KR20210041903A

KR20210041903A - 락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법

Info

Publication number: KR20210041903A
Application number: KR1020190124701A
Authority: KR
Inventors: 박재연; 이태영; 이기성
Original assignee: 에스케이이노베이션 주식회사
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2021-04-16
Also published as: JP2021058184A; CN112725210B; EP3808852A1; US11680270B2; CN112725210A; US20220049262A1

Abstract

본 발명은 젖산 대사와 에탄올 생산이 억제된 내산성 효모를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 젖산 소모반응이 억제되고 젖산생성능이 부여되어, 젖산을 생성능이 향상되고, 에탄올 생성이 억제된 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법{Recombinant Acid Resistant Yeast Inhibited Lactate Metabolism and Alcohol Production and Method for Preparing Lactic Acid Using The Same}

전통적인 젖산 생산 공정은 유산균을 이용하여 생산하며, 유산균에 의해 생성되는 젖산의 축적에 의하여, 산에 의한 균주 사멸 혹은 성장 멈춤을 방지하기 위하여 다양한 형태의 Ca염/Mg염이나 암모니아와 같은 중화제를 이용하여 pH를 중성 pH 인 6~8 로 맞추면서 발효를 진행하게 된다. 발효가 종료되면 미생물을 분리하게 되며 염(salt) 형태로는 물에서의 분리 및 락타이드 전환이 어렵기 때문에 황산을 첨가하여 락테이트를 젖산으로 전환시키면서 Ca염은 CaSO₄ 형태로 제거를 하게 된다. 이와 같은 과정은 젖산보다도 많은 양의 부산물인 CaSO₄가 발생하며, 공정 경제성을 떨어뜨리게 된다.

PLA(Polylacic Acid)는 젖산(lactic acid)을 락타이드(lactide)로 전환하고 이를 개환중합하여 만드는 생분해성 폴리머이며, 그 원료인 젖산은 발효를 통하여 생산하고 있다. PLA는 일회용 식품용기에 광범위하게 사용될 수 있으며, 단독 혹은 조성물이나 공중합체의 형태로 자동차 산업을 포함한 다양한 산업적 플라스틱으로도 사용이 가능한 강도를 갖고 있다. 또한 최근에는 3D 프린팅에서도 사용되는 대표적인 폴리머로 특히 3D 프린터 사용시 유해 가스 발생 및 냄새 발생이 적은 친환경 폴리머이다.

한편, 젖산은 L형과 D형의 광학 이성질체를 가지고 있다. L형을 주로 생산하는 유산균의 경우에도 약 5~10%의 D형을 같이 생산하는 경우가 많으며, D형을 주로 생산하는 균주의 경우 D형과 L형을 같이 생산하는 형태와 D형과 에탄올을 같이 생산하는 형태로 존재하는 등 많은 다양성을 갖고 있는 미생물군이 있다(Ellen I. Garvie, Microbiological Reviews, 106-139, 1980).

PLA는 발효를 통하여 젖산을 생산한 후, 생산된 젖산을 정제 공정을 거쳐 락타이드로 전환하는 공정이 일반적이다. 락타이드 전환을 위해서는 젖산을 Hydrogenated form으로 전환하는 공정이 필요하며, 일반적인 중성 발효에의 pH는 6~7이기에 다량의 황산을 이용하여 산성 pH로 전환하게 된다. 이 과정에서 다량의 중화염이 발생하게 되며 이러한 중화염을 제거하기 위한 공정 투자비와 함께 중화염의 낮은 가치로 인하여 경제성이 저하된다.

한편, 자연계에서 젖산을 생산하는 Lactobacillus의 경우 젖산을 상업성이 있도록 생산하기 위해서는 많은 양의 고가 영양분(nutrient)을 배지로 사용하여야 하며 이러한 과량의 nutrient 성분은 후단 공정의 중합(polymerization) 공정 혹은 락타이드를 중간체로 하는 경우에는 락타이드 전환 공정에 큰 저해를 주게 되어 고수율, 고순도의 폴리머 또는 그 전구체를 얻기 위해서는 흡착, 증류, 이온교환과 같은 정제 공정 비용을 필요로 하게 되어 역시 높은 생산 비용의 원인이 된다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 제시된 방법으로 효모(Yeast)를 이용한 연구가 제시되었다. 효모의 경우 저가의 nutrient를 사용하여도 원활히 성장/발효를 진행하는 것으로 알려져 있으며 산성에서의 내성도 높은 것으로 알려져 있다.

산성에서 잘 자라는 효모(이하, 내산성 효모)를 이용하여 젖산을 생산할 경우, 발효 시 중화제를 이용하여 배지를 pH 6~7로 유지할 필요가 없기 때문에 발효 공정이 단순해지고, 또한 후단 중화제를 제거하는 정제공정이 필요없어진다. 또한, 효모는 대사에 필요한 많은 성분을 스스로 만들기 때문에 세균 특히 락토바실러스에 대비하여 비교적 영양 수준이 낮은 배지에서도 배양이 가능하기 때문에, 많은 후단 정제 공정을 생략할 수 있어, 생산 단가를 크게 낮출 수 있다.

그러나 효모를 이용하는 젖산 생산 기술에 대하여 전제 조건이 있는데 그것은 상업화에 적용하기 위해서는 균주 발효 성능 지표인 수율, 생산성, 젖산의 농도가 유산균의 성능에 유사한 수준으로 높게 유지되어야 한다는 전제 조건이 있다.

효모를 사용한 내산성 젖산 기술 개발이 시도되고 있으나, 실제적으로는 발효에서 중화반응을 수반하여 pH를 젖산의 pKa value 이상인 3.7 이상으로 유지하여 발효를 해야만 고성능의 발효능을 보이는 경우가 많아서 실제적인 내산성 기술이라고 표현하기에는 어렵고 공정에서의 생산비 절감 효과를 보기도 어렵다(Michael Sauer et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 27:229-256, 2010).

따라서 공정 비용을 절감할 수 있는 내산성 효모는 중화제를 사용하지 않거나 최소량으로 사용하면서 발효액의 pH가 pKa value 이하에서 발효를 마칠 수 있어야 하며, 발효 3대 지표가 유산균과 유사한 수준을 달성해야만 상업적 적용 의미가 있다.

일반적 효모는 글루코오스를 발효하면 에탄올을 주 생산물로 대사하며, 젖산을 생산하는 경우는 매우 드물다. 또한 높은 내산성을 갖고 있는 미생물에서 젖산을 생산하는 균주를 선택할 확률이 매우 낮기 때문에, 본 발명자들은 내산성이 우수한 효모 균주를 선별하고, 선별된 균주를 유전공학적인 방법으로 젖산 생산능을 가지면서, 에탄올 생성능이 억제된 균주를 제조하고자 하였다.

이에, 본 발명자들은 젖산 생산능을 가지면서, 에탄올 생성능이 억제된 내산성 균주를 제조하고자 예의 노력한 결과, 내산성 효모에서 젖산을 피루베이트로 전환하는 반응에 관여하는 유전자를 제거하고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 추가로 도입한 재조합 균주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 이용하여 젖산을 제조하는 경우, 젖산 생성능이 향상되고, 에탄올 생성능이 차단되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 내산성 효모에서 젖산 생성능이 증가하면서 에탄올 생성능이 감소된 재조합 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 내산성 효모를 이용하여 젖산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 내산성 효모 유래의 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소 활성을 가지는 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주의 제작에 사용할 수 있는 젖산에 의해 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 g2947 유전자, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 g4423 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자인 g3002 유전자가 결실되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 가지는 g2947 유전자의 포로모터를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 내산성 효모는 에탄올 생성을 억제하여, 세포 내 젖산이 피루베이트로 전환되는 것을 억제하고, LDH 효소를 강하게 발현하여, 젖산을 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 YBC 균주 또는 YBC 2 균주의 게놈에서 g2947 유전자를 삭제하고 LDH 유전자를 삽입하기 위하여 사용한 삭제 카세트를 나타낸 것이다.
도 2는 YBC2 균주와 YBC4 균주의 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 YBC4 균주의 발효 프로파일을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

내산성 효모는 산성 pH에서도 당을 빠른 속도로 소모하며 높은 성장률을 나타내고 발효 조건에서는 소모한 당을 산물로 전환하는 특징을 가진다. 본 발명자들은 이러한 특징을 가지는 효모를 여러 효모 라이브러리를 통하여 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)를 선별하였으며, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)는 젖산 농도가 40g/L~80g/L인 조건에서도 높은 성장성 및 당소모속도를 보이는 균주이다. 상기 내산성 효모 YBC 균주를 대상으로 하여 젖산 생성능을 높이고 에탄올 생성능을 낮추기 위한 대사회로 조절을 실시하여, YBC 균주에서 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자가 결실되고 락테이트 디하이드로게나아제 유전자가 도입된 균주에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시켜 재조합 균주를 제작하였으며, 상기 재조합 균주가 높은 젖산 생성능을 가지면서 에탄올 생성능이 억제되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주에 관한 것이다.

YBC 균주(KCTC13508BP)의 락테이트 소모 반응을 억제하기 위해서는 2가지의 방법이 고려될 수 있으며, 첫번째는 락테이트를 외부로부터 세포 내로 도입하는 트랜스포터를 찾아 이를 제거하는 것이며, 두번째는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소(Lactate dehydrogenase)를 찾아 이를 제거하는 방법이다. 트랜스포터의 경우, 많은 monocarboxylase transporter family가 연구되어 있으며, 이중 대표적으로 많이 연구된 효모의 경우 Ady2 Jen1 등이 외부로부터 락테이트를 이송하는 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다(Ref: Antonio Pacheco et al., FEMS Yeast Res. 12 (2012) 375-381). 그러나 본 발명과 같이 내산성 균주를 활용한 발효의 경우 이러한 트랜스포터에 의한 이송과 함께 외부의 낮은 pH로 인하여 락테이트의 대부분은 배양 조건 및 발효액 조성에 따라 다르나 pH 3에서는 약 80%~90% 정도가 Lactic acid인 Hydrogenation된 형태로 존재를 하며 이러한 Lactic acid는 전하(charge)가 없는 상태에서 상기의 트랜스포터에 의한 이송이 아닌 세포막을 직접 mass transfer하여 세포 내부로 이송되는 것으로 알려져 있다(Minoska Valli et al., Appl Environ Microbio., 72:5492, 2006). 또한 monocarboxylate transporter 중에는 세포 내부로부터 외부로 해리된 염을 이송하는 역할을 하여 세포의 산 스트레스(acid stress)를 완화하는 역할을 하는 경우도 있기에 이러한 트랜스포터의 종류에 따라서는 젖산에 의한 스트레스를 오히려 높일 수 있는 가능성도 있다.

따라서, 본 발명에서는 트랜스포터의 제거에 의하여 내부로의 젖산 수송을 억제하는 것의 효과가 크지 않을 것이라는 판단하에 직접 세포 내부의 락테이트를 피루베이트로 전환하는 반응을 주로 담당하는 효소를 제거한 균주를 제작하였다.

효모에서 락테이트를 피루베이트(pyruvate)로 전환하는 효소/유전자에 대해서 L-락테이트는 CYB2 유전자, D-락테이트는 DLD1 유전자가 알려져 있으며( Guiard, B., EMBO J., 4:3265, 1985; Lodi, T., and Ferrero, I., Mol. Gen. Genet., 238:315,1993), 각각 미토콘드리아막에서 해당 락테이트를 피루베이트로 변환하는 기능을 갖고 있다.

또한, L-락테이트와 관련된 CYB2를 제거할 경우 생산된 락테이트의 소모를 억제하여 젖산의 발효 수율을 높일 수 있다는 보고가 있어 CYB2를 타겟 유전자로 설정하였다(Aki Ookubo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:3063, 2008).

본 발명의 일 양태에서는 YBC 균주에서 주 ADH 유전자인 g4423 유전자를 제거하고 상기 g4423 위치에 락토바실러스 플랜타룸 유래의 서열번호 28의 LDH 유전자를 도입하고, g3002 유전자 (이하, g3002-1 유전자로 칭한다)를 제거하며, 상기 g3002 유전자의 위치에 LDH 유전자를 도입한 재조합 균주 YBC2와 재조합 균주 YBC2에서 다시 g2947 유전자를 제거하면서 LDH 유전자를 도입한 재조합 균주 YBC4를 제작하고, 상기 재조합 균주들을 배양하여, 젖산 생성능이 향되고, 에탄올 생산능이 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 g2947 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 g2947 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(ADH 유전자)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g4423 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 ADH 유전자를 대신하여 LDH 유전자가 추가적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(PDC 유전자)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자는 g3002 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 PDC 유전자를 대신하여 LDH 유전자가 추가적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g2947 유전자와 치환하여 도입되어 g2947 유전자의 프로모터에 의하여 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 g2947 유전자의 결실 또는 약화에 의하여 모균주인 YBC 균주(KCTC13508BP) 보다 젖산 생성능이 증가하고, 에탄올 생성능이 감소 또는 차단되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 도입되는 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 L. helveticus 유래 LDH 유전자, R. oryzae 유래 LDH 유전자 또는 L. plantarum 유래 LDH 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 L. plantarum 유래 LDH 유전자인 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 g2947 유전자, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 g4423 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자인 g3002 유전자가 결실되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g2947 유전자, g4423 유전자 및 g3002 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자와 치환하여 도입되어 치환된 유전자의 프로모터에 의하여 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일양태에서는, YBC4 균주(Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δg2947::ldh)가 YBC2 균주(Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh)에 비하여 젖산 발효 수율이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 반면, 에탄올 발효 수율은 YBC4 균주가 YBC2 균주에 비하여 90% 이상 감소하여 모든 탄소 흐름(Carbon flux)이 에탄올에서 젖산으로 전환된 것을 알 수 있었으며, 이로부터 젖산의 수율이 이론치의 84%까지 높아진 것을 확인하였다(표 2 및 도 2 참조).

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명을 통하여 락테이트 생산이 크게 증가하고 에탄올 생산이 크게 감소한 우수한 내산성 균주를 확보할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하고, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 90%의 상동성을 가지는 유전자에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가지고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가지고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 단백질에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 g2947 유전자의 포로모터에 관한 것이다.

본 발명의 g2947 유전자(CYB2)의 프로모터는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 젖산을 생성하는 균주에서 자체적으로 발현을 유도하여 LDH 유전자를 발현시킬 수 있으며 이는 고농도 글루코오스 조건에서 배양 초기에 강하게 발현되고, 일반적인 해당과정 조건에서 강하게 발현되는 프로모터와는 다른 성격의 프로모터로 배양 후기에 LDH 유전자를 발현시켜서 세포의 젖산 생성능을 지속적으로 유지시켜 줄 수 있는 특성을 갖는 프로모터로써 고효율의 젖산생산 균주 제작을 위한 유용성이 높다.

본 발명에 있어서,'내산성 효모'란 유기산의 pKa 값 미만의 pH에서, 배지에 유기산이 함유되지 않은 경우에 비해, 배지에 1M 이상의 유기산(특히, 젖산)이 함유된 경우, 적어도 10%의 바이오매스 소모율 (당소모율 등) 또는 적어도 10%의 비생장률을 유지할 수 있는 효모로 정의한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서,'내산성 효모'란 pH 5 이상인 경우에 비해, pH 2~4에서 적어도 10%의 바이오매스 소모율 (당소모율 등) 또는 적어도 10%의 비생장률을 유지할 수 있는 효모로 정의한다.

본 발명에 따른 재조합 효모는 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 숙주 효모의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 효모에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 숙주효모는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상적으로 사용되며, 본 발명의 일 실시예에서는 내산성 효모를 이용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 목적 DNA가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 효모라도 무방하다.

상기 재조합 효모는 임의의 형질전환(transformation) 방법에 따라 제조할 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미하며, 일반적인 형질전환 방법에는 전기천공법(electroporation), 초산 리튬-PEG법 등이 있다.

또한, 본 발명에서 유전자를 숙주 미생물의 염색체 상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 임의의 유전자 조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스벡터, 아데노바이러스벡터, 아데노-연관 바이러스벡터, 헤르페스심플렉스 바이러스벡터, 폭스바이러스벡터, 렌티바이러스벡터, 비바이러스성벡터 등을 이용하는 방법이 있다. "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이며 또한 Linearized DNA 또한 효모의 게놈 Integration을 위하여 통상적으로 사용하는 형태이다.

전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 또는 영양 요구 마커 유전자 (auxotrophic marker gene) 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있으며 (Gibson assembly), 필요에 따라서는 원하는 전체의 Sequence 를 합성하여 사용하는 방법도 통상적으로 이용되고 있다.

아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택하는데 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

본 발명에 있어서, 탄소원은 글루코즈, 자일로즈, 아라비노즈, 수크로즈, 프룩토즈, 셀룰로오즈, 갈락토오스, 글루코즈 올리고머 및 글리세롤로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 배양은 미생물, 예를 들어 대장균 등이 더 이상 작용하지 못하도록 (예를 들어, 대사체 생산 불가능) 하는 조건에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 배양은 pH 1.0 내지 6.5, 바람직하게 pH 1.0 내지 6.0, 보다 바람직하게는 2.6 내지 4.0인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 내산성 효모균주 YBC의 게놈 내의 락테이트 소모 유전자 분석

본 발명자들은 다양한 효모 균주에 대한 테스트를 통하여 내산성을 갖는 균주를 선별하여, 효모균에 대하여 젖산을 배양 초기에 배지에 첨가하여 미생물의 성장 및 당소모 속도를 확인하면서 내산성이 가장 우수한 균주인 YBC 균주를 선정하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC13508BP으로 기탁한 바 있다.

계통분석을 통하여 YBC 균주(KCTC13508BP)는 S. cerevisiae와 유사한 균주이며 2배체의 유전자를 갖고 있고 (Diploid), Crab-tree positive 특성이 있는 것을 확인하였다.

Genome Full sequencing Data에서 S. cerevisiae 및 Bioinformatics 정보를 이용하여 YBC 균주의 게놈에 존재하는 L-락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 CYB2로 annotation된 유전자로 g2947과 g3864를 확인하였다.

S. cerevisiae의 CYB2 유전자에 대하여, 단백질 도메인 분석(http://smart.embl-heidelberg.de/ )을 수행하면, S. cerevisiae의 CYB2 유전자는 Cytochrome b5 family, heme-binding domain profile, FMN-dependent alpha-hydroxy acid dehydrogenase domain profile의 특성을 갖고 있다. g2947 유전자에 대하여 동일한 분석을 수행하였을 때 Cytochrome b5 family, heme-binding domain profile, FMN-dependent alpha-hydroxy acid dehydrogenase domain profile과 같이 S. cerevisiae의 CYB2 유전자와 같은 특성을 보였으며, g3864 유전자의 경우는 heme-binding domain profile이 없는 것으로 나타나서 CYB2 특성을 갖고 있기 어려운 것으로 판단되었다. 또한 S. cerevisiae의 게놈 상에서 CYB2 유전자 부근의 ORF를 분석하면 CMP2-IMD4-SPC2-CYB2-YML054c-A의 ORF가 순차적으로 배치되어 있는데 g2947이 있는 YBC 균주의 scaffold 41에도 이와 동일한 부위가 있어 이러한 ORF가 보존된 부위(conserved region)로 존재할 가능성도 보였다. 이에 g2947 유전자 (서열번호 1과 서열번호 2) 및 이의 단백질 (서열번호 3과 서열번호 4)을 대상으로 이를 제거할 수 있는 삭제 카세트(deletion cassette)를 제작하였다.

또한 본 실시예에서는 이를 삭제(결실)만 시키는 카세트와 함께 g2947의 inherent한 프로모터를 이용하여, 락테이트를 생성시키는 효소인 L. plantarum 유래 LDH(lactate dehydrogenase) 유전자를 발현할 수 있는 카세트를 같이 디자인하였다(도 1). 삭제 카세트는 도 1에 나타내었으며, 해당 제한효소 부위나 항생제 내성 유전자의 선택 및 항생제 내성 유전자 제거 방식은 관련 업계에 잘 알려진 방식이며 다양하게 변형하여 사용할 수 있다.

실시예 2: 락테이트 소모 유전자가 제거된 재조합 내산성 효모균주 제작

CYB2 유전자로 예상되는 g2947 유전자를 게놈에서 제거하기 위한 대상 내산성 효모균주는 Wild type 균주가 아닌 기존의 Wild type에 주 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 제거하면서 LDH 유전자를 도입한 YBC1 균주에서, 추가로 g3002-1 유전자(PDC 유전자)가 제거되면서 LDH가 발현된 균주로 Ethanol 생성능이 봉쇄되면서 젖산을 고효율로 생산하는 YBC2 균주이다. 상기 YBC2 균주에서 g2947 유전자를 제거하면서 (Diploid 균주로 Allele1 및 Allele 2 모두 제거) 2 copy의 L. plantarum 유래 LDH 유전자가 발현되도록 한 균주(YBC4)를 제작하였으며, 당해 균주의 genotype을 확인하기 위하여 아래의 표 1의 프라이머를 제작한 뒤 해당 균주의 genomic DNA에서 확인하였다.

상기 균주의 제작방법은 다음과 같다:

상기 YBC1 균주는 YBC 균주의 주 ADH 유전자인 g4423 유전자를 제거하고 상기 g4423 위치에 락토바실러스 플랜타룸 유래의 서열번호 7의 LDH 유전자를 도입한 균주로, g4423 및 이들의 UTR의 정보를 바탕으로 하여 각 유전자의 ORF가 제거되고 5' 과 3' UTR 및 항생제 마커가 있는 유전자 카세트를 제작하여 Donor DNA로 사용하였다. g4423의 각 allele 에 대하여 상응하는 5' UTR은 서열번호 8 및 서열번호 9에 나타내었고, 3' UTR은 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타내었다. Donor DNA의 제작에는 전술한 바와 같이 제한효소를 이용한 클로닝 방법과 Gibson assembly, 유전자 합성을 이용한 방법이 사용되었다. g4423의 ORF 자리에 서열번호 7의 LDH를 합성한 뒤 도입하여 Donor DNA를 제작하고 이를 YBC에 도입하여 재조합 균주 YBC1을 제작하였다.

아울러, g3002-1 유전자는 YBC 균주의 게놈에서 스캐폴드 72 위치에 있는 유전자로 PDC 유전자로 작동하는 유전자이다. YBC 1 균주의 g3002-1 유전자 (스캐폴드 상 72 에 위치한 유전자) 를 제거하며 서열번호 7의 LDH 유전자를 도입한 재조합 균주 YBC2를 제작하였다.

특히 이러한 g3002의 유전자를 치환하기 위하여 UTR을 이용하여 제작하였다. 상기의 YBC1의 g4423 유전자 (ADH) 의 자리에 LDH를 도입하는 방법과 유사하게 g3002-1의 UTR을 이용하여 제작하였다. 단, 당해 유전자의 치환에서는 과정의 단순화를 위하여 allele variation을 고려하지 않고 하나의 allele를 대상으로 하여 Donor cassette를 제작하였으나, allele 별로 제작도 가능하다. 또한 유전자 치환에 사용하는 프라이머에 대해서도 상기의 결실균주 제작에 사용한 프라이머 이외에 다음과 같이 g3002-1의 UTR과 LDH를 같이 확인할 수 있는 프라이머쌍을 별도로 사용하여 유전자 치환 확인의 정확도를 높였다.

g3002-1 UTR-LDH-fwd : GCAGGATATCAGTTGTTTG(서열번호 12)

g3002-1 UTR-LDH-rev : AATACCTTGTTGAGCCATAG(서열번호 13)

상기 균주의 제작방법은 다음과 같다:

상기 YBC4 균주는 YBC2 균주의 CYB2 유전자인 g2947 유전자를 제거하고 상기 g2947 위치에 락토바실러스 플랜타룸 유래의 서열번호 7의 LDH 유전자를 도입한 균주로, g2947 유전자는 YBC 균주의 게놈에서 스캐폴드 41 위치에 있는 유전자이다. g2947 및 이들의 UTR의 정보를 바탕으로 하여 각 유전자의 ORF가 제거되고 5' 과 3' UTR 및 항생제 마커가 있는 유전자 카세트를 제작하여 Donor DNA로 사용하였다. g2947의 각 allele 에 대하여 상응하는 5' UTR은 서열번호 5 및 서열번호 6에 나타내었고, 3' UTR은 서열번호 14 및 서열번호 15에 나타내었다. Donor DNA의 제작에는 전술한 바와 같이 제한효소를 이용한 클로닝 방법과 Gibson assembly, 유전자 합성을 이용한 방법이 사용되었다.

단, 당해 유전자의 치환에서는 과정의 단순화를 위하여 allele variation을 고려하지 않고 하나의 allele를 대상으로 하여 Donor cassette를 제작하였으나, allele 별로 제작도 가능하다. 또한 유전자 치환에 사용하는 프라이머에 대해서도 상기의 결실균주 제작에 사용한 프라이머 이외에 다음 표 1과 같이 g2947의 UTR과 LDH를 같이 확인할 수 있는 프라이머쌍을 별도로 사용하여 유전자 치환 확인의 정확도를 높였다.

g2947 도입 확인용 프라이머 세트

이름	해당 Sequence
G2947 ORF 확인용 primer	CTAGTTGTGGTTCCTTGTAT(서열번호 16) GAAAATAAATCCGATGGTGC(서열번호 17)
G2947 ORF 확인용 primer 2^nd set	TGTTTGACTGTTCGATATGG(서열번호 18) GAAAATAAATCCGATGGTGC(서열번호 19)
G2947 UTR 확인용 primer	TGTTTGACTGTTCGATATGG(서열번호 20) GAAGATTGAAAGGGTCAGT(서열번호 21)
G2947 LDH 도입 확인용 primer	GACTAATCACCCAACTCTCA(서열번호 22) ATCGCCGAGGTACTAGAG(서열번호 23)

상기 제작한 재조합 균주의 유전형은 다음과 같다:

YBC2 : Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh

YBC4 : Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δg2947::ldh

실시예 3: YBC2 균주에서 CYB2 유전자를 결실되고 LDH가 도입된 재조합 YBC 균주에서 젖산 생성 및 에탄올 생성 저해 효과 확인

실시예 2에서 제작한 재조합 균주 YBC2와 YBC4에 대하여 접종 OD는 0.5, 배지는 YP 배지(20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract)에 Glucose 6%를 사용하여 100ml의 플라스크 배양으로 30℃, 175rpm 조건에서, 4시간 배양 후 125rpm 조건에서 배양하였다.

YBC2와 YBC4의 배양 결과

	Yield (g/g)						Productivity (g/L/hr)	pH
	Lactic acid	Ethanol	Glycerol	Acetic acid	Pyruvic acid	Succinic acid	Productivity (g/L/hr)	pH
YBC2	0.66	0.083	0.03	0.002	0.002	0.01	1.31	2.74
YBC4	0.84	0.004	0.03	0	0.002	0.005	1.55	2.59

그 결과, 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, YBC4 균주는 YBC2 균주에 비하여 젖산 발효 수율이 현저히 증가하였다. 반면, 에탄올 발효 수율은 YBC4 균주가 YBC2 균주에 비하여 90% 이상 감소하여 모든 탄소 흐름(Carbon flux)이 에탄올에서 젖산으로 전환된 것을 알 수 있으며, 이로부터 젖산의 수율이 이론치의 84%까지 높아진 것을 알 수 있다. 일반적으로 중성발효에서는 젖산의 수율은 균주 성장에 소모되는 탄소를 제외하면 약 90%에서 94%까지의 높은 수율을 보일 수 있다. 그러나 내산성 균주에서는 외부로부터 세포막을 통하여 확산되는 비해리 형태(undissociated form)의 젖산 흐름이 있으며, 내부생성 젖산과 외부에서 유입되는 젖산에 의한 스트레스를 감소시키기 위하여 외부로 트랜스포터를 통한 수송이 필요하다. 이러한 수송에서 외부 젖산 농도가 저농도인 경우에는 단순 퍼미에이즈(permease) 형태의 수송이 가능하며 이 경우에는 ATP의 소모가 필요없으나, 외부 젖산의 농도가 높아지면 농도구배에 역행하여 젖산을 수송하기 위하여 에너지가 필요하며 이 과정에서 ATP를 소모하게 된다(Antonius J. A. van Maris et al., Metabolic Engineering 6: 245, 2004). 이러한 ATP의 소모는 필연적으로 추가 탄소 손실(carbon loss)을 일으키게 되며 현재까지 중화제를 사용하지 않거나 최소한으로 사용하여 pH 3 이하에서 50g/L 의 높은 젖산을 생산하면서 수율 0.8 이상을 보인 결과는 본 발명이 유일하다.

g2947의 본래 역할인 젖산소모에 대하여 배양 종료 이후 글루코오스가 없을 때 젖산이 소모되는 지를 확인한 결과, YBC2 균주는 기존의 결과와 유사하게 천천히 젖산이 없어지는 것을 알 수 있었으나, g2947 유전자가 결실된 YBC4 균주는 젖산의 저감이 관찰되지 않았으므로, g2947 유전자는 CYB2 유전자인 것을 확인할 수 있었다.

YBC4 균주의 성능에서 가장 두드러진 것은 젖산의 수율 증가와 함께 에탄올 생성의 완전 차단에 있다. 그동안 보고된 CYB2 유전자의 제거 효과는 생성된 젖산이 발효 후반 글루코오스 농도가 낮아져도 소모되어 없어지지 않는다는 것과 젖산의 일부 수율 증가가 있다는 보고가 있었으며 수율의 증가도 pKa 이상의 pH에서는 보이지 않다가 pH 3.5 에서만 19.3%에서 28.6%로 증가하는 경향을 보였다(Aki Ookubo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:3063,2008). 그러나 본 실시예의 결과는 젖산의 소모 차단과 함께 이미 높은 젖산생성 수율을 나타내는 균주 (YBC2)가 추가로 드라마틱한 증가와 함께 에탄올 생성이 완전히 차단된 결과를 보여주었다. 이 이유에 대해서는 다음과 같이 설명할 수 있는데 첫번째는 CYB2 유전자가 미토콘드리아 막에서 락테이트를 피루베이트로 전환시키면서 추가 피루베이트를 공급할 수 있는데 이 피루베이트는 에탄올로 전환이 가능하기 때문에 이로부터 생성되는 에탄올은 CYB2 유전자를 제거하여 억제할 수 있다. 특히 당해 균주의 Genotype에서는 주된 ADH 와 주된 PDC만을 제거한 상태이기 때문에 미토콘드리아에서 역할을 하는 ADH3를 포함한 보조 ADH와 보조 PDC들에 의하여 소량의 에탄올이 생성되고 있는 것으로 유추된다. 다른 하나는 CYB2의 자리에 도입된 LDH의 추가 발현으로 인하여 YBC 균 내부의 LDH가 강화가 되었고 이로부터 피루베이트에서 락테이트로 가는 경로는 피루베이트로부터 에탄올로 가는 경로가 이미 약해진 상태에서, 보다 선택도가 높아질 수 있어서 에탄올의 수율이 감소되었을 것으로 생각되며 이 두 가지의 효과가 같이 일어나면서 에탄올 생성이 완전히 차단될 수 있는 것으로 판단된다.

실시예 4: 야생형 YBC 균주에서 CYB2 유전자가 결실되고 LDH가 도입된 재조합 YBC 균주에서 젖산 생성 및 에탄올 생성 저해 효과 확인

실시예 3의 결과에 의하여 g2947 유전자 제거 및 LDH 발현에 의한 젖산생성능 증가와 에탄올 생성능 저하를 확인하였으나, 모균주로 사용한 YBC2 균주가 ADC와 PDC 유전자가 결실된 균주이므로, 상기 결과는 g2947 유전자 이외 다른 유전자들의 제거에 의한 복합 효과로 나타난 것이다.

따라서, 야생형 균주인 YBC 균주에서 g2947 유전자만을 제거하면서 LDH를 발현한 균주를 제작하고 이의 젖산생성능 및 에탄올 생성 저해를 확인하였다. 재조합 균주의 제작에 사용한 카세트 및 유전형 확인을 위해 사용한 프라이머는 도 1 및 표 1에 나타낸 것과 같은 것을 사용하여, 실시예 2에 나타낸 방법으로 제작하였다.

YBC 균주에서 g2947 유전자가 제거되고 LDH가 삽입된 균주는 YBC_a로 명명하였으며, 유전형은 다음과 같다.

YBC_a : Δg2947::ldh

상기 재조합 균주를 접종 OD 값은 0.5 수준, 배지는 mYP 배지(5g/L Peptone, 4g/L Yeast extract, 5g/L KH₂PO₄, 2g/L MgSO₄·7H2O, 0.15g/L Uracil)에 Glucose 6%를 사용하였으며 500ml 플라스크에 50ml 배양부피로 30℃, 125rpm에서 배양하였다.

또한 추가로 젖산에 의한 유도(induction)효과를 보기 위하여 초기 젖산 농도를 11.5g/L로 배양 초기에 배양액에 주입한 뒤 배양하였다.

YBC_a 균주의 젖산과 에탄올 수율

	Yield (g/g)
	Lactic acid	Ethanol
Wild type	0	0.44
YBC_a	0.02	0.37
YBC_a, 초기 젖산 첨가	0.09	0.35

표 3에 나타난 바와 같이, YBC_a 균주의 경우, 야생형 균주의 일반적인 에탄올 수율인 0.43~0.45g/g 과 비교하여 수율이 낮아져, CYB2 유전자 제거에 의한 에탄올 수율 감소 효과를 확인할 수 있었다. 또한 흥미롭게도 CYB2 유전자의 자리에 도입된 LDH 유전자만으로는 거의 젖산을 생산하지 못한다는 것을 알 수 있으며 이것은 CYB2의 프로모터가 일반적인 발효 조건인 글루코오스 존재하에서 젖산이 없다면 발현하지 못한다는 것을 나타내는 것이며, 또한 젖산이 생성되지 않았음에도 생성되는 에탄올의 감소 효과가 있다는 것을 보여 주는 결과이다. CYB2 유전자의 발현유도(induction) 효과를 확인하기 위하여 배양 초기 배양액에 젖산을 첨가할 경우 이 젖산이 세포 내부로 mass transfer or active transfer하게 되고 이 세포내 젖산에 의하여 CYB2 프로모터가 반응하고, CYB2 자리에 치환된 LDH 유전자를 발현시켜 젖산의 수율이 증가되고 추가 에탄올 수율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이로부터 CYB2 프로모터는 젖산을 생성하는 균주에서 자체적으로 발현을 유도하여 LDH 유전자를 발현시킬 수 있으며 이는 고농도 글루코오스 조건에서 배양 초기에 강하게 발현되고, 일반적인 해당과정 조건에서 강하게 발현되는 프로모터와는 다른 성격의 프로모터로 배양 후기에 LDH 유전자를 발현시켜서 세포의 젖산 생성능을 지속적으로 유지시켜 줄 수 있는 특성을 갖는 프로모터로써 고효율의 젖산생산 균주 제작을 위한 유용성이 높다. g2947 유전자의 프로모터 부위는 서열번호 5와 서열번호 6에 나타내었다.

이러한 CYB2 제거 효과는 선행문헌들과 비교할 경우, 본 발명에서의 효과의 우수성이 보다 극명하며, 이전의 연구에서는 낮은 pH 에서만 일부 젖산 수율 증가가 있었다는 보고가 기술되었으나, 본 발명과 같이 에탄올 저감에 대한 명시는 없다(Aki Ookubo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:3063, 2008). Natureworks의 특허 WO 2007117282 및 US 8,137,953B에서는 I. orientalis에서 젖산을 생성하는 균주를 제작하고 이 균주의 CYB2를 제거한 균주를 개발하였다. 이 때 pH 3에서 CYB2 제거 전 0.35g/L/hr의 속도, 56g/L의 농도 69%의 수율의 락테이트를 생산하는 균주에서, CYB2 제거 후 0.43g/L/hr의 속도, 66g/L 농도 67% 수율로 락테이트를 생산하였는데, 락테이트의 생산 농도는 증가하였으나 수율은 오히려 감소하는 결과를 보였으며, 부산물로 글리세롤도 증가하는 결과를 보였다. 또한 삼성종합기술원의 US 9,353,388B 특허에서는 젖산을 생산하는 미생물을 제작하고 CYB2 유전자를 제거하거나(해당 특허 표 3의 SP1002 성능 평가), 제거와 동시에 LDH 유전자를 발현하는 미생물을 제작하였으며(해당 특허 표 4의 sp1003과 sp1002 에 Jen1 및 Ady2 과발현 효과 참조) 이때 젖산의 생산 농도가 크게 증가하는 효과를 확인하였다. 그러나 상기 특허에서도 에탄올의 완전 차단효과에 대한 명시는 없어, 본 발명에서의 YBC 균주에서의 CYB2 유전자 제거 및 LDH 유전자 발현에 따른 효과는 매우 우수하다 할 수 있다.

실시예 5: YBC1 균주에서 CYB2 유전자를 제거하면서 LDH를 발현한 균주 제작 및 성능 평가

상기 YBC4의 결과는 YBC 균주에서 주 ADH (g4423) 및 주 PDC(g3002-1)가 제거된 균주에서 g2947 유전자를 제거하고 LDH 유전자를 추가로 삽입하여 젖산 생성 및 에탄올 생성능 저해를 확인한 것으로, 이중 주 ADH 유전자와 g2947 유전자만의 복합 효과에 대하여 확인하기 위한 재조합 균주를 제작하고, 발효능을 확인하였다.

ADH (g4423) 및 g2947를 제거하고, LDH 유전자를 삽입한 재조합 균주의 제작은 실시예 2에서 사용한 카세트 및 프라이머 세트를 사용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 제작하였다.

제작된 재조합 균주는 YBC_b 로 명명하였으며 유전형은 아래와 같다.

YBC_b : Δg4423::ldh / Δg2947::ldh

상기 재조합 균주를 접종 OD 값은 0.5 수준, 배지는 mYP 배지(5g/L Peptone, 4g/L Yeast extract, 5g/L KH₂PO4, 2g/L MgSO₄·7H₂O, 0.15g/L Uracil)에 Glucose 10% 로 배양을 하였으며, 500ml의 플라스크에 60ml 배양부피로 30℃, 150rpm 에서 배양하였다. 당해 배양은 초기 글루코오스 농도가 높기 때문에 생성되는 젖산에 의한 pH 저하가 커서, 성장 저해가 예상되기에 40% CaCO₃ 용액을 2회에 걸쳐 1ml 씩 주입하여 최종 pH를 pH 3 수준으로 조절하였다. 또한 비교를 위하여 YBC4 균주를 동일 조건에서 배양하였다.

YBC_b 균주의 젖산 및 에탄올 수율비교

	Yield (g/g)
	Lactic acid	Ethanol	Glycerol
YBC_b	0.73	0.023	0.06
YBC1	0.59	0.093	0.045
YBC4	0.81	0.002	0.04

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, YBC_b 균주는 YBC4 균주가 에탄올 생성이 차단된 것에 비하여, 에탄올이 생성되고 젖산 수율이 떨어지는 것을 알 수 있으며, 이는 YBC_b 균주 주 PDC (g3002-1)가 활성인 상태이기 때문에 피루베이트에서 LDH와 PDC가 서로 경쟁을 하는 상태이며 이로부터 에탄올이 생성되는 것으로 판단된다. 그러나 YBC1(Δg4423::ldh)균주의 에탄올 수율이 0.07~0.1 g/g 수준인 것을 고려하면, YBC_b 균주의 에탄올 수율은 현저히 낮아(0.023 g/g), g2947 유전자 결실에 의한 효과는 여전히 확인할 수 있다.

실시예 6: YBC2 균주에 CYB2 유전자만을 제거한 균주 제작 및 성능 평가

상기 YBC4 균주의 결과는 주 ADH (g4423) 및 주 PDC(g3002-1)가 제거된 균주에서 g2947 유전자의 제거 및 LDH 삽입에 의한 젖산 생성능 증가 및 에탄올 생성능 차단을 확인한 것으로 이중 LDH의 발현을 제외한 효과를 확인하기 위하여, YBC2 균주에서 g2947 유전자만을 제거한 재조합 균주를 제작하고 이의 발효능을 확인하였다.

재조합 균주의 제작은 실시예 2에서 사용한 카세트 및 프라이머 세트를 사용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 제작하였다. LDH 발현이 없기 때문에 표 1의 'G2947 LDH 도입 확인용 프라이머'는 사용하지 않았다.

제작된 재조합 균주는 YBC_c 로 명명하였으며 유전형은 아래와 같다.

YBC_c : Δg4423::ldh/Δg3002-1::ldh/Δ2947

상기 재조합 균주를 접종 OD 값은 0.5 수준, 배지는 mYP 배지(5g/L Peptone, 4g/L Yeast extract, 5g/L KH₂PO₄, 2g/L MgSO₄·7H₂O, 0.15g/L Uracil)에 Glucose 10% 로 배양을 하였으며, 500ml 플라스크에 60ml 배양부피로 30℃, 150rpm에서 배양하였다. 당해 배양은 초기 글루코오스 농도가 높기 때문에 생성되는 젖산에 의한 pH 저하가 커 성장 저해가 예상되기에, 40% CaCO₃ 용액을 2회에 걸쳐 1ml씩 주입하여 최종 pH를 pH 3 수준으로 조절하였다. 또한 비교를 위하여 YBC4 균주를 동일 조건에서 배양하였다.

YBC_c 균주의 젖산 및 에탄올 생산 수율 확인

	Yield (g/g)
	Lactic acid	Ethanol	Glycerol
YBC_c	0.73	0.044	0.05
YBC4	0.81	0.002	0.04

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, YBC4 균주와 비교시 YBC_c 균주는 LDH의 미발현에 의한 에탄올과 젖산의 수율 영향은 동일하며 표 1의 YBC2와 비교시에는 g2947 유전자의 제거에 의한 효과 또한 계속 확인 가능하였다.

실시예 7: YBC4 균주의 초기 접종농도에 따른 생산성 증가 효과 확인

일반적으로 발효에서 초기 접종 농도를 높일 경우 수율 및 생산성의 증가를 예상할 수 있다. YBC4 균주에도 동일한 방법을 적용하여 그 효과를 확인하였다.

YBC4의 동일 종균배양(seed culture)에서 증류수와 혼합하여 접종 OD 를 0.5에서 2까지 변화시켰다. 배지는 mYP 배지(5g/L Peptone, 4g/L Yeast extract, 5g/L KH₂PO₄, 2g/L MgSO₄·7H₂O, 0.15g/L Uracil)에 Glucose 8.7%를 사용하였으며 500ml 플라스크에 55.5ml 배양부피로 30℃, 150 rpm에서 배양하였다.

초기 접종농도에 따른 YBC4 균주의 수율 및 생산성 비교

	Yield (g/g)			Productivity (g/L/hr)	pH
	Lactic acid	Ethanol	Glycerol	Productivity (g/L/hr)	pH
OD 0.5	0.81	0.009	0.04	1.83	2.6
OD 1	0.81	0.012	0.04	2.06	2.6
OD 1.5	0.81	0.008	0.04	2.09	2.6
OD 2	0.80	0.007	0.04	2.13	2.6

그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 초기 접종 OD값의 증가에 따른 생산성 증가를 확인할 수 있었으나 수율의 변화는 거의 없었다. 이는 최종 OD가 10 수준에 도달하기 위하여 소모되는 탄소의 비율이 상기의 초기 OD의 차이에 따라서 큰 변동이 없는 것으로 생각된다.

상기 배양 결과를 기존 보고된 pH 3 이하의 내산성 효모의 젖산 생산 결과 중 가장 우수한 대표적인 2가지의 결과와 비교하여 표 7에 나타내었다.

YBC4 균주와 선행특허의 내산성효모의 젖산 생산수율 및 생산성 비교

	Lactic acid Yield (g/g)	Productivity (g/L/hr)	Lactic acid 농도 (g/L)	pH
US2009/0053782 A1	0.80	1.68	70	3
WO 2005/052174 A2	0.79	0.73	53.8	2.75
실시예 7	0.81	2.1	70	2.6

(US2009/0053782 A 은 농도 명시 성능 기준, WO 2005/052174A 수율은 주입당 기준으로 나타냄)

표 7에 나타난 바와 같이, YBC4 균주의 젖산 생산성이 가장 높은 것을 알 수 있다.

실시예 8: YBC4 균주의 발효 성능 평가

YBC4 균주를 플라스크 배양이 아닌 바이오리액터에서 배양하여 젖산발효 성능을 확인하였다.

접종 OD를 1에 배지는 mYP 배지(5g/L Peptone, 4g/L Yeast extract, 5g/L KH₂PO₄, 2g/L MgSO₄·7H₂O, 0.15g/L Uracil)에 Glucose 12%로 배양을 시작하였으며, CaCO₃ 용액를 간헐적으로 주입하여 pH를 pH3 수준에서 유지할 수 있도록 하였다. 2.5L 배양액에 30℃, 450 rpm, Air 0.1vvm 으로 주입하여 배양하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, YBC4 균주는 바이오리액터 내에서 빠른 시간에 모든 글루코오스를 소모하며 젖산을 생산하는 것을 확인할 수 있었으며 최종 pH 3.3에서 젖산 수율이 0.8(g/g), 생산성 2.0g/L/hr, 생산 젖산 농도 98.1g/L를 나타내었다. 또한 향후 초기 OD 및 배양 조건 개선에 따라 본 성능의 추가 개선도 가능한 것으로 유추된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SK Inovation Co., Ltd <120> Recombinant Acid Resistant Yeast Inhibited Lactate Metabolism and Alcohol Production and Method for Preparing Lactic Acid Using The Same <130> P19-B263 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1851 <212> DNA <213> g2947 allele1_ORF <400> 1 atgcaagcaa tttcaaaaaa ttcaacattt ttacgtaatt gtaaaaattt gaaatttatt 60 tcaaagaaca ttaataatag gaagttatct tcttcatcta taactttatc acaattacaa 120 tcaattaaaa ctaataccaa ttataagaat tattcttcca aaaatttacg taattcatta 180 attttattat cgtctgtatc atttttagct tattacgcta atgatcaatt acaacataat 240 actaattcat taatatctaa tgataatggt aagaatccag ctgctaataa gaaaccaatc 300 tctccagcag aagttgctaa acataacaaa ccagatgatt gttgggtagt tattgacggt 360 tacgtttacg atgtctcttt ctttattcca aatcatccag gtggtgaaga tgtcattaga 420 gctaatgcag gtaaggatgt taccgctatc ttcatgccat tacatgctaa gggtaccctt 480 gaaaagaata ttccaattga aaatcaatta ggtccattaa gtaaaccaat gcctaaaaaa 540 ttagtttgtc caccttatgc tcctggtgag acaccttatg aaattatgac taaacaaaaa 600 ttaagagata atatgccacc attaggcaca attttaaatc tttatgattt tgagagatta 660 gcttcaaaaa ttttaactaa tcaagcttgg gcttattatt cttctggtgc agatgatgaa 720 attacatata gagaaaacca taacgcttat catagaatct ttttcaaacc acatatttta 780 gtcgatgtta aggatgtcga tttgaagact actatgttag gtaataagac cgatgttcca 840 ttctatgtta gtgctactgc tttatgtaaa ttaggtaatc cagaaggtgg tgaagttgat 900 atcgctaaag gttgtggttc aacttcttat atggttcctc aaatgatttc tactttagct 960 tcttgttcat tagatgaagt cgcccagggg aaagctaacg ataaacaatt acaatggttt 1020 caattatatg ttaattccga tagaaagatt actagaaatt taattaaaca tgctgaagat 1080 ttaggtatga aggctatctt cgtcacagtt gatgctcctt ctttaggtaa tagagaaaag 1140 gatcaaaaga ttaaatttac tactcaaggt tctgagggtc caaagatttt acaaaagaaa 1200 ggtgattcct ccaatgctgc tgctgaagca aagaagaaag aaaataaatc cgatggtgcc 1260 tctaaagctt tatctaaatt tatcgatcct tctttgtcct gggaagatat cgcaaagatg 1320 agaaaattga ctaaattacc aatcgttatt aagggtgttc aaagagctga agatgctgta 1380 agagcagctc aaatgggttg tcaaggtgtt gttctttcaa atcatggtgg tagacaatta 1440 gatttctcaa gagccccaat tgaagttctt 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Ile Leu Leu Ser 50 55 60 Ser Val Ser Phe Leu Ala Tyr Tyr Ala Asn Asp Gln Leu Gln His Asn 65 70 75 80 Thr Asn Ser Leu Ile Ser Asn Asp Asn Gly Lys Asn Pro Ala Ala Asn 85 90 95 Lys Lys Pro Ile Ser Pro Ala Glu Val Ala Lys His Asn Lys Pro Asp 100 105 110 Asp Cys Trp Val Val Ile Asp Gly Tyr Val Tyr Asp Val Ser Phe Phe 115 120 125 Ile Pro Asn His Pro Gly Gly Glu Asp Val Ile Arg Ala Asn Ala Gly 130 135 140 Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Met Pro Leu His Ala Lys Gly Thr Leu 145 150 155 160 Glu Lys Asn Ile Pro Ile Glu Asn Gln Leu Gly Pro Leu Ser Lys Pro 165 170 175 Met Pro Lys Lys Leu Val Cys Pro Pro Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Pro 180 185 190 Tyr Glu Ile Met Thr Lys Gln Lys Leu Arg Asp Asn Met Pro Pro Leu 195 200 205 Gly Thr Ile Leu Asn Leu Tyr Asp Phe Glu Arg Leu Ala Ser Lys Ile 210 215 220 Leu Thr Asn Gln Ala Trp Ala Tyr Tyr Ser Ser Gly Ala Asp Asp Glu 225 230 235 240 Ile Thr Tyr Arg Glu Asn His Asn Ala Tyr His Arg Ile Phe Phe Lys 245 250 255 Pro His Ile Leu Val Asp Val Lys Asp Val Asp Leu Lys Thr Thr Met 260 265 270 Leu Gly Asn Lys Thr Asp Val Pro Phe Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu 275 280 285 Cys Lys Leu Gly Asn Pro Glu Gly Gly Glu Val Asp Ile Ala Lys Gly 290 295 300 Cys Gly Ser Thr Ser Tyr Met Val Pro Gln Met Ile Ser Thr Leu Ala 305 310 315 320 Ser Cys Ser Leu Asp Glu Val Ala Gln Gly Lys Ala Asn Asp Lys Gln 325 330 335 Leu Gln Trp Phe Gln Leu Tyr Val Asn Ser Asp Arg Lys Ile Thr Arg 340 345 350 Asn Leu Ile Lys His Ala Glu Asp Leu Gly Met Lys Ala Ile Phe Val 355 360 365 Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly Asn Arg Glu Lys Asp Gln Lys Ile 370 375 380 Lys Phe Thr Thr Gln Gly Ser Glu Gly Pro Lys Ile Leu Gln Lys Lys 385 390 395 400 Gly Asp Ser Ser Asn Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Glu Asn Lys 405 410 415 Ser Asp Gly Ala Ser Lys Ala Leu Ser Lys Phe Ile Asp Pro Ser Leu 420 425 430 Ser Trp Glu Asp Ile Ala Lys Met Arg Lys Leu Thr Lys Leu Pro Ile 435 440 445 Val Ile Lys Gly Val Gln Arg Ala Glu Asp Ala Val Arg Ala Ala Gln 450 455 460 Met Gly Cys Gln Gly Val Val Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu 465 470 475 480 Asp Phe Ser Arg Ala Pro Ile Glu Val Leu Ala Glu Thr Met Pro Ile 485 490 495 Leu Lys His His Gly Leu Asp Lys Asn Phe Asp Val Phe Val Asp Gly 500 505 510 Gly Ile Arg Arg Gly Thr Asp Ile Leu Lys Ala Leu Cys Leu Gly Ala 515 520 525 Thr Gly Val Gly Leu Gly Arg Pro Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr 530 535 540 Gly Arg Asp Gly Val Ala His Ala Ile Asp Ile Ile Thr Lys Glu Leu 545 550 555 560 Glu Met Ser Met Arg Leu Leu Gly Val Ser Lys Ile Glu Asp Leu Asn 565 570 575 Pro Gly Phe Leu Asp Leu Gln Ser Leu His Ala Arg Ser Val Leu Val 580 585 590 Ala Lys Asp Ala Leu Tyr Glu Asn Ser Tyr Lys Glu Pro Gln Leu Ala 595 600 605 Lys Phe Leu Ile Asp Asp Asp Asp *** 610 615 <210> 4 <211> 609 <212> PRT <213> g2947 allele 2 <400> 4 Met Gln Ala Ile Asn Phe Lys Asn Leu Lys Phe Ile Ser Lys Asn Ile 1 5 10 15 Asn Asn Arg Lys Leu Ser Ser Ser Ser Ile Thr Leu Ser Gln Leu Gln 20 25 30 Ser Ile Lys Thr Asn Thr Asn Tyr Lys Asn Tyr Ser Ser Lys Asn Leu 35 40 45 Arg Asn Ser Leu Ile Leu Leu Ser Ser Val Ser Phe Leu Ala Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asn Asp Gln Leu Gln Gln Asn Thr Asn Ser Leu Ile Ser Asn Glu 65 70 75 80 Asn Gly Lys Asn Pro Ala Ala Asn Lys Lys Pro Ile Ser Pro Ala Glu 85 90 95 Val Ala Lys His Asn Lys Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asp Gly 100 105 110 Tyr Val Tyr Asp Val Ser Phe Phe Ile Pro Asn His Pro Gly Gly Glu 115 120 125 Asp Val Ile Arg Ala Asn Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Met 130 135 140 Pro Leu His Ala Lys Gly Thr Leu Glu Lys Asn Ile Pro Ile Glu Asn 145 150 155 160 Gln Leu Gly Pro Leu Ser Lys Pro Met Pro Lys Lys Leu Val Cys Pro 165 170 175 Pro Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Pro Tyr Glu Ile Met Thr Lys Gln Lys 180 185 190 Leu Arg Asp Asn Met Pro Pro Leu Gly Thr Ile Leu Asn Leu Tyr Asp 195 200 205 Phe Glu Arg Leu Ala Ser Lys Ile Leu Thr Asn Gln Ala Trp Ala Tyr 210 215 220 Tyr Ser Ser Gly Ala Asp Asp Glu Ile Thr Tyr Arg Glu Asn His Asn 225 230 235 240 Ala Tyr His Arg Ile Phe Phe Lys Pro His Ile Leu Val Asp Val Lys 245 250 255 Asp Val Asp Leu Lys Thr Thr Met Leu Gly Asn Lys Thr Asp Val Pro 260 265 270 Phe Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Glu Gly 275 280 285 Gly Glu Val Asp Ile Ala Lys Gly Cys Gly Ser Thr Ser Tyr Met Val 290 295 300 Pro Gln Met Ile Ser Thr Leu Ala Ser Cys Ser Leu Asp Glu Val Ala 305 310 315 320 Gln Gly Lys Thr Asn Asp Lys Gln Leu Gln Trp Phe Gln Leu Tyr Val 325 330 335 Asn Ser Asp Arg Lys Ile Thr Arg Asn Leu Ile Lys His Ala Glu Asp 340 345 350 Leu Gly Met Lys Ala Ile Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly 355 360 365 Asn Arg Glu Lys Asp Gln Lys Ile Lys Phe Thr Thr Gln Gly Ser Glu 370 375 380 Gly Pro Lys Ile Leu Gln Lys Lys Gly Asp Ser Ser Asn Ala Ala Ala 385 390 395 400 Glu Ala Lys Lys Lys Glu Asn Lys Ser Asp Gly Ala Ser Lys Ala Leu 405 410 415 Ser Lys Phe Ile Asp Pro Ser Leu Ser Trp Glu Asp Ile Ala Lys Met 420 425 430 Arg Lys Leu Thr Lys Leu Pro Ile Val Ile Lys Gly Val Gln Arg Ala 435 440 445 Glu Asp Ala Val Arg Ala Ala Gln Met Gly Cys Gln Gly Val Val Leu 450 455 460 Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Phe Ser Arg Ala Pro Ile Glu 465 470 475 480 Val Leu Ala Glu Thr Met Pro Ile Leu Lys His His Gly Leu Asp Lys 485 490 495 Asn Phe Asp Val Phe Val Asp Gly Gly Ile Arg Arg Gly Thr Asp Ile 500 505 510 Leu Lys Ala Leu Cys Leu Gly Ala Thr Gly Val Gly Leu Gly Arg Pro 515 520 525 Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Arg Asp Gly Val Ala His Ala 530 535 540 Ile Asp Ile Ile Thr Lys Glu Leu Glu Met Ser Met Arg Leu Leu Gly 545 550 555 560 Val Ser Lys Ile Glu Asp Leu Asn Pro Gly Phe Leu Asp Leu Gln Ser 565 570 575 Leu His Ala Arg Ser Val Leu Val Ala Lys Asp Ala Leu Tyr Glu Asn 580 585 590 Ser Tyr Lys Glu Pro Gln Leu Ala Lys Phe Leu Ile Asp Asp Asp Asp 595 600 605 *** <210> 5 <211> 375 <212> DNA <213> promotor region of g2947 allele 1 <400> 5 atatattttg gctgacattg taattagatg agatccacaa tttttctttt gtttgactgt 60 tcgatatgga gaaggtggga tgcactatta ttatattcag aagtttattt gtacagttta 120 aagaacaaat agtggctaat cctatcctcg gactaaaaaa aatcgttcac ttctatccta 180 ctgtaaatct tatgaaaatg atgtaattca tatagttact atattttctt tcttttagaa 240 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gattgtaaag atgctgattt ggttgttatt 240 actgctggtg ctccacaaaa accaggtgaa tctagattgg atttggttaa taaaaatttg 300 aatattttgt cttctattgt taaaccagtt gttgattctg gttttgatgg tatttttttg 360 gttgctgcta atccagttga tattttgact tatgctactt ggaaattttc tggttttcca 420 aaagaaagag ttattggttc tggtacttct ttggattctt ctagattgag agttgctttg 480 ggtaaacaat ttaatgttga tccaagatct gttgatgctt atattatggg tgaacatggt 540 gattctgaat ttgctgctta ttctactgct actattggta ctagaccagt tagagatgtt 600 gctaaagaac aaggtgtttc tgatgatgat ttggctaaat tggaagatgg tgttagaaat 660 aaagcttatg atattattaa tttgaaaggt gctacttttt atggtattgg tactgctttg 720 atgagaattt ctaaagctat tttgagagat gaaaatgctg ttttgccagt tggtgcttat 780 atggatggtc aatatggttt gaatgatatt tatattggta ctccagctat tattggtggt 840 actggtttga aacaaattat tgaatctcca ttgtctgctg atgaattgaa aaaaatgcaa 900 gattctgctg ctactttgaa aaaagttttg aatgatggtt tggctgaatt ggaaaataaa 960 taa 963 <210> 8 <211> 988 <212> DNA <213> g4423 5-UTR allele 1 <400> 8 gttaactcag ttttctctct ttccctccac cccacgttac 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900 atatctttct tttctatttc tctttttcgt ttaatctcac cgtacacata tatatccata 960 tatcaataca aataaaaatc atttaaaa 988 <210> 9 <211> 961 <212> DNA <213> g4423 5-UTR allele 2 <400> 9 gttaactcag ttttctctct ttccctccac cccacgttac tctgcgaaca aaaaatacgc 60 acagaatgaa catctgattg attaatattt atatattact cagtggcacc cctacaaaca 120 aaccaatttt gaatattgtt caccatcatg atatttattt agggcaagaa tttcatgtac 180 atacgtgcgt gtactgcata gttttgttat atgaaaataa ccagcaatat atcaccaatg 240 aataaattct caataattta tttggaacca aataatgcaa taactagcaa actaagtggt 300 gattatacaa cagctgttaa caacacaaac atacgctctc ttctattatc tcttccctgc 360 ttgttcgtgt ggtatattca cgaatttgca atttagaaat tatatttttt aaaagaattg 420 ttctccattt tctggtagtc gtaagtggca aattggatca taagacacaa tcttgttagt 480 tcgactgcta acaccagaca acaccgaacg aaaacaagaa aaaataatta ttctctctct 540 ttttaaggta tcttacatta catatcccaa attacaacaa gagcaagaaa tgaggcacaa 600 caacacacca tcatctttcg tgattatttt tatcatttct atcatgtaat taaattaaca 660 aatgttaagt ttattaattt ttaatgataa atctagttgc taccttaatt 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aacggaactg gacgcatttt atttgactgt tgaaagggag 360 atttaatatt tatatagaga gatataacaa ctaacttata agtttataca ggctgttatc 420 acatatatat atatatcaac agaggactag ctcaatagaa taacattaga tatgtcgatg 480 ctgaaccgtt tgtttggtgt tagatccatt tcacaatgtg ctactcgttt acaacgttct 540 acagggacaa atatatcaga aggtccacta agaattattc cacaattaca aactttctat 600 tctgctaatc caatgcatga taacaatatc gacaagctag aaaatcttct acgtaaatat 660 atcaagttac caagtacaaa taacttattg aagacacatg ggaatacatc tacagaaatc 720 gatccaacaa aattattaca atcacaaaat tcttcacgtc ctttatggtt atcattcaag 780 gattatacag tgattggagg tggttcacgt ttaaaaccta ctcaatacac agaactttta 840 tttctattga ataaactaca tagtatcgat ccacaattaa tgaatgatga tattaagaac 900 gaattagctc attattataa gaatacttca caggaaacta ataaagtcac catccctaaa 960 ttggatgaat tcggtagaag tattggaatc ggtagaagga aatccgcaac tgcaaaag 1018 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcaggatatc agttgtttg 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aataccttgt tgagccatag 20 <210> 14 <211> 234 <212> DNA <213> 3' terminator region of g2947 allele 1 <400> 14 ttgtgactct atggagttta cctattttat ataccactat atcacaaaaa gtaataacaa 60 cttttcaaat ataatacaat attcaataaa tatatttata tattctaaaa tctacgtttt 120 tctctttctt aaaaaaataa acaaactgac cctttcaatc ttcaatgtga tactttactt 180 attttatttc attacacaga aaggtataaa tatatacata acttaatggt ttat 234 <210> 15 <211> 234 <212> DNA <213> 3'-terminator region of g2947 allele 2 <400> 15 ttgtgactct atggagttta cctattttat ataccactgt atcacaaaaa gtaataacaa 60 cttctcaaat ataatacaat atttaataaa tatatttata tattctaaaa tctacgtttt 120 tctctttctt aaaaaaataa acaaactgac cctttcaatc ttcaatgtga tactttactt 180 attttatttc attacacaga aaggtataaa tatatacata acttaatggt ttat 234 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctagttgtgg ttccttgtat 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gaaaataaat ccgatggtgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tgtttgactg ttcgatatgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gaaaataaat ccgatggtgc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgtttgactg ttcgatatgg 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gaagattgaa agggtcagt 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gactaatcac ccaactctca 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atcgccgagg tactagag 18

Claims

내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주.
제1항에 있어서, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 g2947 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제2항에 있어서, 상기 g2947 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제1항에 있어서, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제4항에 있어서, 상기 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g4423 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제4항에 있어서, 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자를 코딩하는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제5항에 있어서, 상기 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자는 g3002 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제1항에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g2947 유전자와 치환하여 도입되어 g2947 유전자의 프로모터에 의하여 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제2항에 있어서, 상기 g2947 유전자의 결실 또는 약화에 의하여 모균주인 YBC 균주(KCTC13508BP) 보다 젖산생성능이 증가하고, 에탄올 생성능이 감소 또는 차단되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 g2947 유전자, 알코올 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 g4423 유전자 및 피루베이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자인 g3002 유전자가 결실되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주.
제10항에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g2947 유전자, g4423 유전자 및 g3002 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자와 치환하여 도입되어 치환된 유전자의 프로모터에 의하여 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
다음을 단계를 포함하는 젖산의 제조방법;
(a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계.
락테이트를 피루베이트로 전환하는 효소 활성을 가지고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자.
제13항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 g2947 유전자의 프로모터.