JP2021058184A

JP2021058184A - 乳酸代謝及びアルコール生成の抑制された組み換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法

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Publication number: JP2021058184A
Application number: JP2020170131A
Authority: JP
Inventors: パクチェ・ヨン; Jae Yeon Park; リーテ・ヨン; Tae Young Lee; リーキ・スン; Ki Sung Lee
Original assignee: SK Innovation Co Ltd
Current assignee: SK Innovation Co Ltd
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2020-10-07
Publication date: 2021-04-15
Also published as: US11680270B2; CN112725210A; CN112725210B; US20220049262A1; EP3808852A1; KR20210041903A

Abstract

【課題】乳酸消耗反応が抑制され、乳酸生成能が付与され、乳酸生成能が向上し、エタノール生成が抑制された耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法の提供。【解決手段】耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）から乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子が欠失又は弱化され、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する、組み換え菌株、および該組み換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階と、生成された乳酸を取得する段階と、を含む、乳酸の製造方法。【選択図】図２

Description

本発明は、乳酸代謝及びエタノール生産の抑制された組み換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法に関するもので、より詳しくは乳酸消耗反応を抑制し乳酸生成能を付与して、乳酸生成能が向上し、エタノール生成が抑制された組み換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法に関するものである。

伝統的な乳酸生産工程は乳酸菌を用いて生産し、乳酸菌によって生成される乳酸の蓄積による菌株死滅あるいは成長停止を防止するために、多様な形態のＣａ塩／Ｍｇ塩又はアンモニアのような中和剤を用いてｐＨを中性ｐＨである６〜８に調整しながら発酵を進める。発酵が終了すれば微生物を分離することになり、塩形態では水からの分離及びラクチドへの転換が難しいから、硫酸を添加して乳酸塩を乳酸に転換させながらＣａ塩はＣａＳＯ_４形態にして除去することになる。このような過程は、乳酸よりも多くの量の副産物であるＣａＳＯ_４が発生し、工程経済性を落とすことになる。

ポリ乳酸（ＰＬＡ）は、乳酸をラクチドに転換し、これを開環重合することにより製造される生分解性ポリマーであり、その原料である乳酸は発酵によって生産している。ＰＬＡは使い捨て食品容器に広範囲に使うことができ、単独であるいは組成物又は共重合体の形態で自動車産業を含む多様な産業的プラスチックとしても使用可能な強度を有している。また、最近では３Ｄプリンティングにも使われる代表的なポリマーであり、特に３Ｄプリンターの使用の際に有害ガス発生及び匂い発生が少ない環境に優しいポリマーである。
一方、乳酸はＬ型とＤ型の光学異性体を有している。Ｌ型を主に生産する乳酸菌の場合にも約５〜１０％のＤ型を一緒に生産する場合が多く、Ｄ型を主に生産する菌株の場合はＤ型及びＬ型を一緒に生産する形態とＤ型とエタノールを一緒に生産する形態として存在するなどの多くの多様性を有している微生物群がある（非特許文献１）。

ＰＬＡは、発酵によって乳酸を生産した後、生産された乳酸を精製工程によってラクチドに転換する工程で製造されることが一般的である。ラクチド転換のためには、乳酸を水素化形態に転換する工程が必要であり、一般的な中性発酵のためのｐＨは６〜７であるので、多量の硫酸を用いて酸性ｐＨに転換することになる。この過程で多量の中和塩が発生し、このような中和塩を除去するための工程投資費とともに中和塩の低価値によって経済性が低下する。
一方、自然界で乳酸を生産する乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の場合、乳酸を商業的に生産するためには、多量の高価栄養分を培地として使わなければならず、このような過量の栄養分成分は後段工程の重合工程又はラクチドを中間体とする場合にはラクチド転換工程に大きな阻害を与えるため、高収率、高純度のポリマー又はその前駆体を得るためには、吸着、蒸留、イオン交換のような精製工程コストを必要として、やはり高い生産費の原因となる。このような問題を解決するための方法として、酵母を用いた研究が提示された。酵母の場合、低価の栄養分を使っても円滑に成長／発酵を進められることが知られており、酸性に対する耐性も高いと知られている。

酸性でよく育つ酵母（以下、耐酸性酵母）を用いて乳酸を生産する場合、発酵の際に中和剤を用いて培地をｐＨ６〜７に維持する必要がないから、発酵工程が単純になり、さらに後段の中和剤を除去する精製工程が不要になる。また、酵母は代謝に必要な多くの成分を自ら作るから、細菌、特に乳酸菌に比べて栄養水準が低い培地でも培養が可能であるので、多くの後段精製工程を省略することができ、生産コストを大きく低下させることができる。
しかし、酵母を用いる乳酸生産技術に対して前提条件がある。それは、商業化に適用するためには菌株発酵性能の指標である収率、生産性、乳酸の濃度が乳酸菌の性能に類似した水準に高く維持されなければならないという前提条件がある。
酵母を使った耐酸性乳酸製造の技術開発が試みされているが、実際的には発酵に中和反応を伴ってｐＨを乳酸のｐＫａ値以上である３．７以上に維持して発酵をする場合に高性能の発酵能を現す場合が多いから、実際的な耐酸性技術と表現しにくく、工程での生産コスト節減の効果を得ることも難しい（非特許文献２）。
したがって、工程コストを節減することができる耐酸性酵母は、中和剤を使わないか最小量で使いながら発酵液のｐＨがｐＫａ値以下で発酵を終えなければならず、発酵の３大指標が乳酸菌と類似した水準を達成するときにのみ商業的適用の意味がある。
一般的に、グルコースを発酵すれば、酵母はエタノールを主生産物として代謝し、乳酸を生産する場合は非常に稀である。また、高耐酸性を有している微生物から乳酸を生産する菌株を選択する確率が非常に低いから、本発明者らは耐酸性に優れた酵母菌株を選別し、選別された菌株から、遺伝工学的な方法で乳酸生産能を有しながらもエタノール生成能が抑制された菌株を製造しようとした。
よって、本発明者らは乳酸生産能を有しながらもエタノール生成能が抑制された耐酸性菌株を製造しようと鋭意努力した結果、耐酸性酵母から乳酸をピルビン酸に転換する反応に関与する遺伝子を除去し、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を追加的に導入した組み換え菌株を作製し、前記組み換え菌株を用いて乳酸を製造すると、乳酸生成能が向上し、エタノール生成能が遮断されることを確認して本発明を完成するに至った。

Ellen I. Garvie, Microbiological Reviews, 106-139, 1980 Michael Sauer et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 27:229-256, 2010

本発明の目的は、乳酸生成能が増加しながらエタノール生成能が減少した組み換え耐酸性酵母を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記組み換え耐酸性酵母を用いて乳酸を製造する方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記耐酸性酵母由来の乳酸をピルビン酸に転換する酵素活性を有する遺伝子を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、乳酸生成能を有する組み換え菌株の製作に使うことができる乳酸によって遺伝子発現を誘導することができるプロモーターを提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）から乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子が欠失又は弱化され、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組み換え菌株を提供する。
また、本発明は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）から、乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるｇ２９４７遺伝子、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子であるｇ４４２３遺伝子及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるｇ３００２遺伝子が欠失され、乳酸脱水素酵素酵素をコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組み換え菌株を提供する。
また、本発明は、（ａ）前記組み換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階と、（ｂ）前記生成された乳酸を取得する段階とを含む乳酸の製造方法を提供する。
また、本発明は、乳酸をピルビン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
また、本発明は、乳酸をピルビン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。
また、本発明は、配列番号５又は配列番号６で表示される塩基配列を有するｇ２９４７遺伝子のプロモーターを提供する。

本発明による組み換え耐酸性酵母はエタノール生成を抑制して細胞内乳酸がピルビン酸に転換されることを抑制し、ＬＤＨ酵素を強く発現して乳酸を高収率で生産することができる。

本発明においてＹＢＣ菌株又はＹＢＣ２菌株のゲノムからｇ２９４７遺伝子を削除しＬＤＨ遺伝子を挿入するために使用する削除カセットを示した図である。ＹＢＣ２菌株とＹＢＣ４菌株の培養結果を示した図である。ＹＢＣ４菌株の発酵プロファイルを示した図である。

他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する命名法は当該技術分野でよく知られており、通常に使われるものである。

耐酸性酵母は、酸性ｐＨでも糖を速い速度で消耗し、高い成長率を示し、発酵条件では消耗した糖を産物に転換する特徴を有する。本発明者らはこのような特徴を有する酵母から多くの酵母ライブラリーを介して耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）を選別した。耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）は乳酸濃度が４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌの条件でも高い成長性及び糖消耗速度を示す菌株である。前記耐酸性酵母ＹＢＣ菌株を対象として乳酸生成能を高め、エタノール生成能を低下させるための代謝回路調節を実施することにより、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失され、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入されたＹＢＣ菌株から、乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子を欠失させて組み換え菌株を作製し、前記組み換え菌株が高い乳酸生成能を有しながらエタノール生成能が抑制されることを確認した。

したがって、本発明は、一観点で、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）において乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子を欠失又は弱化させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入することによって得られる、乳酸生成能を有する組み換え菌株に関するものである。
ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）の乳酸消耗反応を抑制するためには２種の方法を考慮することができる。一番目は乳酸を外部から細胞内に導入されるトランスポータを捜し、これを除去することであり、二番目は乳酸をピルビン酸に転換する酵素（Ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を捜し、これを除去する方法である。トランスポータの場合、多くのｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｆａｍｉｌｙが研究されている。このうち、代表的に多く研究された酵母の場合、Ａｄｙ２Ｊｅｎ１などが外部から乳酸を移送する役割を担当することが知られている（Ref: Antonio Pacheco et al., FEMS Yeast Res. 12 (2012) 375-381）。しかし、本発明のように耐酸性菌株を活用した発酵の場合、このようなトランスポータによる移送とともに外部の低ｐＨによって乳酸の大部分は、培養条件及び発酵液組成によって違うが、ｐＨ３では約８０％〜９０％程度が乳酸である水素化した形態として存在し、このような乳酸は電荷のない状態で前記トランスポータによる移送ではなくて細胞膜を直接物質移動して細胞の内部に移送されることが知られている（Minoska Valli et al., Appl Environ Microbio., 72:5492, 2006）。また、モノカルボン酸トランスポータの中には細胞の内部から外部に解離した塩を移送する役割をして細胞の酸ストレスを緩和する役割をする場合もあるので、このようなトランスポータの種類によっては乳酸によるストレスをむしろ高めることができる可能性もある。
したがって、本発明は、トランスポータの除去によって内部への乳酸輸送を抑制する効果が大きくないと判断し、直接細胞内部の乳酸をピルビン酸に転換する反応を主に担当する酵素を除去した菌株を作製した。
酵母において乳酸をピルビン酸に転換する酵素／遺伝子として、Ｌ−乳酸についてはＣＹＢ２遺伝子、Ｄ−乳酸についてはＤＬＤ１遺伝子が知られており（Guiard, B., EMBO J., 4:3265, and 1985; Lodi, T., and Ferrero, I., Mol. Gen. Genet., 238:315, 1993）、それぞれミトコンドリア膜で該当する乳酸をピルビン酸に変換する機能を有している。
また、Ｌ−乳酸に関連したＣＹＢ２を除去する場合、生産された乳酸の消耗を抑制して乳酸の発酵収率を高めることができるという報告に基づいてＣＹＢ２をターゲット遺伝子として設定した（Aki Ookubo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:3063, 2008）。

本発明の一様態では、ＹＢＣ菌株から主ＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３遺伝子を除去し、前記ｇ４４２３の位置にラクトバチルスプランタルム由来の配列番号２８のＬＤＨ遺伝子を導入し、ｇ３００２遺伝子（以下、ｇ３００２−１遺伝子という）を除去し、前記ｇ３００２遺伝子の位置にＬＤＨ遺伝子を導入した組み換え菌株ＹＢＣ２と、組み換え菌株ＹＢＣ２からさらにｇ２９４７遺伝子を除去するとともにＬＤＨ遺伝子を導入した組み換え菌株ＹＢＣ４とを作製し、前記組み換え菌株を培養した結果、乳酸生成能が向上し、エタノール生産能が減少することを確認した。
本発明において、前記乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子はｇ２９４７遺伝子であってもよい。
本発明において、前記ｇ２９４７遺伝子は配列番号１又は配列番号２の塩基配列を有するものであってもよい。
本発明において、前記組み換え菌株はアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子（ＡＤＨ遺伝子）が追加に欠失されていることを特徴としてもよく、前記アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子はｇ４４２３遺伝子であってもよい。
本発明において、前記組み換え菌株は前記ＡＤＨ遺伝子の代わりにＬＤＨ遺伝子が追加的に導入されていてもよい。
本発明において、前記組み換え菌株はピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）が追加的に欠失されていることを特徴としてもよく、前記ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子はｇ３００２遺伝子であってもよい。
本発明において、前記組み換え菌株は前記ＰＤＣ遺伝子の代わりにＬＤＨ遺伝子が追加的に導入されていてもよい。
本発明において、前記乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子はｇ２９４７遺伝子と置換して導入され、ｇ２９４７遺伝子のプロモーターによって調節されてもよい。
本発明において、前記ｇ２９４７遺伝子の欠失又は弱化によって母菌株であるＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）より乳酸生成能が増加し、エタノール生成能が減少又は遮断されていてもよい。
本発明において、前記導入される乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子はＬ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来ＬＤＨ遺伝子、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ由来ＬＤＨ遺伝子又はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子であることが好ましく、より好ましくはＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子であることが好ましい。

したがって、本発明は、他の観点で、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）から乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるｇ２９４７遺伝子、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子であるｇ４４２３遺伝子及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるｇ３００２遺伝子を欠失させ、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入することにより得られる、乳酸生成能を有する組み換え菌株に関するものである。
本発明において、前記乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、ｇ２９４７遺伝子、ｇ４４２３遺伝子及びｇ３００２遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子と置換されて導入され、置換された遺伝子のプロモーターによって調節されてもよい。

本発明の一様態では、ＹＢＣ４菌株（Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２−１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ）がＹＢＣ２菌株（Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２−１：：ｌｄｈ）に比べて乳酸発酵収率が著しく増加したことを確認した。一方、エタノール発酵収率はＹＢＣ４菌株がＹＢＣ２菌株に比べて９０％以上減少し、全ての炭素フラックス（Ｃａｒｂｏｎｆｌｕｘ）がエタノールから乳酸に転換されたことが分かった。これから乳酸の収率が理論値の８４％まで高くなったことを確認した（表２及び図２参照）。
したがって、本発明は、他の観点で、（ａ）前記組み換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階と、（ｂ）前記生成された乳酸を取得する段階とを含む乳酸の製造方法に関するものである。
本発明によって乳酸生産性が大きく増加し、エタノール生産が大きく減少した優れた耐酸性菌株を確保することができる。

さらに他の観点で、本発明は、乳酸をピルビン酸に転換する活性を有するタンパク質をコーディングし、配列番号１又は配列番号２の塩基配列と９０％の相同性を有する遺伝子に関するものである。
さらに他の観点で、本発明は、乳酸をピルビン酸に転換する活性を有し、配列番号３又は配列番号４で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。
本発明において、前記遺伝子は配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されるものであってもよい。

さらに他の観点で、本発明は、乳酸をピルビン酸に転換する活性を有し、配列番号３又は配列番号４で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に関するものである。
さらに他の観点で、本発明は、配列番号５又は配列番号６で表示される塩基配列を有するｇ２９４７遺伝子のプロモーターに関するものである。
本発明のｇ２９４７遺伝子（ＣＹＢ２）のプロモーターは、本発明による組み換え酵母において乳酸を生成する菌株で自ら発現を誘導してＬＤＨ遺伝子を発現させることができ、これは高濃度グルコースの条件で培養初期に強く発現し、一般的な該当過程条件で強く発現するプロモーターとは違う性格のプロモーターで培養後期にＬＤＨ遺伝子を発現させて細胞の乳酸生成能を持続的に維持させることができる特性を有するプロモーターであり、高効率の乳酸生産菌株の製作のための有用性が高い。

本発明において、‘耐酸性酵母’とは、有機酸のｐＫａ値未満のｐＨで、培地に有機酸が含有されていない場合に比べ、培地に１Ｍ以上の有機酸（特に、乳酸）が含有された場合、少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の比生長率を維持することができる酵母と定義する。より具体的に、本発明で、‘耐酸性酵母’とは、ｐＨ５以上の場合に比べ、ｐＨ２〜４で少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の比成長率を維持することができる酵母と定義する。
本発明による組み換え酵母は、通常の方法によって前記遺伝子を宿主酵母の染色体上に挿入させるか、前記遺伝子を含むベクターを宿主酵母に導入させることによって製造することができる。
前記宿主酵母は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が通常的に使われ、本発明の一実施例では耐酸性酵母を用いたが、これに限定されるものではなく、目的ＤＮＡが充分に発現することができるものであればどの種類の酵母でもよい。
前記組み換え酵母は、任意の形質転換方法によって製造することができる。“形質転換”とは、ＤＮＡを宿主に導入して、ＤＮＡが染色体の因子として又は染色体統合完成によって複製可能にし、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を引き起こす現象を意味し、一般的な形質転換方法には、電気穿孔法、酢酸リチウム−ＰＥＧ法などがある。

また、本発明で遺伝子を宿主微生物の染色体上に挿入する方法としては、通常知られた任意の遺伝子操作方法を使うことができる。一例として、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、ポキスウィルスベクター、レンチウィルスベクター、非ウイルス性ベクターなどを用いる方法がある。“ベクター”は適した宿主内でＤＮＡを発現させることができる適合した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であることができる。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムと無関係に複製し機能することができるか、又は一部の場合にゲノム自体に統合されることができる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使われる形態であり、また線形化ＤＮＡも酵母のゲノム統合のために通常的に使用する形態である。
典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりプラスミドベクターを含むように複製が効率的になるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターに形質転換された宿主細胞がスクリーニングされるようにする抗生剤耐性遺伝子又は栄養要求性マーカー遺伝子、及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入されることができるようにする制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使えば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーションすることができ（Ｇｉｂｓｏｎａｓｓｅｍｂｌｙ）、必要によっては所望の全体配列を合成して使用する方法も通常的に用いられている。

また、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（等）に結合されるとき遺伝子発現ができるようにする方式で連結された遺伝子及び調節配列（等）であることができる。例えば、前配列又は分泌リーダーに対するＤＮＡはポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；リボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。
一般的に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーが接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。これらの配列の連結は便利な制限酵素部位でライゲーション（結紮）によって遂行される。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使う。
もちろん、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現するのに同等な機能を発揮せず、同様に全ての宿主が同じ発現システムに対して同じ機能を発揮しない。しかし、当業者であれば過度な実験的負担なしに、本発明の範囲を逸脱しない範疇内で、互いに異なる種々のベクター、発現調節配列及び宿主の中で適切に選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択する際には宿主を考慮しなければならない。これは、ベクターがその内部で複製されなければならないからであり、ベクターの複製数、複製数を調節することができる能力及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現も考慮しなければならない。

本発明において、炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、ガラクトース、グルコースオリゴマー及びグリセロールからなる群から選択された１種以上とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、培養は、微生物、例えば大膓菌などがそれ以上作用することができないように（例えば、代謝体生産不可）する条件で行うことができる。例えば、培養は、ｐＨ１．０〜６．５、好ましくｐＨ１．０〜６．０、より好ましくは２．６〜４．０であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はもっぱら本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは当該分野で通常の知識を有する者にとって明らかである。

実施例１：耐酸性酵母菌株ＹＢＣのゲノム内の乳酸消耗遺伝子分析
本発明者らは、多様な酵母菌株に対するテストによって耐酸性を有する菌株を選別し、酵母菌の培養初期に乳酸を培地に添加し、微生物の成長及び糖消耗速度を確認しながら耐酸性が最も優れた菌株であるＹＢＣ菌株を選定し、韓国生命工学研究院生物資源センターにＫＣＴＣ１３５０８ＢＰとして寄託した。
系統分析によって、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと類似した菌株であり、２倍体の遺伝子を有しており、Ｃｒａｂ−ｔｒｅｅｐｏｓｉｔｉｖｅ特性があることを確認した。
ＧｅｎｏｍｅＦｕｌｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＤａｔａにおいて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ情報を用いてＹＢＣ菌株のゲノムに存在するＬ−乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２でａｎｎｏｔａｔｉｏｎされた遺伝子としてｇ２９４７とｇ３８６４を確認した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＢ２遺伝子に対し、タンパク質ドメイン分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）を遂行すれば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＢ２遺伝子はＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ５ｆａｍｉｌｙ、ｈｅｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｐｒｏｆｉｌｅ、ＦＭＮ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｄｏｍａｉｎｐｒｏｆｉｌｅの特性を有している。ｇ２９４７遺伝子に対して同じ分析を遂行した結果、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ５ｆａｍｉｌｙ、ｈｅｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｐｒｏｆｉｌｅ、ＦＭＮ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｄｏｍａｉｎｐｒｏｆｉｌｅのようにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＢ２遺伝子と同じ特性を示し、ｇ３８６４遺伝子の場合はｈｅｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｐｒｏｆｉｌｅがないことが示され、ＣＹＢ２特性を有しにくいことが判断された。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノム上でＣＹＢ２遺伝子付近のＯＲＦを分析した結果、ＣＭＰ２−ＩＭＤ４−ＳＰＣ２−ＣＹＢ２−ＹＭＬ０５４ｃ−ＡのＯＲＦが順次配置されており、ｇ２９４７があるＹＢＣ菌株のｓｃａｆｆｏｌｄ４１にもこれと同じ部位があるので、このようなＯＲＦが保存された領域として存在する可能性も示した。よって、ｇ２９４７遺伝子（配列番号１と配列番号２）及びそのタンパク質（配列番号３と配列番号４）を除去することができる削除カセットを作製した。
また、本実施例では、これを削除（欠失）のみさせるカセットとともにｇ２９４７の固有プロモーターを用いて、乳酸を生成させる酵素であるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を発現することができるカセットを一緒にデザインした（図１）。削除カセットは図１に示し、該当制限酵素部位又は抗生剤耐性遺伝子の選択及び抗生剤耐性遺伝子の除去方式は関連業界によく知られた方式であり、多様に変形して使うことができる。

実施例２：乳酸消耗遺伝子が除去された組み換え耐酸性酵母菌株の作製
ＣＹＢ２遺伝子であると予想されるｇ２９４７遺伝子をゲノムから除去するための対象耐酸性酵母菌株は野生型菌株ではない既存の野生型に主ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）遺伝子を除去するとともにＬＤＨ遺伝子を導入したＹＢＣ１菌株から追加的にｇ３００２−１遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）を除去するときにＬＤＨが発現した菌株であり、エタノール８生成能が封鎖され、乳酸を高効率で生産するＹＢＣ２菌株である。前記ＹＢＣ２菌株からｇ２９４７遺伝子を除去しながら（Ｄｉｐｌｏｉｄ菌株でＡｌｌｅｌｅ１及びＡｌｌｅｌｅ２を全部除去）２ｃｏｐｙのＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子が発現するようにした菌株（ＹＢＣ４）を作製し、当該菌株の遺伝子型を確認するために、下記の表１のプライマーを作製した後、該当菌株のゲノムＤＮＡから確認した。

前記菌株の作製方法は次のとおりである。
前記ＹＢＣ１菌株はＹＢＣ菌株の主ＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３遺伝子を除去し、前記ｇ４４２３の位置にラクトバチルスプランタルム由来の配列番号７のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ４４２３及びこれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦを除去し、５’及び３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーがある遺伝子カセットを作製してドナー（Ｄｏｎｏｒ）ＤＮＡとして使った。ｇ４４２３の各ａｌｌｅｌｅに対し、相応する５’ＵＴＲは配列番号８及び配列番号９で示し、３’ＵＴＲは配列番号１０及び配列番号１１に示した。ドナー（Ｄｏｎｏｒ）ＤＮＡの作製には、前述したように制限酵素を用いたクローニング方法とＧｉｂｓｏｎａｓｓｅｍｂｌｙ、遺伝子合成を用いた方法を使用した。ｇ４４２３のＯＲＦ部位に配列番号７のＬＤＨを合成してから導入してドナーＤＮＡを作製し、これをＹＢＣに導入して組み換え菌株ＹＢＣ１を作製した。
また、ｇ３００２−１遺伝子はＹＢＣ菌株のゲノムにおいてスカフォルド７２位置にある遺伝子であり、ＰＤＣ遺伝子として作動する遺伝子である。ＹＢＣ１菌株のｇ３００２−１遺伝子（スカフォルド７２に位置する遺伝子）を除去し、配列番号７のＬＤＨ遺伝子を導入して組み換え菌株ＹＢＣ２を作製した。
特に、このようなｇ３００２の遺伝子を置換するためにＵＴＲを用いて作製した。前記のＹＢＣ１のｇ４４２３遺伝子（ＡＤＨ）部位にＬＤＨを導入する方法と同様に、ｇ３００２−１のＵＴＲを用いて作製した。ただ、当該遺伝子の置換では、過程の単純化のためにａｌｌｅｌｅｖａｒｉａｔｉｏｎを考慮せず、一つのａｌｌｅｌｅを対象としてドナーカセットを作製したが、ａｌｌｅｌｅ別に作製も可能である。また、遺伝子置換に使用するプライマーに対しても、前記の欠失菌株作製に使用したプライマー以外に次のようにｇ３００２−１のＵＴＲとＬＤＨを一緒に確認することができるプライマー対を別に使用して遺伝子置換確認の正確度を高めた。
ｇ３００２−１ＵＴＲ−ＬＤＨ−ｆｗｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号１２）
ｇ３００２−１ＵＴＲ−ＬＤＨ−ｒｅｖ：ＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号１３）

前記菌株の作製方法は次のようである。
前記ＹＢＣ４菌株は、ＹＢＣ２菌株のＣＹＢ２遺伝子であるｇ２９４７遺伝子を除去し、前記ｇ２９４７位置にラクトバチルスプランタルム由来の配列番号７のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ２９４７遺伝子はＹＢＣ菌株のゲノムにおいてスカフォルド４１位置にある遺伝子である。ｇ２９４７及びこれらのＵＴＲの情報を基にして、各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーがある遺伝子カセットを作製してドナー（Ｄｏｎｏｒ）ＤＮＡとして使った。ｇ２９４７の各ａｌｌｅｌｅに対し、相応する５’ＵＴＲは配列番号５及び配列番号６で示し、３’ＵＴＲは配列番号１４及び配列番号１５で示した。ドナーＤＮＡの製作には、前述したように制限酵素を用いたクローニング方法とＧｉｂｓｏｎａｓｓｅｍｂｌｙ、遺伝子合成を用いた方法を使った。
ただ、当該遺伝子の置換では過程の単純化のためにａｌｌｅｌｅｖａｒｉａｔｉｏｎを考慮せずに一つのａｌｌｅｌｅを対象としてドナーカセットを作製したが、ａｌｌｅｌｅ別に作製も可能である。また、遺伝子置換に使用するプライマーに対しても前記の欠失菌株の製作に使用したプライマー以外に、次の表１のようにｇ２９４７のＵＴＲとＬＤＨを一緒に確認することができるプライマー対を別に使用して遺伝子置換確認の正確度を高めた。

前記作製した組み換え菌株の遺伝型は次の通りである。
ＹＢＣ２：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２−１：：ｌｄｈ
ＹＢＣ４：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２−１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ

実施例３：ＹＢＣ２菌株からＣＹＢ２遺伝子が欠失されＬＤＨが導入された組み換えＹＢＣ菌株において乳酸生成及びエタノール生成阻害効果の確認
実施例２で製作した組み換え菌株ＹＢＣ２とＹＢＣ４に対し、接種ＯＤは０．５にし、ＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス）にグルコース６％を使い、１００ｍｌのフラスコで、３０℃、１７５ｒｐｍの条件で４時間培養した後、１２５ｒｐｍの条件で培養した。

その結果、表２及び図２に示したように、ＹＢＣ４菌株はＹＢＣ２菌株に比べて乳酸発酵収率が著しく増加した。一方、エタノール発酵収率はＹＢＣ４菌株がＹＢＣ２菌株に比べて９０％以上減少して全ての炭素フラックスがエタノールから乳酸に転換されたことが分かり、これから乳酸の収率が理論値の８４％まで高くなったことが分かる。一般的に、中性発酵において、乳酸の収率は菌株成長に消耗される炭素を除けば約９０％から９４％までの高収率を示すことができる。しかし、耐酸性菌株では、外部から細胞膜を介して拡散する非解離形態の乳酸流れがあり、内部生成乳酸と外部から流入する乳酸によるストレスを減少させるために、外部にトランスポータによる輸送が必要である。このような輸送において、外部乳酸濃度が低濃度の場合には単純パーミアーゼ形態の輸送が可能である。この場合にはＡＴＰの消耗が不要であるが、外部乳酸の濃度が高くなれば、濃度勾配に逆行して乳酸を輸送するためにエネルギーが必要であり、この過程でＡＴＰを消耗することになる（Antonius J. A. van Maris et al., Metabolic Engineering 6: 245, 2004）。このようなＡＴＰの消耗は不可避に追加の炭素損失を引き起こすことになり、現在まで中和剤を使わないか最小限に使用してｐＨ３以下で５０ｇ／Ｌの高濃度の乳酸を生産しながら収率０．８以上を示した結果は本発明が唯一である。

ｇ２９４７の本来の役割である乳酸消耗に対し、培養終了後にグルコースがないときに乳酸が消耗されるかを確認した結果、ＹＢＣ２菌株は既存の結果と同様に徐々に乳酸がなくなることが分かったが、ｇ２９４７遺伝子が欠失されたＹＢＣ４菌株は乳酸の低減が観察されなかったので、ｇ２９４７遺伝子はＣＹＢ２遺伝子であることを確認することができた。

ＹＢＣ４菌株の性能において最も著しいことは乳酸の収率増加とともにエタノール生成の完全遮断にある。その間に報告されたＣＹＢ２遺伝子の除去効果に対して、生成された乳酸が発酵後半にグルコース濃度が低くなっても消耗されてなくならないことと乳酸の一部の収率が増加するという報告があり、収率の増加もｐＫａ以上のｐＨでは示していないがｐＨ３．５でのみ１９．３％から２８．６％に増加する傾向を示した（Aki Ookubo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:3063,2008）。しかし、本実施例は、乳酸の消耗遮断とともに高い乳酸生成収率を示す菌株（ＹＢＣ２）の追加によってドラマチックな増加とともにエタノール生成が完全に遮断された結果を示した。この理由については次のように説明することができる。一番目は、ＣＹＢ２遺伝子がミトコンドリア膜で乳酸をピルビン酸に転換させながら追加のピルビン酸を供給することができ、このピルビン酸はエタノールに転換可能であるので、これから生成されるエタノールはＣＹＢ２遺伝子を除去して抑制することができる。特に、当該菌株の遺伝子型では主ＡＤＨと主ＰＤＣのみ除去した状態であるから、ミトコンドリアで役割するＡＤＨ３を含む補助ＡＤＨと補助ＰＤＣによって少量のエタノールが生成されると思われる。二番目は、ＣＹＢ２の位置に導入されたＬＤＨの追加発現によってＹＢＣ菌内部のＬＤＨが強化し、これからピルビン酸から乳酸になる経路は、ピルビン酸からエタノールになる経路が既に弱くなった状態で、より選択的であり、エタノールの収率が減少したと思われる。これらの両効果が一緒に発生してエタノール生成が完全に遮断されることができると判断される。

実施例４：野生型ＹＢＣ菌株からＣＹＢ２遺伝子が欠失されＬＤＨが導入された組み換えＹＢＣ菌株において乳酸生成及びエタノール生成阻害効果の確認
実施例３の結果によってｇ２９４７遺伝子除去及びＬＤＨ発現による乳酸生成能の増加とエタノール生成能の低下を確認したが、母菌株として使用したＹＢＣ２菌株がＡＤＣとＰＤＣ遺伝子が欠失された菌株であるので、前記結果はｇ２９４７遺伝子以外の遺伝子の除去による複合効果によって生じたものである。
したがって、野生型菌株であるＹＢＣ菌株からｇ２９４７遺伝子のみ除去しながらＬＤＨを発現した菌株を作製し、その乳酸生成能及びエタノール生成阻害を確認した。組み換え菌株の作製に使用したカセット及び遺伝型確認のために使用したプライマーは図１及び表１に示したものを使用し、実施例２に示した方法で製作した。
ＹＢＣ菌株からｇ２９４７遺伝子が除去され、ＬＤＨが挿入された菌株はＹＢＣ＿ａと名付け、遺伝型は次の通りである。
ＹＢＣ＿ａ：Δｇ２９４７：：ｌｄｈ
前記組み換え菌株を、接種ＯＤ値を０．５程度にし、ｍＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース６％を使い、５００ｍｌフラスコに５０ｍｌ培養体積で、３０℃、１２５ｒｐｍで培養した。
また、さらに乳酸による誘導効果を観察するために、初期乳酸濃度を１１．５ｇ／Ｌで培養初期に培養液に注入してから培養した。

表３に示したように、ＹＢＣ＿ａ菌株の場合、野生型菌株の一般的なエタノール収率である０．４３〜０．４５ｇ／ｇに比べて収率が低くなり、ＣＹＢ２遺伝子除去によるエタノール収率減少効果を確認することができた。また、おもしろいことに、ＣＹＢ２遺伝子の位置に導入されたＬＤＨ遺伝子のみでは乳酸をほとんど生産することができないことが分かり、これはＣＹＢ２のプロモーターが一般的な発酵条件であるグルコースの存在の下で乳酸がなければ発現することができないことを示し、また乳酸が生成されなかったにもかかわらず生成されるエタノールの減少効果があることを示す結果である。ＣＹＢ２遺伝子の発現誘導効果を確認するために培養初期の培養液に乳酸を添加する場合、この乳酸が細胞の内部に物質移動又は活性移動し、この細胞内乳酸によってＣＹＢ２プロモーターが反応し、ＣＹＢ２位置に置換されたＬＤＨ遺伝子を発現させて乳酸の収率が増加し、追加エタノールの収率が減少することを確認することができた。

ＣＹＢ２プロモーターは乳酸を生成する菌株で自ら発現を誘導してＬＤＨ遺伝子を発現させることができる。これは、高濃度グルコースの条件で培養初期に強く発現し、一般的な該当過程条件で強く発現するプロモーターとは違う性格のプロモーターであり、培養後期にＬＤＨ遺伝子を発現させて細胞の乳酸生成能を持続的に維持させることができる特性を有するプロモーターであり、高効率の乳酸生産菌株の製作に有用性が高い。ｇ２９４７遺伝子のプロモーター部位は配列番号５と配列番号６で示した。

ＣＹＢ２除去効果は、先行文献と比較する場合、本発明の効果の優秀性がより明らかであり、以前の研究では低いｐＨでだけ一部の乳酸収率の増加があったという報告が記述されたが、本発明のようにエタノール低減に対する明示はない（Aki Ookubo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:3063, 2008）。Ｎａｔｕｒｅｗｏｒｋｓの特許ＷＯ２００７１１７２８２号及びＵＳ８，１３７，９５３Ｂ号では、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓから乳酸を生成する菌株を作製し、この菌株のＣＹＢ２を除去した菌株を開発した。ここで、ＣＹＢ２除去前、ｐＨ３で０．３５ｇ／Ｌ／ｈｒの速度、５６ｇ／Ｌの濃度６９％の収率の乳酸を生産する菌株が、ＣＹＢ２除去の後、０．４３ｇ／Ｌ／ｈｒの速度、６６ｇ／Ｌ濃度６７％収率で乳酸を生産した。乳酸の生産濃度は増加したが収率はむしろ減少する結果を示し、副産物としてグリセロールも増加する結果を示した。また、三星総合技術院のＵＳ９，３５３，３８８Ｂ号の特許では、乳酸を生産する微生物を作製し、ＣＹＢ２遺伝子を除去するか（該当特許の表３のＳＰ１００２性能評価）、除去と同時にＬＤＨ遺伝子を発現する微生物を作製した（該当特許の表４のｓｐ１００３とｓｐ１００２にＪｅｎ１及びＡｄｙ２過発現効果参照）。ここで、乳酸の生産濃度が大きく増加する効果を確認した。しかし、前記特許でもエタノールの完全遮断効果についての明示はないので、本発明のＹＢＣ菌株でのＣＹＢ２遺伝子除去及びＬＤＨ遺伝子発現による効果は非常に優秀であると言える。

実施例５：ＹＢＣ１菌株からＣＹＢ２遺伝子を除去するときにＬＤＨを発現する菌株の作製及び性能評価
前記ＹＢＣ４の結果は、ＹＢＣ菌株から主ＡＤＨ（ｇ４４２３）及び主ＰＤＣ（ｇ３００２−１）が除去された菌株からｇ２９４７遺伝子を除去し、ＬＤＨ遺伝子を追加的に挿入して乳酸生成及びエタノール生成能阻害を確認したものである。ここで、ＡＤＨ遺伝子とｇ２９４７遺伝子のみの複合効果について確認するための組み換え菌株を作製し、発酵能を確認した。
ＡＤＨ（ｇ４４２３）及びｇ２９４７を除去し、ＬＤＨ遺伝子を挿入した組み換え菌株は、実施例２で使用したカセット及びプライマーセットを使用して実施例２と同様な方法で作製した。
作製された組み換え菌株はＹＢＣ＿ｂと名付け、遺伝型はつぎの通りである。
ＹＢＣ＿ｂ：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ
前記組み換え菌株を、接種ＯＤ値は０．５程度にし、ｍＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース１０％を使い、５００ｍｌのフラスコに６０ｍｌ培養体積で３０℃、１５０ｒｐｍで培養した。この培養は初期グルコース濃度が高いから生成される乳酸によるｐＨ低下が高くて成長阻害が予想されるので、４０％ＣａＣＯ_３溶液を２回にかけて１ｍｌずつ注入して最終ｐＨをｐＨ３程度に調節した。また、比較のためにＹＢＣ４菌株を同一条件で培養した。

その結果、表４に示したように、ＹＢＣ＿ｂ菌株は、エタノール生成が遮断されたＹＢＣ４菌株に比べ、エタノールを生成し、乳酸収率が落ちることが分かる。これは、ＹＢＣ＿ｂ菌株の主ＰＤＣ（ｇ３００２−１）が活性状態であるからピルビン酸でＬＤＨとＰＤＣが互いに競争する状態であり、これからエタノールが生成されると判断される。しかし、ＹＢＣ１（Δｇ４４２３：：ｌｄｈ）菌株のエタノール収率が０．０７〜０．１ｇ／ｇ程度であることを考慮すれば、ＹＢＣ＿ｂ菌株のエタノール収率は著しく低くて（０．０２３ｇ／ｇ）、ｇ２９４７遺伝子欠失による効果は依然として確認することができる。

実施例６：ＹＢＣ２菌株からＣＹＢ２遺伝子のみ除去した菌株の作製及び性能評価
前記ＹＢＣ４菌株の結果は主ＡＤＨ（ｇ４４２３）及び主ＰＤＣ（ｇ３００２−１）が除去された菌株に対してｇ２９４７遺伝子の除去及びＬＤＨの挿入による乳酸生成能の増加及びエタノール生成能遮断を確認したものであり、ここでＬＤＨの発現を除いた効果を確認するために、ＹＢＣ２菌株からｇ２９４７遺伝子のみ除去した組み換え菌株を作製し、その発酵能を確認した。
組み換え菌株は、実施例２で使用したカセット及びプライマーセットを使用して実施例２と同様な方法で作製した。ＬＤＨ発現がないから、表１の‘Ｇ２９４７ＬＤＨ導入確認用プライマー’は使わなかった。
作製された組み換え菌株はＹＢＣ＿ｃと名付け、遺伝型は次の通りである。
ＹＢＣ＿ｃ：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２−１：：ｌｄｈ／Δ２９４７
前記組み換え菌株を、接種ＯＤ値は０．５程度にし、ｍＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース１０％を使い、５００ｍｌフラスコに６０ｍｌ培養体積で３０℃、１５０ｒｐｍで培養した。この培養は、初期グルコース濃度が高いから、生成される乳酸によるｐＨ低下が大きくて成長阻害が予想されるので、４０％ＣａＣＯ_３溶液を２回にかけて１ｍｌずつ注入して最終ｐＨをｐＨ３程度に調節した。また、比較のためにＹＢＣ４菌株を同一条件で培養した。

その結果、表５に示したように、ＹＢＣ４菌株と比較するとき、ＹＢＣ＿ｃ菌株はＬＤＨの未発現によるエタノールと乳酸の収率影響は同一であり、表１のＹＢＣ２と比較するときには、ｇ２９４７遺伝子の除去による効果もずっと確認可能であった。

実施例７：ＹＢＣ４菌株の初期接種濃度による生産性増加効果の確認
一般的に、発酵で初期接種濃度を高める場合、収率及び生産性の増加を予想することができる。ＹＢＣ４菌株にも同一方法を適用してその効果を確認した。
ＹＢＣ４の同一種菌培養で蒸留水と混合して接種ＯＤを０．５から２まで変化させた。ｍＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース８．７％を使い、５００ｍｌフラスコに５５．５ｍｌ培養体積で３０℃、１５０ｒｐｍで培養した。

その結果、表６に示したように、初期接種ＯＤ値の増加による生産性増加を確認することができたが、収率の変化はほとんどなかった。これは、最終ＯＤが１０程度に到逹するために消耗される炭素の比が前記の初期ＯＤの差によって大きな変動がないと思われる。
前記培養結果を、既存に報告されたｐＨ３以下の耐酸性酵母の乳酸生産結果の中で最も優れた代表的な二つの結果と比較して表７に示した。

表７に示したように、ＹＢＣ４菌株の乳酸生産性が最も高いことが分かる。

実施例８：ＹＢＣ４菌株の発酵性能の評価
ＹＢＣ４菌株をフラスコ培養ではないバイオリアクターで培養して乳酸発酵性能を確認した。
接種ＯＤを１にし、ｍＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース１２％を使って培養を始め、ＣａＣＯ_３溶液を間欠的に注入してｐＨをｐＨ３程度に維持するようにした。２．５Ｌ培養液に３０℃、４５０ｒｐｍ、Ａｉｒ０．１ｖｖｍで注入して培養した。
その結果、図３に示したように、ＹＢＣ４菌株はバイオリアクター内で短時間に全てのグルコースを消耗しながら乳酸を生産することを確認することができ、最終ｐＨ３．３で乳酸収率が０．８（ｇ／ｇ）、生産性２．０ｇ／Ｌ／ｈｒ、生産乳酸濃度９８．１ｇ／Ｌを示した。また、今後初期ＯＤ及び培養条件の改善によって性能の追加改善も可能であると思われる。

以上で本発明の特定部分を詳細に説明したが、当該分野の通常の知識を有する者にとってこのような具体的技術はただ好ましい実施態様であり、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は添付する特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言える。

Claims

耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）から乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子が欠失又は弱化され、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する、組み換え菌株。
前記乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子はｇ２９４７遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え菌株。
前記ｇ２９４７遺伝子は配列番号１又は配列番号２の塩基配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の組み換え菌株。
アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え菌株。
前記アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子はｇ４４２３遺伝子であることを特徴とする、請求項４に記載の組み換え菌株。
ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする、請求項４に記載の組み換え菌株。
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子はｇ３００２遺伝子であることを特徴とする、請求項５に記載の組み換え菌株。
前記乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子はｇ２９４７遺伝子と置換して導入され、ｇ２９４７遺伝子のプロモーターによって調節されることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え菌株。
前記ｇ２９４７遺伝子の欠失又は弱化によって母菌株であるＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）より乳酸生成能が増加し、エタノール生成能が減少又は遮断されることを特徴とする、請求項２に記載の組み換え菌株。
耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）から、乳酸をピルビン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるｇ２９４７遺伝子、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子であるｇ４４２３遺伝子、及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるｇ３００２遺伝子が欠失され、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する、組み換え菌株。
前記乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、ｇ２９４７遺伝子、ｇ４４２３遺伝子及びｇ３００２遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子と置換して導入され、置換された遺伝子のプロモーターによって調節されることを特徴とする、請求項１０に記載の組み換え菌株。
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階と、
（ｂ）前記生成された乳酸を取得する段階と、
を含む、乳酸の製造方法。
乳酸をピルビン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列で表示される、タンパク質をコードする、遺伝子。
配列番号１又は配列番号２で表示されることを特徴とする、請求項１３に記載の遺伝子。
配列番号５又は配列番号６で表示される、ｇ２９４７遺伝子のプロモーター。