KR102214835B1 - 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법 - Google Patents

락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법을 제공한다.

Description

락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법{Lactate dehydrogenase mutant, polynucleotide coding the mutant, yeast cell having the polynucleotide, and method for producing the lactate using the same}
락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법에 관한 것이다.
락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.
PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.
또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.
현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.
따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도 락테이트 데히드로게나제 변이체, 및 이를 이용하여 락테이트를 효율적으로 생산하는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제 변이체를 제공한다.
다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 효모 세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에서 용어 "락테이트 (lactate)"는 "젖산 (lactic acid)" 또는 그의 염을 의미한다.
일 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 제공한다. 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 락테이트 데히드로게나제의 변이체일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 보스 타우루스 (Bos Taurus) 유래의 락테이트 데히드로게나제일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제로서, 상기 락테이트 데히드로게나제의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변이를 갖고, 상기 변이는 서열번호 1에서 102번째 Glu, 236번째 Asp, 237번째 Ser, 또는 그 조합이 변이된 것인 락테이트 데히드로게나제일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1에서 102번째 Glu, 236번째 Asp, 237번째 Ser, 또는 그 조합이 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 비극성 아미노산은 Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Pro, 또는 Met인 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1에서 102번째 Glu, 236번째 Asp, 또는 237번째 Ser이 Gly으로 치환된 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 3, 4, 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 3, 4, 또는 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 6, 7, 또는 8의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제는 기질인 피루베이트와 결합하는 경우, 야생형 락테이트 데히드로게나제(예를 들면, 서열번호 1)의 촉매 부위와 피루베이트 사이의 거리에 비하여, 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위(catalytic site)와 피루베이트 간의 거리가 단축된 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위는 서열번호 1에서 106번째 Arg, 138번째 Asn, 169번째 Arg, 193번째 His, 248번째 Thr, 또는 그의 조합일 수 있다.
또한, 상기 락테이트 데히드로게나제는 야생형 락테이트 데히드로게나제(서열번호 1)의 양성자 공여체 잔기의 pKa에 비하여, 양성자 공여체(proton donor) 잔기(residue)의 pKa가 증가된 아미노산 잔기의 변이를 갖는 것일 수 있다.
락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase, LDH)는 피루베이트로부터 락테이트로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 피루베이트에 작용할 수 있으며, L-락테이트 또는 D-락테이트를 생산할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제는 야생형 또는 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 비활성 (specific activity)보다 개선된 비활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제의 비활성은 아생형 또는 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 비활성보다 약 100% 이상, 약 105% 이상, 약 110% 이상, 약 115% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 150% 이상, 약 160% 이상, 약 170% 이상, 또는 약 200% 이상 증가된 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 gDNA 및 cDNA와 같은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트(expression cassette)를 제공한다. 상기 벡터 또는 발현 카세트에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 카세트는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열일 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미할 수 있다. 이로 인해, 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있다. 상기 조절 서열은 복제 개시점, 프로모터, 터미네이터, 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 또한 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 결합될 수 있다. 상기 프로모터는 Covalently linked Cell Wall protein 12 (CCW12), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD), Pyruvate DeCarboxylase 1(PDC1), phosphoglycerate kinase (PGK), Transcription enhancer factor 1(TEF1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TDH), triose phosphate isomerase (TPI), purine-cytosine permease (PCPL3), 및 alcohol dehydrogenase (ADH) 유전자 유래의 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CCW12 프로모터, CYC 프로모터, TEF1 프로모터, PGK1 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선택 마커(selection marker)를 더 포함할 수 있다. 상기 선택 마커는 ura3(orotidine-5'-phosphate decarboxylase)일 수 있다.
다른 양상은 피루베이트로부터 락테이트로의 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포를 제공한다.
상기 피루베이트로부터 락테이트로의 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관해서는 상술한 바와 같다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 외인성 유전자일 수 있다. 상기 효모 세포는 상기 외인성 유전자를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 벡터, 예를 들면 발현 벡터를 통하여 모세포에 도입된 외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 선형 폴리뉴클레오티드 형태, 예를 들면 발현 카세트로 모세포 내에 도입된 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터, 예를 들면 플라스미드로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전 물질, 예를 들면 염색체에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 상술한 락테이트 데히드로게나제를 발현할 수 있다. 상기 효모 세포는 그 모세포에 비하여 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가된 것일 수 있다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 효모 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상항에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 것을 촉매하는 효소와 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성 (cell activity)"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 일례로 자낭균류 (ascomycota)일 수 있다. 상기 자낭균류는 사카로미세타시에 (saccharomycetaceae) 일 수 있다. 상기 사카로미세타시에는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속, 캔디다 (Candida) 속, 피치아 (Pichia) 속, 이사첸키아 (Issatchenkia) 속, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속, 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces) 속, 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 클루이베로마이세스 속은 클루이베로마이세스 서모톨러란스 (Kluyveromyces thermotolerans)일 수 있다. 캔디다 속은 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata)일 수 있다. 자이고사카로마이세스 속은 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailli) 또는 자이고사카로마이세스 룩시이 (Zygosaccharomyces rouxii)일 수 있다.
상기 효모 세포는 비-천연 효모 세포를 포함할 수 있다. 용어 "비-천연"은 기준 종의 야생형 균주를 포함하여, 상기 기준 종의 천연 균주에서 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변형을 가지는 것을 의미할 수 있다. 유전자 변형은 예를 들면 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입, 다른 폴리뉴클레오티드의 첨가, 폴리뉴클레오티드의 결실 및/또는 상기 효모 세포 유전 물질의 파괴를 포함할 수 있다. 상기 유전적 변형은 예를 들어 상기 기준 종들에 대한 이종, 동종, 또는 이종 및 동종 모두의 폴리펩티드에 대한 코딩 부위 및 그의 작용성 단편을 포함할 수 있다. 추가적인 변형은 예를 들어 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-코딩 조절 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소의 활성을 갖도록 외인성 유전자를 갖고, 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 유전적 변형을 갖고, 및/또는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 감소된 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 그 모세포에 피하여 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 감소된 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질로부터 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
상기 효소의 활성이 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절 인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동 재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자 (paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.
상기 효모 세포는 그 모세포에 비하여 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 감소된 것일 수 있다.
상기 효모 세포가 락테이트 생산용인 경우, 상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1일 수 있다. 상기 pdc1 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 11의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 cyb2 유전자는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하여 락테이트를 생산하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 조건 또는 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 혐기 조건(anaerobic conditions)은 산소가 없는 환경을 나타낸다. 상기 미세호기 조건은 배양 또는 성장 조건에 참조되어 사용되는 경우, 배지 중의 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 액체 배지 중의 용존 산소에 대한 포화 (saturation)의 0% 보다 크고 약 10%이하로 유지되는 것을 의미한다. 미세호기 조건은 또한, 1% 미만의 산소를 가진 분위기 (atmosphere)로 유지된 봉인된 챔버 (sealed chamber) 내에 액체 배지 중 또는 고체 아가 플레이트 상에서 세포를 성장시키거나 유지시키는 (resting) 것을 포함한다. 산소의 농도는 예를 들면, 배양물을 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적당한 비산소 기체로 스파징함으로써 유지될 수 있다. 상기 산소 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%로 유지하는 것을 포함한다.
용어 "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 상기 탄소원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 질소원의 예는 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염일 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 분리는 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트 데히드로게나제 변이체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 pRS416 벡터를 나타낸 도면이다.
도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다.
도 3은 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.
도 4는 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이 균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 pCtB1 벡터의 모식도이다.
도 6은 MD0922 벡터의 모식도이다.
도 7은 MD1188 벡터의 모식도이다.
도 8은 MD1189 벡터의 모식도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 변이체 제작 및 이를 포함하는 벡터 제작
사카로마이세스 세레비지애에서 유전자 발현을 유도한다고 알려진 CCW12 유전자의 프로모터(CCW12p)를 클로닝하기 위해 사카로스마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, 유전자형: MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3ㅿ1; MAL2-8C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 20 및 21의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR (98℃ 5분, 30번 반복으로 98℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 수행 후 72℃ 1분)을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 pRS416 벡터(ATCC® 7521™)에 도입하여 pRS416-CCW12p를 제작하였다. 도 1은 pRS416 벡터를 나타낸 도면이다. pRS416 벡터는 T7 프로모터, 박테리아에서 암피실린 저항성, 효모에서 URA3 카세트 (선택마커), 및 제한효소 클로닝 부위를 갖는 효모 센트로미어 셔틀 플라스미드 (yeast centromere shuttle plasmid)이다.
보스 타우루스의 gDNA를 주형으로 하여 서열번호 22 및 23의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 서열번호 2의 야생형의 락테이트 데히드로게나제 유전자(BtLDHw)를 증폭하였다. 수득된 야생형의 락테이트 데히드로게나제 유전자를 주형으로 하여 site direct mutagenesis를 하여 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 유전자(BtLDHM)를 수득하였다. 상기 변이체를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 6 내지 8의 폴리뉴클레오티드 서열를 갖는다. 락테이트 데히드로게나제 변이체에 관하여 표 1에 나타내었다.
락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 유전자인 ldh(E102G), ldh(D236G), 및 ldh(S237G) 유전자 각각을 제한효소 BamHl/Hindlll를 사용하여 상술한 pRS416-CCW12p 벡터에 도입하여 pRS416-CCW12p-BtLDHM을 각각 제작하였다.
보스 타우루스 유래의 락테이트 데히드로게나제 변이체(ldhM) 변이
내용		 아미노산의
서열번호		 유전자의
서열번호
1 BtLDH(E102G) E102G 3 6
2 BtLDH(D236G) D236G 4 7
3 BtLDH(S237G) S237G 5 8
실시예 2. 락테이트 데히드로게나제 변이체를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애의 제작
2.1 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 + BtLDH M )의 제조
2.1.1 PDC1 유전자 결실 카세트 제작
피루베이트로부터 에탄올을 생산하는데 관여하는 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase 1, PDC1)을 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 유전자 결실 카세트를 다음과 같이 제작하였다.
항생제 마커를 사용하기 위하여 상기 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae, CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 24 및 25의 프라이머를 사용하여 Gal10 터미네이터 (Gal10t) PCR 절편을 제작한 후 NotI으로 절단하고 이를 pGEM-5Zf (Promega USA)에 도입하여 pGEM-Gal10t를 제작하였다.
또한 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae , CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 26 및 27의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의해 PDC 프로모터 (PDCp)를 얻은 후, 수득된 절편을 EcoRI으로 절단하고 이를 동일한 EcoRI으로 절단된 pGEM-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-Gal10t을 제작하였다. 도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다. 제네티신 항생제 저항성 유전자인 NPT를 삽입하여 과발현하기 위하여 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터를 제작하였다.
그 후, pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen 社)를 주형으로 서열번호 28 및 29의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR을 수행하여 제네티신 (G418) 항생제에 내성을 갖게 할 수 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neomycin phosphotransferase, NPT) 유전자를 얻은 후, 수득된 절편을 XhoI과 BamHI으로 절단하고 이를 동일한 제한효소로 절단된 pGEM-PDCp-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t을 제작하였다. 도 3은 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.
PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t를 주형으로 하고, 서열번호 30 및 31의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
2.1.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 ) 균주의 제조
사카로마이세스 세레비지애에서 PDC1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 도 4는 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이 균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여, 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 사카로마이세스 세레비지애 세포를 수득한 다음, 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 재현탁한 세포를 수득한 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
PDC1 제거를 위해 실시예 2.1.1에서 제작된 PDC1 유전자 결실카세트 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음, 수조에 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 배양액과 함께 첨가하여 약 42℃에서 약 1시간 동안 반응 후, 수득된 배양액을 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다.
상기 플레이트에서 형성된 콜로니를 선별해 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD 고체 배지에 옮겼다. 이와 동시에, 동일한 성분의 액체 배지에 선별된 콜로니를 배양한 후 배양한 콜로니로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 변이 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PDC1 결실을 확인하기 위해 서열번호 32 및 33의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 PDC1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)를 수득하였다.
2.1.3 PDC1 유전자가 결실된 사카로마이세스 세레비지애 L- LDH 발현 벡터 도입된 균주 제작
실시예 1에서 제작한 pRS416-CCW12p-BtLDHw 벡터, 및 pRS416-CCW12p-BtLDHM 벡터 (즉, pRS416-CCW12p-BtLDH(E102G) 벡터, pRS416-CCW12p-BtLDH(D236G) 벡터, pRS416-CCW12p-BtLDH(S237G) 벡터) 각각을 실시예 2.1.2에서 제조한 PDC1이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1) 균주에 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 도입하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제작한 pRS416-CCW12p-BtLDHw 벡터, 및 pRS416-CCW12p-BtLDHM 벡터를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA와 혼합한 다음, 수조에 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1) 균주의 배양액과 함께 첨가하여 42℃에서 1시간 동안 반응 후, 수득된 배양액을 우라실(ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하여, 각각의 BtLDH 벡터가 도입된 균주를 제작하였다.
2.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 + BtLDH M )의 제조
2.2.1 L- 락테이트 시토크롬 -c 옥시도리덕타제 ( cyb2 ) 결실 균주의 제작
L- 락테이트 시토크롬 -c 옥시도리덕타제 ( cyb2 ) 결실 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA을 주형으로 하고 서열번호 34 및 35의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 355 bp의 DNA 조각을 얻었다. 또한 같은 게놈 DNA을 주형으로 하고 서열번호 36 및 37의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 378 bp의 DNA 조각을 얻었다. 또한 pCtB1 벡터 (GenBank Accession Number KJ922019; 서열번호 38)를 주형으로 하고 T7 프라이머와 T3 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 1,955 bp의 DNA 조각을 얻었다. 이렇게 얻어진 355 bp, 378 bp, 및 1,955bp의 DNA 조각들을 모두 섞어 서열번호 34 및 37의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 2,630 bp의 DNA 조각을 얻었다. 도 5는 pCtB1 벡터의 모식도이다. 얻어진 DNA 조각을 CEN.PK2-1D 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 야생형 균주에서는 2,676 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 39 및 40의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 2,891 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 확보하였다.
확보된 균주를 YPD (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-glucose 20g /L) 배지에서 하루동안 종균 배양한 후, 5-FOA 배지 (Yeast Nitrogen Base 6.7g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92g, uracil 0.1g, D-glucose 20g, 5-fluoroorotic acid 1g, Bacto Agar 20g /L)에 도말하여 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 다시 서열번호 39 및 40의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 1,497 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 확보하였다. 이 균주를 MD1192 균주로 명명하였다. MD1192 균주의 유전형은 다음과 같다: MATαura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2; Δcyb2.
2.2.2 L- ldh 유전자를 과발현시키기 위한 카세트 제작
사카로마이세스 세레비지애 균주에서 CCW12 프로모터에 의해 L-LDH가 과발현되는 카세트를 만들기 위해 pCtB1 벡터에 CCW12 프로모터가 삽입된 MD0922 벡터를 제작하였다. CCW12 프로모터를 얻기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 자연형 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트를 프라이머로 이용한 PCR을 수행하여 1,605 bp의 DNA 조각을 수득하였다. 수득된 DNA 조각을 KpnI 으로 처리한 pCtB1 벡터와 섞어 In-fusion 키트를 이용하여 클로닝한 후 클로닝용 대장균주인 TOP10 (Invitrogen)에 통상적인 열충격 (heatshock) 형질도입법을 이용하여 도입하고 카나마이신 50 ug/ml이 포함된 LB 한천 배지 (Bacto Tryptone 10 g/L, Yeast Extract 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L, Bacto Agar 15 g/L, Kanamycin 50 ug/ml)에 도말하였다. 37℃에서 10시간 배양 후 형성된 콜로니들에서 통상적인 Alkaline lysis miniprep 방법으로 플라스미드를 회수하여 그 중 서열번호 43와 같은 벡터를 선별하여 효모 과발현 벡터인 MD0922 벡터를 얻었다. 도 6은 MD0922 벡터의 모식도이다. MD0922 벡터는 pCtB1 벡터에 CCW12 프로모터가 삽입된 벡터이다.
실시예 1에서 제작된 pRS416-CCW12p-BtLDH 또는 pRS416-CCW12p-BtLDH(D236G) 벡터로부터 서열번호 44 및 45의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 1,039 bp의 DNA 조각을 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI과 SacI으로 처리한 MD0922 벡터와 섞어 In-fusion 키트를 이용하여 클로닝한 후 클로닝용 대장균주인 TOP10 (Invitrogen) 에 통상적인 열충격 (heatshock) 형질도입법을 이용하여 도입하고 카나마이신 50ug/ml이 포함된 LB 한천 배지 (Bacto Tryptone 10g/L, Yeast Extract 5g/L, 염화나트륨 10g/L, Bacto Agar 15g/L, Kanamycin 50ug/ml)에 도말하였다. 37℃에서 10시간 배양 후 형성된 콜로니들에서 통상적인 Alkaline lysis miniprep 방법으로 플라스미드를 회수하여, 그 중 각각 서열번호 46 또는 서열번호 47와 같은 벡터를 선별하여 효모 LDH 과발현 벡터인 MD1188 또는 MD1189 벡터를 얻었다. 도 7은 MD1188 벡터의 모식도이다. MD1188 벡터는 야생형 BtLDH 유전자가 클로닝된 벡터이다. 도 8은 MD1189 벡터의 모식도이다. MD1189 벡터는 BtLDH (D236G) 유전자가 클로닝된 벡터이다.
2.2.3 피루베이트 데카르복실라제 ( pdc1 ) 유전자가 결실되면서 L- LDH 발현 카세트가 도입된 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 자연형 균주의 게놈 DNA을 주형으로 하고 서열번호 48 및 49의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 260 bp의 DNA 조각을 얻었다. 또한 같은 게놈 DNA을 주형으로 하고 서열번호 50 및 51의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 257 bp의 DNA 조각을 얻었다. 또한 실시예 2.2.2에서 제작된 MD1188 벡터 또는 MD1189 벡터를 주형으로 하고 T7 프라이머 및 T3 프라이머의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 4,422 bp의 DNA 조각을 얻었다. 이렇게 얻어진 260 bp, 257 bp, 및 4,422 bp의 DNA 조각들을 모두 섞어, 각각 서열번호 48 및 서열번호 51의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 각각 4,881 bp 또는 4,881 bp의 DNA 조각을 얻었다.
얻어진 DNA 조각을 실시예 2.2.1에서 제작된 MD1192 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 각각의 균주 중에서 야생형 균주에서는 2,904 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 52 및 53의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 5,414 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 각각 확보하였다. 확보된 균주를 YPD (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-glucose 20g /L) 배지에서 하루동안 종균 배양한 후, 5-FOA 배지 (Yeast Nitrogen Base 6.7g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92g, uracil 0.1g, D-glucose 20g, 5-fluoroorotic acid 1g, Bacto Agar 20g /L)에 도말하여 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 각각의 균주 중에서 다시 서열번호 52 및 53 프라이머 세트를 프라이머로 한 이용한 PCR을 수행하여 4,020 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 각각 확보하였다. 이 중 MD1188 벡터로부터 시작된 균주는 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1Δcyb2+BtLDHw) 균주이며, MD1189 벡터로부터 시작된 균주는 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1Δcyb2+BtLDH(D236G) 균주이다.
실시예 3. 락테이트 데히드로게나제 변이체가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용한 락테이트 생산능 평가
3.1 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿ PDC1 + BtLDH ( E102G )) 균주, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿ PDC1 + BtLDH ( D236G )) 균주, 및 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿ PDC1 + BtLDH ( S237G )) 균주의 락테이트 생산능 평가
실시예 2.1.3에서 제작된 야생형, BtLDH(E102G), BtLDH(D236G), 및 BtLDH(S237G) 를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주를 각각 4% 포도당을 함유한 최소 배지 (minimal Ura drop-out media) 50 ml에 OD600 값 1이 되도록 접종하고, 30?에서 90rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. OD600 값은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 락테이트의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
V W A98G E102G N108G S167G M174G D236G S237G
젖산의 농도
(g/L)		 0.0 7.4 5.7 8.8 10.4 4.5 6.6 12.7 10.5
표 2는 각각 야생형 BtLDH, BtLDH(E102G), BtLDH(D236G), 및 BtLDH(S237G)를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주가 생산한 락테이트 농도를 나타낸 그래프이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, BtLDH(E102G) 발현 벡터가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDH(E102G)) 균주는 약 8.8 g/L의 락테이트 생산량을 나타내고, 약 7.4 g/L의 락테이트 생산량을 보인 야생형 BtLDH가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDHw) 균주보다 향상된 락테이트 생산량을 나타내었다.
또한, BtLDH(D236G) 발현 벡터가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDH(D236G)) 균주는 약 12.7 g/L의 락테이트 생산량을 나타내고, 야생형 BtLDH가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDHw) 균주보다 향상된 락테이트 생산량을 나타내었다.
또한, BtLDH(S237G) 발현 벡터가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDH(S237G)) 균주는 약 10.5 g/L의 락테이트 생산량을 나타내고, 야생형 BtLDH가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDHw) 균주보다 향상된 락테이트 생산량을 나타내었다.
3.2 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿ PDC1 ㅿ CYB2 + BtLDH ( D236G )) 균주의 락테이트 생산능 평가
실시예 2.2.3에서 제작된 야생형, 및 BtLDH(D236G)를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주를 각각 YPD 배지 (효모 추출물 10 g/L, Bacto Peptone 20 g/L, D-글루코스 80 g/L) 50 ml에 OD600 값 1이 되도록 접종하고, 30?에서 90rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. OD600 값은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 락테이트의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
젖산의 농도 (g/L) 수율 (g/g%)
야생형 BtLDH 16.8 ± 0.4 31.3 ± 1
BtLDH(D236G) 18.2 ± 0.4 36.6 ± 0.8
표 3은 각각 야생형 BtLDH 및 BtLDH(D236G)를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주가 생산한 락테이트 농도를 나타낸 그래프이다. 표 3에 나타낸 바와 같이, BtLDH(D236G) 발현 카세트가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDH(D236G)) 균주는 약 18.2 g/L의 락테이트 생산량을 보여, 약 16.8 g/L의 락테이트 생산량을 보인 야생형 BtLDH 카세트가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDHw) 균주의 생산량보다 약 8.33% 향상된 락테이트 생산량을 나타내었다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDH(D236G)) 균주는 약 36.6 g/g %의 락테이트 생산 수율을 보여, 약 31.3 g/g %의 락테이트 생산 수율을 보인 야생형 BtLDH 카세트가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDHw) 균주의 수율보다 약 16.9% 향상된 락테이트 생산 수율을 나타내었다. 상기 생산 수율은 (락테이트 생산량 g/포도당 소모량 g)x100으로 산출하였다.
3.3 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿ PDC1 ㅿ CYB2 + BtLDH ( D236G )) 균주의 pH 3.0 조건하에서의 락테이트 생산능 평가
실시예 2.2.3에서 제작된 야생형, 및 BtLDH(D236G)를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주를 각각 pH 3.0으로 조정된 젖산 함유 YPD 배지(효모 추출물 10 g/L, Bacto Peptone 20 g/L, D-글루코스 80 g/L, 및 젖산 20 g/L) 50 ml에서 OD600 값 1이 되도록 접종하고, 30?에서 90rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. OD600 값은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 락테이트의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
젖산의 농도 (g/L) 수율 (g/g%)
야생형 BtLDH 31.4 28.3
BtLDH(D236G) 34.9 32.8
표 4는 각각 야생형 BtLDH 및 BtLDH(D236G)를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주가 생산한 락테이트 농도를 나타낸 그래프이다. 표 4에 나타낸 바와 같이, BtLDH(D236G) 발현 카세트가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDH(D236G)) 균주는 약 34.9 g/L의 락테이트 생산량을 보여, 약 31.4 g/L의 락테이트 생산량을 보인 야생형 BtLDH 카세트가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDHw) 균주보다 향상된 락테이트 생산량을 나타내었다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDH(D236G)) 균주는 약 32.8 g/g %의 락테이트 생산 수율을 보여, 약 28.3 g/g %의 락테이트 생산 수율을 보인 야생형 BtLDH 카세트가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1ㅿCYB2+BtLDHw) 균주보다 향상된 락테이트 생산 수율을 나타내었다.
따라서, 상기 BtLDH(D236G)를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주는 산성 조건, 예를 들면 pH 3.0 조건에서도 대조군인 야생형 BtLDH에 비하여 더 많이 락테이트를 생산할 수 있고, 높은 수율로 락테이트를 생산할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 4. 락테이트 데히드로게나제 변이체의 비활성 평가
실시예 2.2.3에서 제작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDHw) 및 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDH(E102G)) 균주를 파괴하고, 수득한 조추출물(crude extract)로부터 야생형 락테이트 데히드로게나제 및 락테이트 데히드로게나제 변이체를 각각 TALON® metal affinity resin (Clontech, Inc.)에 의해 정제하였다. 그 후 야생형 락테이트 데히드로게나제 및 그 변이체의 비활성 (specific activity)을 측정하여 표 5에 나타내었다. 표 5는 야생형 락테이트 데히드로게나제 및 락테이트 데히드로게나제 변이체의 비활성 (specific activity)을 나타낸 도면이다. 표 5에 나타낸 바와 같이 BtLDH(D236G)의 비활성은 약 0.635 U/mg로, 약 0.241 U/mg의 값을 갖는 야생형 BtLDH의 비활성에 비하여 증가하였다.
비활성 (U/mg)
야생형 BtLDH 0.241
BtLDH(D236G) 0.635
<110> Samsung Electronic Co. Ltd <120> Lactate dehydrogenase mutant, polynucleotide coding the mutant, yeast cell having the polynucleotide, and method for producing the lactate using the same <130> PN106328 <160> 53 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 1 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 2 <211> 999 <212> DNA <213> Bos Taurus <400> 2 atggcaacat taaaagatca actaatccag aatttgttga aagaggagca tgttccacaa 60 aacaaaatca caatcgtcgg cgtaggtgca gtaggtatgg cttgtgccat atccatcttg 120 atgaaagact tagctgatga ggtcgcgctg gttgatgtaa tggaggacaa acttaaagga 180 gaaatgatgg atcttcaaca tggttcactc tttttgagaa ctcctaaaat tgtatccggg 240 aaagattata acgttaccgc caattctaga cttgttataa tcacggctgg tgcaagacaa 300 caggaaggcg aatcaagact taacttagtt cagagaaacg taaacatttt caagtttatc 360 atcccaaata ttgtaaaata ctccccaaat tgcaagttgc tggttgtttc aaatcctgtt 420 gacatattga cttacgttgc ttggaagatt tcaggtttcc caaagaatag agtaatcgga 480 tctggttgca atctcgattc tgctcgtttt aggtatctga tgggtgaaag attaggggtt 540 catccattga gttgtcacgg atggattcta ggtgaacatg gagatagttc tgtgcctgtt 600 tggtcaggtg tcaacgtagc aggtgtctct ttgaaaaatc tacacccaga actaggaaca 660 gatgccgaca aggaacaatg gaaggccgtc cacaaacaag tggtggattc tgcctacgaa 720 gtcatcaaat tgaagggcta cacatcttgg gcaattggct tatccgtcgc tgatctggct 780 gaatcaataa tgaaaaacct ccgtagagtg catcctataa gtactatgat taagggttta 840 tacgggatca aggaagatgt ttttctatct gtgccatgta ttttgggcca aaatggaatt 900 tctgacgttg ttaaagtgac acttactcat gaagaggaag cgtgtttgaa aaagagcgca 960 gacaccttat ggggcatcca aaaggaatta caattctaa 999 <210> 3 <211> 332 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 3 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Gly Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp 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Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Gly Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys 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agggttaatt tcgagcttgg cgtaatcatg 5820 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 5880 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 5940 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 6000 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 6060 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 6120 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 6180 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 6240 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 6300 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 6360 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 6420 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 6480 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 6540 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 6600 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 6660 aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 6720 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 6780 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 6840 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 6900 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 6960 tgagtaaact tggtctgaca tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 7020 tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 7080 agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 7140 agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 7200 caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgctcgc cttgagcctg 7260 gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 7320 agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 7380 gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 7440 ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 7500 agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 7560 gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcttgcagtt cattcagggc accggacagg 7620 tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 7680 gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 7740 ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca attcgagtgc attcaacatc agccatactc 7800 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7860 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 7920 ccac 7924 <210> 47 <211> 7924 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MD1189 vector <400> 47 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtacgcatt taagcataaa cacgcactat gccgttcttc tcatgtatat 180 atatatacag gcaacacgca gatataggtg cgacgtgaac agtgagctgt atgtgcgcag 240 ctcgcgttgc attttcggaa gcgctcgttt tcggaaacgc tttgaagttc ctattccgaa 300 gttcctattc tctagctaga aagtatagga acttcagagc gcttttgaaa accaaaagcg 360 ctctgaagac gcactttcaa aaaaccaaaa acgcaccgga ctgtaacgag ctactaaaat 420 attgcgaata ccgcttccac aaacattgct caaaagtatc tctttgctat atatctctgt 480 gctatatccc tatataacct acccatccac ctttcgctcc ttgaacttgc atctaaactc 540 gacctctaca ttttttatgt ttatctctag tattactctt tagacaaaaa aattgtagta 600 agaactattc atagagtgaa tcgaaaacaa tacgaaaatg taaacatttc ctatacgtag 660 tatatagaga caaaatagaa gaaaccgttc ataattttct gaccaatgaa gaatcatcaa 720 cgctatcact ttctgttcac aaagtatgcg caatccacat cggtatagaa tataatcggg 780 gatgccttta tcttgaaaaa atgcacccgc agcttcgcta gtaatcagta aacgcgggaa 840 gtggagtcag gcttttttta tggaagagaa aatagacacc aaagtagcct tcttctaacc 900 ttaacggacc tacagtgcaa aaagttatca agagactgca ttatagagcg cacaaaggag 960 aaaaaaagta atctaagatg ctttgttaga aaaatagcgc tctcgggatg catttttgta 1020 gaacaaaaaa gaagtataga ttctttgttg gtaaaatagc gctctcgcgt tgcatttctg 1080 ttctgtaaaa atgcagctca gattctttgt ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt 1140 ttgttttaca aaaatgaagc acagattctt cgttggtaaa atagcgcttt cgcgttgcat 1200 ttctgttctg taaaaatgca gctcagattc tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg 1260 catttttgtt ctacaaaatg aagcacagat gcttcgttaa tgtgctgcaa ggcgattaag 1320 ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta 1380 atacgactca ctatagggcg aattggactg taccgaatat ctgtgtccta atgaattcct 1440 cgttagtggt cattattata tacgatagtt gtagttttcc ctgttttccc tttgttcctt 1500 tttttcgagt ctagtattta ccaatataga agaaagagaa aataaataag gtttcttgtt 1560 agagattagt tacttttgct attattatcg caaattcctc ttccactata caaacaagaa 1620 agtaattact actcttattg taagatagta tgataatttc gacgatagat aatatttgct 1680 tttcgttggc cttttctttt tttttttcct tccttccctt cgaagatcct cccgtataat 1740 aacgccgcca gaccatgtag ggtaaccaga gaatacgccc actccgcttt cgcatgtggc 1800 actcctgtat gtcaaaatgc cgaataatct ccatccatga cgaagcgctt tgaggtgttt 1860 aattatatac agggcaaagt cttggagata aagaacgctt tcctaacaac ttgcgctatt 1920 cctcttattt ccttcaatcg attaaaatta acttttaatc gacattgtct tttaaaccag 1980 ggcaaagcaa aataaaagaa acttaatacg ttatgccgta atgaagggct accaaaaacg 2040 ataatctcaa ctgtaaacag gtacaatgcg gacccttttg ccacaaaaca tacatcattc 2100 attgccggaa aaagaaagaa gtgaagacag cagtgcagcc agccatgttg cgccaatcta 2160 attatagatg ctggtgccct gaggatgtat ctggagccag ccatggcatc atgcgctacc 2220 gccggatgta aaatccgaca cgcaaaagaa aaccttcgag gttgcgcact tcgcccaccc 2280 atgaaccaca cggttagtcc aaaaggggca gttcagattc cagatgcggg aattagcttg 2340 ctgccaccct cacctcacta acgctgcggt gtgcggatac ttcatgctat ttatagacgc 2400 gcgtgtcgga atcagcacgc gcaagaacca aatgggaaaa tcggaatggg tccagaactg 2460 ctttgagtgc tggctattgg cgtctgattt ccgttttggg aatcctttgc cgcgcgcccc 2520 tctcaaaact ccgcacaagt cccagaaagc gggaaagaaa taaaacgcca ccaaaaaaaa 2580 aaaaataaaa gccaatcctc gaagcgtggg tggtaggccc tggattatcc cgtacaagta 2640 tttctcagga gtaaaaaaac cgtttgtttt ggaattcccc atttcgcggc cacctacgcc 2700 gctatctttg caacaactat ctgcgataac tcagcaaatt ttgcatattc gtgttgcagt 2760 attgcgataa tgggagtctt acttccaaca taacggcaga aagaaatgtg agaaaatttt 2820 gcatcctttg cctccgttca agtatataaa gtcggcatgc ttgataatct ttctttccat 2880 cctacattgt tctaattatt cttattctcc tttattcttt cctaacatac caagaaatta 2940 atcttctgtc attcgcttaa acactatatc aatagaaaca atggcaacat taaaagatca 3000 actaatccag aatttgttga aagaggagca tgttccacaa aacaaaatca caatcgtcgg 3060 cgtaggtgca gtaggtatgg cttgtgccat atccatcttg atgaaagact tagctgatga 3120 ggtcgcgctg gttgatgtaa tggaggacaa acttaaagga gaaatgatgg atcttcaaca 3180 tggttcactc tttttgagaa ctcctaaaat tgtatccggg aaagattata acgttaccgc 3240 caattctaga cttgttataa tcacggctgg tgcaagacaa caggaaggcg aatcaagact 3300 taacttagtt cagagaaacg taaacatttt caagtttatc atcccaaata ttgtaaaata 3360 ctccccaaat tgcaagttgc tggttgtttc aaatcctgtt gacatattga cttacgttgc 3420 ttggaagatt tcaggtttcc caaagaatag agtaatcgga tctggttgca atctcgattc 3480 tgctcgtttt aggtatctga tgggtgaaag attaggggtt catccattga gttgtcacgg 3540 atggattcta ggtgaacatg gagatagttc tgtgcctgtt tggtcaggtg tcaacgtagc 3600 aggtgtctct ttgaaaaatc tacacccaga actaggaaca gatgccgaca aggaacaatg 3660 gaaggccgtc cacaaacaag tggtgggttc tgcctacgaa gtcatcaaat tgaagggcta 3720 cacatcttgg gcaattggct tatccgtcgc tgatctggct gaatcaataa tgaaaaacct 3780 ccgtagagtg catcctataa gtactatgat taagggttta tacgggatca aggaagatgt 3840 ttttctatct gtgccatgta ttttgggcca aaatggaatt tctgacgttg ttaaagtgac 3900 acttactcat gaagaggaag cgtgtttgaa aaagagcgca gacaccttat ggggcatcca 3960 aaaggaatta caattctaac ggttctgctt atccttacga cgtgcctgac tacgcctgaa 4020 cccgatgcaa atgagacgat cgtctattcc tggtccggtt ttctctgccc tctcttctat 4080 tcactttttt tatactttat ataaaattat ataaatgaca taactgaaac gccacacgtc 4140 ctctcctatt cgttaacgcc tgtctgtagc gctgttactg aagctgcgca agtagttttt 4200 tcaccgtata ggccctcttt ttctctctct ttctttctct cccgcgctga tctcttcttc 4260 gaaacacaga gtgcaccata ccaccttttc aattcatcat ttttttttta ttcttttttt 4320 tgatttcggt ttccttgaaa tttttttgat tcggtaatct ccgaacagaa ggaagaacga 4380 aggaaggagc acagacttag attggtatat atacgcatat gtagtgttga agaaacatga 4440 aattgcccag tattcttaac ccaactgcac agaacaaaaa cctccaggaa acgaagataa 4500 atcatgtcga aagctacata taaggaacgt gctgctactc atcctagtcc tgttgctgcc 4560 aagctattta atatcatgca cgaaaagcaa acaaacttgt gtgcttcatt ggatgttcgt 4620 accaccaagg aattactgga gttagttgaa gcattaggtc ccaaaatttg tttactaaaa 4680 acacatgtgg atatcttgac tgatttttcc atggagggca cagttaagcc gctaaaggca 4740 ttatccgcca agtacaattt tttactcttc gaagacagaa aatttgctga cattggtaat 4800 acagtcaaat tgcagtactc tgcgggtgta tacagaatag cagaatgggc agacattacg 4860 aatgcacacg gtgtggtggg cccaggtatt gttagcggtt tgaagcaggc ggcagaagaa 4920 gtaacaaagg aacctagagg ccttttgatg ttagcagaat tgtcatgcaa gggctcccta 4980 tctactggag aatatactaa gggtactgtt gacattgcga agagcgacaa agattttgtt 5040 atcggcttta ttgctcaaag agacatgggt ggaagagatg aaggttacga ttggttgatt 5100 atgacacccg gtgtgggttt agatgacaag ggagacgcat tgggtcaaca gtatagaacc 5160 gtggatgatg tggtctctac aggatctgac attattattg ttggaagagg actatttgca 5220 aagggaaggg atgctaaggt agagggtgaa cgttacagaa aagcaggctg ggaagcatat 5280 ttgagaagat gcggccagca aaactaatca tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac 5340 gccctccccc cacatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg 5400 tccctattta tttttttata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 5460 ttcttttttt tctgtacaga cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 5520 agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcgtctg tagcgctgtt actgaagctg 5580 cgcaagtagt tttttcaccg tataggccct ctttttctct ctctttcttt ctctcccgcg 5640 ctgatctctt cttcgaaaca tcatgaataa aaagaaaaag gaaatcaaga aaaaaaagcc 5700 ataatttatc ccacattttt ttttattgtc gctgttcaca ccgcataacg aagatattgg 5760 ctagctaacc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt tcgagcttgg cgtaatcatg 5820 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 5880 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 5940 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 6000 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 6060 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 6120 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 6180 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 6240 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 6300 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 6360 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 6420 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 6480 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 6540 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 6600 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 6660 aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 6720 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 6780 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 6840 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 6900 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 6960 tgagtaaact tggtctgaca tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 7020 tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 7080 agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 7140 agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 7200 caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgctcgc cttgagcctg 7260 gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 7320 agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 7380 gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 7440 ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 7500 agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 7560 gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcttgcagtt cattcagggc accggacagg 7620 tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 7680 gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 7740 ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca attcgagtgc attcaacatc agccatactc 7800 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7860 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 7920 ccac 7924 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ttgcataata ttgtccgctg 20 <210> 49 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca gggaacaaac ccaaatctga ttccaaggag 60 a 61 <210> 50 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt ctgttgaatt ggcttaagtc tgggtcc 57 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gtgtctagtc ttctattacg ct 22 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ttgagataag cacactgca 19 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 caacatcacc caattcatcg 20

Claims (20)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제로서, 상기 락테이트 데히드로게나제의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변이를 갖고, 상기 변이는 서열번호 1에서 236번째 Asp, 237번째 Ser, 또는 102번째 Glu가 Gly로 치환된 것인 락테이트 데히드로게나제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위와 피루베이트 사이의 거리에 비하여, 상기 락테이트 데히드로게나제는 단축된 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위와 피루베이트 사이의 거리를 갖는 것인 락테이트 데히드로게나제.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위는 서열번호 1에서 106번째 Arg, 138번째 Asn, 169번째 Arg, 193번째 His, 248번째 Thr, 또는 그의 조합인 것인 락테이트 데히드로게나제.
  7. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 락테이트 데히드로게나제의 양성자 공여체 잔기의 pKa에 비하여, 상기 락테이트 데히드로게나제는 증가된 pKa를 갖는 양성자 공여체 잔기를 갖는 것인 락테이트 데히드로게나제.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 양성자 공여체 잔기는 서열번호 1에서 193번째 His인 것인 락테이트 데히드로게나제.
  9. 청구항 1의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 청구항 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 청구항 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포.
  12. 청구항 11에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 파괴를 갖는 것인 효모 세포.
  13. 청구항 12에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 것인 효모 세포.
  14. 청구항 12에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 코딩하는 것인 효모 세포.
  15. 청구항 12에 있어서, 추가로 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 파괴를 갖는 것인 효모 세포.
  16. 청구항 15에 있어서, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 것인 효모 세포.
  17. 청구항 15에 있어서, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 11의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 코딩하는 것인 효모 세포.
  18. 청구항 11에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  19. 청구항 11에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
  20. 청구항 11의 효모 세포를 배양하여 락테이트를 생산하는 단계; 및
    배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
KR1020140125301A 2014-02-14 2014-09-19 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법 KR102214835B1 (ko)

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