições anaeróbicas"
se referem a condições de cultura ou crescimento em relação à concentração de oxigênio, que pretende significar que a quantidade de oxigênio é menor que cerca de 0% de saturação de oxigênio dissolvido em meio líquido. O termo também pretende incluir câmaras seladas de meios líquidos ou sólidos mantidas com uma atmosfera inferior a cerca de 0% de oxigênio.
[0072] Conforme utilizado neste relatório, "condições microaeróbicas" referem-se às concentrações de oxigênio no meio de cultura em que a concentração de oxigênio é menor que no ar sob temperatura e pressão padrão, isto é, uma concentração de oxigênio de até ~ 6% do total de gás presente.
[0073] O termo "variante" refere-se a qualquer polipeptídeo ou enzima descrito neste relatório. Uma variante também abrange um ou mais componentes de um multímero, multímeros que compreendem um componente individual, multímeros compreendendo múltiplos de um componente individual (por exemplo, multímeros de uma molécula de referência), um produto de degradação química e um produto de degradação biológica. Em particular, aspecto não limitativo, uma enzima pode ser uma "variante" em relação a uma enzima de referência em virtude de alteração (alterações) em qualquer parte da sequência polipeptídica que codifica a enzima de referência. Uma variante de uma enzima de referência pode apresentar atividade enzimática de pelo menos 10%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 105%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130% ou mais em um ensaio padrão usado para medir atividade enzimática de uma preparação da enzima de referência. Em alguns aspectos, uma variante pode também se referir a polipeptídeos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos
93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para as enzimas não processadas ou de comprimento total da presente invenção. Em alguns aspectos, uma variante pode também se referir a polipeptídeos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para as enzimas maduras ou processadas da presente invenção.
[0074] Conforme utilizados neste relatório, os termos "micro- organismo" ou "micróbio" devem ser considerados de maneira ampla. Esses termos, usados alternadamente, incluem, mas não se limitam a, os dois domínios procarióticos, bactérias e arquéias (Archaea).
[0075] Conforme utilizados neste relatório, "isolar", "isolado", "micróbio isolado" e termos semelhantes, pretendem significar que um ou mais micro-organismos foram separados de pelo menos um dos materiais ao qual é associado a um ambiente específico (por exemplo, meios, água, câmara de reação, etc.). Desse modo, um "micróbio isolado" não existe em seu ambiente de ocorrência natural; ao contrário, é através das várias técnicas aqui descritas que o micróbio foi removido de sua configuração natural e colocado em um estado de existência que não ocorre naturalmente. Desse modo, a cepa isolada ou micróbio isolado pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa). Em aspectos, o micróbio isolado pode estar em associação com um veículo aceitável, o qual pode ser um veículo comercial ou industrialmente aceitável.
[0076] Em certos aspectos da invenção, os micróbios isolados existem como "culturas isoladas e biologicamente puras". Será avaliado por aquele versado no estado da técnica que uma cultura isolada e biologicamente pura de um micróbio particular indica que essa cultura é substancialmente livre de outros organismos vivos e contém apenas o micróbio individual em questão. A cultura pode conter concentrações variáveis desse micróbio. A presente invenção observa que micróbios isolados e biologicamente puros geralmente "diferem necessariamente de materiais menos puros ou impuros". Ver, por exemplo, In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970) (discutindo prostaglandinas purificadas), ver também, In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979) (discutindo micróbios purificados), ver também, Parke- Davis & Co v. H.K. Mulford & Co., 189 F. 95 (S.D.N.Y. 1911) (Learned Hand discutindo adrenalina purificada), relatado em parte, revisado em parte, 196 F.496 (2ª. Cir. 1912), cada um dos quais são aqui incorporados como referência neste relatório. Além disso, em alguns aspectos, a invenção proporciona certas medidas quantitativas da concentração, ou limitações de pureza, que devem ser encontradas em uma cultura microbiana isolada e biologicamente pura. A presença desses valores de pureza, em certos aspectos, é um atributo adicional que distingue os micróbios atualmente descritos daqueles que existem em um estado natural. Ver, por exemplo, Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4ª. Cir. 1958) (discutindo limitações de pureza para vitamina B12 produzida por micróbios), aqui incorporado como referência.
[0077] Micróbios da presente invenção podem incluir esporos e/ou células vegetativas. Em alguns aspectos, os micróbios da presente invenção incluem micróbios em um estado viável, mas não cultivável (VBNC). Conforme utilizado neste relatório, "esporo" ou "esporos" referem-se às estruturas produzidas por bactérias e fungos que são adaptados para sobrevivência e dispersão. Os esporos são geralmente caracterizados como estruturas dormentes; entretanto, os esporos são capazes de se diferenciar através do processo de germinação. Germinação é a diferenciação de esporos em células vegetativas que são capazes de atividade metabólica, crescimento e reprodução. A germinação de um único esporo resulta em uma única célula vegetativa fúngica ou bacteriana. Os esporos de fungos são unidades de reprodução assexuada e, em alguns casos, são estruturas necessárias nos ciclos de vida dos fungos. Os esporos bacterianos são estruturas para condições de sobrevivência que normalmente podem não ser conducentes à sobrevivência ou crescimento de células vegetativas.
[0078] Conforme utilizado neste relatório, "composição microbiana" refere-se a uma composição compreendendo um ou mais micróbios da presente invenção.
[0079] Como usado neste relatório, "veículo", "veículo aceitável", "veículo comercialmente aceitável" ou "veículo industrial aceitável" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o micróbio pode ser administrado, armazenado ou transferido, o que não afeta prejudicialmente o micróbio.
[0080] O termo "potencial de rendimento", conforme aqui utilizado, refere-se ao rendimento de um produto a partir de uma via biossintética. Em um aspecto, o potencial de rendimento pode ser expresso como uma percentagem em peso do produto final por peso do composto de partida.
[0081] O termo "rendimento máximo termodinâmico", conforme utilizado neste relatório, refere-se ao rendimento máximo de um produto obtido a partir da fermentação de uma determinada matéria- prima, tal como glicose, com base no valor energético do produto em comparação com a matéria-prima. Em uma fermentação normal, sem o uso de fontes de energia adicionais, tais como luz, gás hidrogênio ou metano ou eletricidade, por exemplo, o produto não pode conter mais energia do que a matéria-prima. O rendimento máximo termodinâmico significa um rendimento do produto no qual toda a energia e massa da matéria-prima é convertida no produto. Esse rendimento pode ser calculado e é independente de uma via específica. Se um caminho específico em direção a um produto tiver um rendimento menor que o rendimento máximo termodinâmico, então este perderá massa e mais provavelmente poderá ser aprimorado ou substituído por um caminho mais eficiente em direção ao produto.
[0082] O termo "redox balanceado" refere-se a um conjunto de reações que, juntas, produzem tantos cofatores redox quanto consomem. A concepção de vias metabólicas e a engenharia de um organismo de tal modo que os cofatores redox sejam equilibrados ou quase equilibrados geralmente resultam em uma produção mais eficiente e com maior rendimento dos compostos desejados. As reações redox sempre ocorrem juntas como duas meias-reações acontecendo simultaneamente, uma sendo uma reação de oxidação e a outra uma reação de redução. Em processos redox, o redutor transfere elétrons para o oxidante. Desse modo, na reação, o redutor ou agente redutor perde elétrons e é oxidado, e o oxidante ou agente oxidante ganha elétrons e é reduzido. Em um aspecto, as reações redox ocorrem em um sistema biológico. A energia biológica é frequentemente armazenada e liberada por meio de reações redox. Fotossíntese envolve a redução de dióxido de carbono em açúcares e a oxidação de água em oxigênio molecular. A reação reversa, respiração, oxida os açúcares para produzir dióxido de carbono e água. Como etapas intermediárias, os compostos de carbono reduzido são usados para reduzir o dinucleotídeo nicotinamida adenina (NAD+), o que contribui para a criação de um gradiente de prótons, que impulsiona a síntese de adenosina trifosfato (ATP) e é mantido pela redução de oxigênio. O termo estado redox é frequentemente usado para descrever o equilíbrio de GSH/GSSG, NAD+/NADH e NADP+/NADPH em um sistema biológico, tal como uma célula ou órgão. O estado redox é refletido no equilíbrio de vários conjuntos de metabólitos (por exemplo, lactato e piruvato, beta-hidroxibutirato e acetoacetato), cuja interconversão depende dessas proporções. Um estado redox anormal pode se desenvolver em uma variedade de situações deletérias, tais como hipóxia, choque e sepse.
[0083] Conforme utilizado neste relatório, o termo "produtividade" refere-se à quantidade total de bioproduto (os produtos descritos neste relatório) produzidos por hora.
[0084] Conforme utilizados neste relatório, "malonato de semialdeído", "semialdeído malônico" e "ácido 3-oxopropanóico" são utilizados alternadamente para descrever a molécula C3H4O3 da presente invenção.
[0085] Conforme utilizado neste relatório, "atividade acentuada" de uma enzima designa a uma atividade catalítica específica elevada da enzima, e/ou uma quantidade/disponibilidade elevada da enzima na célula, obtida, por exemplo, por meio de superexpressão do gene que codifica a enzima.
[0086] O presente pedido refere-se geralmente aos métodos de utilização de micróbios modificados por coprodução de ácido 3- hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA e/ou derivados dos mesmos; e adicionalmente relacionados aos micróbios modificados, intrinsecamente.
[0087] Em alguns aspectos, a presente invenção é desenhada para um microrganismo recombinante capaz de coproduzir ácido 3- hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA e/ou derivados dos mesmos, a partir de uma matéria-prima compreendendo uma ou mais fontes de carbono, em que o microrganismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase que catalisa a produção de 3-HP a partir de malonato semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica o (i) malonato de semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato semialdeído e/ou (ii) malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato semialdeído em malonil-CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA e/ou (iii) malonil-CoA sintetase que catalisa a conversão de oxaloacetato em malonil -CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato de semialdeído.
[0088] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é capaz de produzir 1-propanol. Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma propionil-CoA sintase que catalisa a produção de propionil-CoA a partir de 3-HP; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/transferase, 3-hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil-CoA redutase que catalisa a produção de propionil-CoA a partir de 3-HP; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um álcool/aldeído desidrogenase que catalisa a produção de 1- propanol a partir de propionil-CoA; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um aldeído desidrogenase (acetilante) que catalisa a produção de propionaldeído a partir de propionil-CoA e álcool desidrogenase que catalisa a produção de 1-propanol a partir de propionaldeído.
[0089] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é capaz de produzir acetona. Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA ; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil- CoA a partir de malonil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetil-CoA; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil- CoA e (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
[0090] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante catalisa o malonato de semialdeído para a produção tanto de 3-HP quanto de acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos. Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante compreende uma descarboxilase capaz de agir no oxaloacetato para produzir malonato de semialdeído. Em alguns aspectos, os derivados de 3-HP são selecionados do grupo que consiste de: ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno. Em alguns aspectos, os derivados de acetil- CoA são selecionados do grupo que consiste de: acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno.
[0091] Em alguns aspectos, pelo menos uma porção de excesso de NAD(P)H produzido pelo micro-organismo recombinante na produção de acetil-CoA é utilizada como uma fonte de equivalentes redutores na produção de 3-HP.
[0092] Em alguns aspectos, o micro-organismo é selecionado de uma bactéria, fungo ou levedura. Em alguns aspectos, o micro- organismo recombinante é uma levedura. Em alguns aspectos, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em alguns aspectos, a levedura é capaz de crescimento aeróbico e anaeróbico.
[0093] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é derivado de um micro-organismo parental selecionado do grupo que consiste de: Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Candida sp., Candida Krusei, Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis e Terrisporobacter glycolicus.
[0094] Em alguns aspectos, a invenção é desenhada para um método de produção de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos, o método compreendendo a cultura do micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo uma matéria-prima compreendendo uma fonte de carbono até que o ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA e/ou seus derivados sejam produzidos.
[0095] Em alguns aspectos, a invenção é desenhada para um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA e/ou derivados dos mesmos, a partir de uma matéria-prima compreendendo um ou mais fontes de carbono, o método compreendendo introdução e/ou superexpressão no micro-organismo recombinante de um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase que catalisa a produção de 3-HP a partir de malonato semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica a (i) malonato de semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato de semialdeído e/ou (ii) malonil-CoA redutase e/ou ácido 2- ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato de semialdeído em malonil-CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA, e/ou (iii) malonil-CoA sintetase que catalisa a conversão de oxaloacetato em malonil-CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato de semialdeído.
[0096] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é capaz de produzir 1-propanol.
[0097] Em alguns aspectos, o método compreende adicionalmente introdução e/ou superexpressão no micro-organismo recombinante de um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma propionil-CoA sintase que catalisa a produção de propionil-CoA a partir de 3-HP; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/transferase, 3- hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil-CoA redutase que catalisa a produção de propionil-CoA a partir de 3-HP; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma álcool/aldeído desidrogenase que catalisa a produção de 1- propanol a partir de propionil-CoA; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um aldeído desidrogenase (acetilante) que catalisa a produção de propionaldeído a partir de propionil-CoA e álcool desidrogenase que catalisa a produção de 1-propanol a partir de propionaldeído.
Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é capaz de produzir acetona.
Em alguns aspectos, o método compreende adicionalmente introdução e/ou superexpressão no micro-organismo recombinante de um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil- CoA a partir de acetil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de malonil- CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetil-CoA; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA e (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e
(e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
[0098] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante catalisa o malonato de semialdeído para a produção tanto de 3-HP quanto de acetil-CoA e/ou derivados dos mesmos. Em alguns aspectos, os derivados de 3-HP são selecionados do grupo que consiste de: ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno. Em alguns aspectos, os derivados de acetil-CoA são selecionados do grupo que consiste de: acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno. Em alguns aspectos, pelo menos uma porção do excesso de NAD(P)H produzido pelo micro-organismo recombinante na produção de acetil- CoA é utilizada como fonte de equivalentes redutores na produção de 3-HP. Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante compreende uma descarboxilase capaz de agir no oxaloacetato para produzir malonato de semialdeído.
[0099] Em alguns aspectos, o micro-organismo é selecionado de uma bactéria, fungo ou levedura. Em alguns aspectos, o micro- organismo recombinante é uma levedura. Em alguns aspectos, a levedura é capaz de crescimento aeróbico e anaeróbico. Em alguns aspectos, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
[00100] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é derivado de um micro-organismo parental selecionado do grupo que consite de: Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Candida sp., Candida krusei, Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis, e Terrisporobacter glycolicus. Geração de Populações Microbianas Modificação Genética
[00101] A modificação genética introduzida em um ou mais micróbios da presente invenção pode alterar ou abolir uma sequência reguladora de um gene alvo. Em alguns aspectos, a modificação genética introduzida em um ou mais micróbios da presente invenção pode introduzir uma nova característica ou fenótipo em um ou mais micróbios. Uma ou mais sequências reguladoras também podem ser inseridas, incluindo, sequências reguladoras heterólogas e sequências reguladoras encontradas em um genoma de um animal, planta, fungo, levedura, bactéria ou vírus correspondente ao micróbio no qual a variação genética é introduzida. Além disso, as sequências reguladoras podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura microbiana. A variação genética pode ser uma variação genética predeterminada que é introduzida especificamente em um sítio alvo. Em alguns aspectos, a variação genética é uma sequência de ácido nucleico que é introduzida em um ou mais cromossomos microbianos. Em alguns aspectos, a variação genética é uma sequência de ácido nucleico que é introduzida em uma ou mais sequências de ácido nucleico extracromossômico. A variação genética pode ser uma mutação aleatória dentro do sítio alvo. A variação genética pode ser uma inserção ou exclusão de um ou mais nucleotídeos. Em alguns casos, uma pluralidade de variações genéticas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais) são introduzidas em uma ou mais das bactérias isoladas. A pluralidade de variações genéticas pode ser qualquer um dos tipos acima, tipos iguais ou diferentes, e em qualquer combinação. Em alguns casos, uma pluralidade de variações genéticas diferentes é introduzida em série, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma segunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento, e assim por diante, de modo a acumular uma pluralidade de modificações desejadas nos micróbios.
[00102] Em geral, o termo "variação genética" refere-se a qualquer alteração introduzida em uma sequência polinucleotídica em relação a um polinucleotídeo de referência, tal como um genoma de referência ou uma porção do mesmo, ou gene ou porção de referência deste. Uma variação genética pode ser referida como "mutação", e uma sequência ou organismo compreendendo uma variação genética pode ser referida como uma "variante genética" ou um "mutante". As variações genéticas podem apresentar vários efeitos, tal como o aumento ou diminuição de alguma atividade biológica, incluindo, expressão gênica, metabolismo e sinalização celular. Variações genéticas podem ser introduzidas especificamente em um sítio alvo ou introduzidas aleatoriamente. Uma variedade de ferramentas e métodos moleculares está disponível para a introdução de variação genética. Por exemplo, a variação genética pode ser introduzida via mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese direcionada a oligonucleotídeo, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, recombinação, recombinação mediada por lambda vermelho, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações dos mesmos. Os métodos químicos de introdução de variação genética incluem exposição do ADN a um mutagênico químico, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosouréia (ENU), N-metil-N-nitro-N′-nitrosoguanidina, N-óxido de 4-nitroquinolina, sulfato de dietila, benzopireno, ciclofosfamida bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda de nitrogênio, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, cloridrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12-dimetilbenz(a)antraceno, clorambucila, hexametilfosforamida, bisulfano e similares.
Agentes indutores de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação γ, raios X e bombardeio rápido de nêutrons.
A variação genética pode também ser introduzida em um ácido nucleico usando, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta.
A inserção aleatória ou direcionada de um elemento de ADN móvel, por exemplo, um elemento transponível, é outro método adequado para gerar variação genética.
Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico durante amplificação em um sistema in vitro livre de células, por exemplo, usando uma técnica de reação em cadeia da polimerase (RCP), tal como reação em cadeia da polimerase (RCP) propensa a erros.
Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico in vitro usando técnicas de embaralhamento de ADN (por exemplo, embaralhamento de exóns, troca de domínio e similares). Variações genéticas podem também ser introduzidas em um ácido nucleico como resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de ADN em uma célula, por exemplo, se espera que a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de ADN mutante deve gerar uma alta frequência de mutações (isto é, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10.000 genes) no genoma da célula.
Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo do
ADN incluem, mas não se limitam aos mesmos, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U e seus homólogos em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 e similares). Descrições de exemplos de vários métodos para introdução de variações genéticas são proporcionadas em, por exemplo, Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang e outros (1993) PCR Methods Appl. 2(3):210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; e Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.033.861 e 6.773.900.
[00103] Em alguns aspectos, os micróbios recombinantes da presente invenção podem compreender qualquer uma ou mais das listagens de sequência de ácidos nucleicos descritos. Em alguns aspectos, os micróbios recombinantes da presente invenção podem compreender qualquer uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que compartilhem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma ou mais das listagens de sequência de ácidos nucleicos descritos. Em alguns aspectos, os micróbios recombinantes da presente invenção podem compreender qualquer uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que compartilhem pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com qualquer uma ou mais das listagens de sequências de ácidos nucleicos descritos.
[00104] Em alguns aspectos, os micróbios recombinantes da presente invenção podem compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos da presente invenção. Em alguns aspectos, os micróbios recombinantes da presente invenção podem compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos que compartilham pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma ou mais das listagens de sequências de aminoácidos descritos. Em alguns aspectos, os micróbios recombinantes da presente invenção podem compreender uma ou mais sequências de ácidos nuclé0icos que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos que compartilham pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com qualquer uma ou mais das listagens de sequências de aminoácidos descritos.
[00105] Variações genéticas introduzidas nos micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intragenéricas, intergenéricas, sintéticas, evoluídas, reorganizadas ou SNPs. Os sistemas CRISPR/Cas9 (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas) /associados ao CRISPR (Cas) podem ser usados para introduzir as mutações desejadas. O CRISPR/Cas9 proporciona bactérias e arquéias com imunidade adaptativa contra vírus e plasmídeos utilizando ARNs de CRISPR (ARNscr) para orientar o silenciamento de ácidos nucleicos invasores. A proteína Cas9 (ou equivalente funcional e/ou variante da mesma, ou seja, proteína semelhante a Cas9) contém naturalmente atividade de endonuclease de ADN que depende da associação da proteína com duas moléculas de ARN que ocorrem naturalmente ou sintéticas denominadas ARNcr e ARNtracr (também denominados ARNs guias). Em alguns casos, as duas moléculas são ligadas covalentemente para formar uma única molécula (também denominada ARN guia único
("ARNsg"). Desse modo, a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 associa-se a um ARN que direciona ADN (cujo termo abrange tanto a configuração de ARN guia de duas moléculas quanto a configuração de ARN guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 e guia a proteína para uma sequência alvo de ácido nucleico. Se a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 retêm sua função enzimática natural, esta clivará o ADN alvo para criar uma ruptura de fita dupla, o que pode levar à alteração do genoma (isto é: edição: exclusão, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição etc.), alterando assim a expressão gênica. Algumas variantes de Cas9 (cujas variantes são abrangidas pelo termo semelhante a Cas9) foram alteradas de tal modo que apresentem uma atividade de clivagem de ADN reduzida (em alguns casos, clivam uma única fita em vez de ambas as fitas do ADN alvo, enquanto em outros casos, têm severamente reduzido nenhuma atividade de clivagem de ADN). Descrições exemplares adicionais de sistemas CRISPR para introdução de variação genética podem ser encontradas em, por exemplo, US879596 e Di Carlo e outros (2013. Nucl. Acids Res., 7(41):4336-4343).
[00106] Mutagênese direcionada a oligonucleotídeos, também denominada mutagênese direcionada a sítios, utiliza tipicamente um iniciador de ADN sintético. Esse iniciador sintético contém a mutação desejada e é complementar ao ADN modelo em torno do sítio de mutação, de modo que possa hibridar com o ADN no gene de interesse. A mutação pode ser uma única alteração de base (uma mutação pontual), múltiplas alterações de base, exclusão ou inserção ou uma combinação destas. O iniciador de fita simples é em seguida estendido usando uma polimerase de ADN, que copia o restante do gene. O gene assim copiado contém o sítio mutante, e pode então ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado.
Finalmente, os mutantes podem ser selecionados por sequenciamento de ADN para verificar se estes contêm a mutação desejada.
[00107] Variações genéticas podem ser introduzidas usando RCP propensas a erros. Nessa técnica, o gene de interesse é amplificado usando uma polimerase de ADN sob condições que são deficientes na fidelidade de replicação de sequência. O resultado é que os produtos de amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o(s) produto(s) resultante(s) da reação contém(êm) uma ou mais alterações na sequência quando comparado com a molécula modelo, os produtos resultantes são mutagenizados em comparação com o modelo. Outro meio de introduzir mutações aleatórias é expor as células a um mutagênico químico, tal como nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat. Res., junho de 1975; 28(3):323-30), e o vetor que contém o gene é então isolado do hospedeiro.
[00108] Mutagênese de recombinação homóloga envolve recombinação entre um fragmento de ADN exógeno e a sequência de polinucleotídeo direcionado. Após ocorrer uma ruptura de fita dupla, as seções de ADN em torno das extremidades 5’ da ruptura são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão da fita que se segue, uma extremidade 3’ pendente da molécula de ADN rompida em seguida "invade" uma molécula de ADN similar ou idêntica que não está rompida. O método pode ser usado para excluir um gene, remover exóns, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagênese de recombinação homóloga pode ser permanente ou condicional. Tipicamente, também é proporcionado um modelo de recombinação. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado, ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em alguns aspectos, um modelo de recombinação é projetado para servir como um modelo na recombinação homóloga, tal como dentro ou próximo a uma sequência alvo cortada ou clivada por uma nuclease específica ao sítio. Um polinucleotídeo modelo pode ser de qualquer comprimento adequado, tal como cerca de, ou mais aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo modelo é complementar a uma porção de um polinucleotídeo compreendendo a sequência alvo. Quando perfeitamente alinhado, um polinucleotídeo modelo pode se sobrepor a um ou mais nucleotídeos de uma sequência alvo (por exemplo, aproximadamente ou mais de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em alguns aspectos, quando uma sequência modelo e um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo estão otimamente alinhadas, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo modelo situa-se dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500,
1.000, 5.000, 10.000 ou mais nucleotídeos da sequência alvo. Exemplos não limitativos de nucleases direcionadas ao sítio úteis em métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedo de zinco, nucleases de CRISPR, nucleases de TALE e meganuclease. Para uma descrição adicional da utilização de tais nucleases, ver, por exemplo, US8795965 e US20140301990.
[00109] Introdução de variação genética pode ser um processo incompleto, de tal modo que algumas bactérias em uma população de bactérias tratadas carregam uma mutação desejada, enquanto outras não. Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção para enriquecer as bactérias que transportam uma variação genética desejada. Tradicionalmente, a seleção de variantes genéticas bem- sucedidas envolveu a seleção a favor ou contra alguma funcionalidade conferida ou abolida pela variação genética, tal como no caso de inserção do gene de resistência a antibióticos ou abolição de uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. Também é possível aplicar uma pressão de seleção com base em uma própria sequência polinucleotídica, de tal modo que apenas seja necessária a introdução de uma variação genética desejada (por exemplo, sem também a necessidade de um marcador selecionável). Neste caso, a pressão de seleção pode compreender genomas de clivagem que faltam a variação genética introduzida em um sítio alvo, de tal modo que a seleção seja efetivamente direcionada contra a sequência de referência na qual a variação genética é buscada ser introduzida. Tipicamente, a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do sítio alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10 ou menos nucleotídeos do sítio alvo, incluindo, clivagem em ou no sítio alvo). A clivagem pode ser direcionada por uma nuclease específica ao sítio selecionada do grupo que consiste de uma nuclease do dedo de zinco, uma nuclease de CRISPR, uma nuclease de TALE (TALEN) ou uma meganuclease. Tal processo é similar aos processos para acentuar a recombinação homóloga em um sítio alvo, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é proporcionado. Como resultado, as bactérias faltando a variação genética desejada têm maior probabilidade de sofrer clivagens que, deixadas sem reparo, resultam em morte celular. As bactérias que sobrevivem à seleção podem então ser isoladas para avaliar a atribuição de uma característica aperfeiçoada.
[00110] Uma nuclease de CRISPR pode ser usada como nuclease específica ao sítio para direcionar clivagem para um sítio alvo. Uma seleção aperfeiçoada de micróbios mutados pode ser obtida usando Cas9 para matar células não mutadas. Os micróbios podem então ser isolados novamente a partir dos tecidos. Os sistemas nuclease de CRISPR empregados para seleção contra não variantes podem empregar elementos similares àqueles descritos acima com relação à introdução de variação genética, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga seja proporcionado. Clivagem direcionada ao sítio alvo acentua assim morte de células afetadas.
[00111] Outras opções para induzir especificamente a clivagem em um sítio alvo são disponíveis, tais como nucleases do dedo de zinco, sistemas nuclease de TALE (TALEN) e meganuclease. As nucleases do dedo de zinco (ZFNs) são endonucleases de ADN artificiais geradas por meio de fusão de um domínio de ligação de ADN do dedo de zinco a um domínio de clivagem de ADN. As nucleases do dedo de zinco (ZFNs) podem ser projetadas para direcionar sequências de ADN desejadas e isso permite que as nucleases de dedos de zinco clivem sequências alvo exclusivas. Quando introduzidas em uma célula, as ZFNs podem ser usadas para editar ADN alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula), induzindo rupturas de fita dupla. As nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) são endonucleases artificiais de ADN geradas pela fusão de um domínio de ligação ao ADN efetor do tipo TAL (semelhante ao ativador de transcrição) a um domínio de clivagem do ADN. As TALENS podem ser rapidamente projetadas para ligar praticamente qualquer sequência de ADN desejada e, quando introduzidas em uma célula, as TALENs podem ser usadas para editar o ADN alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula), induzindo rupturas de fita dupla. Meganucleases (endonuclease sinalizadora (homing)) são endodesoxirribonucleases caracterizadas por um grande sítio de reconhecimento (sequências de ADN de fita dupla de 12 a 40 pares de bases. As meganucleases podem ser usadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de maneira altamente direcionada. Ao modificar sua sequência de reconhecimento através de proteína elaborada por engenharia, a sequência alvo pode ser alterada. As meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, seja bacteriano, vegetal ou animal, e são geralmente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG, a família GIY- YIG, a família de caixas de cistos His e a família HNH. Endonucleases sinalizadoras (homing) exemplares incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI- Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I- TevII e I-TevIII.
[00112] Em alguns aspectos, métodos de acentuar expressão de genes endógenos ou exógenos é introduzir uma ou mais cópias suplementares do gene em um cromossomo ou plasmídeo. Em alguns aspectos, outra maneira de acentuar a expressão de genes endógenos ou exógenos é substituir o promotor endógeno de um gene com, ou usar um promotor exógeno de um gene, um promotor mais forte. Em alguns aspectos, os promotores são homólogos ou heterólogos.
[00113] Em alguns aspectos, os micróbios da presente invenção são modificados de tal modo que compreendem um ou mais marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células microbianas transformadas. Em alguns aspectos, os marcadores selecionáveis são introduzidos via constructos de ADN compreendendo os genes, polinucleotídeos, oligonucleotídeos e/ou vias da presente invenção.
[00114] Em alguns aspectos, o marcador selecionável é um marcador de resistência a antibióticos. Exemplos ilustrativos de marcadores de resistência a antibióticos incluem, mas não se limitam aos mesmos, os produtos dos genes NAT1, AURl-C, HPH, DSDA, KAN<R> e SH BLE. O produto do gene NAT 1 a partir de S. noursei confere resistência à nourseotricina; o produto do gene AURl-C de Saccharomyces cerevisiae confere resistência à auerobasidina A (AbA); o produto do gene HPH de Klebsiella pneumonia confere resistência à higromicina B; o produto do gene DSDA de Escherichia coli permite que as células cresçam em placas com D-serina como única fonte de nitrogênio; o gene KAN<R> do transposon Tn903 confere resistência a G418; e o produto do gene SH BLE de Streptoalloteichus hindustanus confere resistência a Zeocina (bleomicina). Em alguns aspectos, o marcador de resistência aos antibióticos é excluído após a célula microbiana geneticamente modificada da presente invenção ser isolada.
[00115] Em alguns aspectos, o marcador selecionável resgata uma auxotrofia (por exemplo, uma auxotrofia nutricional) na célula microbiana geneticamente modificada. Em tais aspectos, uma célula microbiana progenitora compreende uma interrupção funcional em um ou mais produtos gênicos que funcionam em uma via biossintética de aminoácidos ou nucleotídeos, tais como, por exemplo, os produtos gênicos HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 e URA3 em leveduras, que tornam a célula microbiana original incapaz de crescer em meios sem suplementação com um ou mais nutrientes (fenótipo auxotrófico). O fenótipo auxotrófico pode então ser resgatado transformando a célula microbiana original com uma integração cromossômica que codifica uma cópia funcional do produto genético interrompido (NB: a cópia funcional do gene pode se originar de espécies próximas, tal como Kluveromyces, Candida, etc.), e a célula microbiana geneticamente modificada gerada pode ser selecionada com base na perda do fenótipo auxotrófico da célula microbiana parental.
[00116] Quando um gene de um tipo diferente de micro-organismo é introduzido em uma célula (gene de levedura para bactérias, gene bacteriano para levedura, gene viral para levedura, etc.), o gene pode ser transcodificado (otimizado por códon) de tal modo que os genes sejam sintetizados com um uso ótimo de códons para expressão no hospedeiro ao qual o gene está sendo introduzido. Em alguns aspectos, a sequência nucleotídica (e não a sequência de aminoácidos) de alguns genes pode ser transcodificada para minimizar recombinação com uma cópia endógena do mesmo gene ou homólogo. Em alguns aspectos, o gene pode se tornar induzível por exclusão da cópia endógena do gene, se necessário, e colocando uma nova cópia do gene sob o controle de um promotor induzível.
[00117] Em alguns aspectos, a invenção é desenhada para uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato semialdeído, ou um de seus sais, e pode ser expressa em um micróbio usando tipos de maneiras não mutuamente exclusivas: (1) superexpressão, isto é, uma ou uma pluralidade de cópias é/são introduzidas no micro- organismo; e/ou (2) o ácido nucleico, pelo menos um é colocado sob o controle de um promotor forte ou induzível. Promotores
[00118] Em alguns aspectos, vários promotores podem ser utilizados para a expressão desejada das sequências de codificação de interesse, os quais incluem (i) promotores fortes constitutivos (às vezes referidos como promotores fortes) e (ii) promotores induzíveis.
[00119] Em alguns aspectos, os promotores são promotores de leveduras. Uma lista de promotores de leveduras com suas atividades relativas em diferentes meios pode ser encontrada em Keren e outros, (2013. Molecular Systems Biology, 9:701). Promotores que permitem a superexpressão constitutiva de um determinado gene podem ser encontrados em Velculescu e outros (1997. Cell, 88:243-251).
[00120] Em alguns aspectos, promotores fortes podem ser selecionados dos seguintes: pTDH3 (ID SEQ NO: 13), pENO2 (ID SEQ NO: 14), pTEF KI (ID SEQ NO: 15), pTEF3 (ID SEQ NO: 16), pTEF1 (ID SEQ NO: 17), pADH1 (ID SEQ NO: 18), pGMP1 (ID SEQ NO: 19), pFBA1 (ID SEQ NO: 20), pPDC1 (ID SEQ NO: 21), pCCW12 (ID SEQ NO: 22) e pGK1 (ID SEQ NO: 23).
[00121] Em alguns aspectos, o promotor forte de acordo com a invenção é, independentemente, selecionado do grupo que consiste de: pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 e pGK1.
[00122] Conforme descritos neste relatório, promotores induzíveis são promotores cuja atividade é controlada pela presença ou ausência de fatores bióticos ou abióticos, e também pela quantidade desse fator. Consequentemente, sua atividade será induzida e, portanto, aumentada quando a quantidade de um determinado fator aumenta ou é elevada.
[00123] Em alguns aspectos, o aumento da quantidade de metionina em um meio de cultura de uma levedura recombinante compreendendo um promotor pSAM4 induzirá e, desse modo, aumentará a transcrição do gene sob o controle desse promotor. Em alguns aspectos, redução da quantidade de cobre em um meio de cultura de uma levedura recombinante compreendendo um promotor de pCTR1 levará a uma transcrição induzida e, desse modo, aumentada, do gene sob o controle desse promotor.
[00124] Por esta razão, os seguintes promotores são referidos no presente texto como sendo "promotores induzíveis".
[00125] Em alguns aspectos, promotores induzíveis podem ser selecionados do grupo que compreende promotores induzíveis com cobre, promotores induzíveis com metionina e promotores induzíveis com treonina, e podem ser selecionados do grupo que consiste de: pSAM4 - induzível por metionina (ID SEQ NO: 24), pCUP1-1 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 25), pCUP1.cgla - induzível por cobre (ID SEQ NO: 26), pCUP1.sba - induzível por cobre (ID SEQ NO: 27), pACU1 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 28), pACU2 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 29), pACU3p - induzível por cobre (ID SEQ NO: 30), pACU4p - induzível por cobre (ID SEQ NO: 31), pACU5 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 32), pACU6 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 33), pACU7 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 34), pACU8 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 35), pACU9 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 36), pACU10p - induzível por cobre (ID SEQ NO: 37), pACU11 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 38), pACU12 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 39), pACU13 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 40), pACU14 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 41), pACU15 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 42), pGAL/CUP1p - induzível por cobre (ID SEQ NO: 43), pCRS5 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 44) e pCHA1 - induzível por treonina (ID SEQ NO: 45).
[00126] Em alguns aspectos, os promotores induzíveis podem ser selecionados do grupo que consiste de: pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 e pCHA1. A atividade desses promotores é assim induzida pela presença crescente de metionina, cobre ou treonina, como indicado acima.
[00127] Em alguns aspectos, os promotores induzíveis podem ser selecionados de: (1) promotores induzíveis devido à ausência de cobre (isto é, a atividade do promotor é aumentada pela ausência de cobre - quanto menos cobre houver no meio, maior a atividade desses promotores); (2) promotores induzíveis devido à ausência de lisina (isto é, a atividade do promotor é aumentada pela ausência de lisina - quanto menos lisina houver no meio, maior a atividade desses promotores); e (3) promotores induzíveis devido à ausência de metionina (isto é, a atividade do promotor é aumentada pela ausência de metionina - quanto menos metionina houver no meio, maior a atividade desses promotores). Em alguns aspectos, os promotores induzíveis são selecionados do grupo que consiste de: pCTR1 -
induzível por cobre (ID SEQ NO: 46), pCTR3 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 47), pCUR1 – induzível por cobre (ID SEQ NO: 48), pCUR2 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 49), pCUR3 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 50), pCUR4 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 51), pCUR5p - induzível por cobre (ID SEQ NO: 52), pCUR6 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 53), pCUR7 – induzível por cobre (ID SEQ NO: 54), pCUR8 – induzível por cobre (ID SEQ NO: 55), pCUR9 – induzível por cobre (ID SEQ NO: 56), pCUR10 – induzível por cobre (ID SEQ NO: 57), pCUR11 – induzível por cobre (ID SEQ NO: 58), pCUR12 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 59), pCUR13 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 60), pCUR14 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 61), pCUR15 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 62), pCUR16 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 63), pCUR17 - induzível por cobre (ID SEQ NO: 64), pLYS1 - induzível por lisina (ID SEQ NO: 65), pLYS4 - induzível por lisina (ID SEQ NO: 66), pLYS9 - induzível por lisina (ID SEQ NO: 67), pLYR1p - induzível por lisina (ID SEQ NO: 68), pLYR2p - induzível por lisina (ID SEQ NO: 69), pLYR3p - induzível por lisina (ID SEQ NO: 70), pLYR4p - induzível por lisina (ID SEQ NO: 71), pLYR5p - induzível por lisina (ID SEQ NO: 72), pLYR6p - induzível por lisina (ID SEQ NO: 73), pLYR7p - induzível por lisina (ID SEQ NO: 74), pLYR8 - induzível por lisina (ID SEQ NO: 75), pLYR9 - induzível por lisina (ID SEQ NO: 76), pLYR10 - induzível por lisina (ID SEQ NO: 77), pLYR11 - induzível por lisina (ID SEQ NO: 78), pMET17 - induzível por metionina (ID SEQ NO: 79), pMET6 - induzível por metionina (ID SEQ NO: 80), pMET14 - induzível por metionina (ID SEQ NO: 81), pMET3 - induzível por metionina (ID SEQ NO: 82), pSAM1 - induzível por metionina (ID SEQ NO: 83), pSAM2 - induzível por metionina (ID SEQ NO: 84), pMDH2 - induzível por glicose (ID SEQ NO: 85), pJEN1 - induzível por glicose (ID SEQ NO: 86), pICL1 – induzível por glicose (ID SEQ NO: 87), pADH2 – induzível por glicose (ID SEQ NO: 88) e pMLS1 – induzível por glicose (ID SEQ NO: 89).
[00128] Em alguns aspectos, o(s) promotor(es) induzível(eis) pode(m) ser selecionado(s) do grupo que consiste de: pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 e pMLS1.
[00129] Em alguns aspectos, promotores induzíveis podem ser selecionados do grupo que compreende promotores induzíveis com cobre, promotores induzíveis devido à ausência de cobre, promotores induzíveis devido à ausência de glicose, promotores induzíveis devido à ausência de lisina, promotores induzíveis com metionina, promotores induzíveis devido à ausência de metionina e promotores induzíveis com treonina.
[00130] Em alguns aspectos, o promotor induzível pode ser selecionado do grupo que consiste de: pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, pCHA1, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 e pMLS1.
[00131] Em alguns aspectos, os promotores induzíveis, idênticos ou diferentes, podem ser preferencialmente caracterizados por uma sequência de ácidos nucleicos selecionados do grupo que consiste de sequências apresentando pelo menos 80/85/90/95/96/97/98/99/100% de identidade com as sequências ID SEQ Nos: 13-89.
[00132] Em alguns aspectos, promotores sintéticos, conforme descritos em Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58, podem também ser usados.
[00133] Os promotores fortes e induzíveis ou repressíveis da invenção podem se originar de qualquer organismo de classe Saccharomycetes e podem, em particular, se originar, independentemente, de um organismo selecionado do grupo que consiste de: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii, Ashbya gossypii, Kluveromyces lactis, Pichia pastoris, Candida glabrata, Candida tropicalis, Debaryomyces castelii, Yarrowia lipolitica e Cyberlindnera jadinii.
[00134] Em alguns aspectos, promotores fortes, fracos e induzíveis podem se originar de um organismo selecionado do grupo que consiste de: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii e Kluveromyces lactis. Terminadores
[00135] Em alguns aspectos, os micróbios recombinantes compreendem sequências terminadoras de transcrição apropriadas que são funcionais em células de levedura, incluindo, em Saccharomyces cerevisiae. Em alguns aspectos, os terminadores de transcrição, idênticos ou diferentes, podem ser encontrados em Yamanishi e outros, (2013) ACS Synthetic Biology 2, 337-347.
[00136] Em alguns aspectos, terminadores podem ser selecionados do grupo que compreende:
[00137] • tTDH2 a partir do gene que codifica o gliceraldeído-3-
fosfato desidrogenase, isozima 2 (gene TDH2 = sequência ID SEQ NO: 90),
[00138] • tCYC1 (= Sequência ID SEQ NO: 91),
[00139] • tTDH3 (= Sequência ID SEQ NO: 92),
[00140] • tADH1 a partir do gene que codifica o álcool desidrogenase (gene ADH1 = Sequência ID SEQ NO: 93),
[00141] • tADH2 a partir do gene que codifica o álcool desidrogenase (gene ADH2 = Sequência ID SEQ NO: 94),
[00142] • tTPI1 a partir do gene que codifica a triose fosfato isomerase (gene TPI1 = sequência ID SEQ NO: 95),
[00143] • tMET17 a partir do gene que codifica a O-acetil- homoserina-O-acetil-serina-sulfidrilase (gene Met17 = Sequência ID SEQ NO: 96),
[00144] • tENO2 a partir do gene que codifica a Enolase II (gene ENO2 = Sequência ID SEQ NO: 97),
[00145] • tMET3 (= Sequência ID SEQ NO: 98),
[00146] • tPGK1 a partir do gene que codifica a 3-fosfoglicerato quinase (gene PGK1 = Sequência ID SEQ NO: 99),
[00147] • tDIT1 (= Sequência ID SEQ NO: 100)
[00148] • tRPL3 (= Sequência ID SEQ NO: 101)
[00149] • tRPL41B (= Sequência ID SEQ NO: 102)
[00150] • tRPL15A (= Sequência ID SEQ NO: 103)
[00151] • tIDP1 (= Sequência ID SEQ NO: 104)
[00152] Em alguns aspectos, o terminador, idêntico ou diferente, pode ser preferencialmente caracterizado por uma sequência de ácido nucleico selecionado do grupo que consiste de sequências apresentando pelo menos 80/85/90/95/96/97/98/99/100% de identidade com ID SEQ Nos.: 90-104. Malonato Semialdeído, Sais do mesmo e Derivados deste
[00153] Malonato semialdeído e seus sais são um intermediário-
chave para a produção de compostos valiosos. Esses compostos de interesse econômico incluem aqueles produzidos diretamente a partir de malonato semialdeído ou seus sais, tais como acrilato, 1-propanol, isopropanol, 3-hidroxipropionato e propionato, mas também aqueles derivados de malonil-CoA, principalmente, produzidos por policetídeos sintases, tais como floroglucinol e flavonóides, e os ácidos graxos sintase, ou aqueles derivados do mevalonato, tais como farnesil-PP, esqualeno e derivados ou as vias de butirato de 3-hidróxi-3-metila.
[00154] Malonato semialdeído e seus sais são produzidos naturalmente em leveduras a partir de malonil-CoA e beta-alanina. Entretanto, produção de malonil-CoA e seus sais está em competição com a via da biossíntese do etanol, dificultando, desse modo, a derivação de fluxo para o malonato semialdeído.
[00155] Além disso, a produção de beta-alanina exige a aminação de oxaloacetato seguida pela desaminação de beta-alanina, envolvendo um grande número de enzimas.
[00156] A fim de facilitar a produção de malonato semialdeído e seus sais em leveduras, propõe-se obter malonato semialdeído em uma etapa por meio de descarboxilação de oxaloacetato (US2010/0021978). Contudo, nenhuma enzima natural é conhecida como sendo capaz de realizar essa transformação em uma via natural de forma eficiente. A atividade enzimática da descarboxilação de oxaloacetato em malonato semialdeído é neste relatório referida como oxaloacetato 1-descarboxilase (formação de MSA) e não deve ser confundida com oxaloacetato descarboxilase (EC 4.1.1.3) que produz piruvato.
[00157] US2010/0021978 propõe o uso de uma descarboxilase promíscua tal como o formato de benzoíla descarboxilase, o alfa- cetoglutarato descarboxilase, o alfa-cetoisovalerato descarboxilase ou o piruvato descarboxilase para realizar essa descarboxilação de oxaloacetato em malonato semialdeído ou um de seus sais. Este documento exemplifica o uso de benzoilformato descarboxilase em Escherichia coli para produzir 3-hidroxipropionato através de malonato semialdeído.
[00158] US2018/032830 propõe e exemplifica o uso de uma descarboxilase tal como piruvato descarboxilase para realizar essa descarboxilação de oxaloacetato em 3-oxopropanoato (malonato semialdeído) para produzir 3-hidroxipropionato.
[00159] US8809027 propõe e exemplifica o uso de piruvato descarboxilase, 2-oxoglutarato descarboxilase e alfa-cetoglutarato descarboxilase para realizar a descarboxilação do oxaloacetato em malonato semialdeído para produzir 3-hidroxipropionato.
[00160] Os inventores na publicação pré-concessão mencionada acima puderam detectar a atividade de carboxilase in cellulo e in vitro em seu substrato cognato; os inventores foram incapazes de detectar qualquer atividade de todas essas enzimas em oxaloacetato.
[00161] Consequentemente, ainda existe uma necessidade no estado da técnica de enzimas capaz de catalisar eficientemente a transformação de oxaloacetato em malonato semialdeído, ou um de seus sais, quando expresso em uma levedura, e em particular, na levedura Saccharomyces cerevisiae.
[00162] Malonato semialdeído é um composto que apresenta a seguinte estrutura:
HO O O H
[00163] Em alguns aspectos, o composto pode existir na forma de uma base ou de um sal. Em alguns aspectos, o sal pode ser malonato semialdeído apresentando a seguinte estrutura: –
O O O H
[00164] Em alguns aspectos, sais de cátions orgânicos tais como sais de amônio, sódio, potássio, fosfônio, ou sulfônio podem também ser considerados.
[00165] Em alguns aspectos, derivados de malonato semialdeído são compostos que podem ser obtidos a partir de malonato semialdeído, ou de um de seus sais, após modificação por pelo menos uma enzima natural ou artificialmente presente no micro-organismo que produz o malonato semialdeído, ou um de seus sais.
[00166] Em alguns aspectos, derivados de malonato semialdeído incluem propanol, propanal, ácido acrílico, acrilil-CoA, acetil-CoA, 3- HP, acrilato, acetona, isopropanol, propionato, propionil-CoA, 3- hidroxipropionato, 3-hidroxipropionil-CoA, 3-hidróxi-3-metil-butirato, floroglucinol, flavonóides, canabinóides, farnesil-PP e esqualeno.
[00167] Em alguns aspectos, 3-hidroxipropionato, acrilil-CoA, propionil-CoA, propanal e propanol podem ser obtidos a partir de malonato semialdeído ou a partir de um de seus sais através das etapas detalhadas na FIGURA 11. PCS representa uma propionil-CoA sintase, tal como a PCS de Chloroflexus aggregans, Roseiflexus castenholzii ou Chloroflexus aurantiacus. Essa reação pode ser catalisada por enzimas com, mas não se restringe ao número EC
6.2.1.17/6.2.1.36, tal como listado na Tabela 3. ADHE representa um álcool desidrogenase E, tal como ADHE de Clostridium beijerinckii ou Clostridium arbusti. Essa reação pode ser catalisada por enzimas com, mas não se restringe ao número EC 1.1.1.1/1.2.1.4/1.2.1.5, tais como aqueles listados na Tabela 7.
[00168] Em alguns aspectos, ácido acrílico e acrilato podem ser obtidos a partir de malonato semialdeído ou de um de seus sais por reações enzimáticas de múltiplas etapas envolvendo a ligação de CoA ao 3-HP, desidratação de 3-HP-CoA a acrilil-CoA como representado na FIGURA 12 e desprendimento de CoA de acrilil-CoA como uma via sintética já demonstrada na literatura (Chu e outros, Direct Fermentation route for the production of acrylic acid (Via de fermentação direta para a produção de ácido acrílico). Metabolic Engineering, 32 (2015), 23-29). As etapas de malonato semialdeído para acrilil-CoA podem ser catalisadas por ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase com, mas não restrito ao número EC 1.1.1.381, tais como aqueles listados na Tabela 1; 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/CoA transferases que podem ser utilizadas apresentam, mas não se restringem aos, números EC 2.8.3.1/6.2.1.17/6.2.1.36, tais como aqueles listados na Tabela 4; 3-hidroxipropionil-CoA desidratase/enoil-CoA hidratases que podem ser utilizadas apresentam, mas não se restringem aos números EC
4.2.1.116/4.2.1.55/4.2.1.150/4.2.1.17, tais como aqueles listados na Tabela 5 e acil-CoA hidrolase ou tioesterase (Tabela 14). O ácido acrílico pode ser derivado quimicamente através de uma reação de desidratação. Métodos de desidratação de ácido 3-hidroxipropiônico são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, incorporado neste relatório por seus ensinamentos de conversão de 3-HP, a patente dos Estados Unidos 8.846.353 B2 descreve um método em que 3-HP presente em um caldo de fermentação pode ser desidratado em uma reação de fase de vapor na presença de um catalisador ácido, como não limitado a NaH2PO4-sílica-gel, H3PO4-sílica-gel, CuSO4- sílica-gel e zeólito H-β-H3PO4. A patente dos Estados Unidos número
2.469.701 descreve outro exemplo para a reação adicionando ácido 3- hidroxipropiônico gradualmente a um catalisador de desidratação concentrado, tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, mantido sob uma temperatura de cerca de 150-190°C sob pressão r eduzida, na presença de cobre metálico em pó e separando o ácido acrílico aquoso formado a partir do catalisador por meio de destilação. Uma fase aquosa contendo 3-HP pode também ser desidratada via destilação reativa para fornecer uma solução fluida de ácido acrílico que pode prosseguir para uma etapa de purificação opcional por meio de uma cristalização em suspensão ou uma cristalização em camadas, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos Número US
8.198.481 B2.
[00169] Em alguns aspectos, o malonato semialdeído pode ser transformado em acetil-CoA por meio de um malonato semiadeído desidrogenase (acetilação (E.C. 1.2.1.18), tal como KES23460 de Pseudonomas putida descrito em Wilding e outros (2016. Appl. Microbiol. Biotechnol., 82: 3846- 3856). Ver, FIGURA 9 acetil-CoA é então um ponto de partida para produzir isopropanol como descrito em Tamakawa e outros, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2013) 97:6231-6239.
[00170] Em alguns aspectos, propionil-CoA é obtido a partir de malonato semialdeído. O propionil-CoA pode então ser transformado em propionato através da catálise sucessiva de fosfotransacetilase (E.C. 2.3.1.) e uma acetato-cinase (E.C. 2.7.2.1), descrita em Erbilgin e outros, (2016) PLoS Biol. 14(3): e1002399.doi:10.1371/journal.pbio.1002399 e Reinscheid e outros (1999) Microbiology 145,503-513.
[00171] Em alguns aspectos, o malonato de semialdeído pode ser transformado em malonil-CoA por meio de uma malonil-CoA redutase (E.C 1.2.1.75), como descrito em Alber e outros (2006) Journal of bacteriology 188, 8551-8559. Ver, FIGURA 4 malonil-CoA é, então, o ponto de partida para sintetizar floroglucinol e seus derivados usando uma floroglucinol sintase (E.C.2.3.1.253), conforme descrito em Yang e Cao (2012) Appl. Microbiol. Biotechnol. 93: 487-495.
[00172] Malonil-CoA é um bloco de construção principal e, muitas vezes, um obstáculo necessário para biossíntese de flavonóides (Johnson e outros (2017) Metabolic Engineering 44:253-264). Malonato semialdeído pode ser transformado em malonil-CoA por meio de uma malonil-CoA redutase (E.C 1.2.1.75) como descrito em Alber e outros (2006) Journal of Bacteriology 188, 8551-8559. Malonil- CoA pode então ser usado para alimentar a síntese de flavonóides, conforme descrito em Batra, Priya e Anil K. Sharma. (2013) 3 Biotech. 6: 439‑59; e em Mou, e outros (2015) PLoS ONE 10(6).
[00173] Acetil-CoA é também um bloco de construção principal e, muitas vezes, um obstáculo necessário para biossíntese de farnesil- PP e derivados, como, por exemplo, esqualeno. Conforme mencionado acima, malonato semialdeído pode ser transformado em acetil-CoA por meio de um malonato de semialdeído desidrogenase (acetilação) (E.C. 1.2.1.18) como, por exemplo, KES23460 de Pseudomonas putida descrito em Wilding e outros (2016) Appl. Env. Microbiology, 82, 3846-3856. Acetil-CoA é então um ponto de partida para produzir farnesil-PP e derivados, como descrito em Wang, J.; Li, Y.; Liu, D. Cloning and Characterization of Farnesyl Diphosphate Synthase Gene Involved in Triterpenoids Biosynthesis (Clonagem e caracterização de gene da farnesil-difosfato sintase envolvido em biossíntese de triterpenóides) a partir de, Poria cocos. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 22188-22202.
[00174] Em alguns aspectos, canabinóides podem ser obtidos a partir de malonato semialdeído ou de um de seus sais de acetil-CoA, o qual é o precursor de todos os canabinóides. Malonato semialdeído pode ser transformado em acetil-CoA por meio de uma malonato semialdeído desidrogenase (acetilação) (E.C. 1.2.1.18) como, por exemplo, KES23460 de Pseudomonas putida descrito em Wilding e outros. Acetil-CoA é então um ponto de partida para produzir canabinóides conforme descrito em Carvalho e outros (2017) FEMS Yeast Research, 17, fox037. doi: 10.1093/femsyr/fox037.
[00175] Em alguns aspectos, butirato de 3-hidróxi-3-metila pode ser obtido a partir de semialdeído malônico ou de um de seus sais, como segue. Malonato semialdeído pode, como mencionado acima, ser transformado em acetil-CoA por meio de um malonato semialdeído desidrogenase (acetilante) (E.C. 1.2.1.18) como, por exemplo, KES23460 de Pseudomonas putida descrito em Wilding e outros. Acetil-CoA é então o ponto de partida para biossíntese de butirato de 3-hidróxi-3-metila, conforme descrito em Gogerty e Bobic (2010) Appl. Microbiol. Biotechnol. 76: 8004-8010.
[00176] Em alguns aspectos, um micróbio recombinante da presente invenção pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam as enzimas mencionadas acima, a fim de obter o malonato semialdeído e/ou derivados de interesse. As sequências de ácidos nucleicos, uma ou mais que codificam as enzimas que executam as transformações necessárias de malonato semialdeído, ou um de seus sais, para o derivado de malonato de semialdeído de interesse podem estar presentes naturalmente no micróbio (endógeno) e/ou podem ser incorporadas ao micróbio como transgênicos de acordo com métodos bem conhecidos daquele versado no estado da técnica.
[00177] Em alguns aspectos, um micróbio recombinante da presente invenção pode compreender, além de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato para malonato de semialdeído, conforme definido acima, pelo menos um ácido nucleico que codifica um ácido 3-hidroxi desidrogenase e/ou uma malonil-CoA redutase.
[00178] Em alguns aspectos, ácido 3-hidroxi desidrogenase e/ou malonil-CoA redutase de acordo com esta modalidade pode ser, mas não se limita ao mesmo, ácido 3-hidroxi desidrogenase com número E.C. 1.1.1.381, tais como aqueles listados na Tabela 1.
[00179] Em alguns aspectos, um micróbio recombinante da presente invenção pode compreender, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato para malonato semialdeído, conforme definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica um ácido 3-hidroxi desidrogenase ou uma malonil-CoA redutase e (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionil-CoA sintase.
[00180] Em alguns aspectos, a ácido 3-hidroxi desidrogenase e/ou malonil-CoA redutase de acordo com esta modalidade pode ser, mas não se limita ao mesmo, a ácido 3-hidroxi desidrogenase com número E.C. 1.1.1.381, tais como aqueles listados na Tabela 1. A propionil-coA sintase (PCS) que pode ser utilizada apresenta, mas não se restringe aos números E.C. 6.2.1.17/6.2.1.36, como aqueles listados na Tabela 3.
[00181] Em alguns aspectos, um micróbio recombinante da invenção pode compreender, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato para malonato de semialdeído, conforme definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma ácido 3-hidroxi desidrogenase ou uma malonil-CoA redutase, (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionil-CoA sintase ou 3-hidroxipropionil- CoA sintetase/transferase, 3-hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil- CoA redutase e (iii) pelo menos um álcool desidrogenase E ou aldeído desidrogenase e álcool desidrogenase.
[00182] Em alguns aspectos, o ácido 3-hidroxi desidrogenase e/ou malonil-CoA redutase da invenção pode ser o ácido 3-hidroxi desidrogenase com, mas não se restringe ao número E.C. 1.1.1.381, tais como aqueles listados na Tabela 1. Em alguns aspectos, a propionil-CoA sintase (PCS) da invenção pode ser a PCS com, mas não se limita aos números E.C. 6.2.1.17/6.2.1.36, tais como aqueles listados na Tabela 3.
[00183] Em alguns aspectos, o ADHE da invenção que pode ser usado, mas não se restringe a, é uma enzima com números E.C.
1.1.1.1/1.2.1.4/1.2.1.5, tais como aqueles listados na Tabela 7. Em alguns aspectos, é possível usar duas enzimas para converter propanol a partir de propionil-CoA. Podem ser utilizadas, mas não se restringem a, enzimas com números E.C. 1.2.1.10/1.2.1.87, tais como aquelas listadas na Tabela 8, ou enzimas com números E.C.
2.3.1.8/2.7.2.1, tais como aquelas listadas na Tabela 10 e enzimas com números E.C. 1.1.1.1/1.1.1.2, tais como aquelas listadas na Tabela 9.
[00184] Em alguns aspectos, o micróbio recombinante pode compreender, além de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato para malonato de semialdeído, conforme definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma ácido 3-hidroxi desidrogenase ou uma malonil-CoA redutase e (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionato-CoA transferase.
[00185] Em alguns aspectos, um propionato-CoA transferase pode ser, mas não se restringe à enzima com a referência E.C.2.8.3.1.
[00186] Em alguns aspectos, a ácido 3-hidroxi desidrogenase e/ou malonil-CoA redutase pode ser, mas não limitada ao, ácido 3-hidroxi desidrogenase ou a malonil-CoA redutase com número E.C. 1.1.1.381, tais como aqueles listados na Tabela 1. Em alguns aspectos, a propionato-CoA transferase pode ser, mas não se limita a, propionato- CoA transferase ou 3-hidroxipropionil-CoA sintetases com número EC
2.8.3.1/6.2.1.17/6.2.1.36, tais como aqueles listados na Tabela 4.
[00187] Em alguns aspectos, um micróbio recombinante pode compreender, além de um gene de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato para malonato de semialdeído, conforme definido acima, (i) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma ácido 3-hidroxi desidrogenase ou uma malonil-CoA redutase, (ii) pelo menos um ácido nucleico que codifica uma propionato-CoA transferase e (iii) pelo menos uma coenzima A de 3-hidroxipropionil desidratase.
[00188] Em alguns aspectos, a ácido 3-hidroxi desidrogenase e/ou malonil-CoA redutase pode ser, mas não se restringe às enzimas com número EC 1.1.1.381, tais como aquelas listadas na Tabela 1. Em alguns aspectos, a propionato-CoA transferase ou a 3-hidroxipropionil- CoA sintetase que pode ser usada apresenta, mas não se restringe ao número EC 2.8.3.1/6.2.1.17/6.2.1.36, tais como aqueles listados na Tabela 4. Em alguns aspectos, a coenzima A 3-hidroxipropionil desidratase pode ser, mas não se restringe às enzimas com números EC 4.2.1.116/4.2.1.55/4.2.1.150/4.2.1.17, tais como aquelas listadas na Tabela 5.
[00189] Em alguns aspectos, a invenção é desenhada para um organismo microbiano recombinante, um micróbio em alguns aspectos, capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato para malonato de semialdeído. Em alguns aspectos, essas enzimas são caracterizadas por ID SEQ NO: 1, como seguem:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA
CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEV
PHAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVL VIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIG
AMASALANLVEESSRQLPTAAPEP AKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESX3STTAQMWQRLN MRNPGSYYX4X5AAGGX6GFA
LPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGX7LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAK GPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 1);
[00190] em que:
[00191] X1 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de leucina, lisina, arginina e valina;
[00192] X2 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de leucina e lisina;
[00193] X3 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de treonina e serina; X4 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina e valina;
[00194] X5 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de cisteína e arginina; X6 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de leucina, asparagina e alanina; e
[00195] X7 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de alanina e leucina, com a condição de que a enzima não pode apresentar a sequência ID SEQ NO: 1, em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina.
[00196] Em alguns aspectos, X1 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de lisina, arginina e valina. Em alguns aspectos, X1 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de arginina e valina. Em alguns aspectos, X1 é arginina.
[00197] Em alguns aspectos, uma enzima da invenção é aquela de ID SEQ NO: 1 conforme definida acima, com X1 sendo arginina.
[00198] Em alguns aspectos, X2 representa leucina.
[00199] Em alguns aspectos, X1 representa valina e X2 representa lisina.
[00200] Em alguns aspectos, X3 representa treonina.
[00201] Em alguns aspectos, X1 é arginina, X2 representa leucina e X3 representa treonina.
[00202] Em alguns aspectos, X4 representa fenilalanina ou asparagina.
[00203] Em alguns aspectos, uma enzima de sequência de ID SEQ NO: 1 é de tal modo que:
[00204] X1 seja arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina e X4 representa fenilalanina; ou
[00205] X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina e X4 representa asparagina.
[00206] Em alguns aspectos, X5 representa cisteína.
[00207] Em alguns aspectos, uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1 é de tal modo que:
[00208] X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa fenilalanina e X5 representa cisteína; ou
[00209] X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa asparagina e X5 representa cisteína.
[00210] Em alguns aspectos, X6 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de leucina e asparagina. Em alguns aspectos, X6 é leucina.
[00211] Em alguns aspectos, X1 representa valina, X2 representa lisina e X6 representa asparagina.
[00212] Em alguns aspectos, uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1 é de tal modo que:
[00213] X1 seja arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa fenilalanina, X5 representa cisteína e X6 é leucina; ou
[00214] X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa asparagina, X5 representa cisteína e X6 é leucina.
[00215] Em alguns aspectos, X7 representa alanina.
[00216] Em alguns aspectos, uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1 é de tal modo que:
[00217] X1 seja arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa fenilalanina, X5 representa cisteína, X6 é leucina e X7 é alanina; ou
[00218] X1 é arginina ou lisina, X2 representa leucina, X3 representa treonina, X4 representa asparagina, X5 representa cisteína, X6 é leucina e X7 é alanina.
[00219] Em alguns aspectos, uma enzima da invenção é selecionada do grupo que consiste de:
[00220] (i) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 2)
[00221] (ii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 3)
[00222] (iii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa alanina; (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 4)
[00223] (iv) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; e X7 representa leucina; (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 5), e
[00224] (v) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 1, em que X1 representa valina; X2 representa lisina; X3 representa treonina; X4 representa asparagina; X5 representa cisteína; X6 representa asparagina; e X7 representa alanina; (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 6)
[00225] Em alguns aspectos, a invenção é desenhada para um organismo microbiano recombinante, um micróbio em alguns aspectos, capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato para malonato semialdeído. Em alguns aspectos, essas enzimas são caracterizadas por uma sequência de aminoácidos que compreende: MASVHGTTYELLRRQGIDX8VFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQE
ACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEAX1X2TNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP
HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VX9SSVRLNDQDLDILVKALNSASNPX10IVLGPDVDAANANADCV
MLAERLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHD VVLVIGAPVFRYX11X12YDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAI
VADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPE TVFDTLNDMAPEX13AIYLNESX3STTAQMWQRLX14MRNPGSYY X4X5AAGGX6GFALPAAIGVQLAEPX15RQVIAVIGDGSANYSISALWTA AQYNX16PTIFVIMNNGTYGX7LRWX17AGVLX18AENVPGLDVPG
IDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 274), em que:
[00226] X1 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de leucina, lisina, arginina e valina;
[00227] X2 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de leucina e lisina;
[00228] X3 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de treonina e serina;
[00229] X4 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de fenilalanina, asparagina, alanina, isoleucina, valina, leucina, triptofano e arginina;
[00230] X5 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de cisteína e arginina;
[00231] X6 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de leucina, asparagina, alanina, valina e serina;
[00232] X7 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de alanina, leucina, treonina, glicina e asparagina;
[00233] X8 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de treonina ou isoleucina;
[00234] X9 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de serina ou treonina;
[00235] X10 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de alanina ou valina;
[00236] X11 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de histidina ou arginina;
[00237] X12 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de glutamina ou arginina;
[00238] X13 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de asparagina ou ácido aspártico;
[00239] X14 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de asparagina ou ácido aspártico;
[00240] X15 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de ácido glutâmico ou glicina;
[00241] X16 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de isoleucina ou valina;
[00242] X17 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de fenilalanina ou serina; e
[00243] X18 representa um aminoácido selecionado do grupo que consiste de ácido glutâmico ou glicina;
[00244] com a condição de que a enzima não pode apresentar a sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa leucina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina, X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa asparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina e X18 representa ácido glutâmico.
[00245] Uma enzima de acordo com a invenção pode, em particular, ser selecionada do grupo que consiste de:
[00246] (i) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 2);
[00247] (ii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 242);
[00248] (iii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 243);
[00249] (iv) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 244);
[00250] (v) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 245);
[00251] (vi) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 247);
[00252] (vii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 248);
[00253] (viii) uma enzima da sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 249);
[00254] (ix) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 250);
[00255] (x) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima da sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 251);
[00256] (xi) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 252);
[00257] (xii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 253);
[00258] (xiii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa serina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 254);
[00259] (xiv) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa glicina; X16 representa valina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 255);
[00260] (xv) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 256);
[00261] (xvi) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina;
X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 257);
[00262] (xvii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa leucina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 258);
[00263] (xviii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 259);
[00264] (xix) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina;
X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 260);
[00265] (xx) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa asparagina; X8 representa isoleucina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa ácido aspártico; X15 representa glicina; X16 representa isoleucina; X17 representa serina; e X18 representa glicina (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 261);
[00266] (xxi) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa fenilalanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa treonina; X10 representa valina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 262);
[00267] (xxii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa alanina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 263);
[00268] (xxiii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa leucina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 264);
[00269] (xxiv) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa alanina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 265);
[00270] (xxv) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 266);
[00271] (xxvi) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina;
X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa serina; X7 representa asparagina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 267);
[00272] (xxvii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 268);
[00273] (xxviii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa glicina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa arginina; X12 representa glutamina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 269);
[00274] (xxix) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 270);
[00275] (xxx) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa leucina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa asparagina; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa isoleucina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 271);
[00276] (xxxi) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa arginina; X5 representa cisteína; X6 representa valina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 272); e
[00277] (xxxii) uma enzima de sequência ID SEQ NO: 274, em que X1 representa arginina; X2 representa leucina; X3 representa treonina; X4 representa triptofano; X5 representa cisteína; X6 representa serina; X7 representa treonina; X8 representa treonina; X9 representa serina; X10 representa alanina; X11 representa histidina; X12 representa arginina; X13 representa ácido aspártico; X14 representa aparagina; X15 representa ácido glutâmico; X16 representa valina; X17 representa fenilalanina; e X18 representa ácido glutâmico (isto é, uma enzima de sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 273). 3-HP e Derivados do mesmo
[00278] Derivados de 3-HP incluem, mas não se limitam aos mesmos, ácido acrílico, 1-propanol, propeno, acrilil-CoA e polipropileno. Acetil-CoA e Derivados do mesmo
[00279] Derivados de acetil-CoA incluem, mas não se limitam aos mesmos, acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno. Coprodução de 3-HP e Acetil-CoA, sais dos mesmos, e derivados destes
[00280] A combinação da via de 3-HP com a via de acetil-CoA é adotada aqui para criar uma via equilibrada por redox, resultando em alto rendimento. Entre os derivados de 3-HP, é possível citar ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno. Entre os derivados de acetil-CoA, é possível citar acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno.
[00281] Observando uma solução para a perda de rendimento para produção de derivados de 3-HP e acetil-CoA, identificamos uma nova combinação de vias de produção de derivados de 3-HP com produção de derivados de acetil-CoA em leveduras recombinantes. A biossíntese de 1-propanol a partir de glicose é altamente dependente da disponibilidade de cofatores de potência redutora para a conversão de malonato semialdeído em 1-propanol: são necessários 4 cofatores de NAD(P)H para converter 1 molécula de malonato semialdeído em 1 molécula de 1-propanol. Embora a biossíntese de malonato semialdeído a partir de glicose gere alguns cofatores de NAD(P)H, não há formação suficiente de NAD(P)H para sustentar tal conversão do malonato semialdeído em 1-propanol. Os cofatores restantes de NAD(P)H necessários para a biossíntese de 1-propanol si próprio devem ser proporcionados queima de alguma glicose sob condições aeróbicas, mas reduzindo assim seu potencial de rendimento total. A presente invenção supera esse desequilíbrio redox e gera restrição de potencial combinando a biossíntese de 1-propanol com a biossíntese de acetona. Como acetona é uma molécula altamente oxidada, sua biossíntese a partir de glicose está ligada à produção líquida de cofatores de NAD(P)H de poder redutor. Portanto, a coprodução tanto de 1-propanol quanto de acetona é equilibrada por redox sob certa razão de fluxo de carbono em relação aos produtos-alvo, uma vez que o NAD(P)H necessário para a biossíntese de 1-propanol procederia tanto da glicólise quanto da biossíntese de acetona.
[00282] Conforme descrito na FIGURA 15 e FIGURA 16, a coprodução de 1-propanol e acetona é equilibrada por redox sob condições de fermentação aeróbica e anaeróbica, com um aumento do potencial de rendimento em condição anaeróbica. A estequiometria da via de coprodução de 1-propanol e acetona sob condições de fermentação aeróbica é: 1 Glicose + 0,33 de O2 → 0,67 acetona + 0,67 de 1-propanol + 1,33 H2O + 2 CO2 com um rendimento teórico máximo de 0,437g/g de produtos por glicose. Como mostrado na FIGURA 15, 6 moléculas de malonato de semialdeído são produzidas a partir de 3 moléculas de glicose, em que 4 moléculas de malonato de semialdeído irão para a biossíntese de acetona e 2 moléculas irão para a biossíntese de 1-propanol, ajustando a rede de cofatores de NAD(P)H para um equilíbrio neutro de redox.
[00283] Em contraste, a estequiometria de via de coprodução de 1- propanol e acetona sob condições de fermentação anaeróbica é: 1 Glicose → 0,6 acetona + 0,8 1-propanol + 0,8 H2O + 1,8 CO2 com um rendimento teórico máximo de 0,46 g/g de produtos por glicose. Como mostrado na FIGURA 16, 10 moléculas de malonato de semialdeído são produzidas a partir de 5 moléculas de glicose, em que 6 moléculas de malonato de semialdeído irão para biossíntese de acetona e 4 irão para biossíntese de 1-propanol, a fim de ter um equilíbrio neutro de redox.
Um exemplo de via de coprodução de 1-propanol e acetona equilibrada por redox é mostrado na FIGURA 14, em que os cofatores NADH e NADPH são perfeitamente equilibrados: os 6 cofatores NADH gerados na glicólise superior e na biossíntese de acetona são consumidos na biossíntese de 1-propanol e os 2 cofatores NADPH gerados na glicólise superior são usados na biossíntese de 1-propanol, considerando 2,5 moléculas de glicose consumidas para a produção de 2 moléculas de 1-propanol e 1,5 moléculas de acetona.
Isso pode ser obtido usando enzimas específicas descritas e listadas na presente invenção.
Mais precisamente, pode ser usado um candidato à enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) a partir de Kluyveromyces lactis, o qual mostra alta atividade com NAD+ e NADP+ (e assim gerando NADH e NADPH), em vez de usar os genes nativos de Saccharomyces cerevisiae (TDH1, TDH2 e TDH3), que exibem um requisito estrito para NAD+ (gerando apenas NADH). Além disso, candidatos à enzima malonato semialdeído desidrogenase a partir de Pseudomonas aeruginosa ou Candida albicans podem converter o malonato de semialdeído em acetil-CoA, exibindo uma exigência estrita de NAD+ como cofator.
Uma enzima desidrogenase de ácido 3-hidroxipropiônico dependente de NADH altamente ativa a partir de Candida albicans (codificada pelo gene HPD1) pode ser usada para converter malonato de semialdeído em 3-HP.
Finalmente, a conversão de 3-HP em propionil-CoA deve ser feita usando enzimas dependentes de NADPH, enquanto a produção de 1-propanol a partir de propionil-CoA pode ser realizada por enzimas desidrogenase dependentes de NADH.
Esta via de coprodução é neutra a redox e com um pequeno excesso de ATP, resultando em uma produção mais eficiente e com maior rendimento dos compostos desejados.
Além disso, a via balanceada apresenta o potencial que deve ser executado sob condições anaeróbicas, o que traz várias vantagens do processo quando comparado com um processo aeróbico com o mesmo rendimento. Como, por exemplo, não é necessário suprir ar aos fermentadores de produção, portanto, há uma redução CAPEX nos compressores de ar e uma redução OPEX nas utilidades consumidas por esses equipamentos. Outra vantagem significativa é que os fermentadores anaeróbicos podem apresentar tamanhos máximos maiores que os fermentadores aeróbicos, principalmente, porque em fermentadores aeróbicos a transferência de oxigênio de fase gasosa para a líquida fica mais difícil à medida que o tamanho do fermentador aumenta, limitando seu tamanho a um valor máximo, portanto, o mesmo processo anaeróbico de produção anual pode apresentar um número menor de fermentadores maiores que um processo aeróbico, o qual no final representa um CAPEX menor com fermentadores e seus acessórios para o processo anaeróbico. Além disso, há uma melhora no rendimento em condições anaeróbicas, em que a coprodução de 1-propanol e acetona leva a um rendimento maior total de 0,46 g de solventes/g de glicose, assumindo que esses produtos sejam produzidos em uma razão de 3:4 (acetona: 1-propanol).
[00284] Sob condições anaeróbicas, a via proposta, a qual inclui geração de acetil-CoA a partir de malonato semialdeído, evita alguns dos maiores desafios de engenharia de vias para produção de derivados de acetil-CoA, que é a disponibilidade de acetil-CoA em condições anaeróbicas.
[00285] Além disso, a nova rota para a produção de acetil-CoA é independente de piruvato, que é distinto das vias típicas de produção de acetil-CoA. Além disso, a via para derivados de 3-HP também é distinta das vias típicas de produção de 3-HP, sendo independente de malonil-CoA.
[00286] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é capaz de produzir acetona a partir de malonato de semialdeído via acetil-CoA. A via de acetona proposta depende da conversão do malonato de semialdeído em acetil-CoA, que é independente de piruvato, e difere das vias típicas de produção de acetil-CoA, atenuando a perda de rendimento por desvio de piruvato ao ciclo TCA. Além disso, o malonato semialdeído é produzido pela descarboxilação do oxaloacetato ou pela via de β-alanina, que difere do malonato semialdeído naturalmente produzido a partir de malonil-CoA em leveduras. A produção natural de malonil-CoA e seus sais é em competição com a biossíntese de etanol, dificultando, desse modo, a derivação do fluxo para malonato de semialdeído.
[00287] Em alguns aspectos, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase nativa do micróbio é substituída por uma versão exógena. A levedura nativa gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase catalisa a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-bifosfoglicerato, resultando na oxidação de um aldeído com conversão de NAD+ em NADH. Outras versões desta enzima são descritas na literatura em que a atividade enzimática resulta na conversão de NADP+ em NADPH. Ver, Martinez e outros (2008. Metabolic Engineering, 10(6):352-359). Substituição da enzima dependente de NAD nativa por uma enzima dependente de NADP fornece uma via melhor equilibrada, favorecendo a produção dos compostos desejados. Em alguns aspectos, uma ou mais gliceraldeído-3-fosfato desidrogenases não nativas substituem a enzima nativa. Em alguns aspectos, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é selecionada de fungos, leveduras, bactérias, insetos, animais, plantas ou flagelados. Em alguns aspectos, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase que pode ser usada tem, mas não se restringe ao número EC 1.2.1.12, tal como Clostridium acetobutylicum (gapC) ou Kluyveromyces lactis (gdp1).
[00288] A nova via combinada para produção de 3-HP e acetil-CoA tem malonato de semialdeído como um único intermediário comum. A via usual para a produção de malonato de semialdeído tem malonil- CoA como intermediário (Suyama e outros, 2017). De outro modo, na via instantânea, malonato semialdeído apresenta oxaloacetato como intermediário. Ver, FIGURA 1.
[00289] Os problemas acima mencionados, relacionados às vias tradicionais da produção dos produtos, como descritos acima, deprimem a disponibilidade de intermediários e resultam em enzimas com baixa atividade. Como indicado na FIGURA 1, a rota tradicional para malonil-CoA é a partir de acetil-CoA, mas uma porção considerável do acetil-CoA é direcionada para o ciclo de TCA. Desse modo, forma-se uma quantidade limitada de malonil-CoA (0,01-0,023 nmol/mg-1 em peso seco de célula, que representa apenas 0,5% do pool total de CoA) (Rathnasingh e outros, 2012). Além disso, malonil- CoA é um intermediário importante no metabolismo dos ácidos graxos e é difícil redirecionar esse composto para a via dos produtos aqui descritos. Além disso, a conversão de malonil-CoA em malonato semialdeído é realizada por uma redutase com baixa atividade a 37°C (atividade máxima a 50°C, diminuição de 65% a 37°C) e alto valor de Km para malonil-CoA (30 µM) (Rathnasingh e outros, 2012). A via instantânea é capaz de resolver esses problemas utilizando oxaloacetato como intermediário para a produção de malonato semialdeído.
[00290] Como representado na FIGURA 2, células de levedura apresentam duas vias para geração de oxaloacetato; através de atividade da piruvato carboxilase (gene pyc) ou malato desidrogenase (gene mdh). Como a piruvato carboxilase é uma enzima dependente de biotina com baixa atividade catalítica, sua rotatividade catalítica não é suficiente para proporcionar altos níveis de oxaloacetato. Além disso, o oxaloacetato gerado pelo ciclo de TCA não foi útil para alimentar altos fluxos de carbono. A via instantânea é capaz de resolver esses problemas produzindo oxaloacetato a partir de piruvato de fosfoenol (PEP) em vez de piruvato. Para atingir uma alta concentração de oxaloacetato, a enzima bacteriana fosfoenol piruvato carboxilase e/ou fosfoenol piruvato carboxiquinase é utilizada no micróbio recombinante. Em alguns aspectos, o micróbio de interesse é modificado pela introdução de uma ou mais fosfoenol piruvato carboxilase (ppc) e/ou uma ou mais fosfoenol piruvato carboxiquinase (pepck). Em alguns aspectos, uma ou mais fosfoenol piruvato carboxilase (ppc) e/ou uma ou mais fosfoenol piruvato carboxiquinase (pepck) são selecionadas a partir de fungos, leveduras, bactérias, insetos, animais, plantas ou flagelados. Em alguns aspectos, uma ou mais fosfoenol piruvato carboxilase (ppc) e/ou uma ou mais fosfoenol piruvato carboxiquinase (pepck) são de Escherichia coli.
[00291] Uma vez formado o oxaloacetato, a molécula pode ser convertida em malonato de semialdeído diretamente a partir do oxaloacetato ou através da formação intermediária de β-alanina, como representada na FIGURA 3.
[00292] Em alguns aspectos, a produção direcionada de malonato de semialdeído a partir de oxaloacetato é realizada por uma descarboxilase, tal como um alfa-ceto-isovalerato descarboxilase, formato de benzoíla descarboxilase ou um 2-oxoglutarato descarboxilase. Em alguns aspectos, o micróbio recombinante compreende uma ou mais alfa-cetoisovalerato descarboxilase (kdca), formato de benzoíla descarboxilase (mdlc) e/ou 2-oxoglutarato descarboxilase (oxdc). Em alguns aspectos, uma ou mais alfa-ceto- isovalerato descarboxilase, formato de benzoíla descarboxilase e/ou 2- oxoglutarato descarboxilase são selecionadas a partir de fungos, leveduras, bactérias, insetos, animais, plantas ou flagelados. Em alguns aspectos, a alfa-cetoisovalerato descarboxilase é de
Lactococcus lactis. Em alguns aspectos, formato de benzoíla descarboxilase é de Pseudomonas putida. Em alguns aspectos, a 2- oxoglutarato descarboxilase é de Oenococcus oeni ou Euglena gracilis.
[00293] A produção de malonato semialdeído através de β-alanina envolveu transaminação de oxaloacetato para aspartato por uma aspartato amino transferase (aat2), conversão de aspartato em β- alanina por uma aspartato descarboxilase (pand) e conversão de β- alanina em malonato semialdeído por uma β-alanina piruvato amino transferase (baat) e/ou β-alanina transaminase (pyd4). Em alguns aspectos, o micróbio recombinante compreende uma ou mais aspartato amino transferase, aspartato descarboxilase, β-alanina piruvato amino transferase e/ou β-alanina transaminase. Em alguns aspectos, a aspartato amino transferase, aspartato descarboxilase, β- alanina piruvato amino transferase e/ou β-alanina transaminase são selecionadas a partir de fungos, leveduras, bactérias, insetos, animais, plantas ou flagelados. Em alguns aspectos, a aspartato amino transferase é de Saccharomyces cerevisiae. Em alguns aspectos, a aspartato descarboxilase é de Tribolium castaneum. Em alguns aspectos, o aspartato descarboxilase é de Corynebacterium glutamicum. Em alguns aspectos, a beta-alanina piruvato amino transferase é de Bacillus cereus. Em alguns aspectos, a beta-alanina transaminase é de Lachancea kluyveri (Tabela 16).
[00294] Malonato semialdeído pode ser convertido em 3-HP por uma desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico. Em alguns aspectos, o micróbio recombinante compreende uma ou mais desidrogenases do ácido 3-hidroxipropiônico que podem ser, mas não se restringem as mesmas, enzimas com número EC 1.1.1.381, tais como aquelas listadas na Tabela 1. Em alguns aspectos, a desidrogenase de ácido 3-hidroxipropiônico é de fungos, leveduras, bactérias, insetos, animais,
plantas ou flagelados. Em alguns aspectos, a desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico (mcr-1) é de Chloroflexus aurantiacus. Em alguns aspectos, a desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico (adh) é de Arthrobacter enclensis. Em alguns aspectos, a desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico (mmsb) é de Bacillus cereus. Em alguns aspectos, a desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico (ydfg-0) é de Escherichia coli. Em alguns aspectos, a desidrogenase do ácido 3- hidroxipropiônico (YDF1) é de Saccharomyces cerevisiae. Em alguns aspectos, a desidrogenase do ácido 3-hidroxipropiônico é preferencialmente (HPD1) de Candida albicans. Tabela 1: Enzimas candidatas para conversão em 3-HP a partir de malonato semialdeído Enzimas Origem Número de UniProt Número ID SEQ de EC NO MCR- Chloroflexus aurantiacus YP_001636209.1 - 105 Nterm.Cau (NCBI ref. seq.) ADH.Ae Arthrobacter enclensis WP_058267460.1 - 106 (NCBI ref. seq.) MMSB.Bce Bacillus cereus NP_833760.1 - 107 (NCBI ref. seq.) YDFG-0.Ec Escherichia coli BAA15241.1 (seq. - 108 nucleotídeo) YMR226C Saccharomyces cerevisiae Q05016 1.1.1.381 109 (YDF1) HPD1 Candida albicans A0A1D8PQ07 110
[00295] Malonato semialdeído pode ser convertido em acetil-CoA por meio de uma reação de única etapa usando um malonato semialdeído desidrogenase ou por uma reação de duas etapas através de malonil-CoA, incluindo, uma malonil-CoA sintetase ou uma malonil- CoA redutase e uma malonil-CoA descarboxilase. Em alguns aspectos, uma pluralidade ou maioria do malonato semialdeído é produzida a partir de oxaloacetato. Em alguns aspectos, uma pluralidade ou maioria do malonato semialdeído não é produzido a partir de malonil-CoA. As enzimas candidatas para esta etapa podem ser, mas não se restringem as mesmas, enzimas com número EC
1.2.1.18/1.2.1.27, tais como aquelas listadas na Tabela 2. Tabela 2: Enzimas candidatas para conversão em acetil-CoA a partir de malonato semialdeído Genes Origem Número de Número EC ID SEQ UniProt NO MSD.Pa Pseudomonas Q9I702 1.2.1.18 111 aeruginosa MSD.Cal Candida albicans A0A1D8PM94 1.2.1.18 112 iolA Listeria Q8Y9Y4 1.2.1.27 113 monocytogenes iolA Bacillus subtilis A7BJC4 1.2.1.27 114 iolA Cupriavidus necator F8GGV48 1.2.1.18 115 mmsA Bacillus cereus A0A2C1ZL92 1.2.1.27 116 dddC Halomonas sp. HTNK1 C8YX90 - 117 iolA Lactobacillus casei A5YBJ3 1.2.1.27 118
[00296] Alternativamente, outra opção para produzir acetil-CoA é uma via de duas etapas a partir de oxaloacetato e através de malonil- CoA, incluindo, um ácido 2-ceto descarboxilase e um malonil-CoA descarboxilase. Ver, FIGURA 4, nenhuma das rotas apresentadas utiliza piruvato como um intermediário, sendo diferente de vias usuais e uma solução interessante para geração de acetil-CoA em condições anaeróbicas, em que a disponibilidade de acetil-CoA citosólico é comprometida.
[00297] Em alguns aspectos, o micróbio recombinante compreende um ou mais malonato semialdeído desidrogenase, malonil-CoA sintetase, malonil-CoA redutase, malonil-CoA descarboxilase e/ou 2- cetoácido descarboxilase. Em alguns aspectos, um ou mais malonato semialdeído desidrogenase, malonil-CoA sintetase, malonil-CoA redutase, malonil-CoA descarboxilase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase são a partir de fungos, leveduras, bactérias, insetos, animais, plantas ou flagelados. Em alguns aspectos, o malonato de semialdeído desidrogenase que pode ser usado apresenta, mas não se restringe as mesmas ao número EC 1.2.1.18/1.2.1.27, tais como aquelas listadas na Tabela 2, preferencialmente, MSD de Candida albicans ou Pseudomonas aeruginosa.
[00298] Em alguns aspectos, a malonil-CoA sintetase (MatB) é de Rhizobium trifolii. Em alguns aspectos, a malonil-CoA sintetase (AAE13) é de Arabidopsis thaliana. Em alguns aspectos, a malonil- CoA sintetase (ACSF3B) é do Homo sapiens. Em alguns aspectos, a malonil-CoA redutase (mcr) é de Chloroflexus aurantiacus.
[00299] Em alguns aspectos, a malonil-CoA descarboxilase (MatA) é de Rhizobium trifolii. Em alguns aspectos, a malonil-CoA descarboxilase (MLYCD) é do Homo sapiens. Em alguns aspectos, o ácido 2-ceto descarboxilase (kivd) é de Lactococcus lactis. Em alguns aspectos, o ácido 2-ceto descarboxilase (KdcA) é de Lactococcus lactis. Em alguns aspectos, o ácido 2-ceto descarboxilase (ARO10) é de Saccharomyces cerevisiae.
[00300] A partir de 3-HP, vários compostos podem ser produzidos, incluindo 1-propanol como exemplo. Para a produção de 1-propanol, o 3-HP precisa ser convertido em propionil-CoA por meio de uma reação de etapa única realizada por um propionil-CoA sintase ou por reações de várias etapas envolvendo uma 3-hidroxipropionil-CoA sintetase, 3- hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil-CoA redutase. Em seguida, o propionil-CoA precisa ser convertido em 1-propanol por um álcool bifuncional/aldeído desidrogenase (número EC 1.1.1.1/1.2.1.4/1.2.1.5, tal como listado na Tabela 7) ou por um aldeído desidrogenase (acetilante) (tabela 8) e um álcool desidrogenase (número EC
1.2.1.10/1.2.1.87, tal como listado na Tabela 9). Como representado na FIGURA 5, produção de 1-propanol tem uma alta demanda para NAD(P)H, não havendo via equilibrada.
[00301] Em alguns aspectos, o micróbio recombinante compreende uma ou mais propionil-CoA sintase, 3-hidroxipropionil-CoA sintetase, 3- hidroxipropionil-CoA desidratase, acrilil-CoA redutase, álcool/aldeído desidrogenase, álcool desidrogenase e/ou aldeído desidrogenase a partir de fungos, leveduras, bactérias, insetos, animais, plantas ou flagelados. Em alguns aspectos, a uma ou mais propionil-CoA sintase que pode ser usada são enzimas, mas não se limitam as mesmas, número EC 6.2.1.17/6.2.1.36, tais como aquelas listadas na Tabela 3. Em alguns aspectos, a 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/transferase que pode ser usada, mas não se restringe a mesma, é uma enzima com número EC 2.8.3.1/6.2.1.17/6.2.1.36, tais como aquelas listadas na Tabela 4. Em alguns aspectos, a 3-hidroxipropionil-CoA desidratase que pode ser usada, mas não se restringe a mesma, é uma enzima com número EC 4.2.1.116/4.2.1.55/4.2.1.150/4.2.1.17, tais como aquelas listadas na Tabela 5. Em alguns aspectos, a acrilil-CoA redutase é de, mas não se limita a mesma, os organismos e/ou corresponde aos genes indicados na Tabela 6. Em alguns aspectos, o álcool/aldeído desidrogenase, que pode ser usada, mas não se restringe a mesma, é uma enzima com número EC 1.1.1.1/1.2.1.4/1.2.1.5, tais como aquelas listadas na Tabela 7. Em alguns aspectos, outros candidatos para converter propionil-CoA em propanol são utilizados (número EC:
1.2.1.10/1.2.1.87, tais como listados na Tabela 8, número EC
2.3.1.8/2.7.2.1, tais como listados na Tabela 9 e número EC
2.3.1.8/2.7.2.1, tais como listados na Tabela 10).
Tabela 47: Enzimas candidatas para a conversão de oxaloacetato em acetil-CoA através de malonil-CoA Genes Origem Número de Uniprot Número EC ID SEQ NO AAE13 Arabidopsis thaliana Q8H151 6.2.1.- 276 matB Rhizobium trifolii - - ACSF3 Homo sapiens Q4G176 6.2.1.- 277 mcr Chloroflexus aurantiacus Q6QQP7 1.1.1.298 278 mata Rhizobium trifolii - - - MLYCD Homo sapiens O95822 4.1.1.9 279 kivD Lactococcus lactis D2BR82 - 280 kdcA Lactococcus lactis Q6QBS4 - 281 ARO10 Saccharomyces Q06408 - 282 cerevisiae Tabela 3: Enzimas candidatas para propionil-CoA sintase trifuncional Genes Origem Número de Número ID SEQ Uniprot EC NO PCS.Cau Chloroflexus aurantiacus Q8VRG6 6.2.1.17 119 PCS.Cag Chloroflexus aggregans B8G4K4 6.2.1.17 120 PCS.Rca Roseiflexus castenholzii WP_012121416.1 6.2.1.17 121 (genebank) PCS.No Natronococcus occultus WP_015322855.1 6.2.1.17 122 (NCBI ref Seq) PCS.Hj Halioglobus japonicus - 6.2.1.17 - NAP1_02725 Erythrobacter sp NAP1 A3WE14 6.2.1.36 123
4.2.1.116
1.3.1.84 AP017312.1 Aneurinibacillus soli - CP0022600.1 Porphyrobacter HT-58-2 - CP017057.1 Erythrobacter litoralis - CP020083.1 Blasromonas fulva -
Genes Origem Número de Número ID SEQ Uniprot EC NO CP003929.1 Natronococcus occultus -
CP007793.1 Azospirillum brasilense -
CP019450.1 Halioglobus japonicus -
Tabela 4: Enzimas candidatas para conversão em 3- hidroxipropionil-CoA a partir de 3-HP (3-hidroxipropionil-CoA sintetase/CoA transferase). Genes Organismo Número de Número ID SEQ Uniprot EC NO PCT-0.Cne Cupriavidus necator Q0K874 2.8.3.1 124 (pct) PCT-0.Cp Clostridium propionicum Q9L3F7 2.8.3.1 125 (pct) PCT or YdiF Megasphaera elsdenii G0VND6 2.8.3.1 126
PrpE Salmonella enterica P55912 6.2.1.17 127
Nmar_1309 Nitrosopumilus maritimus A9A2G6 - 128
Msed_1456 Metallosphaera sedula A4YGR1 6.2.1.36 129
PrpE Escherichia coli P77495 6.2.1.17 130
YdiF Cupriavidus necator Q0K874 2.8.3.1 131
STK_07830 Sulfolobus tokodaii Q973W5 6.2.1.36 132
Tabela 5: Enzimas candidatas para conversão em acrilil-CoA a partir de 3-hidroxipropionil-CoA (3-hidroxipropionil-CoA desidratase/enoil-CoA hidratase) Genes Organismo Número de Número ID SEQ Uniprot EC NO: HPCD.Mse Metallosphaera sedula A4YI89 4.2.1.116 133
HPDC.Bsp Bacillus sp.
A0A1B9ACR9 - 134
HPCD.Sac Sporanaerobacter A0A1M5Y529 - 135 acetigenes ENCD.Rp Ruegeria pomeroyi Q5LMB7 - 136
Genes Organismo Número de Número ID SEQ Uniprot EC NO: 3HPCD Sulfolobus tokodaii F9VNG3 4.2.1.116 137 Nmar_1308 Nitrosopumilus maritimus A9A2G5 4.2.1.116 138 Hpcd Chloroflexus aurantiacus - 4.2.1.116 - crt Clostridium acetobutylicum P52046 4.2.1.55/ 139
4.2.1.150 3-hidrobutiril-coa Clostridium pasteuranum L7EP14 4.2.1.55 140 desidratase crt Clostridium pasteuranum P81357 4.2.1.150 141 MELS_1449 Megasphaera elsdenii G0VQE2 4.2.1.55 142 Aflv_0566 Anoxybacillus flavithermus B7GGZ2 4.2.1.17 143 Tabela 6: Enzimas candidatas para conversão em propionil-CoA a partir de Acrilil-CoA (acrilil-CoA redutase). Genes Organismo Número de Número ID SEQ Uniprot EC NO ACR-0.Rp Ruegeria pomeroyi Q5LS56 1.3.1.84 144 ACR-0.Ec Escherichia coli P26646 1.3.1.84 145 ACR-0.Rs Rhodobacter sphaeroides Q3J6K9 1.3.1.84 146 acuI Ruegeria pomeroyi Q5LS56 1.3.1.84 147 acuI Rhodobacter sphaeroids Q3J6K9 1.3.1.84 148 β-ETF, α-ETF e Clostridium propionicum G3KIM6, 1.3.1.95 149 Propionil-coA G3KIM7 e desidrogenase G3KIM8 acuI Alcaligenes faecalis A0A3G6HCN9 1.3.1.95 150 ACR Sulfurisphaera tokodaii Q975C8 1.3.1.84 151 AcuI Escherichia coli P26646 1.3.1.84 152 Acr Metallosphaera sedula A4YGN2 1.3.1.84 153 Nmar_1565 Nitrosopumilus maritimus A9A5Y3 - 154
Tabela 7: Enzimas candidatas para conversão em propanol a partir de propionil-CoA (álcool/aldeído desidrogenase) Genes Origem Número de Número EC ID SEQ UniProt NO ADHE.Ca Clostridium Q9ANR5 - 155 acetobutylicum ADHE.Cbe Clostridium beijerinckii A0A1S8PSK3 - 156
ADHE.St Salmonella typhimurium P74880 - 157
ADHE.Car Clostridium arbusti WP_010241373.1 - 158 (NCBI Ref. seq.) adhE Escherichia coli P0A9Q7 1.1.1.1 159 adhP Escherichia coli P39451 1.1.1.1 160 bdhB Clostridium Q04945 1.1.1.1 161 acetobutylicum ADH2 Saccharomyces P00331 1.1.1.1 162 cerevisiae adhE Clostridium roseum - -
adhA Thermoanaerobacterium I3VX46 - 163 saccharolyticum ald6 Saccharomyces P54115 1.2.1.4 164 cerevisiae aldh3A1 Homo sapiens P30838 1.2.1.5 165
Tabela 8: Enzimas candidatas para conversão de propionil-CoA em propionaldeído (aldeído desidrogenase (acetilante)) Genes Origem Número de Número ID UniProt EC SEQ NO: MHPF.Ec Escherichia coli WP_097337838.1 1.2.1.10 166 (NCBI ref seq) MHPF.Ppu Pseudomonas putida YP_003617188.1 1.2.1.10 167 (NCBI ref seq) MHPF.Pse Pseudomonas sp.
CRM99844.1 1.2.1.10 168 (NCBI ref Seq)
Genes Origem Número de Número ID UniProt EC SEQ NO: MHPF.Pf Pseudomonas BAA09693.1 1.2.1.10 169 fluorescens (gene Bank) MHPF.Px Paraburkholderia Q79AF6 1.2.1.10 170 xenovorans PDUP.Sen Salmonella enterica AAD39015.1 - 171 (H9L4I6) PDUP1.Lmo listeria NP_464690.1 - 172 monocytogenes (Q8Y7V4) PDUP2.Lmo listeria A0A0E0UUX4 - 173 monocytogenes PDUP.Kp Klebsiella YP_001336844.1 - 174 pneumoniae aldH Acinetobacter sp.
A5JT11 1.2.1.10 175
Ald Clostridium Q9X681 1.2.1.10 176 beijerinckii Cphy1178 Clostridium A9KN57 - 177 phytofermentans tesF Comamonas Q83VZ4 1.2.1.10 178 testosteroni BN476_01309 Eubacterium hallii R6G856 - 179
PduP Lactobacillus Q845A7 - 180 collinoides EutE Lactobacillus reuteri A0A1B7LQN5 - 181
HsaG Mycobacterium A0A2I7WCV7 1.2.1.10 182 tuberculosis MhpF Mycobacterium P9WQH3 1.2.1.10 183 tuberculosis bphJ Paraburkholderia Q79AF6 1.2.1.10 184 xenovorans 1.2.1.87 SAMN04244550_00489 Rhodobacter A0A1G7D6K3 - 185 capsulatus hsaG Rhodococcus jostii Q0S816 1.2.1.10 186
RPC_1174 Rhodopseudomonas Q21A49 - 187 palustris
Genes Origem Número de Número ID UniProt EC SEQ NO: TTHB247 Thermus Q53WH9 1.2.1.10 188 thermophilus 1.2.1.87
Tabela 9: Enzimas candidatas para conversão em propanol a partir de propionaldeído Genes Origem Número de Número EC ID SEQ UniProt NO alrA Acinetobacter sp Q9F1R1 1.1.1.2 189 Aldeído redutase Acinetobacter sp.
Q9F1Q8 1.1.1.2 190 bdhI Clostridium Q04944 1.1.1.- 191 acetobutylicum bdhII Clostridium Q04945 1.1.1.- 192 acetobutylicum adhA Corynebacterium A0A169S5A7 1.1.1.1 193 glutamicum Q8NLX9 194 yqhD Escherichia coli Q46856 1.1.1.2 195 yjgB Escherichia coli P27250 1.1.1.2 196 adhP Escherichia coli P39451 1.1.1.1 197 PduQ Propionibacterium A0A2C8A2U1 - 198 freudenreichii ADH1 Saccharomyces P00330 1.1.1.1 199 cerevisiae ADH2 Saccharomyces P00331 1.1.1.1 200 cerevisiae ADH4 Saccharomyces P10127 1.1.1.1 201 cerevisiae ADH6 Saccharomyces Q04894 1.1.1.2 202 cerevisiae PduQ (adhE_2) Salmonella enterica H9L4H8 - 203 Adh Sulfolobus tokodaii Q96XE0 1.1.1.1 204 adhA Synechocystis sp P74721 - 205 adhA Zymomonas mobilis P20368 1.1.1.1 206
Tabela 10: Enzimas candidatas para conversão em propionaldeído a partir de propionil-CoA Genes Origem Número de UniProt Número EC ID SEQ
NO PTA.Cg Corynebacterium WP_011015350 (NCBI 2.3.1.8 207 glutamicum ref seq) ACKA.Cg Corynebacterium P77845 2.7.2.1 208 glutamicum
[00302] A partir de acetil-CoA, vários compostos podem ser produzidos, sendo possível citar acetona como exemplo. Para a produção de acetona, o acetil-CoA precisa ser convertido em acetoacetil-CoA por uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase. Alternativamente, o acetoacetil-CoA pode ser formado através de malonil-CoA por acetoacetil-CoA sintase. Uma vez formado o acetoacetil-CoA, sua conversão em acetoacetato pode ser feita por uma acetoacetil-CoA transferase ou através de HMG-CoA por hidroximetilglutaril-CoA sintase e hidroximetilglutaril-CoA liase. A conversão de acetoacetato em acetona é feita por um acetoacetato descarboxilase. Como representado na FIGURA 6, a produção de acetona apresenta um excesso de NAD(P)H, sendo também uma via não equilibrada.
[00303] Em alguns aspectos, o micróbio recombinante compreende uma ou mais tiolase, acetil-CoA acetiltransferase, acetoacetil CoA sintase, acetoacetil-CoA transferase, hidroximetilglutaril-CoA sintase, hidroximetilglutaril-CoA sintase, hidroximetilglutaril-CoA sintase, hidroximetilglutaril-CoA liase e/ou acetoacetato descarboxilase a partir de fungos, levedura, bactéria, inseto, animal, planta ou flagelado. Em alguns aspectos, a uma ou mais tiolase ou acetil-CoA acetiltransferase que pode ser usada apresentam, mas não se restringe as mesmas, ao número EC 2.3.1.9, tais como aquelas listadas na Tabela 11 e acetoacetil-CoA transferase que pode ser usada apresenta, mas não se restringe as mesmas, ao número EC 2.8.3.8/2.8.3.9, tais como aquelas listadas na Tabela 12, hidroximetilglutaril-CoA sintase, hidroximetilglutaril-CoA liase e/ou acetoacetato descarboxilase que podem ser usadas apresentam, mas não se restringe as mesmas, uma enzima com número EC 4.1.1.4, tais como aquelas listadas na Tabela
13. Tabela 11: Enzimas candidatas para conversão em acetoacetil- CoA a partir de acetil-CoA (acetiltransferase) Genes Origem Número de Número EC ID SEQ NO UniProt ERG10 Saccharomyces cerevisiae P41338 2.3.1.9 209 thlA Clostridium acetobutylicum P45359 2.3.1.9 210 atoB Escherichia coli P76461 2.3.1.9 211 H16_B0759 Cupriviadus necator Q0K368 2.3.1.9 212 Msed_0656 Metallosphaera sedula A4YEH9 2.3.1.9 213 AAT1 Arabidopsis thaliana Q8S4Y1 2.3.1.9 214 Tabela 12: Enzimas candidatas para conversão em acetoacetato a partir de acetoacetil-CoA (acetoacetil-CoA transferase/sintase) Genes Origem Número de Número EC ID SEQ UniProt NO ATOA.Ec/ATOD.Ec Escherichia coli P76459 2.8.3.8 215 P76458 216 C7401_123119 Paraburkholderia A0A328X8N5 2.8.3.8 217 unamae YdiF Escherichia coli Q8X5X6 2.8.3.8 218 ctfA.Ca/ ctfB Clostridium P33752 2.8.3.9 219 acetobutylicum P23673 220 ctfA./ ctfB Clostridium U5MXH7 2.8.3.9 221 saccharobutylicum U5MUQ0 222 ctfA/ctfB Escherichia coli 2.8.3.9 223
Genes Origem Número de Número EC ID SEQ UniProt NO A0A2X1MWL8 224 A0A0K5TTP4 ERG13 Saccharomyces P54839 2.3.3.10 283 cerevisiae yngG Bacillus subtilis O34873 4.1.3.4 284 nphT7 Streptomyces sp. D7URV0 2.3.1.194 285 Tabela 13: Enzimas candidatas para conversão em acetona a partir de acetoacetato (acetoacetato descarboxilase) Genes Origem Número de Número EC ID SEQ NO UniProt Adc.Ca Clostridium P23670 4.1.1.4 225 acetobutylicum Adc.Cbe Clostridium beijerinckii A6M020 4.1.1.4 226 Adc Clostridium P23650 4.1.1.4 227 pasteurianum Adc Pseudomonas Q8XR10 4.1.1.4 228 solanacearum Adc Paraburkholderia Q141C9 4.1.1.4 229 xenovorans Adc.Pp Paenibacillus A0A378XWA9 - 230 polymyxa
[00304] Para resolver a alta demanda de NAD(P)H relacionada à produção de derivados de 3-HP e excesso de NADH relacionado à produção de derivados de acetil-CoA, sugerimos a combinação de ambas as vias para resultar em uma via equilibrada. Como representado na FIGURA 7, a combinação dessas vias para 1- propanol e acetona, por exemplo, leva a um alto rendimento total de 0,437 g de solventes/g de glicose, assumindo que esses produtos sejam produzidos em uma proporção de 1:1 (acetona:1-propanol) em condições aeróbicas (FIGURA 15). A via de coprodução proposta é neutra para redox e com um pequeno excesso de ATP, resulta em uma produção mais eficiente e de alto rendimento dos compostos desejados. Além disso, a via equilibrada tem potencial para ser realizada em uma condição anaeróbica, o que pode representar um potencial para um processo de menor custo de produção, devido às vantagens já mencionadas no parágrafo [0264], como redução de CAPEX e OPEX com compressores de ar, e diminuição de CAPEX com fermentadores de produção. Além disso, há uma melhora no rendimento em condições anaeróbicas, em que a coprodução de 1- propanol e acetona leva a um maior rendimento total de 0,46 g de solventes/g de glicose, assumindo que esses produtos sejam produzidos em uma proporção 3:4 (acetona:1-propanol) (FIGURA16).
[00305] Em alguns aspectos, 2-propanol pode ser obtido por desidrogenação da acetona e pode ser coproduzido com 1-propanol. Os requisitos de NADPH/NADH na via derivada de 3-HPA complementam o excesso de NADPH/NADH da via derivada de acetil- CoA. A combinação dessas vias para a produção de 1-propanol e 2- propanol leva a um alto rendimento total de 0,39 g de solventes/g de glicose, assumindo que esses produtos sejam produzidos na proporção 2:5 (1-propanol:2-propanol), em condições aeróbicas, de acordo com a FIGURA17.
[00306] Em alguns aspectos, o 2-propanol pode ser obtido por desidrogenação enzimática de acetona e pode ser coproduzido com 1- propanol em condições anaeróbicas, o que leva a um maior rendimento total de 0,44 g de solventes/g de glicose, assumindo que esses produtos sejam produzidos em uma proporção de 1:1 (1- propanol:2-propanol), em condições anaeróbicas, de acordo com a FIGURA 18. Esse processo pode representar um potencial para um processo de menor custo, em relação a um processo aeróbico.
Tabela 14: Enzimas para converter acrilil-CoA em ácido acrílico (acil-CoA hidrolase ou tioesterase) Genes Origem Número de UniProt Número ID SEQ NO:
EC yciA Escherichia coli P0A8Z0 - 231 ACIAD3139 Escherichia coli Q6F7Y5 - 232 Tabela 15: Enzimas candidatas para 2-propanol desidrogenase Genes Origem Número de UniProt Número
EC PRDH.Dr Devosia riboflavina - - PRDH.Sp Sporotrichum - - pulverulentum Tabela 16: Genes envolvidos em produção de malonato semialdeído por via β -alanina Genes Origem Número de UniProt Número ID SEQ
EC NO aat2 Saccharomyces P23542 2.6.1.1 233 cerevisiae PAND Corynebacterium A4QAD0 4.1.1.11 234 glutamicum PAND.Tca Tribolium castaneum A7U8C7 4.1.1.11 275 Baat Saccharomyces P47176 2.6.1.42 235 cerevisiae PYD4.Lk Lachancea kluyveri A5H0J5 2.6.1.19 236
Tabela 17: Genes de glicólise Genes Origem Número de Número EC ID SEQ NO UniProt PEPCK Escherichia coli P22259 4.1.1.49 237 GAPDH Saccharomyces cerevisiae P00359 1.2.1.13 238 GDP1.Kl Kluyveromyces lactis Q8J0C9 1.2.1.13 239 PYK1 Saccharomyces cerevisiae P00549 2.7.1.40 240 gapC Clostridium acetobutylicum Q97D25 1.2.1.13 241 Métodos de Detecção de Modificação Genética
[00307] A presente invenção ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detectar os micróbios aqui ensinados. Em alguns aspectos, a invenção proporciona métodos para detectar as cepas parentais de WT. Em outros aspectos, a invenção proporciona métodos para detectar os micróbios de engenharia ou modificados derivados de cepas progenitoras ou de WT. Em alguns aspectos, a presente invenção proporciona métodos de identificação de alterações genéticas em um micróbio.
[00308] Em alguns aspectos, os métodos de engenharia genômica da presente invenção levam à criação de sequências não naturais de "junção" de nucleotídeos nos micróbios modificados. Essas junções nucleotídicas que não ocorrem naturalmente podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética específica em um micróbio aqui ensinado.
[00309] As técnicas presentes são capazes de detectar essas junções nucleotídicas que não ocorrem naturalmente através da utilização de métodos quantitativos especializados de RCP, incluindo, iniciadores e sondas projetados exclusivamente. Em alguns aspectos, as sondas da invenção se ligam às sequências de junção nucleotídica que não ocorrem naturalmente. Em alguns aspectos, a RCP tradicional é utilizada. Em outros aspectos, a RCP em tempo real é utilizada. Em alguns aspectos, a RCP quantitativa (qPCR) é utilizada. Em alguns aspectos, os métodos de RCP são usados para identificar sequências heterólogas que foram inseridas no ADN genômico ou no ADN extragenômico dos micróbios.
[00310] Desse modo, a invenção pode abranger a utilização de dois métodos comuns para a detecção de produtos de RCP em tempo real: (1) corantes fluorescentes não específicos que se intercalam com qualquer ADN de fita dupla e (2) sondas de ADN específicas a sequências consistindo em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente que permite detecção somente após a hibridação da sonda com sua sequência complementar. Em alguns aspectos, apenas a junção nucleotídica que não ocorre naturalmente será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico ou pela utilização de uma sonda de hibridação específica. Em outros aspectos, os iniciadores da invenção são escolhidos de tal modo que os iniciadores flanqueiam cada lado de uma sequência de junção, de tal modo que, se ocorrer uma reação de amplificação, então a sequência de junção está presente.
[00311] Aspectos da invenção envolvem moléculas de sequência de junção nucleotídica que não ocorrem naturalmente em si, juntamente com outras moléculas nucleotídicas que são capazes de se ligar às referidas sequências de junção nucleotídica que não ocorrem naturalmente sob condições de hibridação leves a rigorosas. Em alguns aspectos, as moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às sequências de junção de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente sob condições de hibridação leves a rigorosas são denominadas "sondas de nucleotídeos".
[00312] Em alguns aspectos, o ADN genômico pode ser extraído a partir das amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da invenção usando RCPq. Os iniciadores utilizados na reação RCPq podem ser iniciadores projetados por Primer Blast
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar regiões únicas do genoma do tipo selvagem ou regiões únicas das cepas mutantes não intergenéricas projetadas. A reação de RCPq pode ser realizada usando o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), usando apenas os iniciadores de amplificação direta e reversa; alternativamente, o kit Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan contendo uma marca de corante FAM na extremidade 5', um supressor ZEN interno e um ligante de ranhura menor e um supressor fluorescente na a extremidade 3’ (Tecnologias Integradas de ADN).
[00313] A reação quantitativa em cadeia da polimerase (RCPq) é um método de quantificar, em tempo real, a amplificação de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos. A quantificação em tempo real do ensaio de RCP permite a determinação da quantidade de ácidos nucleicos sendo gerados pelas etapas de amplificação de RCP comparando os ácidos nucleicos de amplificação de interesse e uma sequência de ácido nucleico de controle apropriada, que pode atuar como um padrão de calibração.
[00314] As sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em ensaios de RCPq que requerem uma especificidade aumentada para quantificar as sequências-alvo de ácido nucleico. As sondas TaqMan compreendem uma sonda oligonucleotídica com um fluoróforo ligado à extremidade 5’ e um supressor ligado à extremidade 3’ da sonda. Quando as sondas TaqMan permanecem como estão com as extremidades 5’ e 3’ da sonda em contato próximo umas com as outras, o supressor impede a transmissão de sinal fluorescente a partir do fluoróforo. As sondas TaqMan são projetadas para emparelhar dentro de uma região do ácido nucleico amplificada por um conjunto específico de iniciadores. À medida que a polimerase Taq estende o iniciador e sintetiza a fita nascente, a atividade da exonuclease 5’ a 3’ da polimerase Taq degrada a sonda que se emparelhou no molde. Essa degradação da sonda libera o fluoróforo, quebrando assim a proximidade ao supressor e permitindo fluorescência do fluoróforo. A fluorescência detectada no ensaio RCPq é diretamente proporcional ao fluoróforo liberado e à quantidade de ADN presente na reação.
[00315] As características de RCPq permitem ao profissional eliminar a etapa pós-amplificação de trabalho intensivo de preparação da eletroforese em gel, que geralmente é necessária para observação dos produtos amplificados de ensaios tradicionais de RCP. Os benefícios de RCPq sobre a RCP convencional são consideráveis e incluem maior velocidade, facilidade de uso, reprodutibilidade e capacidade quantitativa. Micróbios
[00316] Conforme descritos neste relatório, em alguns aspectos, os micro-organismos recombinantes são micro-organismos procarióticos. Em alguns aspectos, os micro-organismos procarióticos são bactérias. "Bactérias", ou "eubactérias", referem-se a um domínio de organismos procarióticos. As bactérias incluem pelo menos onze grupos distintos, como seguem: (1) bactérias Gram-positivas (gram+), das quais existem duas subdivisões principais:
[00317] (1) grupo G + C alto (Actinomicetos, Micobactérias, Micrococos, outros) (2) grupo G + C baixo (Bacillus, Clostridia, Lactobacillus, Staphylococci, Streptococci, Mycoplasmas); (2) Proteobactérias, por exemplo, bactérias Gram-negativas fotossintéticas roxas + não fotossintéticas (inclui a maioria das bactérias gram-negativas "comuns"); (3) cianobactérias, por exemplo, fototróficos oxigênicos; (4) espiroquetas e espécies relacionadas; (5) Planctomyces; (6) Bacteróides, Flavobactérias; (7) clamídia; (8) bactérias verdes de enxofre; (9) Bactérias verdes sem enxofre
(também fototróficos anaeróbicos); (10) micrococos radiorresistentes e relativos; (11) Termotoga e Termosifo termofilos.
[00318] "Bactérias gram-negativas" incluem cocos, bastonetes não - entéricos e bastonetes entéricos. Os gêneros de bactérias Gram- negativas incluem, por exemplo, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema e Fusobacterium.
[00319] "Bactérias gram-positivas" incluem cocos, bastões não esporulados e bastonetes esporulados. Os gêneros de bactérias gram- positivas incluem, por exemplo, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces.
[00320] Em alguns aspectos, os micro-organismos da presente invenção são fungos ou leveduras.
[00321] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo eucariótico. Em alguns aspectos, o micro-organismo eucariótico é uma levedura. Em aspectos exemplares, a levedura é membro de um gênero selecionado do grupo que consiste de Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodysporon e Myxozyma.
[00322] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo procariótico. Em aspectos exemplares, o micro- organismo procariótico é membro de um gênero selecionado do grupo consistindo de Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella,
Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium e Brevibacterium.
[00323] Em alguns aspectos, o micro-organismo para uso nos métodos da presente invenção pode ser selecionado do grupo que consiste de Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Myxozyma, Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium e Brevibacterium.
[00324] Em alguns aspectos, um micróbio resultante dos métodos descritos neste relatório pode ser uma espécie selecionada de qualquer um dos seguintes gêneros: Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema, Fusobacterium, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Saccharomyces, Pichia e Aspergillus.
[00325] Em alguns aspectos, micro-organismos para uso nos métodos da presente invenção incluem Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Candida krusei, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis e Terrisporobacter glycolicus.
[00326] Em alguns aspectos, os micro-organismos recombinantes são derivados de um micro-organismo parental selecionado de qualquer um dos micro-organismos descritos neste relatório.
[00327] Em alguns aspectos, a levedura pode ser cultivada mais rapidamente e em uma densidade mais alta que as bactérias, e não requer um ambiente asséptico na configuração comercial/industrial. Em alguns aspectos, as células de levedura podem ser mais facilmente separadas do meio de cultura do que as bactérias, simplificando, o processo de extração e purificação do produto.
[00328] Em alguns aspectos, o(s) micro-organismo(s) utilizado(s) nos métodos da presente invenção incluem leveduras selecionadas do gênero Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus ou Malassezia.
[00329] Em alguns aspectos, a levedura pode ser uma levedura positiva para Crabtree (macieira silvestre) selecionada do gênero Saccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora, Zigosaccharomyces ou Brettanomycces.
[00330] Em alguns aspectos, a levedura pode ser selecionada de
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces thermotolerens, Torulaspora globosa e Torulaspora glabrata.
[00331] Em alguns aspectos, a levedura pode ser de gênero Saccharomyces. Em alguns aspectos, a levedura pode ser Saccharomyces cerevisiae.
[00332] Em alguns aspectos, uma levedura recombinante da presente invenção é capaz de descarboxilar oxaloacetato em malonato de semialdeído devido à inserção de pelo menos uma sequência de ácido nucleico ou gene descrito neste relatório. Em alguns aspectos, uma levedura recombinante da presente invenção é ainda capaz de coproduzir um ou mais derivados de 3-HP e acetil-CoA. Em alguns aspectos, o malonato semialdeído é o substrato para a coprodução de um ou mais derivados de 3-HP e acetil-CoA.
[00333] Os termos "micro-organismo recombinante" e "célula hospedeira recombinante" são utilizados alternadamente neste relatório e referem-se aos micro-organismos que foram geneticamente modificados para expressar ou superexpressar enzimas endógenas, para expressar enzimas heterólogas, tais como aquelas incluídas em um vetor, em um construto de integração, ou que apresentam uma alteração na expressão de um gene endógeno. Por "alteração", entende-se que a expressão do gene, ou nível de uma molécula de ARN ou moléculas de ARN equivalentes que codificam um ou mais polipeptídeos ou subunidades polipeptídicas, ou atividade de um ou mais polipeptídeos ou subunidades polipeptídicas é induzida ou reprimida, de tal modo que o nível de expressão, ou atividade seja maior ou menor que o observado na ausência da alteração. Por exemplo, o termo "alterar" pode significar "inibir", mas o uso da palavra "alterar" não se limita a essa definição. Entende-se que os termos "micro-organismo recombinante" e "célula hospedeira recombinante" se referem não apenas ao microrganismo recombinante particular, mas também à progênie ou progênie potencial de tal micro-organismo. Como certas modificações podem ocorrer em gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie, não pode, de fato, ser idêntica à célula parental, mas ainda está incluída no escopo do termo conforme utilizado neste relatório. Condições de Cultura
[00334] Cultura dos micro-organismos utilizados nos métodos da invenção pode ser conduzida usando qualquer número de processos conhecidos no estado da técnica para cultura e fermentação de substratos usando os micro-organismos da presente invenção.
[00335] A fermentação pode ser realizada em qualquer biorreator adequado, tais como biorreator de tanque de agitação contínua, biorreator de coluna de bolhas, biorreator de transporte aéreo, biorreator de leito fluidizado, biorreator de leito embalado, foto- biorreator, reator de célula imobilizada, reator de leito gotejador, reator biofilme de leito móvel, coluna de bolhas, fermentador de elevação de gás, reatores de membrana, tal como biorreator de membrana de fibra oca. Em alguns aspectos, o biorreator compreende um primeiro reator de crescimento no qual os micro-organismos são cultivados, e um segundo reator de fermentação, no qual o caldo de fermentação do reator de crescimento é alimentado e no qual a maior parte do produto de fermentação é produzida. Em alguns aspectos, o biorreator realiza simultaneamente a cultura de micro-organismos e a produção do produto de fermentação a partir de fontes de carbono, tais como substratos e/ou matérias-primas fornecidas.
[00336] Em alguns aspectos, a presente invenção refere-se ao uso de um micróbio recombinante, para a produção de (1) malonato de semialdeído, um de seus sais, ou um derivado de malonato de semialdeído; (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais ou um derivado de acetil-CoA. Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante é uma levedura.
[00337] Em alguns aspectos, a presente invenção refere-se ainda a um método para produzir (1) malonato de semialdeído, um de seus sais ou um derivado de malonato de semialdeído; (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais ou um derivado de acetil-CoA; o método compreendendo as etapas de:
[00338] (a) cultivar um micro-organismo recombinante descrito neste relatório em um meio de cultura; e
[00339] (b) recuperar o (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais, ou um derivado de acetil- CoA a partir do meio de cultura. Em alguns aspectos, o micro- organismo recombinante é uma levedura.
[00340] Em alguns aspectos, os microrganismos aqui descritos são cultivados sob uma temperatura na faixa de cerca de 20°C a cerca de 37°C, preferencialmente, sob uma temperatura que va ria de 27°C a 34°C, em um meio de cultura apropriado.
[00341] Em alguns aspectos, a levedura recombinante da presente invenção pertence às espécies de Saccharomyces cerevisiae, a temperatura pode variar de 27°C a 34°C, em um meio de cultura apropriado.
[00342] Em alguns aspectos, meios de crescimento adequados para levedura são meios comuns preparados comercialmente, tal como caldo que inclui base de nitrogênio de levedura, sulfato de amônio e dextrose como fonte de carbono/energia) ou meio YPD, uma mistura de peptona, extrato de levedura e dextrose em proporções ideais para a maioria de crescimento. Em alguns aspectos, também podem ser utilizados outros meios de crescimento definidos ou sintéticos e o meio apropriado para o crescimento do micro-organismo particular será conhecido por aquele versado no estado da técnica de microbiologia ou ciência de fermentação.
[00343] Exemplos de meios de cultura para uma levedura recombinante da presente invenção são descritos por D. Burke e outros, Methods in yeast Genetics - A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (2000).
[00344] Em alguns aspectos, faixas de pH adequadas para a fermentação podem estar entre pH 3,0 e pH 7,5, em que pH 4,5 a pH 6,5 é preferido como a condição inicial.
[00345] Em alguns aspectos, fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas, condições microaeróbicas ou condições anaeróbicas.
[00346] Em alguns aspectos, a quantidade de produto(s) no meio de fermentação pode ser determinada utilizando vários métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho (CLAD) ou cromatografia gasosa (CG).
[00347] Em alguns aspectos, o presente processo pode empregar um método descontínuo de fermentação. Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado em que a composição do meio é definida no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Desse modo, no início da fermentação, o meio é inoculado com o(s) organismo(s) desejado(s) e é permitido que a fermentação ocorra sem adicionar nada ao sistema. Tipicamente, entretanto, uma fermentação em "batelada" é um método descontínuo com relação à adição de fonte de carbono e são frequentemente feitas tentativas em controlar fatores tais como temperatura, pH e concentração de oxigênio. Nos sistemas descontínuos, as composições de metabolito e biomassa do sistema alteram constantemente até o momento quando a fermentação é interrompida. Nas culturas descontínuas, as células progridem através de uma fase estática de atraso para uma fase log de alto crescimento e, finalmente, para uma fase estacionária em que a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Se não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrerão. As células em fase logarítmica geralmente são responsáveis pela maior parte da produção do produto final ou intermediário.
[00348] Em alguns aspectos, um sistema descontínuo alimentado também pode ser usado. Um sistema descontínuo alimentado é similar a um sistema descontínuo típico, com a exceção de que o substrato da fonte de carbono é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. Os sistemas descontínuos alimentados são úteis quando a repressão por catabólito (por exemplo, repressão à glicose) é capaz de inibir o metabolismo das células e em que é desejável apresentar quantidades limitadas de substrato nos meios. A medição da concentração real de substrato em sistemas descontínuos alimentados é difícil e, portanto, estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e pressão parcial de gases residuais, tal como CO2.
[00349] Uma variedade de fermentações é descrita em Sunderland e outros, (1992), aqui incorporado como referência. Em alguns aspectos, a fermentação é realizada em modo descontínuo, sendo considerado que o método seria adaptável à fermentação contínua.
[00350] Fermentação contínua é um sistema aberto em que um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade alta constante, em que as células estão primariamente em crescimento na fase logarítmica.
[00351] Fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final. Por exemplo, um método manterá um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou nível de nitrogênio, sob uma taxa fixa e permitirá que todos os outros parâmetros variem. Em outros sistemas, vários fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto a concentração celular, medida pela turbidez do meio, é mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter as condições de crescimento em estado estacionário e, desse modo, a perda de células devido à extração do meio deve ser equilibrada com a taxa de crescimento de células na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como, técnicas para maximizar a taxa de formação de produtos, são bem conhecidos no estado da técnica de microbiologia industrial.
[00352] Em alguns aspectos, os métodos podem ser praticados usando processos descontínuos, descontínuos alimentados ou contínuos e que qualquer modo conhecido de fermentação seria adequado. Adicionalmente, consideram-se que as células podem ser imobilizadas em um substrato como catalisadores de células inteiras e submetidas às condições de fermentação para produção.
[00353] A fim de melhorar ainda a produção de (1) malonato de semialdeído, (2) 3-HP e acetil-CoA; um de seus sais, ou derivados destes, uma modalidade particular pode consistir em cultivar as células de levedura recombinantes em um meio de cultura apropriado, tal como mencionado acima, em que o meio de cultura compreende uma quantidade ótima de fonte de carbono, especialmente glicose.
[00354] Em alguns aspectos, as células são cultivadas em um meio de cultura ideal durante apenas uma parte de toda a duração da cultura. Em alguns aspectos, as células de levedura são incubadas nesse meio de cultura ideal 10 horas ou mais após o início da cultura, o que abrange 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 horas ou mais após o início da cultura.
[00355] Em alguns aspectos, as células são cultivadas em um meio de cultura ideal durante um período de tempo que varia de 5 horas a 15 horas, o qual inclui de 6 horas a 10 horas, por exemplo, 8 horas após o início da cultura.
[00356] Em alguns aspectos, a fonte de carbono compreendida no meio de cultura ideal consiste de glicose. Em modalidades preferidas, o meio de cultura ideal compreende 12% p/p ou mais de glicose, incluindo, 15% p/p ou mais de glicose. Em modalidades preferidas, o meio de cultura ideal compreende no máximo 40% p/p de glicose, o qual inclui no máximo 35% p/p de glicose.
[00357] Em alguns aspectos, um método de produção (1) malonato semialdeído, (2) 3-HP e (3) acetil-CoA; um de seus sais, ou derivados dos mesmos, podem compreender adicionalmente, entre etapas (a) e (c), uma etapa intermediária (b) consistindo de cultivar as células de levedura nesse meio de cultura ideal. Isolamento/Purificação do produto
[00358] Em alguns aspectos, o método de produção (1) de malonato semialdeído, um de seus sais, ou um derivado de malonato de semialdeído; (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais, ou um derivado de acetil-CoA compreende uma ou mais etapas de isolamento de pelo menos o (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais ou um derivado de acetil-CoA. Em alguns aspectos, o método compreende, em uma primeira reação, produzir e isolar/purificar malonato de semialdeído, um de seus sais ou um derivado de malonato semialdeído em uma fermentação para adicionar o produto purificado/isolado a uma segunda reação (fermentação/biorreator) para conduzir a produção de (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais, ou um derivado de acetil-CoA.
[00359] Em alguns aspectos, recuperação de um ou mais de (1) malonato de semialdeído, um de seus sais, ou um derivado de malonato de semialdeído; (2) 3-HP, um de seus sais, ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais ou um derivado de acetil- CoA a partir de um meio de cultura pode ser alcançada por várias técnicas, incluindo, mas não se limitam as mesmas, destilação, remoção de gás, pervaporação, precipitação seletiva, ou extração líquida.
[00360] Em alguns aspectos, o micro-organismo recombinante exporta (1) malonato de semialdeído, um de seus sais, ou um derivado de malonato de semialdeído; (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais, ou um derivado de acetil-CoA para o meio de cultura, simplificando assim o processo de cultura.
[00361] Em alguns aspectos, os produtos são referidos como um ou mais de (1) malonato de semialdeído, um de seus sais ou um derivado de malonato de semialdeído; (2) 3-HP, um de seus sais ou um derivado de 3-HP; e (3) acetil-CoA, um de seus sais, ou um derivado de acetil-CoA.
[00362] Em alguns aspectos, os produtos são coletados do meio através de destilação. Em alguns aspectos, a destilação pode envolver um componente diferente do meio de cultura, a fim de facilitar o isolamento dos produtos através da formação de azeótropo e, notavelmente, com água. Esse componente é um solvente orgânico, tais como cicloexano, pentano, butanol, benzeno, tolueno,
tricloloetileno, octano, éter dietílico ou uma mistura dos mesmos.
[00363] Em alguns aspectos, a remoção de gás é obtida com um gás de remoção escolhido entre hélio, argônio, dióxido de carbono, hidrogênio, nitrogênio ou misturas dos mesmos. Em alguns aspectos, a extração líquida é obtida com um solvente orgânico como a fase hidrofóbica, tais como pentano, hexano ou dodecano.
[00364] Em alguns aspectos, uma vez atingido o número desejado de micróbios, o meio gasto é submetido a um processo para isolamento dos produtos. Em alguns aspectos, uma vez atingida a densidade desejada de micróbios, o meio gasto é submetido a um processo para isolamento dos produtos. Em alguns aspectos, os micróbios são lisados e os detritos celulares são sedimentados fora da solução em uma centrífuga. Em alguns aspectos, os produtos coletados a partir da fração de péletes celulares ou da fração líquida com a ajuda de um processo de extração por solvente ou um processo de ultracentrifugação em gradiente. Composições Microbianas
[00365] Em alguns aspectos, os micróbios da invenção são combinados em composições microbianas.
[00366] Em alguns aspectos, as composições microbianas da presente invenção são sólidas. Nos casos em que são utilizadas composições sólidas, pode ser desejável incluir um ou mais materiais transportadores, incluindo, mas não se limitam aos mesmos: terras minerais tais como sílicas, talco, caulim, calcário, giz, argila, dolomita, terra diatomácea; sulfato de cálcio; sulfato de magnésio; óxido de magnésio; zeólitos, carbonato de cálcio; carbonato de magnésio; trealose; quitosana; goma-laca; albuminas; amido; leite desnatado em pó; soro de leite doce em pó; maltodextrina; lactose; inulina; dextrose; e produtos de origem vegetal, tais como farinhas de cereais, farelo de casca de árvore, farelo de madeira e farelo de casca de nozes.
[00367] Em alguns aspectos, as composições microbianas da presente invenção são líquidas. Em outros aspectos, o líquido compreende um solvente que pode incluir água ou um álcool ou uma solução salina ou carboidrato. Em alguns aspectos, as composições microbianas da presente invenção incluem ligantes tais como polímeros, carboximetilcelulose, amido, álcool polivinílico e similares.
[00368] Em alguns aspectos, composições microbianas da presente invenção compreendem sacarídeos (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, oligossacarídeos e similares), sacarídeos poliméricos, lipídios, lipídios poliméricos, lipopolissacarídeos, proteínas, proteínas poliméricas, lipoproteínas, ácidos nucleicos, polímeros de ácidos nucleicos, sílica, sais inorgânicos e combinações dos mesmos. Em aspecto adicional, as composições microbianas compreendem polímeros de ágar, agarose, gelrita, goma gelana e similares. Em alguns aspectos, as composições microbianas compreendem cápsulas plásticas, emulsões (por exemplo, água e óleo), membranas e membranas artificiais. Em alguns aspectos, emulsões ou soluções poliméricas ligadas podem compreender composições microbianas da presente invenção. Ver, Harel e Bennett (Patente dos Estados Unidos 8.460.726 B2).
[00369] Em alguns aspectos, as composições microbianas da presente invenção ocorrem em uma forma sólida (por exemplo, esporos liofilizados dispersos) ou em uma forma líquida (micróbios intercalados em um meio de armazenamento). Em alguns aspectos, as composições microbianas da presente invenção são adicionadas em forma seca a um líquido para formar uma suspensão, imediatamente, antes de uso.
[00370] Em alguns aspectos, a composição microbiana da presente invenção possui uma atividade de água (at. a) inferior a 0,750; 0,700; 0,650; 0,600; 0,550; 0,500; 0,475; 0,450; 0,425; 0,400; 0,375; 0,350;
0,325; 0,300; 0,275; 0,250; 0,225; 0,200; 0,190; 0,180; 0,170; 0,160; 0,150; 0,140; 0,130; 0,120; 0,110; 0,100; 0,095; 0,090; 0,085; 0,080; 0,075; 0,070; 0,065; 0,060; 0,055; 0,050; 0,045; 0,040; 0,035; 0,030; 0,025; 0,020; 0,015; 0,010 ou 0,005.
[00371] Em alguns aspectos, a composição microbiana da presente invenção possui uma atividade de água (at. a) inferior a cerca de 0,750, cerca de 0,700, cerca de 0,650, cerca de 0,600, cerca de 0,550, cerca de 0,500, cerca de 0,475, cerca de 0,450, cerca de 0,425, cerca de 0,400, cerca de 0,375, cerca de 0,350, cerca de 0,325, cerca de 0,300, cerca de 0,275, cerca de 0,250, cerca de 0,225, cerca de 0,200, cerca de 0,190, cerca de 0,180, cerca de 0,170, cerca de 0,160, cerca de 0,150, cerca de 0,140, cerca de 0,130, cerca de 0,120, cerca de 0,110, cerca de 0,100, cerca de 0,095, cerca de 0,090, cerca de 0,085, cerca de 0,080, cerca de 0,075, cerca de 0,070, cerca de 0,065, cerca de 0,060, cerca de 0,055, cerca de 0,050, cerca de 0,045, cerca de 0,040, cerca de 0,035, cerca de 0,030, cerca de 0,025, cerca de 0,020, cerca de 0,015, cerca de 0,010 ou cerca de 0,005.
[00372] Os valores da atividade de água são determinados pelo método de soluções aquosas saturadas (Multon, "Techniques d'Analyse E De Controle Dans Les Industries Agroalimentaires" APRIA (1981)) ou por medição direta usando um higrômetro Robotronic BT viável ou outro higrômetro ou higroscópio. Matéria-prima
[00373] Em alguns aspectos, a invenção é desenhada para um método de produção e/ou recuperação/isolamento de um derivado de 3-HP e acetil-CoA. A recuperação/coleta/isolamento pode ser realizada por meio de métodos conhecidos no estado da técnica, tais como destilação, remoção de gás de separação com base em membrana, extração com solvente e adsorção em leito expandido.
[00374] Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende uma fonte de carbono. Em alguns aspectos, a fonte de carbono pode ser selecionada de açúcares, glicerol, álcoois, ácidos orgânicos, alcanos, ácidos graxos, lignocelulose, proteínas, dióxido de carbono e monóxido de carbono. Em um aspecto, a fonte de carbono é um açúcar. Em um aspecto, o açúcar é glicose ou oligômeros de glicose dos mesmos. Em um aspecto, os oligômeros de glicose são selecionados de frutose, sacarose, amido, celobiose, maltose, lactose e celulose. Em um aspecto, o açúcar é um açúcar de cinco carbonos. Em um aspecto, o açúcar é um açúcar de seis carbonos. Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende um ou mais açúcares de cinco carbonos e/ou um ou mais açúcares de seis carbonos. Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende uma ou mais de xilose, glicose, arabinose, galactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende uma ou mais de xilose e/ou glicose. Em alguns aspectos, a matéria-prima compreende uma ou mais de arabinose, galactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos.
[00375] Em alguns aspectos, os micróbios utilizam um ou mais açúcares de cinco carbonos (pentoses) e/ou um ou mais açúcares de seis carbonos (hexoses). Em alguns aspectos, os micróbios utilizam um ou mais de xilose e/ou glicose. Em alguns aspectos, os micróbios utilizam um ou mais de arabinose, galactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, os micróbios utilizam um ou mais de xilose, glicose, arabinose, galactose, maltose, frutose, manose, sacarose e/ou combinações dos mesmos. A(s) fonte(s) de carbono utilizada(s) pode(m) abranger uma ampla variedade de substratos contendo carbono e geralmente será apenas limitada pela escolha de micro- organismo.
[00376] Em alguns aspectos, hexoses podem ser selecionadas de
D-alose, D-altrose, D-glicose, D-manose, D-gulose, D-idose, D- galactose, D-talose, D-tagtose, D- sorbose, D-frutose, D-psicose e outras hexoses conhecidas no estado da técnica. Em alguns aspectos, as pentoses podem ser selecionadas de D-xilose, D-ribose, D- arabinose, D-lixose, D-xilulose, D-ribulose e outras pentoses conhecidas no estado da técnica. Em alguns aspectos, as hexoses e pentoses podem ser selecionadas a partir do enantiômero levorrotatório ou dextrorrotatório de qualquer uma das hexoses e pentoses descritas neste relatório.
[00377] Em alguns aspectos, uma fermentação é geralmente conduzida em fermentadores/biorreatores com um meio de cultura apropriado adaptado ao(s) micro-organismo(s) que está(ão) sendo cultivados. Em alguns aspectos, o meio contém pelo menos uma fonte simples de carbono. Em alguns aspectos, o meio contém substratos adicionais.
[00378] Em alguns aspectos, os substratos adicionais podem incluir qualquer uma ou mais das fontes de carbono descritas neste relatório; polissacarídeos tais como start ou celulose, ou misturas dos mesmos; misturas não purificadas a partir de matérias-primas renováveis, tais como permeado do soro de queijo, licor de maceração de milho, melaço de beterraba sacarina e malte de cevada.
[00379] Em alguns aspectos, os meios podem ainda conter minerais adequados, sais, cofatores, tampões e outros componentes adequados para o crescimento das culturas e promoção da via enzimática necessária para a produção do produto desejado.
[00380] Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados a um biorreator/meio de crescimento durante a fase de crescimento é de pelo menos 5 kg de carboidrato/m3, pelo menos 10 kg de carboidrato/m3, pelo menos 20 kg de carboidrato/m3, pelo menos 30 kg de carboidrato/m3, pelo menos 40 kg de carboidrato/m3, pelo menos 50 kg de carboidrato/m3, pelo menos 60 kg de carboidrato/m3, pelo menos 70 kg de carboidrato/m3, pelo menos 80 kg de carboidrato/m3, pelo menos 90 kg de carboidrato/m3, pelo menos 100 kg de carboidrato/m3, pelo menos 150 kg de carboidrato/m3, pelo menos 200 kg de carboidrato/m3, pelo menos 250 kg de carboidrato/m3, pelo menos 300 kg de carboidrato/m3, pelo menos 400 kg de carboidrato/m3, pelo menos 500 kg de carboidrato/m3, pelo menos 600 kg de carboidrato/m3, pelo menos 700 kg de carboidrato/m3, até 800 kg de carboidrato/m3. Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de crescimento varia de cerca de 10 kg de carboidrato/m3 até 500 kg de carboidrato/m3.
[00381] Em alguns aspectos, o tempo necessário para a fase de crescimento varia entre 1 a 200 horas. Em outros aspectos, o tempo da fase de crescimento é entre 5 a 50 horas. O tempo depende da alimentação de carboidratos e/ou matérias-primas.
[00382] Como usado neste relatório, um "meio de cultura apropriado" entende-se um meio, tal como um meio líquido estéril, compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou crescimento das células microbianas, tais como fontes de carbono ou substrato de carbono, fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico ou fosfato dipotássico; oligoelementos (por exemplo, sais de metais), por exemplo, sais de magnésio, sais de cobalto e/ou sais de manganês; bem como, fatores de crescimento, tais como aminoácidos, vitaminas, promotores de crescimento e similares. O termo "fonte carbono" ou "substrato de carbono" ou "fonte de carbono" de acordo com a presente invenção denota qualquer fonte de carbono que pode ser usada por aqueles versados no estado da técnica para suportar o crescimento normal de um micro-organismo, incluindo, hexoses (tais como glicose, galactose ou lactose), pentoses, monossacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos (tais como sacarose, celobiose ou maltose), melaço, amido ou seus derivados, celulose, hemiceluloses e combinações dos mesmos.
[00383] Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de produção é de pelo menos 50 kg de carboidrato/m3, pelo menos 60 kg de carboidrato/m3, pelo menos 70 kg de carboidrato/m3, pelo menos 80 kg de carboidrato/m3, pelo menos 90 kg de carboidrato/m3, pelo menos 100 kg de carboidrato/m3, pelo menos 150 kg de carboidrato/m3, pelo menos 200 kg de carboidrato/m3, pelo menos 250 kg de carboidrato/m3, pelo menos 300 kg de carboidrato/m3, pelo menos 400 kg de carboidrato/m3, pelo menos 500 kg de carboidrato/m3, pelo menos 600 kg de carboidrato/m3, pelo menos 700 kg de carboidrato/m3, pelo menos 800 kg de carboidrato/m3, pelo menos 900 kg de carboidrato/m3 até 1.000 kg de carboidrato/m3. Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de produção varia de cerca de 100 kg de carboidrato/m3 até 800 kg de carboidrato/m3.
[00384] Em alguns aspectos, o tempo necessário para a fase de produção varia entre 5 a 500 horas. Em outros aspectos, o tempo para a fase de produção varia de 10 a 300 horas para operações em processos descontínuos e descontínuos alimentados. Em outros aspectos, o tempo da fase de produção é de até 300 horas com fermentação contínua.
[00385] Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento para o processo de fase única é de pelo menos 50 kg de carboidrato/m3, pelo menos 60 kg de carboidrato/m3, pelo menos 70 kg carboidrato/m3, pelo menos 80 kg de carboidrato/m3, pelo menos 90 kg de carboidrato/m3, pelo menos 100 kg de carboidrato/m3, pelo menos 150 kg de carboidrato/m3, pelo menos 200 kg de carboidrato/m3, pelo menos 250 kg de carboidrato/m3, pelo menos 300 kg de carboidrato/m3, pelo menos 400 kg de carboidrato/m3, pelo menos 500 kg de carboidrato/m3, pelo menos 600 kg de carboidrato/m3, pelo menos 700 kg de carboidrato/m3, pelo menos 800 kg de carboidrato/m3, pelo menos 900 kg de carboidrato/m3 até 1.000 kg de carboidrato/m3. Em alguns aspectos, a quantidade total de carboidratos C5 e/ou C6 alimentados ao biorreator/meio de crescimento durante a fase de produção varia de cerca de 100 kg de carboidrato/m3 a 800 kg de carboidrato/m3.
[00386] Em alguns aspectos, o tempo necessário para a fase de produção no processo de fase única varia entre 5 a 500 horas. Em aspectos adicionais, o tempo necessário para a fase de produção no processo de fase única varia entre 5 a 300 horas.
[00387] Em alguns aspectos, os processos de produção de fase única ou de múltiplas fases levam cerca de 5, cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150, cerca de 175, cerca de 200, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300, cerca de 325, cerca de 350, cerca de 375, cerca de 400, cerca de 425, cerca de 450, cerca de 475 ou cerca de 500 horas.
[00388] Em alguns aspectos, os processos de produção de fase única ou fases múltiplas levam de 5, 10, 25, 50,75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ou 500 horas.
EXEMPLOS Exemplo 1: Criação de cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae para produzir malonato de semialdeído
[00389] Cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae foram construídas a partir de cepas padrão usando o procedimento genético molecular de levedura padrão (Methods in yeast Genetics – A cold spring harbor laboratory course manual (2000) por D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).
[00390] Os seguintes genes foram integrados em leveduras recombinantes usando a capacidade de levedura de recombinar eficientemente extremidades de ADN livre que compartilham homologia de sequência.
[00391] Mais particularmente, as sequências de codificação que devem ser clonadas foram sintetizadas artificialmente. Para sequências heterólogas (não leveduras), as sequências nucléicas foram modificadas a fim de se obter uma sequência de codificação sinônima utilizando o uso de códons de levedura. Utilizando enzima de restrição e tecnologia de clonagem clássica, cada sequência sintética foi clonada entre um promotor de transcrição e um terminador de transcrição. Cada sequência promotora é precedida por uma sequência de 50 a 200 nucleotídeos homóloga à sequência do terminador do gene a montante. Similarmente, o terminador de cada gene (um gene compreendendo o terminador de sequência que codifica o promotor) é seguido por sequências homólogas ao gene imediatamente a seguir. Para que cada uma da unidade que deve ser integrada tenha uma sobreposição de 50 a 200 nucleotídeos com tanto a unidade a montante quanto a unidade a jusante. Para a primeira unidade, o promotor é precedido por 50-200 nucleotídeos homólogos ao nucleotídeo do cromossomo da levedura para o local (locus) no qual será integrado. Da mesma forma, para a última unidade, o terminador é seguido por 50-200 nucleotídeos homólogos ao nucleotídeo do cromossomo da levedura para o locus no qual será integrado.
[00392] Cada unidade é em seguida amplificada por RCP a partir dos constructos de plasmídeos, produzindo unidade X de ADN linear apresentando sequências sobrepostas. Pelo menos um desses genes é um marcador auxotrófico, a fim de selecionar o evento de recombinação. Todos os fragmentos lineares são transformados na levedura de uma só vez, e a levedura recombinante é selecionada para a auxotrofia relacionada ao marcador utilizado. A integridade da sequência é então verificada por RCP e sequenciamento. Aspectos de biologia sintética utilizada descritos em Tian J. e outros, Mol. Biosyst. 2009; 5(7):714-22. Exemplo 2: Método de modificação de uma levedura
[00393] As leveduras recombinantes são leveduras mutantes (∆fms1) que são prejudicadas para síntese de β-alanina. Como consequência, a levedura é auxotrófica em relação ao pantotenato e não pode crescer em um meio privado de pantotenato. Nas mesmas leveduras é expresso PYD4 de Lachancea kluyveri, um gene que codifica uma atividade da β-alanina aminotransferase ausente de Saccharomyces cerevisiae.
[00394] Essa enzima é capaz de transformar o semialdeído malônico em β-alanina (Andersen e outros, 2007 FEBS Journal 274, 1804-1817). Essa levedura falta então uma atividade capaz de produzir malonil semialdeído que deve ser capaz de crescer na ausência de pantotenato no meio. Ver, FIGURA 13).
[00395] Essa levedura ainda é incapaz de crescer em um meio livre de pantotenato sob expressão da descarboxilase de formato de benzoíla a partir de P. putida. De fato, a descarboxilase de formato de benzoíla não é capaz de catalisar a transformação de oxaloacetato em malonato de semialdeído.
[00396] As seguintes enzimas foram testadas in vivo, em leveduras separadas.
[00397] Enzima No. 1:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQE ACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPL IVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVSSS VRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAERLKA PVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGA PVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMA SALANLVEESSRQLPTAAPEPAK VDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRN PGSYYFCAAGGLGFALPAAIGVQ LAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYGALRW
FAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEA LSAKGPVLIE VSTVSPVK (ID SEQ NO: 2)
[00398] Enzima No. 2:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDR HVSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLA ERLAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYNCAAGGLGFALP AAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGT
YGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 3)
[00399] Enzima No. 3:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEAKLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAK VDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRN PGSYYNCAAGGLGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTY
GALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVLIE VSTVSPVK (ID SEQ NO: 4)
[00400] Enzima No. 4:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYNCAAGGLGFALPAA IGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIE VSTVSPVK (ID SEQ NO: 5)
[00401] Enzima No. 5:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEAVKTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEP AKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYNCAAGGNGFALPAA IGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGT
YGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVL IEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 6)
[00402] Enzima No. 6:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVL VIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIG AMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFD TLNDMAPEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYLCAAGGLGFA LPAA IGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNNGTYG
TLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLK GSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 242)
[00403] Enzima No. 7:
MASVHGTTYELLRRQGIDIVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNS HSPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEV PHAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLDMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAAIG VQLAEPGRQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYGLL
RWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 243)
[00404] Enzima No. 8:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVL VIGAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIG AMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTL NDMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALP AAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGGLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 244)
[00405] Enzima No. 9:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAA IGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTY GTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL
KGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 245)
[00406] Enzima No. 10:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDR HVSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLA ERLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGH DVVLVIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIV ADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETV FDTLNDMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYACAAGGLG FALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIF
VIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKA DNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 246)
[00407] Enzima No. 11:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAA IGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 247).
[00408] Enzima No. 12:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLV IGAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLN DMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPA AIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 248).
[00409] Enzima No. 13:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAAIG VQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYGT
LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGS LQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 249).
[00410] Enzima No. 14:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLV IGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTY
GALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 250).
[00411] Enzima No. 15:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPA AIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGT
YGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 251).
[00412] Enzima No. 16:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVL VIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIG AMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYLCAAGGLGFALPA AIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNNG
TYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 252).
[00413] Enzima No. 17:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHD VVLVIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVA DIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETV FDTLNDMAPEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYLCAAGGLG FALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTI
FVIMNNGTYGGLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQAL KADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 253).
[00414] Enzima No. 18:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDV VLVIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVAD IGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTL NDMAPEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYLCAAGGLGFALP AAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNN
GTYGTLRWSAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 254).
[00415] Enzima No. 19:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVL VIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIG AMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTL NDMAPEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYLCAAGGLGFALP AAIGVQLAEPGRQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIM
NNGTYGTLRWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADN LEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 255).
[00416] Enzima No. 20:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLN DMAPEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYLCAAGGLGFALPA AIGVQLAEPGRQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGTLRWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 256).
[00417] Enzima No. 21:
MASVHGTTYELLRRQGIDIVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLDMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAA IGVQLAEPGRQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGLLRWSAGVLGAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 257).
[00418] Enzima No. 22:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVL VIGAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIG AMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYNCAAGGLGFALPAA IGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGLLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 258).
[00419] Enzima No. 23:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHD VVLVIGAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVA DIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFD TLNDMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYWCAAGGLGF ALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVI
MNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKAD NLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 259).
[00420] Enzima No. 24:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLN DMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYRCAAGGVGFALP AAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 260)
[00421] Enzima No. 25:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLN DMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYWCAAGGLGFALP AAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNN
GTYGNLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 261).
[00422] Enzima No. 26:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRH VTSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPVIVLGPDVDAANANADCVMLAE RLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVV LVIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADI GAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPA AIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTY
GTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNL EQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 262).
[00423] Enzima No. 27:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYACAAGGLGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYG
TLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKG SLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 263).
[00424] Enzima No. 28:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYLCAAGGLGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTY
GTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 264).
[00425] Enzima No. 29:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVL VIGAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIG AMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLND MAPEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYRCAAGGVGFALPA AIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNN
GTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLE QLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 265).
[00426] Enzima No. 30:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYRCAAGGVGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNNGTY
GGLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 266).
[00427] Enzima No. 31:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYWCAAGGSGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNNGTY
GNLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLK GSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 267).
[00428] Enzima No. 32:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYWCAAGGLGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYG
LLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKG SLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 268).
[00429] Enzima No. 33:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYRQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYRCAAGGLGFALPAAIG VQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYGL
LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGS LQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 269).
[00430] Enzima No. 34:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYWCAAGGLGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYG
TLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGS LQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 270).
[00431] Enzima No. 35:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSH SPLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVP HAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYRCAAGGLGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYGT
LRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGS LQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 271).
[00432] Enzima No. 36:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYRCAAGGVGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNNGTY
GTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQL KGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 272).
[00433] Enzima No. 37:
MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEA CVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHS PLIVTAGQQTRAMIGVEARLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPH AMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHV SSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAER LKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVI GAPVFRYHRYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGA MASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMA PEDAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYWCAAGGSGFALPAAI GVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNVPTIFVIMNNGTY
GTLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLK GSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK (ID SEQ NO: 273).
[00434] Quando uma das enzimas da invenção de sequência ID SEQ NO: 274 conforme descrita neste relatório foi expressa na cepa ∆fms1-Pyd41k, essa levedura foi capaz de crescer em um meio livre de pantotenato.
[00435] Esses resultados in vivo mostram que as enzimas da invenção catalisam a transformação de oxaloacetato em malonato de semialdeído ou um de seus derivados, tais como, por exemplo, malonato semialdeído. Exemplo 3: Produção de 3-HP a partir de Malonato semialdeído (MSA) 3-HP desidrogenase
[00436] A maioria das enzimas desidrogenase 3-HP (Tabela 1) aceita NADPH como um cofator para converter malonato de semialdeído em ácido 3-hidroxipropiônico, mas o uso de NADH é desejável para se obter uma via equilibrada por redox. Para considerar esse problema, a desidrogenase 3-HP codificada pelo gene HPD1 da levedura Candida albicans, também ativa em células de Saccharomyces, foi identificada e caracterizada como uma desidrogenase de 3-HP trabalhando na via de degradação de Propionil-CoA e demonstrou sustentar síntese eficiente de 3-HP a partir de malonato semialdeído, enquanto se usa preferencialmente NADH como cofator. O gene HPD1.Cal de comprimento completo foi, portanto, clonado e expresso em um plasmídeo sob o controle de um forte promotor em células de Saccharomyces cerevisiae e comparado com outras enzimas. No ensaio, foram utilizados 20 mM de malonato de semialdeído e 2 mM de cofator (NADPH ou NADH). Mediu-se 3-HP por meio de CG-EM/EM após derivação com BSTFA (dados não mostrados). Tabela 18: Cepa construída para testar a desidrogenase de 3-HP. Cepa Genótipo YA3542-3 MAT-α, ade2, adh1::[ADH1-4-URA3.Kl-loxP], adh3::RS, adh4::RS, adh5::RS, can1-100, his3, leu2, pdc1::HIS5.Sp-loxP, pdc6::LEU2.Kl-loxP, trp1, ura3 Tabela 19: Plasmídeos construídos com diferentes desidrogenases de 3-HP Plasmídeos Descrição pAD4003 pRS314-pCCW12-YDFG.Ec-tRPL15A pAD4042 pRS314-pCCW12-YDF1-tRPL15A pAD4287 pRS314-pCCW12-YDF1-11-tRPL15A pAD4346 pRS314-pCCW12-HPD1.Cal-tRPL15A Tabela 20: Atividade de desidrogenases de 3-HP com base em cofator consumidor (in-vitro) Atividade Atividade -1 -1 -1 -1 Cepa Genótipo relevante (nmol.min .mg ) (nmol.min .mg )
NADPH NADH YA3542-3 WT Não detectado YA3542-3 pRS314-pSTRONG-YDFG- 50 Não detectado + pAD4003 0.Ec YA3542-3 pRS316-pSTRONG-YDF1 2750 (+/- 250) 2 (+/-1) + pAD4042 YA3542-3 pRS316-pSTRONG-YDF1 – 50 48 (+/-2) + pAD4287 11 (S22N + A47D + R48F) YA3542-3 pRS316-pSTRONG- 200 2500 + pAD4346 HPD1.Cal
[00437] Demonstrou-se que HPD1.Cal é altamente ativo na catálise de formação de 3-HP a partir de malonato semialdeído (MAS) e exibe adicionalmente um uso preferencial de NADH como cofator. Exemplo 4: Produção de 3-HP a partir de glicose – Fluxo de carbono de religação a partir de PEP a oxaloacetato
[00438] Este exemplo descreve conversão enzimática de malonato de semialdeído em 3-HP. O malonato semialdeído (MSA) foi produzido pela via β-alanina (FIGURA 3).
[00439] O redirecionamento do fluxo de carbono em direção ao oxaloacetato pode ser alcançado através da implementação da derivação de oxaloacetato, com base na forte expressão de piruvato de fosfoenol carboxiquinase de Escherichia coli (PEPCK.Ec), enquanto a atividade da levedura de piruvato quinase é fortemente atenuada mediante (i) expressar o gene PYK1 a partir de um promotor fraco (pNUP57 ou pMET25∆F) e (ii) reduzir a meia-vida da própria proteína por sua fusão a um degron (sinal de degradação) específico (PYK1-7). Tal estratégia é descrita em WO2019011945A1 e WO2019011948A1.
[00440] O fluxo de trabalho de engenharia (FIGURA 20) inicia-se com cepas diplóides que compreendem um desvio inativo de oxaloacetato, à medida em que o pLow-PYK1-7 está presente em apenas um cromossomo e termina por uma etapa de esporulação que permite a ativação do desvio de oxaloacetato. As cepas haplóides finais são YA4963 e YA4968 (Tabela 21).
[00441] As cepas foram assim ensaiadas em relação à produção de 3-HP em condições anaeróbicas de crescimento: 10 mL de meio rico na presença de glicose a 8% em tubos Falcon de 50 mL fechados. Agitação em 135 rpm (diâmetro de agitação vigorosa de 50 mm). A análise de 3-HP foi realizada após 48 horas de crescimento usando CG/FID (após extração de 3-HP na presença de 1-butanol). Tabela 21: Cepas construídas para aperfeiçoar fluxo de carbono rewiring a partir de PEP.
Cepa Genótipo DA2124-14 MAT-a/MAT-α, can1-100/can1-100, his3/his3, JLP1/jlp1::[TRP1.Kl-loxP- PYK1-7], leu2/leu2, MET14/met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca-PYD4.Lk- YDFG-0.Ec], PYK1/pyk1::[LEU2.Kl-loxP-PEPCK-1.Ec-AAT2-PEPCK-
1.Ec], trp1/trp1, ura3/ura3::[PAND.Tca-YDFG-0.Ec-URA3]x9 YA4963-25A jlp1::[TRP1.Kl-loxP-pNUP57-PYK1-7], met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca- PYD4.Lk-YDFG-0.Ec], pyk1::[LEU2.Kl-loxP-PEPCK-1.Ec-AAT2-PEPCK-
1.Ec], ura3::[PAND.Tca-YDFG-0.Ec-URA3]x9 YA4968-12C jlp1::[TRP1.Kl-loxP-pMET25DF-PYK1], met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca- PYD4.Lk-YDFG-0.Ec], pyk1::[LEU2.Kl-loxP-PEPCK-1.Ec-AAT2-PEPCK-
1.Ec], ura3::[PAND.Tca-YDFG-0.Ec-URA3]x10
[00442] Em condições fermentativas, as cepas atenuadas PYK1 (YA4963-21C e YA4963-25A) produziram mais 3-HP (7,8 g/L de 3-HP) do que sua cepa parental (0,9 g/L de 3-HP) sem atenuação de PYK1 (DA2124-12) (Tabela 22). Tabela 22: Produção de 3-HP (in-vivo) após atenuação de PYK1-7 OD 3-HP Glicose Etanol Glicerol Atividade de PYK1 -1 -1 Cepa 600nm (g.L-1) (g.L-1) (g.L-1) (g.L-1) (nmol.min .mg ) DA2124-12 59 0,9 0 39 2 6200 YA4963- 37 5,1 42 15 5 130 21C YA4963- 22 7,8 44 11 8 150 25A
[00443] Determinou-se a atividade de piruvato quinase conforme descrita em Aust, A.; Yun, S.L.; Suelter, C.H. (1975) Methods Enzymol. 42C, 176-182. Exemplo 5: Produção de 3-HP a partir de glicose por meio de oxaloacetato descarboxilase
[00444] Candidatos à enzima oxaloacetato descarboxilase foram prospectados e projetados com sucesso para transferir uma enzima ativa para converter oxaloacetato em malonato semialdeído e em uma segunda etapa para impulsionar uma nova via metabólica fermentativa para produzir malonato semialdeído (MSA), 3-HP e derivados de glicose.
[00445] Para ilustrar os esforços de pesquisa e desenvolvimento de engenharia R&D da enzima oxaloacetato descarboxilase e a magnitude dos resultados de engenharia da enzima MDLC (Pseudomonas putida), a atividade resultante pode ser comparada com o valor obtido em uma abordagem similar ao aspartato descarboxilase do tipo selvagem (PAND.Tca de Tribolium castaneum), que catalisa a conversão de aspartato em β-alanina. Como descrito anteriormente, 5-8 g/L de 3-HP foram produzidos com sucesso a partir de glicose através da via β-alanina pelo uso da enzima aspartato descarboxilase (PAND.Tca). Conforme descrito na tabela abaixo, a variante MDLC-54 demonstrou ser tão ativa quanto ao aspartato descarboxilase PAND.Tca (apenas com atividade 4x menor), indicando que essa variante seria capaz de sustentar a produção in vivo de 3-HP a partir de glicose (Tabela 23). Tabela 23: Atividades de MDLC-54 e PAND.Tca Enzima Atividade (nmol/min/mg) Variante de engenharia MDLC-54 10 – 15 Pand.Tca do tipo selvagem 2 – 2,5
[00446] Realizou-se um ensaio de oxaloacetato descarboxilase com extratos de células de levedura contendo 50, 100, 150 e 200 µg de proteína total em tampão fosfato 100 mM de pH 6 por 40 minutos a 30°C na presença de oxaloacetato (20 mM), MgSO 4.7H2O (2 mM), TPP (2 mM), NADPH (2 mM) e uma enzima YdfG purificada (4 µg/100 µL). Mediu-se a formação de 3-HP por meio de CG/EM/EM após derivação com BSTFA.
[00447] Realizou-se ensaio com aspartato descarboxilase (PAND.Tca) com extratos de células de levedura contendo 20, 40, 60 e 80 µg de proteína total em tampão fosfato 100 mM de pH 7 por 20 minutos a 30°C na presença de aspartato (20 mM). Me diu-se a formação de beta-alanina por meio de UPLC/UV após derivação com AQC (carbamato de 6-aminoquinolil-n-hidroxissucimidila).
[00448] Com base nesses resultados, os ensaios são realizados adicionalmente para analisar as propriedades cinéticas de enzimas da invenção através da medida de suas Km e Vmáx., utilizando extratos de leveduras que expressam as diferentes variantes de MDLC.
[00449] Os ensaios cinéticos são realizados com 100 µg de extratos de levedura por 30 minutos na presença de concentrações crescentes de oxaloacetato (2,5; 5; 10; 20; 40; 80 e 120 mM), de YdfG purificado (ácido 3-hidróxi-hidrogenase dependente de NADP - EC 1.1.1.298) de Escherichia coli (4 µg/100 µL) e 2 mM de NADPH.
[00450] A eficiência das enzimas da invenção é ensaiada através da formação de 3-HP que é medida por CG/EM/EM após derivação com BSTFA (N,O-bis(trimetilsilil)trifluoracetamida).
[00451] Como controle negativo, esse ensaio é realizado em um extrato de levedura que não compreende uma enzima de acordo com a invenção. Nenhuma atividade significativa é detectada.
[00452] Os resultados obtidos com cepas de leveduras compreendendo a enzima N°. 1 (ID SEQ NO: 2), enzima N°. 6 (ID SEQ NO: 242), enzima No. 7 (ID SEQ NO: 243), enzima N°. 8 (ID SEQ NO: 244) ou enzima N°. 9 (ID SEQ NO: 245) são, em parti cular, representados em FIGURA 21, FIGURA 22, FIGURA 23, FIGURA 24 e FIGURA 25, respectivamente.
[00453] Pode-se observar que Km muito baixo é obtido, demonstrando que as enzimas da invenção são muito eficazes. Exemplo 6: Produção de acetona a partir de Malonato
Semialdeído (MSA) Produção de acetil-CoA a partir de MSA
[00454] Genes da Tabela 2 foram clonados e expressos em um plasmídeo sob o controle de um forte promotor em células de Saccharomyces cerevisiae (Tabela 24).
[00455] Nenhuma atividade MSD foi detectada usando o NADP como cofator. Utilizando o NAD como a coenzima, tanto MSD.Cal quanto MSD.Pa foram ativos com uma atividade de 40 nmol.min-1.mg-1 (Tabela 25).
[00456] O extrato de levedura das cepas consideradas foi incubado na presença de beta-alanina 80 mM, oxoglutarato 20 mM, 100 µM de fosfato de piridoxal, NAD 1 mM, coenzima A 0,5 mM e DTT 1 mM em tampão de fosfato 100 mM pH 7,5. Beta-alanina e oxoglutarato foram convertidos em MSD e β-alanina pela transaminase de PYD-4. A atividade de MSD foi então monitorada seguindo aparência de NADH por absorbância UV a 340 nM. Não se observou aumento de absorbância a 340 nM se oxoglutarato ou beta-alanina fossem omitidos ou em uma cepa na qual nenhuma atividade de MSD foi expressa. Esse ensaio foi adaptado da revista Andersen e Piskur FEBS, (2007) 274, 1804-1817 e Waters e Venables FEMS Microbiology Letters 34 (1986) 279-282. Tabela 24: Cepas construídas para produção de acetona Cepa Genótipo YA4666-1 MAT-a, ade2, can1-100, fms1::ADE2.Sba-RS, his3, jlp1::[HIS3.Sba-RS- PYD4.Lk], trp1, ura3 YA4750-2/-4 MAT-a, ade2, can1-100, fms1::ADE2.Sba-RS, his3, jlp1::[HIS3.Sba-RS- PYD4.Lk], met14::[TRP1.Kl-RS-MSD.Cal], trp1, ura3 YA4751-2 MAT-a, ade2, can1-100, fms1::ADE2.Sba-RS, his3, jlp1::[HIS3.Sba-RS- PYD4.Lk], met14::[TRP1.Kl-RS-MSD.Pa], trp1, ura3 Tabela 25: Atividade de malonato semialdeído desidrogenase com base em consumo de cofator.
Atividade Atividade -1 -1 -1 Cepa Genótipo relevante (nmol.min .mg-1) (nmol.min .mg )
NADP NAD YA4666-1 WT Não detectado YA4750-2 YA4666-1 + pSTRONG-MSD.Cal 40 YA4751-2 Não detectado 40 YA4666-1 + pSTRONG-MSD.Pa YA4750-4 40 Produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA
[00457] Para a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA, a enzima ERG10 (S. cerevisiae) que é capaz de catalisar essa reação foi preferencialmente, utilizada (dados não mostrados), de acordo com Hiser L., e outros (1994) ERG10 a partir de Saccharomyces cerevisiae codifica acetoacetil-CoA tiolase. J. Biol. Chem. 269(50):31383-9. Produção de acetona a partir de acetil-CoA in vivo
[00458] Para identificar a melhor combinação de acetoacetil-CoA transferase/acetoacetato descarboxilase, uma combinação de diferentes candidatos gênicos foi integrada como agrupamentos na cepa YA4565-2 (Tabela 26), na qual o fluxo de carbono é direcionado através de desvio de β-alanina permitindo a produção de malonato de semialdeído (FIGURA 3). Tabela 26: Cepas construídas para produzir acetona. Cepa Genótipo relevante YA4565-2 his3, leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca-PYD4.Lk], trp1, ura3 YA5060 YA4565-2 + jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-ATOA-0.Ec- ATOD-0.Ec-ADC-0.Ca-PTA.Cg-ACKA.Ec] YA5061 YA4565-2 + jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-ATOA-0.Ec- ATOD-0.Ec-ADC-0.Cbe-PTA.Cg-ACKA.Ec] YA5062 YA4565-2 + jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-ATOA-0.Ec- ATOD-0.Ec-ADC-0.Pp-PTA.Cg-ACKA.Ec] YA5063 YA4565-2 + jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-CTFA-0.Ca- CTFB-0.Ca-ADC-0.Ca-PTA.Cg-ACKA.Ec]
Cepa Genótipo relevante YA5064 YA4565-2 + jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-CTFA-0.Ca- CTFB-0.Ca-ADC-0.Cbe-PTA.Cg-ACKA.Ec] YA5065 YA4565-2 + jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-CTFA-0.Ca- CTFB-0.Ca-ADC-0.Pp-PTA.Cg-ACKA.Ec]
[00459] Cepas foram cultivadas em 25 mL de meio rico na presença de glicose a 2% em balão Erlenmeyer fechado com uma tampa de silício com duas pontas de pipeta de 1 mL com filtro, e agitação foi mantida a 135 rpm (diâmetro de agitação vigorosa de 50 mm). Amostras são mantidas em gelo até análise ou congeladas a -20°C. A acetona foi medida por espaço-cabeça de CG/EM após 24 horas de crescimento (Tabela 27). Tabela 27: Produção de acetona (in vivo) usando genes Cultura total Sobrenadante Cepa DO 600 nm Acetona Acetona (g .L-1) (g .L-1) YA4565-2 36 0 0 YA5063-1 31 0,1 0,1 YA5063-2 35 0,1 0,1 YA5064-2 31 0,1 0,1 YA5064-3 33 0,1 0,1 YA5065-1 37 0,2 0,2 YA5065-2 36 0,2 0,2 YA5060-1 31 0,3 0,3 YA5060-2 33 0,3 0,3 YA5061-1 39 0,1 0,1 YA5061-2 31 0,1 0,1 YA5062-1 33 0,5 0,5 YA5062-2 33 0,5 0,5
[00460] Em ambas as séries de cepas, o acetoacetato descarboxilase mais eficiente foi ADC-0 de Paenibacillus polymyxa. A melhor combinação de enzimas correspondeu ao acetoacetil-CoA transferase ATOA-0 - ATOD-0 de Escherichia coli e acetoacetato descarboxilase ADC-0 de Paenibacillus polymyxa. Para aumentar a produção de acetona, cópias adicionais de MSD.Pa e PanD.Tca foram integradas no genoma das cepas YA5060 e YA5062 (Tabela 28). Tabela 28: Cepas construídas com cópias adicionais de genes para produzir acetona. Cepa Genótipo relevante YA4565-2 his3, leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca-PYD4.Lk], trp1, ura3 YA5060-1 jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-ATOA-0.Ec-ATOD-0.Ec- ADC-0.Ca-PTA.Cg-ACKA.Ec], leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca- PYD4.Lk] YA5182-4/-11 YA5060-1 ura3::[PAND.Tca-MSD.Pa-URA3]x2/x4 YA5062-1 jlp1::[LEU2.Sba-RS-MSD.Pa-MSD.Cal-ERG10-ATOA-0.Ec-ATOD-0.Ec- ADC-0.Pp-PTA.Cg-ACKA.Ec], leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca- PYD4.Lk YA5183-1/-23 YA5062-1 ura3::[PAND.Tca-MSD.Pa-URA3]x1/x5
[00461] As cepas resultantes YA5182 e YA5183 foram cultivadas em 25 mL de meio rico na presença de glicose a 8% em balão de Erlenmeyer com uma tampa de silício + duas pontas de pipeta de 1 mL com filtro. Agitação foi mantida em 135 rpm (diâmetro de agitação de 50 mm) e a produção de acetona foi medida após 48 horas de crescimento por meio de análise de espaço-cabeça CG/EM-EM (Tabela 29).
Tabela 29: Produção de acetona por meio de cepas apresentando mais cópias de genes de MSD.Pa e PanD.Tca. Cepa DO 600 nm Acetona (g .L-1) Etanol (g .L-1) YA4565-2 51 0 39 YA5060-1 69 0,7 36 YA5182-4 77 1,0 +/- 0,1 34 YA5182-11 75 1 35 YA5062-1 68 0,8 35 YA5183-1 70 1,1 34 YA5183-23 79 1,2 +/- 0,1 34 Exemplo 7. Produção de propanol a partir de 3-HP Produção de propionil-CoA a partir de 3-HP usando propionil-CoA sintase de Chloroflexus aurantiacus in vitro
[00462] A atividade de PCS de Chloroflexus aurantiacus foi medida utilizando duas estratégias: a) integração de múltiplas cópias do gene PCS.Cau sob o controle de um forte promotor e b) uso e avaliação de diferentes sequências sinônimas do gene obtidas por vários recodificação de algoritmos para evitar qualquer evento deletério de recombinação. A melhor variante foi PCS-A.Cau e a atividade foi maior de acordo com o número de cópias de genes. É notável que a 30°C, a atividade enzimática foi de 8 - 10 vezes menor que a 50oC.
[00463] Os resultados foram medidos por meio de produção de propionil-CoA por UPLC/UV conforme descritos em Alder e Fuchs (2002) Journal of Biological Chemistry, 277 (14), 12137-12143. Tabela 30: Cepas construídas com diferentes genes PCS para produzir propanol. Cepa Genótipo relevante YA4788-2 MAT-a, can1-100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCS.Cau], leu2, met14::[HIS3.Sba-RSPAND.Tca-PYD4.Lk-YDFG-0.Ec], trp1, ura3::[PAND.Tca-URA3]x14
Cepa Genótipo relevante YA4971 MAT-a, can1-100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCS-A.Cau], leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca-PYD4.Lk-YDFG-0.Ec], trp1, ura3::[PAND.Tca-URA3]x14 YA5068 his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCS-A.Cau-PCS-A.Cau-PCS-A.Cau-PCS- A.Cau], leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca-PYD4.Lk-YDFG-0.Ec], trp1,ura3::[PAND.Tca-URA3]x14 YA5133 MAT-a, can1-100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCS-D.Cau], leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca-PYD4.Lk-YDFG-0.Ec], trp1, ura3::[PAND.Tca-URA3]x14 Tabela 31: Atividade de diferentes variantes de PCS em diferentes temperaturas avaliadas por consumo de cofator. Atividade Atividade -1 -1 -1 Cepa Genótipo relevante (nmol.min .mg-1) (nmol.min .mg ) 50°C 30°C YA4788-2 PCS.Cau 15 ND YA4971-2/-3 PCS-A.Cau 42 5 YA5133-2/-6 PCS-D.Cau 41 5 YA5068-18 4x PCS-A.Cau 200 21 Produção de propionil-CoA a partir de 3-HP utilizando únicas enzimas (in vitro) Rastreamento de 3-HP-CoA transferase
[00464] Foram testadas as atividades de 3-hidroxipropionil-CoA transferase de Cupriavidus necator e Clostridium propionicum. Mediu- se a atividade in vitro essencialmente como descrita em Volodina E., Schürmann M., Lindenkamp N., Steinbüchel A. (2014) Appl. Microbiol. Biotechnol. 98:3579-3589. Extratos brutos de cepas YA4951-4, YA4952-2 e YA5067 (Tabela 32) foram diafiltrados (corte de 3 Kda) e avaliou-se o teor de proteínas. Os extratos contendo 5; 10; 20; 40; 80 ou 160 µg de proteína foram incubados na presença de 3 HP 20 mM, acetil-CoA 2 mM, NADPH 1 mM e MgCl2 2 mM por 30 minutos a 30°C. A reação foi em seguida interrompida por adição de HClO4 a 1% e a quantidade de 3-hidroxipropionil-CoA formada foi determinada por CLAD (HPLC). A enzima mais ativa foi a PCT de Clostridium propionicum. Tabela 32: Cepas construídas com diferentes genes PCT para produzir 3-HP-CoA a partir de 3-HP. Cepa Genótipo relevante YA4951-4 jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cne-PCT-0.Cne-PCT-0.Cne-PCT-0.Cne] YA4952-2 jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp] YA5067 MAT-a, ade2, can1-100, his3, leu2::[HIS3.Sba-RS-PCT-0.Cp-HPCD-
0.Sac-HPCD-0.Sac-HPCD-0.Sac-HPCD-0.Sac], trp1, ura3 Tabela 33: Atividade de PCT medida por consumo de acetil-CoA. Atividade Genótipo relevante -1 Cepa (nmol.min .mg-1) YA4951-4 PCT-0.Cne x4 140 YA4952-2 PCT-0.Cp x4 240 YA5067-1 77 PCT-0.Cp x1 YA5067-4 64 Rastreamento de 3-HP-CoA desidratase
[00465] Foram ensaiadas 3-HP-CoA desidratases a partir de Metallosphaera sedula (HPCD.Mse), Bacillus sp. (HPCD.Bsp), Sporanaerobacter acetigenes (HPCD-0.Sac) e enoil-CoA hidratase de Ruegeria pomeroyi (ENCD.Rp). A cepa YA4952-2 foi transformada com os seguintes plasmídeos. Tabela 34: Plasmídeos construídos com 3-hidroxipropionil-CoA desidratases/Enoil-CoA hidratase Plasmídeo Descrição pAD3967 pFL45L-pCCW12.Sba-HPCD.Mse-tRPL15A pAD3968 pFL45L-pCCW12.Sba-HPCD.Bsp-tRPL15A pAD3969 pFL45L-pCCW12.Sba-HPCD-0.Sac-tRPL15A pAD3970 pFL45L-pCCW12.Sba-ENCD.Rp-tRPL15A
[00466] Mediu-se a atividade in vitro essencialmente como descrita em Asao, M. & Alber, B. E. (2013). Journal of Bacteriology 195, 4716-
4725. Extratos brutos da cepa YA4952-2 transformados com os plasmídeos descritos na Tabela 34 foram diafiltrados (corte de 3 Kda) e avaliou-se o teor de proteínas. Os extratos contendo 5; 10; 20; 40 ou 80 µg de proteína foram incubados na presença de 3 HP 20 mM, acetil-CoA 2 mM, NADPH 1 mM e MgCl2 2 mM por 30 minutos a 30°C. A reação foi rm seguida interrompida por adição de HClO4 a 1% e a quantidade de acrilil-CoA formada foi determinada por CLAD (HPLC). As 3-HP-CoA desidratases de Metallosphaera sedula e Sporanaerobacter acetigenes foram ligeiramente mais ativas do que as outras candidatas. Tabela 35: Atividade de 3-hidroxipropionil-CoA desidratase medida por área de pico de acrilil-CoA.
µg de extrato bruto Área de pico Cepa YA4952-2 80 <LOQ* YA4952-2 + pAD3970 80 <LOQ 10 4000 20 5000 YA4952-2 + pAD3968 40 7000 80 8000 10 5000 20 8000 YA4952-2 + pAD3969 40 9000 80 10000 10 5000 20 8000 YA4952-2 + pAD3967 40 11000 80 13000
*limite de quantificação Rastreamento de acrilil-CoA redutase
[00467] A acrilil-CoA redutase de Ruegeria pomeroyi foi testada in vitro, essencialmente, conforme descrita em Asao, M. & Alber, B. E. (2013). Journal of Bacteriology 195, 4716-4725. Extratos brutos da cepa YA4952-2 foram diafiltrados (corte de 3 Kda) e avaliou-se o teor da proteína. Os extratos contendo 5; 10; 20 ou 30 µg de proteínas foram incubados na presença de 3 HP 20 mM, acetil-CoA 2 mM, NADPH 1 mM e MgCl2 2 mM por 30 minutos a 30°C. A reação foi em seguida interrompida por adição de HClO4 a 1% e a quantidade de propionil-CoA formada foi determinada por CLAD (HPLC). Foi possível observar que ACR de Ruegeria pomeroyi foi altamente ativa em células de levedura. Tabela 36: Cepas construídas com acrilil-CoA redutase a partir de Ruegeria pomeroyi. Cepa Genótipo relevante YA5057 MAT-a, ade2, can1-100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp- PCT-0.Cp-PCT-0.Cp], leu2::[HIS3.Sba-RS-ACR-0.Rp-HPCD-0.Sac-HPCD-
0.Sac-HPCD-0.Sac-HPCD-0.Sac], trp1, ura3 YA5058 MAT-a, ade2, can1-100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp- PCT-0.Cp-PCT-0.Cp], leu2::[HIS3.Sba-RS-HPCD-0.Sac-ACR-0.Rp-ACR-
0.Rp-ACR-0.Rp-ACR-0.Rp], trp1, ura3 Tabela 37: Atividade de acrilil-CoA redutase medida por consumo de cofator. Atividade Genótipo relevante -1 Cepa (nmol.min .mg-1) YA4952-2 WT ND YA5057-2 700 ACR-0.Rp x1 YA5057-9 400 YA5058-5 1200 ACR-0.Rp x4 YA5058-15 1700 Produção de propanol a partir de propionil-CoA in vitro
[00468] Para esta etapa, duas vias diferentes podem ser usadas para converter propionil-CoA em 1-propanol. A primeira baseia-se na implementação da enzima multifuncional ADHE de Clostridium arbusti, enquanto a segunda procede através da formação intermediária de propionaldeído por uma propionil-CoA redutase de Paraburkholderia xenovorans ou Salmonella enterica com ou sem superexpressão endógena do álcool desidrogenase ADH1. A reação foi medida monitorando o consumo de NADH a 340 nm usando propionil-CoA 1 mM como substrato. Os resultados demonstraram que a enzima PDUP de Salmonella enterica foi a melhor candidata para catalisar a reação. Tabela 38: Cepas construídas para testar atividade de propionil- CoA redutase e álcool/aldeído desidrogenase. Cepa Genótipo relevante YA5051 jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cne-PCT-0.Cne-PCT-0.Cne-PCT-0.Cne] YA5212 MAT-a, ade2::[TRP1.Sba-loxP-ADHE-0A.Car-ADHE-0A.Car-ADHE-0A.Car], can1-100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-
0.Cp], leu2::[HIS3.Sba-RS-ACR-0.Rp-HPCD-0.Sac-HPCD-0.Sac-HPCD-
0.Sac-HPCD-0.Sac YA5214 MAT-a, ade2::[TRP1.Sba-loxP-PDUP.Sen-PDUP.Sen-PDUP.Sen], can1- 100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp], leu2::[HIS3.Sba-RS-ACR-0.Rp-HPCD-0.Sac-HPCD-0.Sac-HPCD-0.Sac- HPCD-0.Sac] YA5215 MAT-a, ade2::[TRP1.Sba-loxP-PDUP.Sen-PDUP.Sen-PDUP.Sen-ADH1], can1-100, his3, jlp1::[LEU2.Sba-RS-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-0.Cp-PCT-
0.Cp], leu2::[HIS3.Sba-RS-ACR-0.Rp-HPCD-0.Sac-HPCD-0.Sac-HPCD-
0.Sac-HPCD-0.Sac] Tabela 39: Atividade de propionil-CoA redutase e álcool/aldeído desidrogenase medida por consumo de cofator. Atividade Genótipo relevante -1 Cepa (nmol.min .mg-1) YA5057-2 WT ND YA5051-1 + MHPF.Px x3 ND YA5212-4 YA5057-2 + ADHE-0.Car x3 45 YA5214-1 1500 YA5057-2 + PDUP. Sen x3 YA5214-4 2200
Atividade Genótipo relevante -1 Cepa (nmol.min .mg-1) YA5215-1 YA5057-2 + PDUP. Sen x3 + 2200 ADH1 Produção de propanol a partir de 3-HP in vitro
[00469] Testou-se in vitro a produção de propanol a partir de 3-HP utilizando extratos celulares das cepas YA5214 e YA5215. O ensaio foi realizado em tampão fosfato 0,1 M, pH 6,5 na presença de 2 mg/mL de extrato celular a 30°C por 60 minutos, utilizand o 3-HP 20 mM + acetil-CoA 2 mM + NADPH 2,8 mM + NADH 4 mM. A produção de 1- propanol foi monitorada por análise de espaço-cabeça de CG/EM-EM. Tabela 40: Produção in vitro de 1-propanol Cepa Propanol Atividade Propionil-CoA (mg.L-1) (mg.L-1) (nmol.min-1.mg-1) YA5214-1 28 4 59 YA5214-4 29 4 60 YA5215-2 35 5 6 Produção de propanol a partir de 3-HP in vivo
[00470] Para avaliar a síntese de 1-propanol, as cepas YA5212, YA5214 e YA5215 foram crescidas na presença de glicose e alimentadas com 3-HP. As células foram cultivadas em 25 mL de meio rico na presença de glicose a 4% em balões de Erlenmeyer com uma tampa de silício + duas pontas de pipeta de 1 mL com filtro. Após 24 horas de cultura, foi adicionada outra quantidade de glicose a 4%. A agitação foi mantida em 135 rpm (diâmetro de agitação vigorosa de 50 mm). A presença de 1-propanol no meio de crescimento foi medida por análise de espaço-cabeça de CG/EM-EM. Tabela 41: Cepas construídas para produzir 1-propanol Cepa Genótipo relevante YA4613-7 MAT-a, can1-100, his3, leu2, met14::[HIS3.Sba-RS-PAND.Tca-PYD4.Lk- YDFG-0.Ec], trp1, ura3::[PAND.Tca-URA3]x8
Tabela 42: Produção de 1-propanol após 48 horas de cultura. Cepa 3-HP adicionado DO 600 nm 1-propanol (mg.L-1) - 74 <20 YA4613-7 5 g.L-1 70 <20 - 37 <20 YA5212-1 5 g.L-1 51 44 - 40 26 1 g.L-1 40 58 YA5214-1 2 g.L-1 49 90 5 g.L-1 46 178 - 37 31 YA5214-4 5 g.L-1 41 159 - 40 26 1 g.L-1 50 43 YA5215-1 2 g.L-1 51 76 5 g.L-1 46 159 - 38 27 YA5215-2 5 g.L-1 50 162 Exemplo 8: Substituição de genes GAPDH nativos de levedura por gdp1 a partir de Kluyveromyces lactis para favorecer atingir um equilíbrio neutro redox de uma via de coprodução de 1- propanol e acetona.
[00471] Conforme descrito no parágrafo [207], existem meios de engenharia metabólica para gerar cepas anaeróbicas para a coprodução de 1-propanol e acetona com equilíbrio neutro redox. É descrito aqui um exemplo, que é a substituição de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH) de Saccharomyces cerevisiae, codificando por 3 genes (TDH1, TDH2 e TDH3), uma enzima com exigência estrita para o cofator oxidado NAD+ por GAPDH (codificado por GDP1.Kl) a partir de levedura negativa para crabtree (macieira silvestre) Kluyveromyces lactis, que aceita NAD+ ou NADP+ e também exibe uma afinidade similar para ambos os compostos.
[00472] Para determinar a atividade mínima de GAPDH necessária para sustentar um fluxo de carbono adequado em relação à PEP, a contribuição de cada uma das três isoenzimas de GAPDH de levedura foi ensaiada tanto em cepas do tipo selvagem quanto de mutantes. Como as células de levedura mutantes triplas TDH1∆, TDH2∆ e TDH3∆ não foram viáveis, as cepas portadoras de deleções únicas ou duplas de TDH foram manipuladas e a atividade de GAPDH foi analisada no extrato bruto das cepas resultantes. Tabela 43: Cepas construídas para testar atividade de TDHs. Cepa Genótipo relevante YA4693-1A ade2, his3, leu2, tdh1::URA3.Sba-loxP, tdh3::LEU2.Kl-loxP, trp1, ura3 YA4693-1B ade2, his3, leu2, tdh1::URA3.Sba-loxP, tdh2::HIS5.Sp-loxP, trp1, ura3 YA4693-1D ade2, his3, leu2, tdh2::HIS5.Sp-loxP, trp1, ura3 YA4693-2D ade2, his3, leu2, tdh1::URA3.Sba-loxP, trp1, ura3 YA4693-3D ade2, his3, leu2, tdh2::HIS5.Sp-loxP, tdh3::LEU2.Kl-loxP, trp1, ura3 YA4693-4C ade2, his3, leu2, tdh3::LEU2.Kl-loxP, trp1, ura3
[00473] O teste de atividade do TDH3 é como descrito em Nakajima H., Itakura M., Kubo T., Kaneshige A., Harada N., Izawa T., Azuma YT, Kuwamura M., Yamaji R., Takeuchi T. (2017) J. Biol. Chem. 292(11): 4727-4742. Tabela 44: Atividade de isoenzimas GAPDH para consumo de NAD. Atividade (nmol.min-1.mg-1) Cepa Genes ativos
NAD Tipo selvagem TDH1, TDH2, TDH3 24000 YA4693-2D TDH2, TDH3 24000 YA4693-1D TDH1, TDH3 24000 YA4693-4C TDH1, TDH2 6000 YA4693-1B TDH3 24000 YA4693-1A TDH2 6000 YA4693-3D TDH1 3500
[00474] Deleção de TDH3 leva a uma redução de 4 vezes da atividade de GAPDH. TDH1, TDH2 ou tanto TDH1 quanto TDH2 não apresentaram efeito na atividade de GAPDH e a exclusão tanto de
TDH2 quanto de TDH3 levou a uma redução de 8 vezes na atividade. Também é importante observar que o gene TDH3 é responsável por maior parte da atividade de GAPDH em células de levedura.
[00475] Para medir a atividade da enzima GAPDH de Kluyveromyces lactis, o GDP1.Kl foi expresso sob o controle de um forte promotor em uma cepa deletada por TDH1 e comparado com células do tipo selvagem. Tabela 45: Cepas construídas para medir a atividade de GDP1.K1. Cepa Genótipo relevante YA4807-1 MAT-a, ade2, his3, leu2, tdh2::loxP, tdh3::loxP, trp1, ura3 YA4857-3 ade2, his3, jlp1 :: [ADE2.Sba-loxP-GDP1.Kl], leu, tdh2 ::loxP, thd3 :: loxP, trp1, ura3 YA4915-25C tdh1::loxP, tdh2::loxP, tdh3::loxP, ura3::[GDP1.Kl-URA3]x8 YA4918-67C tdh1::loxP, tdh2::loxP, tdh3::loxP, ura3::[GDP1.Kl-URA3]x11 Tabela 46: Atividade de GDP1.K1 para consumo de cofator. Atividade (nmol.min-1.mg-1) Cepa Genes ativos
NAD NADP Tipo selvagem TDH1, TDH2, TDH3 24000 0 YA4807-1 TDH1 3200 Não detectado YA4857-3 TDH1 + pForte-GDP1.Kl 7500 2800 YA4915-25C [pForte-GDP1.Kl] x8 25000 32000 YA4918-67C [pForte-GDP1.Kl] x11 35000 47000
[00476] Células expressas em Saccharomyces cerevisiae, GDP1.Kl consumiu NAD+ ou NADP+. Essa atividade parece ser forte para complementar a deleção dos três genes TDH de Saccharomyces cerevisiae com o incremento do número de cópias de GDP1.Kl.
[00477] Além disso, a substituição de GAPDH em combinação com o uso de enzima HPD1 (Candida albicans), que catalisa a conversão de malonato de semialdeído em ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP), pode ser usada para alcançar o equilíbrio neutro redox. Exemplo 9: Coprodução de 1-propanol e acetona
[00478] Como descrito nos exemplos anteriores, a produção in vivo de 3-HP, MSA e acetona foi demonstrada a partir de glicose através da via de β-alanina. Além disso, a conversão in vivo de 3HP em 1- propanol foi demonstrada com sucesso, suplementando demais os meios de cultura com 1-5 g/L de 3HP. Considerando que variantes modificadas por engenharia de oxaloacetato descarboxilase apresentam atividade elevada para a conversão de oxaloacetato em malonato semialdeído, espera-se que essas variantes modificadas por engenharia acentuadas de oxaloacetato descarboxilase sejam capazes de sustentar a produção de malonato de semialdeído e derivados de malonato semialdeído, tais como 1-propanol a partir de fermentação da glicose. Por exemplo, uma das melhores variantes de oxaloacetato descarboxilase projetada por engenharia mostrou ser 4 - 5x menor apenas comparada com a enzima PAND (panD, Tribolium castaneum), que catalisa a conversão de aspartato em β-alanina, em experimento enzimático in vitro, indicando tal variante de engenharia sustentaria a produção in vivo de 3-HP a partir de glicose (dados não mostrados).
[00479] Com base na informação aqui descrita, uma cepa microbiana elaborada por engenharia pode ser gerada para coproduzir 1-propanol e acetona, introduzindo, por exemplo, as enzimas da via alvo 1-propanol em uma cepa elaborada por engenharia já produtora de acetona, como aquela anteriormente descrita. Além disso, foi demonstrada com sucesso previamente a produção in vivo de 3-HP a partir de glicose através da via de β-alanina sob condições de fermentação anaeróbica. Assim, espera-se que essa cepa produtora de 3HPA comece a coproduzir 1-propanol e acetona após introdução de ambas as enzimas-alvo das vias de 1-propanol e acetona.
[00480] Por exemplo, tais cepas elaboradas por engenharia coprodutoras de 1-propanol e acetona podem ser cultivadas em 25 mL de meio rico na presença de glicose a 4% em balões de Erlenmeyer com ou sem tampa de silício, mais duas pontas de pipeta de 1 mL com filtro. Após 24 horas de cultura, é adicionada outra quantidade de glicose a 4%. Agitação é mantida em 135 rpm (diâmetro de agitação de 50 mm). A presença de 1-propanol e acetona no meio de cultura é medida por análise padrão de espaço-cabeça de CG/EM-EM. Exemplo 10: Coprodução de 1-propanol e 2-propanol
[00481] Conforme descrita no Exemplo 9, uma cepa microbiana manipulada por engenharia pode ser gerada para coproduzir 1- propanol e acetona, introduzindo, por exemplo, as enzimas-alvo da via 1-propanol em uma cepa manipulada por engenharia já produtora de acetona, tal como aquela descrita anteriormente. Além disso, foi demonstrada com sucesso previamente a produção in vivo de 3-HP a partir de glicose através da via de β-alanina sob condições de fermentação anaeróbica. Assim, espera-se que essa cepa produtora de 3HPA comece a coproduzir 1-propanol e acetona após introdução de ambas as enzimas-alvo das vias de 1-propanol e acetona. Em seguida, para coproduzir 1-propanol e 2-propanol, a 2-propanol desidrogenase, por exemplo, conforme listada na Tabela 15, pode ser introduzida na cepa descrita no exemplo 9.
[00482] Para avaliar a coprodução de 1-propanol e 2-propanol, as cepas podem ser cultivadas em 25 mL de meio rico na presença de glicose a 4% em balões de Erlenmeyer com ou sem tampa de silício e duas pontas de pipeta de 1 mL com filtro. Após 24 horas de cultura, é adicionada outra quantidade de glicose a 4%. Agitação é mantida em 135 rpm (diâmetro de agitação vigorosa de 50 mm). A presença de 1- propanol e 2-propanol no meio de cultura é medida por análise padrão de espaço-cabeça de CG/EM-EM.
MODALIDADES NUMERADAS
[00483] Modalidade 1. Um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA e/ou derivados dos mesmos, a partir de uma matéria-prima compreendendo uma ou mais fontes de carbono, em que o microrganismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes:
[00484] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase que catalisa a produção de 3-HP a partir de malonato semialdeído;
[00485] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um
[00486] (i) malonato semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato semialdeído, e/ou
[00487] (ii) malonil-CoA redutase e ácido 2-ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato semialdeído em malonil-CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA;
[00488] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato semialdeído.
[00489] Modalidade 2. O micro-organismo recombinante, de modalidade 1, em que o micro-organismo recombinante é capaz de produzir 1-propanol.
[00490] Modalidade 3. O micro-organismo recombinante, de modalidade 2, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes:
[00491] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um propionil-CoA sintase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA;
[00492] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/CoA transferase, 3-hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil-CoA redutase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA;
[00493] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um álcool/aldeído desidrogenase que catalisa a conversão de propionil-CoA de (a) ou (b) em 1-propanol, ou um aldeído desidrogenase (acetilante) e álcool desidrogenase que catalisa juntos a produção de 1-propanol a partir de propionil-CoA.
[00494] Modalidade 4. O micro-organismo recombinante, de modalidade 1, em que o micro-organismo recombinante é capaz de produzir acetona.
[00495] Modalidade 5. O micro-organismo recombinante, de modalidade 4, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes:
[00496] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA;
[00497] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA;
[00498] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetil-CoA;
[00499] (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma
[00500] (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA, e
[00501] (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e
[00502] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
[00503] Modalidade 6. O micro-organismo recombinante, de modalidade 5, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende: ERG10 (ID SEQ NO: 209), thlA (ID SEQ NO: 210), atoB (ID SEQ NO: 211), H16_B0759 (ID SEQ NO: 212), Msed_0656 (ID SEQ NO: 213) ou AAT1 (ID SEQ NO: 214).
[00504] Modalidade 7. O micro-organismo recombinante, de modalidade 6, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase codifica uma sequência compreendendo ERG10 (ID SEQ NO: 209).
[00505] Modalidade 8. O micro-organismo recombinante, de modalidade 5, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo nphT7 (ID SEQ NO: 285).
[00506] Modalidade 9. O micro-organismo recombinante, de modalidade 5, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo atoA/atoD (ID SEQ NO: 215 e 216), ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 219 e 220), ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 221 e 222) ou ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 223 e 224).
[00507] Modalidade 10. O micro-organismo recombinante, de modalidade 9, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo atoA/atoD (ID SEQ NO: 215 e 216).
[00508] Modalidade 11. O micro-organismo recombinante, de modalidade 5, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma hidroximetilglutaril-CoA sintase e uma hidroximetilglutaril-CoA liase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo ERG13 (ID SEQ NO: 283) e yngG (ID SEQ NO: 284).
[00509] Modalidade 12. O micro-organismo recombinante, de modalidade 5, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo Adc.Ca (ID SEQ NO: 225), Adc.Cbe (ID SEQ NO: 226), Adc (ID SEQ NO: 227), Adc (ID SEQ NO: 228), Adc (ID SEQ NO: 229) ou Adc.Pq (ID SEQ NO: 230).
[00510] Modalidade 13. O micro-organismo recombinante, de modalidade 12, em que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo Adc.Pp (ID SEQ NO: 230).
[00511] Modalidade 14. O micro-organismo recombinante, de modalidade 1, em que o micro-organismo recombinante catalisa malonato de semialdeído para a produção tanto de 3-HP quanto de acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos.
[00512] Modalidade 15. O micro-organismo recombinante, de modalidade 1, em que os derivados de 3-HP são selecionados do grupo que consiste de: ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno.
[00513] Modalidade 16. O micro-organismo recombinante, de modalidade 1, em que os derivados de acetil-CoA são selecionados do grupo que consiste de: acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno.
[00514] Modalidade 17. O micro-organismo recombinante, de modalidade 1, em que o micro-organismo é selecionado de bactéria, fungo ou levedura.
[00515] Modalidade 18. O micro-organismo recombinante, de modalidade 1, em que o micro-organismo recombinante é derivado de um micro-organismo parental selecionado do grupo que consiste de: Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum,
Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis, e Terrisporobacter glycolicus.
[00516] Modalidade 19. O micro-organismo recombinante, de modalidade 17, em que o micro-organismo recombinante é uma levedura.
[00517] Modalidade 20. O micro-organismo recombinante, de modalidade 19, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
[00518] Modalidade 21. O micro-organismo recombinante, de modalidade 19, em que a levedura é capaz de produção aeróbica e anaeróbica.
[00519] Modalidade 22. O micro-organismo recombinante, de modalidade 14, em que o micro-organismo recombinante compreende uma descarboxilase capaz de agir em oxaloacetato para produzir malonato semialdeído.
[00520] Modalidade 23. Um método de produção de ácido 3- hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos, método compreendendo cultivo do micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo uma matéria-prima que compreende uma fonte de carbono até que o ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil- CoA, e/ou derivados dos mesmos, sejam produzidos.
[00521] Modalidade 24. Um método de produção de um micro- organismo recombinante capaz de coproduzir ácido 3- hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos, a partir de uma matéria-prima compreendendo uma ou mais fontes de carbono, o método compreendendo introduzir em, e/ou superexpressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos seguintes:
[00522] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase que catalisa a produção de 3-HP a partir de malonato de semialdeído;
[00523] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um
[00524] (i) malonato de semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato de semialdeído e/ou
[00525] (ii) malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato semialdeído em malonil-CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA;
[00526] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato de semialdeído.
[00527] Modalidade 25. O método, de modalidade 24, em que o micro-organismo recombinante é capaz de produzir 1-propanol.
[00528] Modalidade 26. O método, de modalidade 24, em que o método compreende adicionalmente introduzir em, e/ou superexpressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos seguintes:
[00529] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um propionil-CoA sintase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA;
[00530] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/CoA transferase, 3-hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil-CoA redutase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA;
[00531] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um álcool/aldeído desidrogenase que catalisa a conversão de propionil-CoA de (a) ou (b) em 1-propanol ou aldeído desidrogenase (acetilante) e álcool desidrogenase que catalisa juntamente a produção de 1-propanol a partir de propionil-CoA.
[00532] Modalidade 27. O método, de modalidade 24, em o micro- organismo recombinante é capaz de produzir acetona.
[00533] Modalidade 28. O método, de modalidade 27, em que o método compreende adicionalmente introduzir em, e/ou superexpressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos seguintes:
[00534] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA;
[00535] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA;
[00536] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetil-CoA;
[00537] (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma
[00538] (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA, e
[00539] (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e
[00540] (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
[00541] Modalidade 29. O método, de modalidade 24, em que o micro-organismo recombinante catalisa malonato de semialdeído para a produção tanto de 3-HP quanto de acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos.
[00542] Modalidade 30. Método, de modalidade 24, em que os derivados de 3-HP são selecionados do grupo que consiste de: ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno.
[00543] Modalidade 31. Método, de modalidade 24, em que os derivados de acetil-CoA são selecionados do grupo que consiste de: acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno.
[00544] Modalidade 32. Método, de modalidade 24, em que o micro-organismo é selecionado de bactéria, fungo ou levedura.
[00545] Modalidade 33. Método, de modalidade 24, em que o micro-organismo recombinante é derivado de um micro-organismo parental selecionado do grupo que consiste de: Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis, e Terrisporobacter glycolicus.
[00546] Modalidade 34. Método, de modalidade 32, em que o micro-organismo recombinante é uma levedura.
[00547] Modalidade 35. Método, de modalidade 34, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
[00548] Modalidade 36. Método, de modalidade 34, em que o micro-organismo recombinante coproduz 3-HP, e/ou derivados e acetil-CoA e/ou derivados, em um processo de produção aeróbico, microanaeróbico ou anaeróbico, preferencialmente, um processo anaeróbico.
[00549] Modalidade 37. Método, de modalidade 29, em que o micro-organismo recombinante compreende uma descarboxilase capaz de agir em oxaloacetato para produzir malonato de semialdeído.
[00550] Modalidade 38. Método, de modalidade 24, em que pelo menos uma porção de excesso de NAD(P)H produzida na produção de acetil-CoA é utilizada como uma fonte de equivalentes redutores na produção de 3-HP e/ou derivados dos mesmos.
[00551] Modalidade 39. O micro-organismo recombinante de modalidade 1, em que pelo menos uma porção de excesso de NAD(P)H produzido na produção de acetil-CoA é utilizada como uma fonte de equivalentes de redução na produção de 3-HP e/ou derivados dos mesmos.
[00552] Modalidade 40. Um micro-organismo recombinante capaz de coprodução de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos, a partir de uma matéria-prima compreendendo uma ou mais fontes de carbono, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes:
[00553] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase que catalisa a produção de 3-HP a partir de malonato de semialdeído;
[00554] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um
[00555] (i) malonato de semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato de semialdeído e/ou
[00556] (ii) malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato semialdeído em malonil-CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA; e
[00557] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma aspartato amino transferase, aspartato descarboxilase, β-alanina piruvato amino transferase e/ou β-alanina transaminase que catalisa a produção de malonato semialdeído a partir de oxaloacetato, apresentando beta-alanina como um intermediário.
[00558] Modalidade 41. O micro-organismo recombinante, de modalidade 40, em que o micro-organismo recombinante é capaz de produzir 1-propanol, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes:
[00559] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma propionil-CoA sintase que catalisa a produção de propionil-CoA a partir de 3-HP;
[00560] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma 3-hidroxipropionil-CoA sintetase, 3- hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil-CoA redutase que catalisa a produção de propionil-CoA a partir de 3-HP; e
[00561] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um álcool/aldeído desidrogenase que catalisa a produção de 1- propanol a partir de propionil-CoA.
[00562] Modalidade 42. O micro-organismo recombinante, de modalidade 40, em que o micro-organismo recombinante é capaz de produzir acetona, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes:
[00563] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA;
[00564] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA;
[00565] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetil-CoA;
[00566] (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma
[00567] (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA, e
[00568] (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e
[00569] (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
[00570] Modalidade 43. O micro-organismo recombinante, de modalidades 40 a 42, em que os derivados de 3-HP são selecionados do grupo que consiste de: ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno.
[00571] Modalidade 44. O micro-organismo recombinante, de modalidades 40 a 42, em que os derivados de acetil-CoA são selecionados do grupo que consiste de: acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno.
[00572] Modalidade 45. Um micro-organismo recombinante capaz de produzir acetona e/ou derivados da mesma, a partir de uma matéria-prima compreendendo uma ou mais fontes de carbono, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes:
[00573] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica:
[00574] (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação do oxaloacetato em malonato de semialdeído ou
[00575] (ii) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma aspartato amino transferase, aspartato descarboxilase, piruvato de β-alanina amino transferase e/ou β-alanina transaminase que catalisa a produção de malonato semialdeído a partir de oxaloacetato, apresentando beta-alanina como um intermediário,
[00576] (iii) malonato de semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato de semialdeído de (i) ou (ii), ou
[00577] (iv) malonil-CoA redutase e/ou 2-ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato semialdeído de (i) ou (ii) em malonil- CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil- CoA a partir de malonil- CoA
[00578] (b) pelo menos uma ou mais moléculas de ácido nucleico endógena e/ou exógena capazes de catalisar a conversão de acetil- CoA em acetona.
[00579] Modalidade 46. Micro-organismo recombinante, de modalidade 45, em que o micro-organismo recombinante compreende adicionalmente um ou mais dos seguintes:
[00580] (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA;
[00581] (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA;
[00582] (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetil-CoA;
[00583] (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma
[00584] (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA, e
[00585] (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e
[00586] (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
[00587] Modalidade 47. O micro-organismo recombinante, de modalidade 46, em que os derivados de acetona são selecionados do grupo que consiste de: 2-propanol, propeno e polipropileno.
[00588] Modalidade 48. O micro-organismo recombinante, de modalidade 46, em que pelo menos uma porção de excesso de NAD(P)H produzido na produção de acetona é utilizada como uma fonte de equivalentes redutores em uma via de coprodução.
[00589] Modalidade 49: O micro-organismo recombinante, de modalidade 48, em que a via de coprodução é uma via de 3-HP.
[00590] Modalidade 50: O micro-organismo recombinante, de modalidades 40-48, em que o micro-organismo recombinante produz acetona em um processo de produção aeróbico, microaeróbico ou anaeróbico.
[00591] Modalidade 51: Um método de coprodução de 3-HP e/ou derivados do mesmo, e acetil-CoA e/ou derivados do mesmo por meio de contato do micro-organismo recombinante, de qualquer uma das modalidades 1, com uma fonte de carbono fermentável sob condições e por um período de tempo suficiente para produzir 3-HP, ou derivados e acetil-CoA ou derivados.
[00592] Modalidade 52: Um método de produção de acetona ou derivados por meio de contato do micro-organismo recombinante com uma fonte de carbono fermentável sob condições e por um período de tempo suficiente para produzir acetona ou derivados.
[00593] Modalidade 53: Os métodos, de modalidades 51 ou 52, em que a fonte de carbono é selecionada de açúcares, gliceróis, álcoois, ácidos orgânicos, alcanos, ácidos graxos, lignoceluloses, proteínas, dióxido de carbono e monóxido de carbono.
[00594] Modalidade 54: O micro-organismo recombinante, de modalidades 51 ou 52, em que o micro-organismo recombinante produz acetona em um processo de produção aeróbico, microaeróbico ou anaeróbico.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00595] Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publicações de patentes e pedidos de patentes citados neste relatório são incorporados por referência na íntegra para todos os fins. Entretanto, menção de qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente aqui citados não é, e não deve ser tomada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que constituam estado da técnica válido ou formam parte do comum conhecimento geral em qualquer país do mundo.
Adicionalmente, as seguintes referências são aqui incorporadas com referência.

Claims (35)

REIVINDICAÇÕES
1. Micro-organismo recombinante capaz de coprodução de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) e acetil-CoA, e/ou derivados dos mesmos, a partir de uma matéria-prima compreendendo uma ou mais fontes de carbono, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3-hidroxipropiônico desidrogenase que catalisa a produção de 3-HP a partir de malonato de semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um (i) malonato de semialdeído desidrogenase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonato de semialdeído e/ou (ii) malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase que catalisa a conversão de malonato de semialdeído em malonil-CoA e malonil-CoA descarboxilase que catalisa a produção de acetil-CoA a partir de malonil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato de semialdeído.
2. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é capaz de produzir 1- propanol, em que o micro-organismo recombinante compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma propionil-CoA sintase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma 3-hidroxipropionil-CoA sintetase/CoA transferase, 3-hidroxipropionil-CoA desidratase e acrilil-CoA redutase que catalisa a conversão de 3-HP em propionil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um álcool/aldeído desidrogenase que catalisa a conversão de propionil-CoA de (a) ou (b) em 1-propanol ou aldeído desidrogenase (acetilante) e álcool desidrogenase que catalisa juntamente a produção de 1-propanol a partir de propionil-CoA.
3. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os derivados de 3-HP são selecionados do grupo que consiste de: ácido acrílico, 1-propanol, propeno e polipropileno.
4. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os derivados de acetil- CoA são selecionados do grupo que consiste de: acetona, 2-propanol, propeno e polipropileno.
5. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção de excesso de NAD(P)H gerado na produção de acetil-CoA é utilizada como uma fonte de equivalentes redutores na produção de 3- HP e/ou derivados de 3-HP.
6. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que coproduz 3-HP e/ou derivados do mesmo, e acetil-CoA e/ou derivados, em um processo de produção aeróbico, microanaeróbico ou anaeróbico, preferencialmente, um processo anaeróbico.
7. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é selecionado de bactéria, fungo ou levedura.
8. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é derivado de um micro-organismo parental selecionado do grupo que consiste de:
Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Candida sp., Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Candida krusei, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis, e Terrisporobacter glycolicus.
9. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é uma levedura.
10. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
11. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3- hidroxipropiônico desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende MCR-Nterm.Cau (ID SEQ NO: 105), ADH.Ae (ID SEQ NO: 106), MMSB.Bce (ID SEQ NO: 107), YDFG-0.Ec (ID SEQ NO: 108), YMR226C (YDF1) (ID SEQ NO: 109) ou HPD1 (ID SEQ NO: 110).
12. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3- hidroxipropiônico desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende YMR226C (YDF1) (ID SEQ NO: 109).
13. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um ácido 3- hidroxipropiônico desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende HPD1 (ID SEQ NO: 110).
14. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonato semialdeído desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende MSD.Pa (ID SEQ NO: 111), MSD.Cal (ID SEQ NO: 112), iolA (ID SEQ NO: 113), iolA (ID SEQ NO: 114), iolA (ID SEQ NO: 115), mmsA (ID SEQ NO: 116), dddC (ID SEQ NO: 117) ou iolA (ID SEQ NO: 118).
15. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonato semialdeído desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende MSD.Pa (ID SEQ NO: 111).
16. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um malonato semialdeído desidrogenase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende MSD.Cal (ID SEQ NO: 112).
17. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende mcr (ID SEQ NO: 278), matA, MLYCD (ID SEQ NO: 279), kivD (ID SEQ NO: 280), kdcA (ID SEQ NO: 281), ARO10 (ID SEQ NO: 282).
18. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende mcr (ID SEQ NO: 278).
19. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende kivD (ID SEQ NO: 280).
20. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma malonil-CoA redutase e/ou ácido 2-ceto descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende ARO10 (ID SEQ NO: 282).
21. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato semialdeído codifica uma sequência de aminoácidos que compreende (ID SEQ NO: 1) ou (ID SEQ NO: 274).
22. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato semialdeído codifica uma sequência de aminoácidos que compreende (ID SEQ NO: 1).
23. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma enzima que é capaz de catalisar a descarboxilação de oxaloacetato em malonato semialdeído codifica uma sequência de aminoácidos que compreende (ID SEQ NO: 274).
24. Método de coprodução de 3-HP, e/ou derivados do mesmo e acetil-CoA e/ou derivados deste, caracterizado pelo fato de que é por meio de contato do micro-organismo recombinante como definido na reivindicação 1, com uma fonte de carbono fermentável sob condições e por um período de tempo suficiente para produzir 3- HP, ou derivados e acetil-CoA ou derivados.
25. Métodos, de acordo com a reivindicação 24, caracterizados pelo fato de que a fonte de carbono é selecionada de açúcares, gliceróis, álcoois, ácidos orgânicos, alcanos, ácidos graxos, lignoceluloses, proteínas, dióxido de carbono e monóxido de carbono.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante coproduz 3-HP, e/ou derivados, e acetil-CoA e/ou derivados, em um processo de produção aeróbico, microanaeróbico ou anaeróbico, preferencialmente, um processo anaeróbico.
27. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que produz acetona e compreende um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de acetil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase que catalisa a produção de acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de acetoacetril-CoA; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma (i) hidroximetilglutaril-CoA sintase que catalisa a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA, e (ii) hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa a produção de acetoacetato a partir de HMG-CoA; e (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase que catalisa a produção de acetona a partir de acetoacetato.
28. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende ERG10 (ID SEQ NO: 209), thlA (ID SEQ NO: 210), atoB (ID SEQ NO: 211), H16_B0759 (ID SEQ NO: 212), Msed_0656 (ID SEQ NO: 213) ou AAT1 (ID SEQ NO: 214).
29. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma tiolase ou uma acetil-CoA acetiltransferase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende ERG10 (ID SEQ NO: 209).
30. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA sintase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende nphT7 (ID SEQ NO: 285).
31. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende atoA/atoD (ID SEQ NO: 215 e 216), ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 219 e 220), ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 221 e 222) ou ctfA/ctfB (ID SEQ NO: 223 e 224).
32. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma acetoacetil-CoA transferase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende atoA/atoD (ID SEQ NO: 215 e 216).
33. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica uma hidroximetilglutaril- CoA sintase e uma hidroximetilglutaril-CoA liase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende ERG13 (ID SEQ NO: 283) e yngG (ID SEQ NO: 284).
34. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende Adc.Ca (ID SEQ NO: 225), Adc.Cbe (ID SEQ NO: 226), Adc (ID SEQ NO: 227), Adc (ID SEQ NO: 228), Adc (ID SEQ NO: 229) ou Adc.Pp (ID SEQ NO: 230).
35. Organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico endógena e/ou exógena que codifica um acetoacetato descarboxilase codifica uma sequência de aminoácidos que compreende Adc.Pp (ID SEQ NO: 230).
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
WO2022226190A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Synthesis of 3-hydroxypropionic acid via hydration of acetylenecarboxylic acid
WO2022251933A1 (en) * 2021-06-01 2022-12-08 Braskem S.A. Production of malonate semialdehyde and derivatives by microorganisms expressing aspartate 1-decarboxylase
CN114480469B (zh) * 2022-02-16 2023-10-31 湖南省中医药研究院 装载茯苓内源序列的基因编辑载体、编辑系统及应用
US20240067994A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Braskem S.A. Process for the recovery of low-boiling point components from an ethanol stream

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US879596A (en) 1906-10-08 1908-02-18 Elmer A Sperry Reclaiming tin-scrap.
US2469701A (en) 1946-02-13 1949-05-10 American Cyanamid Co Preparation of acrylic acid
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6033861A (en) 1997-11-19 2000-03-07 Incyte Genetics, Inc. Methods for obtaining nucleic acid containing a mutation
CN100577626C (zh) 2002-03-25 2010-01-06 嘉吉有限公司 制造α,β-不饱和羧酸或其衍生物的方法
DE102006039203B4 (de) 2006-08-22 2014-06-18 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von durch Kristallisation gereinigter Acrylsäure aus Hydroxypropionsäure sowie Vorrichtung dazu
WO2008076975A1 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Advanced Bionutrition Corporation A dry food product containing live probiotic
US8048624B1 (en) * 2007-12-04 2011-11-01 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass
US20100021978A1 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Genomatica, Inc. Methods and organisms for production of 3-hydroxypropionic acid
EP2480673B1 (en) 2009-09-27 2018-05-23 OPX Biotechnologies, Inc. Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products
US8809027B1 (en) 2009-09-27 2014-08-19 Opx Biotechnologies, Inc. Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase
CN107828671B (zh) * 2010-11-22 2022-03-08 卡吉尔公司 用于生产3-羟基丙酸的组合物和方法
WO2013043758A2 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods regarding direct nadh utilization to produce 3-hydroxypropionic acid, derived chemicals and further derived products
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
CA2906970C (en) 2013-03-21 2021-05-18 Ospedale San Raffaele Srl Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US20180312887A1 (en) * 2014-04-10 2018-11-01 Cargill Incorporated Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems
US20170362613A1 (en) * 2014-12-19 2017-12-21 Novozymes A/S Recombinant Host Cells For The Production Of 3-Hydroxypropionic Acid
CN107406821B (zh) * 2015-02-27 2021-10-15 诺维信公司 用于生产3-羟基丙酸的突变宿主细胞
KR20180012064A (ko) 2016-07-26 2018-02-05 엘지전자 주식회사 디스플레이 장치
US20200095621A1 (en) * 2017-05-16 2020-03-26 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for 3-hydroxypropionate production
US11608488B2 (en) 2017-07-11 2023-03-21 Adisseo France S.A.S. Enhanced metabolite-producing yeast
US11319564B2 (en) 2017-07-11 2022-05-03 Adisseo France S.A.S. Enhanced metabolite-producing yeast

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