KR20180081527A - 클로스트리듐 박테리아의 형질전환을 위한 유전자 도구 - Google Patents

클로스트리듐 박테리아의 형질전환을 위한 유전자 도구 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클로스트리듐 속의 박테리아, 전형적으로 용매형성성 박테리아의 상동성 재조합에 의한 형질전환을 가능하게 하는 적어도 2종의 상이한 핵산을 포함하는 유전자 도구에 관한 것이다.

Description

클로스트리듐 박테리아의 형질전환을 위한 유전자 도구
본 발명은 클로스트리듐(Clostridium) 속의 박테리아, 전형적으로 클로스트리듐 속의 용매형성성(solventogenic) 박테리아의 상동성 재조합에 의한 형질전환을 가능하게 하는 적어도 2종의 상이한 핵산을 포함하는 유전자 도구에 관한 것이다.
퍼미큐테스(Firmicutes) 문, 클로스트리듐 속에 속하는 박테리아는 내생포자를 형성할 수 있는 절대 혐기성 그람 양성 바실러스이다. 이러한 속은 그들의 병원성 성질 또는 그들의 산업적 및 의학적 관심의 해석에 관해 연구되는 많은 종들을 함유한다. 예를 들어, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)은 각각이 파상풍, 보툴리누스 중독증, 가스 괴저증 및 가막성 대장염의 원인이 되는 동인이 된다. 동시에, 인간에 비병원성인 다른 종들 예컨대 클로스트리듐 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 부티리컴(Clostridium butyricum) 및 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii)는 발효에 사용된다. 마지막으로, 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi) 및 클로스트리듐 스포로제네스(Clostridium sporogenes)는 최근에 항암 요법의 개발을 목표로 하는 연구에서 사용되고 있다.
산업적 관심 대상의 클로스트리듐 종은 포도당에서 셀룰로스에 이르는 범위의 광범위한 기질 및 당류로부터 용매를 생성시킬 수 있다. 용매 생성 클로스트리듐 박테리아는 이중영양적 성장을 특징으로 한다. 산(아세트산 및 부티르산)이 대수 성장기 동안 생성된다. 그러고 나서, 세포 성장이 멈추고 박테리아가 정체기에 들어가면, 이들은 용매를 생성한다.
대부분의 용매형성성 클로스트리듐 균주는 최종 생성물로서 아세톤, 부탄올 및 에탄올을 생성한다. 이들 균주는 "ABE 균주"라고 불린다. 이것은 예를 들어 씨. 아세토부틸리컴 ATCC824 및 씨. 베이제린키 NCIMB 8052 균주의 경우이다. 다른 균주들도 또한 아세톤을 이소프로판올로 환원시킬 수 있고 "IBE 균주"라고 불린다. 이것은 예를 들어 아세톤을 이소프로판올로 환원시킬 수 있는 1차/2차 알코올-디히드로게나제를 코딩하는 adh 유전자를 그의 게놈에 갖는 균주 씨. 베이제린키 DSM 6423(NRRL B593)의 경우이다.
씨. 아세토부틸리컴 ATCC824에 의한 이소프로판올 생성은 씨. 베이제린키 DSM 6423 유래의 adh 유전자를 발현시키기 위한 플라스미드의 도입 후에 가능하다. 이러한 유전자 변형된 균주는 DSM 6423 균주와 동일한 방식으로 수행한다. 이러한 수행은 각각 산의 재동화에 관여하는 CoA-트랜스퍼라제, 및 아세토아세테이트 디카복실라제를 코딩하는 ctfA, ctfB 및 adc 유전자의 오페론 구조 내 과발현 후에 개선될 수 있다(Collas et al., 2012). 이들 유전자를 함유하는 플라스미드의 도입은 IBE 혼합물을 생성하도록 ATCC824 균주의 발효 프로파일을 변형시킨다. 그러나, 성장 배지 중 항생제의 존재는 이러한 유전자 구성체를 유지시키는데 필요하여, 이 균주를 산업적 용도로 사용하는 것을 불가능하게 만든다.
클로스트리듐 속의 박테리아에 대한 명백한 관심에도 불구하고, 유전자 변형된 균주 획득의 어려움으로 인해 그들 물질대사를 연구하고/하거나 변형시키는 작업은 거의 수행되지 않았다. 가장 강건한 시스템은 게놈의 정밀하고 안정한 변형을 가능하게 하는 상동성 재조합 사건을 기반으로 한다. 그러나, 클로스트리듐에서 관찰되는 상동성 재조합 빈도는 매우 낮고, 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자) 및 대항-선별 마커(예를 들어, 독소 코딩 유전자)가 필수적인 것으로 입증되었다. 2가지 도구가 최근에 개발되었는데(Al-Hinai et al., 2012; Cartman et al., 2012), 각각은 단일 플라스미드의 사용을 기반으로 한다. 획기적이긴 하지만, 이들 시스템은 단점을 갖는다. 제1 시스템은 많은 수의 변형을 수행하기 위한 도구의 재사용을 방지하고 돌연변이체의 유전자 맥락(genetic context)을 변경시킬 수 있는 FRT 카세트(선별가능한 마커의 절제 동안 사용됨)를 변형 부위에 남겨두는 결점을 갖는다. 이들 결점은 당업자에게 잘 알려져 있다. 두 순차적인 상동성 재조합 사건을 필요로 하는, 제2 시스템은 게놈의 필수 영역을 변형시키는데 사용될 수 없다. 2종의 플라스미드의 순차적 사용을 포함하는 도구가 이후에 개발되었는데, 그들 중 하나는 메가뉴클레아제 I-SceI을 코딩하며, 이것은 특정 표적 부위에서 이중 가닥 DNA에 파괴를 유도할 수 있고 상동성 재조합 사건을 촉진할 수 있다(Zhang et al., 2015). 여기서도 역시, 일부 필수 유전자의 변형이 두 순차적 상동성 재조합 사건을 수행하는 필요성으로 인해 불가능하다. 현재, 개발된 최신 세대의 도구(Wang et al., 2015; Xu et al., 2015)는 진핵생물에서 관찰되는 RNA 간섭과 유사한 방식으로 작동하는, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술을 기반으로 한다(Barrangou et al., 2007). 각각 씨. 베이제린키 및 씨. 셀룰롤리티컴에 적합화된 문헌 [Wang et al.] 및 문헌 [Xu et al.]에 기술된 도구는 단일 플라스미드의 사용을 기반으로 한다. 문헌 [Xu et al.]은 이중 가닥 파괴 대신 단일 가닥 파괴를 생성하는 Cas9 효소의 변형된 이형(version)을 사용한다. 이용가능한 CRISPR 기술-기반 도구 둘 모두는 박테리아 게놈에 삽입시킬 수 있는 관심 핵산의 크기(및 따라서 코딩 서열 또는 유전자의 개수)(문헌 [Xu et al.]에 따라 고작 약 1.8 kb)를 상당히 제한한다는 주요한 단점을 갖는다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 산업적 규모로 클로스트리듐 속의 박테리아의 사용을 가능하게 하기 위해 최초로 박테리아 게놈을 변형시킬 수 있는, 전체로서 클로스트리듐 속, 구체적으로 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아에 적합화된 유전자 도구를 제공하는 것이다.
따라서 본 발명은 적어도 2종의 상이한 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로스트리듐 속의 박테리아, 바람직하게는 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아의 상동성 재조합에 의한 형질전환을 가능하게 하는 유전자 도구에 관한 것이다. 이러한 도구는 예를 들어 박테리아 생존에 필수적인 서열을 포함하는 클로스트리듐 속의 박테리아의 게놈의 영역을 변형시킬 수 있거나, 또는 현존하는 도구를 사용해서는 불가능한, 핵산 서열의 거대 단편의 삽입을 가능하게 할 수 있다.
따라서 본 발명의 제1 목적은:
- 적어도 Cas9을 코딩하는 제1 핵산으로서, 여기서 Cas9 코딩 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인 제1 핵산, 및
- 상동성 재조합 기전에 의해, Cas9-표적화 박테리아 DNA의 일부분의 관심 서열로의 치환을 가능하게 하는 복구 주형을 함유하는 적어도 제2 핵산
을 포함하는 것을 특징으로 하고,
i) 상기 핵산 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 더 코딩하거나, 또는 ii) 유전자 도구는 하나 이상의 가이드 RNA를 더 포함하며, 각각의 가이드 RNA는 Cas9-효소-결합 RNA 구조, 및 박테리아 DNA의 표적화 부분에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아의 상동성 재조합에 의한 형질전환을 가능하게 하는 유전자 도구에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 유전자 도구를 박테리아에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 클로스트리듐 속의 박테리아, 전형적으로 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 상동성 재조합에 의해 형질전환 및/또는 유전자 변형시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그에 따라 형질전환되고/되거나 유전자 변형된 클로스트리듐 속의 박테리아에 관한 것이다.
본 발명자는 또한 본 발명에 따른 유전자 도구의 성분, 및 임의로는 구체적으로 도구 내에서 사용되는 선택된 유도성 프로모터(들)에 적합화된 하나 이상의 유도인자를 포함하는, 클로스트리듐 속의 박테리아를 사용하여, 적어도 하나의 용매, 예를 들어, 용매의 혼합물을 생성시키거나, 또는 클로스트리듐 속의 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키기 위한 키트를 개시한다.
또한 산업적 규모로 용매 또는 용매의 혼합물, 바람직하게는 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 이소프로판올/부탄올 혼합물을 생성하기 위한, 본 발명에 따른 유전자 도구, 상동성 재조합에 의해 클로스트리듐 속의 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키기 위한 방법, 이에 따라 형질전환 및/또는 유전자 변형된 박테리아의 용도를 개시한다.
발명의 상세한 설명
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)은 박테리아 및 고세균에서 파지 및 플라스미드에 대항하여 면역 방어 역할을 갖는 유전자의 유전자좌를 의미한다. CRISPR-Cas9 시스템은 본질적으로 표적 게놈에서 이중 가닥 파괴를 유도하는 Cas9 단백질 및 절단 부위에 대한 특이성을 책임지는 가이드 RNA(gRNA)의 조합을 기반으로 한다. DNA에서 표적화 이중 가닥 파괴를 생성시키는 이러한 능력은 관심 균주의 게놈으로 돌연변이를 도입시키는데 필수적인 상동성 재조합 사건을 촉진시킬 수 있다. 세포 생존능은 게놈의 무결성에 의존적이다. 박테리아는 복구 주형을 요구하는 상동성 재조합 기전에 의해서건, 또는 비상동성 말단 연결 기전에 의해서건 간에, 그의 DNA 내 임의 파괴를 복구해야만 한다. 세포에 이러한 주형을 제공함으로서, 파괴 부위에 상응하는 영역을 변형시키는 것이 가능하다(도 2). DNA 분자에 이중 가닥 파괴를 만드는 CRISPR의 능력은 다양한 유기체, 구체적으로 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)에서 유전자 도구로서의 이의 최근 사용을 가능하게 하였으며, 이는 대장균(E. coli), 및 진핵생물 세포에서 처음 특징규명되었다(Jiang et al., 2013; Cong et al., 2013; Hwang et al., 2013; Hsu et al., 2013). 이는 박테리아 게놈에 대해 제한된 변형만을 가능하게 하는 유전자 도구의 도움으로 클로스트리듐 베이제린키 및 클로스트리듐 셀룰롤리티컴에서 최근에 사용되었는데, 산업적 규모로는 비현실적이다(Wang et al., 2015; Xu et al., 2015).
클로스트리듐 속의 박테리아의 상동성 재조합에 의한 형질전환을 가능하게 하고, 적어도 2종의 상이한 핵산을 포함하는 유전자 도구가 본 명세서에서 최초로 개시된다. 본 발명자들은 이 도구를 산업적 관점에서 특히 유용하게 하여, 따라서 오랜 동안 표현된 요구를 충족시키는데 충분히 효과적인 방식으로, 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시킬 수 있다는 것을 입증하였다.
클로스트리듐 속의 박테리아의 상동성 재조합에 의한 형질전환을 가능하게 하는, 본 발명에 따른 구체적인 유전자 도구는:
- 적어도 Cas9를 코딩하는 제1 핵산으로서, 여기서 Cas9 코딩 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인 제1 핵산, 및
- 상동성 재조합 기전에 의해서, Cas9-표적화 박테리아 DNA의 일부분의 관심 서열로의 치환을 가능하게 하는 복구 주형을 함유하는 적어도 제2 핵산
을 포함하고,
여기서 i) 상기 핵산 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 더 코딩하거나 또는 ii) 유전자 도구는 하나 이상의 가이드 RNA를 더 포함한다는 것을 고려한다. 이러한 도구에서 각각의 가이드 RNA는 Cas9-효소-결합 RNA 구조, 및 박테리아 DNA의 표적화 부분에 상보적인 서열을 포함한다.
표현 "클로스트리듐 속의 박테리아"는 구체적으로 산업적 관심의 클로스트리듐 종, 전형적으로 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 의미하려는 의도이다. 표현 "클로스트리듐 속의 박테리아"는 야생형 박테리아 뿐 아니라 CRISPR 시스템에 노출시키지 않고 그들 성능을 개선시키는(예를 들어, ctfA, ctfB 및 adc 유전자의 과발현) 목적으로 유전자 변형시켜 그로부터 유래된 균주를 포함한다.
표현 "산업적 관심의 클로스트리듐 종"은 발효에 의해, 단당류 예컨대 포도당, 자일로스, 프룩토스 또는 만노스, 다당류 예컨대 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스, 산 예컨대 부티르산 또는 아세트산, 또는 클로스트리듐 속의 박테리아에 의해 동화될 수 있고 이용될 수 있는 임의의 다른 탄소원(예를 들어, CO, CO2 및 메탄올)으로부터 용매를 생성시킬 수 있는 종을 의미하려는 의도이다. 관심의 용매형성성 박테리아의 예로는 아세톤, 부탄올, 에탄올 및/또는 이소프로판올을 생성하는 클로스트리듐 속의 박테리아, 예컨대 "ABE 균주"[발효 생성물로서 아세톤, 부탄올 및 에탄올을 생성하는 균주] 및 "IBE 균주"[발효 생성물로서 이소프로판올(아세톤의 환원에 의함), 부탄올 및 에탄올을 생성하는 균주]와 같이 문헌에서 확인되는 균주들이 있다. 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아는 씨. 아세토부틸리컴(C. acetobutylicum), 씨. 셀룰롤리티컴(C. cellulolyticum), 씨. 피토퍼멘탄스(C. phytofermentans), 씨. 베이제린키(C. beijerinckii), 씨. 사카로부틸리컴(C. saccharobutylicum), 씨. 사카로퍼부틸아세토니컴(C. saccharoperbutylacetonicum), 씨. 스포로제네스(C. sporogenes), 씨. 부티리컴(C. butyricum), 씨. 아우란티부티리컴(C. aurantibutyricum) 및 씨. 티로부티리컴(C. tyrobutyricum), 바람직하게는 씨. 아세토부틸리컴, 씨. 베이제린키, 씨. 부티리컴 및 씨. 티로부티리컴 및 씨. 셀룰롤리티컴, 및 보다 바람직하게는 씨. 아세토부틸리컴 및 씨. 베이제린키에서 선택될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 관심있는 클로스트리듐 속의 박테리아는 "ABE 균주", 바람직하게는 씨. 아세토부틸리컴 ATCC824 균주 또는 씨. 베이제린키 NCIMB 8052 균주이다.
다른 구체적인 실시형태에서, 관심있는 클로스트리듐 속의 박테리아는 "IBE 균주", 바람직하게는 씨. 베이제린키 DSM 6423 균주(NRRL B593 균주라고도 식별함)이다.
CRISPR 시스템은 2종의 별개의 성분, 즉 i) 엔도뉴클레아제, 본 경우에서 CRISPR 시스템과 연관된 뉴클레아제(Cas 또는 "CRISPR-연관 단백질"), Cas9, 및 ii) 가이드 RNA를 함유한다. 가이드 RNA는 박테리아 CRISPR RNA(crRNA) 및 tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)의 조합으로 이루어진 키메라 RNA의 형태이다(Jinek et al., Science 2012 - 도 3 참조). gRNA는 Cas 단백질을 위한 가이드로서 제공되는 "스페이서 서열"에 상응하는 crRNA의 표적화 특이성, 및 tracrRNA의 입체형태 특성을 단일 전사물에 조합한다. gRNA 및 Cas9 단백질이 세포에서 동시에 발현되는 경우, 표적 게놈 서열은 영구적으로 변형되거나 또는 차단될 수 있다. 변형은 유리하게는 복구 주형에 의해 가이드된다.
본 발명에 따른 유전자 도구는 적어도 Cas9을 코딩하는 제1 핵산을 포함한다. 용어 "Cas9"은 Cas9 단백질(Csn1 또는 Csx12라고도 함) 또는 이의 기능성 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 의미하려는 의도이고, "기능성"은 하나 이상의 가이드 RNA와 상호작용할 수 있고 표적 게놈의 DNA에 이중 가닥 파괴를 생성시킬 수 있는 효소(뉴클레아제) 활성을 수행할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, "Cas9"은 예를 들어 단백질의 사전정의된 기능에 필수적이지 않은 단백질 도메인, 구체적으로 하나 이상의 gRNA와 상호작용하는데 필요하지 않은 도메인을 제거하기 위해 절단된, 변형된 단백질을 나타낼 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용시 Cas9(전체 단백질 또는 이의 단편)을 코딩하는 서열은 임의의 공지된 Cas9 단백질로부터 획득될 수 있다(Makarova et al., 2011). 본 발명에서 유용한 Cas9 단백질의 예는 제한없이, 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 및 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질을 포함한다. 본 발명에서 유용한 다른 Cas9 단백질은 또한 [Fonfara et al., 2013]의 논문에 기술되어 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자 도구의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 Cas9 단백질, 또는 이의 기능성 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 단편은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60% 동일성을 갖고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열의 위치 10("D10") 및 위치 840("D840")을 차지하는 적어도 2개의 아스파르트산("D")을 함유하는 임의의 다른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, Cas9는 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) M1 GAS 균주 유래의 cas9 유전자(NCBI 수탁 번호: NC_002737.2 SPy_1046, SEQ ID NO: 2)에 의해 코딩되는 Cas9 단백질(NCBI 수탁 번호: WP_010922251.1, SEQ ID NO: 1), 또는 클로스트리듐 속의 박테리아가 우선적으로 사용하는 코돈, 전형적으로 이 박테리아 속에서 Cas9 단백질의 촉진된 발현을 가능케 하는, 아데닌("A") 및 티민("T") 염기가 풍부한 코돈을 함유하는 전사물을 생기게 하는 최적화를 겪은 이의 이형("최적화된 이형(optimized version")을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 이들 최적화된 코돈은 각각의 박테리아 균주에 특이적인, 당업자에게 잘 알려진 코돈 용법 편향성을 준수한다.
이 문헌에 개시된 펩티드 서열에서, 아미노산은 다음의 명명법에 따라 그들의 한 글자 코드로 표시된다: C: 시스테인; D: 아스파르트산; E: 글루탐산; F: 페닐알라닌; G: 글리신; H: 히스티딘; I: 이소류신; K: 리신; L: 류신; M: 메티오닌; N: 아스파라긴; P: 프롤린; Q: 글루타민; R: 아르기닌; S: 세린; T: 트레오닌; V: 발린; W: 트립토판 및 Y: 티로신.
구체적인 실시형태에 따라서, Cas9 도메인은 전체 Cas9 단백질, 바람직하게는 스트렙토코커스 피오제네스 유래의 Cas9 단백질, 또는 이의 최적화된 이형으로 이루어진다.
본 발명에 따른 유전자 도구의 핵산 중 하나에 존재하는 Cas9 코딩 서열은 프로모터의 제어 하에 위치된다. 이 프로모터는 항상성 프로모터이거나 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, Cas9 발현을 제어하는 프로모터는 유도성 프로모터이다.
본 발명의 맥락에서 유용한 항상성 프로모터의 예는 thl 유전자의 프로모터, ptb 유전자의 프로모터, adc 유전자의 프로모터, BCS 오페론의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게는 기능성이지만 보다 짧은(절단형) 유도체 예컨대 씨. 아세토부틸리컴 유래의 thl 유전자 프로모터의 "miniPthl" 유도체(Dong et al., 2012), 또는 클로스트리듐에서 단백질의 발현을 가능케하는, 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 프로모터에서 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 유용한 유도성 프로모터의 예는 예를 들어 그 발현이 전사 억제인자 TetR에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어, tetA 유전자(본래 대장균 트랜스포존 Tn10에 존재하는 테트라사이클린 내성 유전자)의 프로모터; 그 발현이 L-아라비노스에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 ptk 유전자의 프로모터(문헌 [Zhang J. et al., 2015] 참조)로서, ARAi 시스템을 구축하기 위해 씨. 아세토부틸리컴 유래의 araR 조절인자 발현 카세트와 조합된 것(문헌 [Zhang J. et al., 2015] 참조); 그 발현이 라미나리비오스(β-1,3 포도당 이량체)에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 바람직하게는 억제인자 유전자 glyR3 및 관심 유전자가 바로 후속되는, celC 유전자 프로모터(문헌 [Mearls EB et al. (2015)] 참조) 또는 celC 유전자 프로모터(문헌 [Newcomb M. et al., 2011] 참조); 그 발현이 락토스에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 바람직하게는 AdhE1(알데하이드/알코올 디히드로게나제) 유전자가 바로 후속되는, bgaL 유전자 프로모터(문헌 [Banerjee et al., 2014] 참조); 그 발현이 자일로스에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 xylB 유전자 프로모터(문헌 [Nariya H et al., 2011] 참조); 및 그 발현이 UV 노출에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 bcn 프로모터(문헌 [Dupuy et al., 2005] 참조)로부터 선택될 수 있다.
상기 기술된 프로모터 중 하나로부터 유래된 프로모터, 바람직하게는 기능성이지만 짧은(절단형) 유도체가 또한 유리하게 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
본 발명에서 유용한 다른 유도성 프로모터가 또한 예를 들어 [Ransom EM et al. (2015)], [Currie DH et al. (2013)], [D'Urzo N et al. (2013)] 및 [Hartman AH et al. (2011)]의 논문에 기술되어 있다.
바람직한 유도성 프로모터는 Pcm-2tetO1 및 Pcm-2tetO2/1로부터 선택된, tetA 로부터 유래된 언히드로테트라사이클린(aTc)-유도성 프로모터(aTc는 테트라사이클린보다 덜 독성이 있고 보다 낮은 농도에서 전사 억제인자 TetR의 억제를 풀어줄 수 있음)이다(Dong et al., 2012).
또 다른 바람직한 유도성 프로모터는 xylB로부터 유래된 자일로스 유도성 프로모터, 예를 들어 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 630 유래의 xylB 프로모터이다(Nariya et al., 2011).
본 명세서에 개시된 바와 같은 유도성 프로모터는 유리하게는 효소의 작용을 제어하고 바람직한 유전자 변형을 겪은 형질전환체의 선택을 촉진하는 것을 가능하게 한다.
용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 본 발명의 의미에서 박테리아 염색체의 표적 영역 쪽으로 가이드하기 위해 "Cas9"과 상호작용할 수 있는 RNA 분자를 의미한다. 파괴의 특이성은 gRNA에 의해 결정된다. 상기에 설명한 바와 같이, 각각의 gRNA는 다음의 2개 영역을 포함한다:
- 표적 염색체 영역에 상보적이고 내생성 CRISPR 시스템의 crRNA를 모방하는, gRNA의 5' 말단의 제1 영역(통상적으로 "SDS" 영역이라고 불림), 및
- 내생성 CRISPR 시스템의 crRNA 및 tracrRNA(trans-activating crRNA) 사이의 염기쌍 상호작용을 모방하고 본질적으로 단일 가닥 서열로 3' 방향으로 종결되는 이중 가닥 스템-루프 구조를 갖는, gRNA의 3' 말단의 제2 영역(통상적으로 "핸들" 영역이라고 함). 이 제2 영역은 Cas9에 대한 gRNA의 결합에 필수적이다.
gRNA의 제1 영역(SDS 영역)은 표적화 염색체 서열에 따라 다양하다.
표적 염색체 영역에 상보적인 gRNA의 SDS 영역은 적어도 1개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 40개 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 이 영역은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
gRNA의 제2 영역(핸들 영역)은 스템-루프(또는 헤어핀) 구조를 갖는다. 상이한 gRNA의 핸들 영역은 선택된 염색체 표적에 의존하지 않는다.
구체적인 실시형태에 따라서, 핸들 영역은 적어도 1개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 1, 50, 100, 200, 500 및 1000개 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 1000개 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 바람직하게, 이 영역은 40 내지 120개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
gRNA의 전체 길이는 일반적으로 50 내지 1000개 뉴클레오티드, 바람직하게는 80 내지 200개 뉴클레오티드, 보다 특히 구체적으로 90 내지 120개 뉴클레오티드이다. 구체적인 실시형태에 따라서, 본 발명에서 사용하는 바와 같은 gRNA는 95 내지 110개 뉴클레오티드 범위의 길이, 예를 들어 약 100개 또는 약 110개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
당업자는 표적화하려는 염색체 영역에 따라서 gRNA의 서열 및 구조를 잘 알려진 기술을 사용하여 쉽게 정의할 수 있다(예를 들어, [DiCarlo et al., 2013]의 논문을 참조함).
박테리아 염색체 내의 표적화된 DNA 영역/부분/서열은 비코딩 DNA의 일부분 또는 코딩 DNA의 일부분에 상응할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 박테리아 DNA의 표적화된 부분은 박테리아 생존에 필수적인 하나 이상의 유전자 또는 유전자 부분(들) 또는 그 불활성화가 관심 핵산(들)이 통합된 박테리아의 선택을 가능케 하는 하나 이상의 유전자 또는 DNA 서열을 포함한다.
클로스트리듐 속의 박테리아 내의 표적화 DNA 부분의 구체적인 예는 실험 부문에서 사용되는 서열이다. 이들은 예를 들어 upp(SEQ ID NO: 3) 및 adhE1(SEQ ID NO: 4) 유전자를 코딩하는 서열이다.
표적화된 DNA 영역/부분/서열에는 Cas9 결합에서 역할을 하는 PAM(protospacer adjacent motif) 서열이 후속된다.
소정 gRNA의 SDS 영역은 박테리아 염색체 내의 표적화된 DNA 영역/부분/서열과 100% 동일하거나 또는 적어도 80% 동일하거나, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고, 상기 영역/부분/서열의 상보성 서열의 전부 또는 일부분, 전형적으로 적어도 1개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 서열, 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드를 포함하는 서열과 혼성화할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 하나 이상의 gRNA가 동시에 사용될 수 있다. 이들 상이한 gRNA는 동일하거나 또는 상이한, 바람직하게는 상이한, 염색체 영역을 표적으로 할 수 있다.
gRNA는 gRNA 분자(성숙형 또는 전구체)의 형태로, 전구체의 형태로 또는 상기 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 형태로 박테리아 세포에 도입될 수 있다. gRNA는 바람직하게는 상기 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 형태로 박테리아 세포에 도입된다.
하나 이상의 gRNA가 RNA 분자의 형태로 직접적으로 세포에 도입되는 경우, 이들 gRNA(성숙형 또는 전구체)는 예를 들어 뉴클레아제에 대한 그들의 내성을 증가시키고 따라서 세포 내에서 이들의 수명을 증가시킬 수 있게 하는 변형된 뉴클레오티드 또는 화학 변형을 함유할 수 있다. 이들은 특히, 적어도 하나의 변형되거나 또는 비천연인 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 염기, 예컨대 이노신, 메틸-5-데옥시시티딘, 디메틸아미노-5-데옥시우리딘, 데옥시우리딘, 디아미노-2,6-푸린, 브로모-5-데옥시우리딘 또는 혼성화를 가능케하는 임의의 다른 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 gRNA는 뉴클레오티드간 결합 수준, 예를 들어 포스포로티오에이트, H-포스포네이트 또는 알킬-포스포네이트, 또는 골격의 수준, 예를 들어 알파-올리고뉴클레오티드, 2'-O-알킬 리보스 또는 펩티드 핵산(PNA)에 대해 변형될 수도 있다(Egholm et al., 1992).
gRNA는 천연 RNA, 합성 RNA, 또는 재조합 기술로 생성된 RNA일 수 있다. 상기 gRNA는 당업자에게 공지된 임의 방법 예컨대 화학 합성, 생체내 전사 또는 증폭 기술에 의해 제조될 수 있다.
gRNA가 하나 이상의 핵산의 형태로 박테리아 세포에 도입될 때, 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 서열은 발현 프로모터의 제어 하에 위치된다. 상기 프로모터는 항상성일 수 있거나 또는 유도성일 수 있다.
몇몇 gRNA가 사용될 때, 각각의 gRNA의 발현은 상이한 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 프로모터는 모든 gRNA에 대해 동일하다. 구체적인 실시형태에서, 발현시키고자 의도하는 몇몇개, 예를 들어 오직 소수의 gRNA의 발현을 허용하도록 동일한 프로모터가 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA의 발현을 제어하는 하나 이상의 프로모터는 항상성 프로모터이다.
본 발명의 맥락에서 유용한 항상성 프로모터의 예는 thl 유전자의 프로모터, ptb 유전자의 프로모터 또는 bcs 오페론의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게는 miniPthl, 또는 클로스트리듐 내에서 RNA(코딩 또는 비코딩)의 합성을 가능하게 하는, 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 유용한 유도성 프로모터의 예는 tetA 유전자의 프로모터, xylA 유전자의 프로모터, lacI 유전자의 프로모터, 또는 bgaL 유전자의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게는 2tetO1 또는 tetO2/1로부터 선택될 수 있다. 바람직한 유도성 프로모터는 tetO2/1이다.
Cas9 및 하나 이상의 gRNA의 발현을 제어하는 프로모터는 동일하거나 또는 상이할 수 있고 항상성이거나 또는 유도성일 수 있다. 본 발명의 구체적이고 바람직한 실시형태에서, 각각, Cas9 또는 하나 이상의 gRNA의 발현을 제어하는 프로모터 중 오직 하나는 유도성 프로모터이다.
본 발명의 의미 내에서, 용어 "핵산"은 코딩 서열로부터 합성된 전사물의 코돈이 클로스트리듐 속의 박테리아에서 사용을 위해 그에서 가장 빈번하게 발견되는 코돈이 되도록 최적화되거나, 또는 임의로는 화학적으로 변형된(즉, 예를 들어 변형된 결합, 변형된 염기 및/또는 변형된 당을 포함하는 변형된 뉴클레오티드, 비천연 염기를 포함), 임의의 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자를 의미하고자 한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 클로스트리듐 속의 경우, 최적화된 코돈은 전형적으로 아데닌("A") 및 티민("T") 염기가 풍부한 코돈이다.
본 발명에 따른 유전자 도구 내에 존재하는 각각의 핵산, 전형적으로 "제1" 핵산 및 "제2" 핵산은 별개의 독립체로 이루어지고, 예를 들어 i) 발현 카세트(또는 "구성체") 예컨대 하나 이상의 관심 (코딩) 서열, 전형적으로 그 발현 생성물이 박테리아 내에서 관심 기능의 생성에 기여하는 몇몇 관심 코딩 서열을 포함하는 오페론에 작동적으로 연결된(당업자가 이해하는 의미로) 적어도 하나의 전사 프로모터를 포함하는 핵산, 또는 예컨대 활성화 서열 및/또는 전사 종결인자를 더 포함하는 핵산; 또는 ii) 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 원형 또는 선형의, 단일 가닥 또는 이중 가닥 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파지, 코스미드, 인공 또는 합성 염색체에 상응한다. 바람직하게, 벡터는 플라스미드이다.
발현 카세트 및 벡터는 당업자에게 잘 알려진 통상의 절차에 의해 구축될 수 있고 하나 이상의 프로모터, 박테리아 복제 기원(ORI 서열), 종결인자 서열, 선택 유전자, 예를 들어 항생제 내성 유전자, 및 카세트 또는 벡터의 표적화 삽입을 허용하는 서열("측접 영역")을 포함할 수 있다. 또한, 상기 발현 카세트 및 벡터는 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 게놈에 통합시킬 수 있다.
관심 ORI 서열은 pIP404, pAMβ1, repH(씨. 아세토부틸리컴의 복제 기원), ColE1 또는 rep(대장균의 복제 기원), 또는 클로스트리듐 세포 내에서 벡터, 전형적으로 플라스미드를 유지시킬 수 있게 하는 임의의 다른 복제 기원으로부터 선택될 수 있다.
관심 종결 서열은 adc 및 thl 유전자의 종결 서열, bcs 오페론의 종결 서열, 또는 클로스트리듐 내에서 전사의 중지를 위한, 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 종결인자로부터 선택될 수 있다.
관심 선택 유전자는 ermB, catP, bla, tetA, tetM, 및 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜, 테트라사이클린 또는 당업자에게 잘 알려진 클로스트리듐 속의 박테리아를 선택하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 항생제에 대한 내성을 위한 임의의 다른 유전자로부터 선택될 수 있다.
구체적인 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 카세트는 gRNA를 코딩한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 청구항에서 확인된 바와 같은 "제1" 핵산으로서 그 서열이 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 7의 서열 중 하나로부터 선택되는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 도구에 관한 것이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명은 "제2" 또는 "n번째" 핵산으로서, 그 서열이 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11의 서열 중 하나로부터 선택되는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 도구에 관한 것이다.
관심 서열은 선택된 복구 주형에 의해 가이드되는 상동성 재조합 기전을 통해 박테리아 게놈에 도입된다(CRISPR 기술에 따름). 관심 서열은 박테리아 게놈 내의 표적화된 부분을 치환한다. 따라서 재조합 과정은 박테리아의 게놈 내에서 표적화 부분의 전체 또는 부분 변형 또는 결실을 가능하게 하거나 또는 박테리아의 게놈에 핵산 단편(구체적인 실시형태에서 거대 단편)의 삽입을 가능하게 한다. 선택된 복구 주형은 실제로, 원하는 형질전환의 성질에 따라 박테리아 게놈의 표적화 서열의 전부 또는 일부, 또는 다소간 변형된 이의 이형을 포함할 수 있다. DNA의 표적화된 부분처럼, 따라서 주형은 그 자체가 천연 및/또는 합성, 코딩 및/또는 비코딩 서열에 상응하는 하나 이상의 핵산 서열 또는 핵산 서열 부분을 포함할 수 있다. 주형은 예를 들어 박테리아 생존, 구체적으로 클로스트리듐 속의 박테리아의 생존에 필수적인 유전자, 또는 그의 불활성화가 하나 이상의 관심 핵산이 통합된 클로스트리듐 속의 박테리아의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 유전자 또는 DNA 서열에 상응하는 하나 이상의 서열 또는 서열의 일부분(들)을 포함할 수 있다. 주형은 또한 하나 이상의 "외래" 서열, 즉 클로스트리듐 속에 속하는 박테리아의 게놈 또는 상기 속의 특정 종의 게놈에 자연적으로 부재하는 서열을 포함할 수 있다. 주형은 또한 상기 기술된 바와 같은 서열의 조합을 포함할 수 있다.
관심 서열의 구체적인 예는 실험 부문에서 사용되는 서열들이다. 이들은 예를 들어 서열 upp_del(SEQ ID NO: 12) 및 upp_중지(SEQ ID NO: 13)이다.
본 발명에 따른 유전자 도구는 복구 주형이, 관심 핵산, 전형적으로 적어도 1개 염기쌍(bp), 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1,000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 bp, 전형적으로 1 bp 내지 20 kb 또는 1 bp 내지 10 kb, 바람직하게는 10 bp 내지 20 kb 또는 10 bp 내지 10 kb, 예를 들어 1 bp 내지 2 kb를 포함하는 DNA 서열 또는 서열 부분의, 클로스트리듐 속의 박테리아의 박테리아 게놈 내로의 도입을 가이드할 수 있게 한다.
구체적인 실시형태에서, 관심 DNA 서열은 적어도 하나의 관심 생성물, 바람직하게는 용매의 생성을 촉진하는 생성물, 전형적으로 적어도 하나의 관심 단백질, 예를 들어 효소; 막 단백질 예컨대 트랜스포터; 전사 인자; 또는 이의 조합을 코딩한다.
바람직한 실시형태에서, 관심 DNA 서열은 용매의 생성을 촉진하고 전형적으로 i) 예를 들어 알코올 디히드로게나제를 코딩하는 서열(예를 들어 adh, adhE, adhE1, adhE2, bdhA, 및 bdhB에서 선택된 서열), 트랜스퍼라제를 코딩하는 서열(예를 들어, ctfA, ctfB, atoA 및 atoB에서 선택된 서열), 디카복실라제를 코딩하는 서열(예를 들어, adc), 히드로게나제를 코딩하는 서열(예를 들어, etfA, etfB 및 hydA에서 선택된 서열), 및 이의 조합에서 선택되는, 효소, 바람직하게는 알데하이드에서 알코올로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 서열, ii) 막 단백질을 코딩하는 서열, 예를 들어 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 서열(예를 들어, glcG, bglC, cbe4532, cbe4533, cbe4982, cbe4983, cbe0751에서 선택된 서열), 및 iii) 전사 인자를 코딩하는 서열(예를 들어, sigE, sigF, sigG, sigH, sigK에서 선택된 서열)에서 선택된다.
본 발명은 또한 클로스트리듐 속의 박테리아, 바람직하게는 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 상동성 재조합에 의해 형질전환 및/또는 유전자 변형시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 출원에서 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 유전자 도구를 박테리아에 도입시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 형질전환된 박테리아, 즉 하나 이상의 원하는 재조합/최적화를 갖는 박테리아를 획득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 상동성 재조합에 의해 형질전환 및/또는 유전자 변형시키기 위한 본 발명에 따른 구체적인 방법은 순서대로, 하기 단계를 포함한다:
a) 적어도 하나의 유도성 프로모터를 포함하는 본 출원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 유전자 도구를 박테리아에 도입시키는 단계, 및
b) 박테리아를 유전자 변형시키기 위해 유도성 프로모터의 발현을 유도시키는 단계.
본 발명에 따른 유전자 도구의 성분(핵산 또는 gRNA)을 박테리아에 도입시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 직접 또는 간접 방법, 예를 들어 형질전환, 접합, 미세주입, 형질감염, 전기천공 등, 바람직하게는 형질전환에 의해 수행된다(Lutke-Eversloh, 2014).
필요한 경우, 유도 단계는 본 발명에 따른 유전자 도구를 표적 박테리아에 도입시킨 후 당업자에게 공지된 임의 방법으로 실행할 수 있다. 이는 예를 들어 충분한 양으로 존재하는 적합한 물질과 박테리아를 접촉시키거나, 또는 UV 광에 노출시켜 수행된다. 상기 물질은 선택된 유도성 프로모터에 연결된 발현의 억제를 풀어준다. 선택된 프로모터가 Pcm-2tetO1 및 Pcm-tetO2/1에서 선택되는, 언히드로테트라사이클린(aTc)-유도성 프로모터인 경우, aTc는 바람직하게는 약 1 ng/mL 내지 약 5000 ng/mL, 바람직하게는 1 mL 당 약 100 ng 내지 약 500 ng/mL 또는 1 mL 당 약 200 ng 내지 약 300 ng/mL, 예를 들어 약 250 ng/mL 범위의 농도로 사용된다.
구체적인 실시형태에서, 방법은 존재하는 경우 단계 b) 이후에, i) 이미 도입된 것 또는 도입된 것들과 상이한 복구 주형 및 ii) 박테리아의 게놈의 표적화 구역으로 그들의 통합을 가능하게 하는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는, n번째, 예를 들어 제3, 제4, 제5 등의 핵산을 도입시키는 하나 이상의 추가 단계를 포함하고, 각각의 추가 단계는, 바람직하게는 유리하게 이전에 도입된 복구 주형을 코딩하는 핵산의 제거 단계로서 이후에 박테리아 세포는 상기 핵산이 "소거된" 것으로 간주되는 것인 단계, 및 바람직하게는 이전에 도입된 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 서열의 제거 단계가 선행된다.
구체적으로 유리한 방식으로, 그리고 종래 이용가능한 도구와 대조적으로, 본 발명에 따른 유전자 도구는 한 단계로, 즉 단일 핵산(전형적으로 본 명세서에서 개시하는 바와 같은 "제2" 핵산)을 사용하거나, 또는 몇몇 단계로, 즉 몇몇 핵산(전형적으로 본 명세서에서 개시하는 바와 같은 "제2" 및 하나 이상의 "n번째" 핵산)을 사용하여, 바람직하게는 한 단계로, 소형 크기뿐만 아니라 대형 크기의 관심 서열의 도입을 가능하게 한다.
본 발명의 구체적인 실시형태에서, 이러한 "n번째" 핵산은 박테리아 DNA의 표적화 부분을 결실시키거나 또는 보다 짧은 서열(예를 들어, 적어도 하나의 염기쌍이 결실된 서열) 및/또는 비기능성인 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 구체적으로 바람직한 실시형태에서, "제2" 또는 "n번째" 핵산은 유리하게는 박테리아 게놈에 적어도 하나의 염기쌍, 및 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 kb를 포함하는 관심 핵산을 도입시킨다.
관심 핵산은 사용된 gRNA에 따라서 동일하거나 또는 상이한 영역에서 박테리아 염색체, 및 유용한 것으로 입증된다면 박테리아 생존에 필수적인 유전자, 예를 들어 유전자 gyrA, pfkA, hydA, crt, thl, hbd, 또는 클로스트리듐 속의 박테리아의 생존에 필수적인 것으로 당업자에게 알려진 임의의 다른 유전자 중 하나를 포함하는 박테리아 게놈의 일부분, 및/또는 그 불활성화가 하나 이상의 관심 핵산이 통합된 박테리아의 선택을 가능케 하는 유전자 또는 DNA 서열, 예를 들어 upp 유전자에 삽입될 수 있다.
본 발명에 의해서, 전형적으로 본 발명에 따른 유전자 도구 및 방법에 의해서, 형질전환된 관심 박테리아, 예를 들어 그것이 유래된 박테리아와 유전자형 또는 표현형 차이를 갖는 향상된 변이체, 전형적으로 산업적으로 유용한 박테리아, 예를 들어 용매 또는 생물연료의 생산에 유용한 박테리아가 획득되도록 클로스트리듐 속의 박테리아를 효율적으로(고빈도의 상동성 재조합), 실질적으로(대형 크기의 관심 핵산을 박테리아의 게놈 내에 도입시키는 것이 가능), 그리고 안정하게(형질전환된 박테리아를 항생제와 접촉시켜 유지시킬 필요없음) 변형시키는 것이 이제 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법 및/또는 유전자 도구를 사용하여 형질전환된, 클로스트리듐 속의 박테리아, 전형적으로 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아에 관한 것이다. 이러한 박테리아는 복구 주형을 사용하는 상동성 재조합에 의해 그의 게놈에 도입된 하나 이상의 관심 핵산을 발현한다. 이러한 박테리아는 본 발명에 따른 유전자 도구의 전부 또는 일부, 전형적으로 Cas9 또는 Cas9를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 유전자 도구를 사용하여 형질전환된, 본 발명에 따른 클로스트리듐 속의 구체적인 박테리아, 예를 들어 박테리아 ATCC824는 더 이상 pSOL 메가플라스미드를 함유하지 않는다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법 및 유전자 도구를 사용하여 형질전환된, 본 발명에 따른 클로스트리듐 속의 박테리아는 그의 게놈에 자발적으로 도입된 하나 이상의 관심 핵산의 발현에 의해서만 하나 이상의 용매를 생성시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 도구의 성분의 전부 또는 일부, 전형적으로 i) Cas9를 코딩하는 제1 핵산으로서, 여기서 Cas9 코딩 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인 제1 핵산, 및 ii) 상동성 재조합 기전에 의해서, Cas9-표적화 박테리아 DNA의 일부분의 관심 서열로의 치환을 허용하는 복구 주형을 코딩하는 적어도 제2 핵산, 및 임의로는 도구 내에서 임의로 사용되는 선택된 유도성 프로모터(들)에 적합화된 하나 이상의 유도인자를 포함하는, 클로스트리듐 속의 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 구체적인 키트는 태그를 포함하는 Cas9 단백질의 발현을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 키트는 하나 이상의 소모품 예컨대 배양 배지, 적어도 하나의 클로스트리듐 속의 컴피턴트 박테리아(즉, 형질전환에 사용하기 위해 패키징됨), 적어도 하나의 gRNA, Cas9 단백질, 하나 이상의 선택 분자, 또는 설명서 세트를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 전형적으로 본 명세서에 개시된 형질전환 방법의 실시 또는 클로스트리듐 속의 박테리아를 사용하여 용매(들)(적어도 하나의 용매)의 생성을 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 마지막으로, 클로스트리듐 속의 박테리아, 전형적으로 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키기 위한, 예를 들어, 클로스트리듐 속의 박테리아의 향상된 변이체를 발생시키기 위한, 본 발명에 따른 유전자 도구, 또는 방법, 또는 키트의 잠재적인 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 전형적으로 산업적 규모로, 구체적으로 용매 또는 생물연료, 또는 이의 혼합물의 생성을 위한, 본 발명에 따른 유전자 도구, 방법, 키트 또는 형질전환된 클로스트리듐 속의 박테리아의 잠재적인 용도에 관한 것이다. 생성될 가능성이 있는 용매는 전형적으로 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 에탄올/이소프로판올, 부탄올/이소프로판올, 또는 에탄올/부탄올 혼합물, 바람직하게는 이소프로판올/부탄올 혼합물이다.
구체적인 실시형태에서, 에탄올/이소프로판올 혼합물의 비는 적어도 1/4과 같다. 상기 비는 바람직하게는 1/3 내지 1, 보다 바람직하게는 1과 같다.
구체적인 실시형태에서, 에탄올/부탄올 혼합물의 비는 적어도 1/4과 같다. 상기 비는 바람직하게는 1/3 내지 1, 보다 바람직하게는 1과 같다.
구체적인 실시형태에서, 이소프로판올/부탄올 혼합물의 비는 적어도 1/4과 같다. 상기 비는 바람직하게는 1/3 내지 1, 보다 바람직하게는 1과 같다.
본 발명에 따른 형질전환된 박테리아의 용도는 전형적으로 산업적 규모로 적어도 100 톤의 아세톤, 적어도 100 톤의 에탄올, 적어도 1000 톤의 이소프로판올, 적어도 1800 톤의 부탄올, 또는 적어도 40,000 톤의 이의 혼합물의 연간 생산을 가능하게 한다.
이하의 실시예 및 도면의 목적은 이의 범주를 제한하지 않고 본 발명을 보다 완전하게 예시하려는 것이다.
도 1: 클로스트리듐의 용매형성성 균주의 물질대사. ABE 균주는 아세톤, 에탄올 및 부탄올을 생성시키는 한편, IBE 균주는 아세톤을 이소프로판올로 전환시키는 adh 유전자를 보유한다. 문헌 [Lee et al., 2012]을 변형시킴.
도 2: CRISPR의 작용 방식(Mali et al.)
도 3: 게놈 편집을 위한 CRISPR-Cas9의 용도. 이중 가닥 파괴는 gRNA에 의해 지정된, Cas9 뉴클레아제에 의해 생성된다. 상동성 재조합에 의한 이러한 파괴의 복구는 복구 주형에 함유된 변형의 게놈 내로의 도입을 가능하게 한다. 도면은 문헌 [Ann Ran et al., 2013]의 것을 변형시켰다.
도 4: upp 표적화 플라스미드. pIP404, 씨. 아세토부틸리컴의 복제 기원. ColE1, 대장균(E. coli)의 복제 기원. catP, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(클로람페니콜/티암페니콜 내성 유전자). CDS, 코딩 서열.
도 5: pSOL 표적화 플라스미드. pIP404, 씨. 아세토부틸리컴의 복제 기원. ColE1, 대장균 복제 기원. catP, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(클로람페니콜/티암페니콜 내성 유전자). CDS, 코딩 서열.
도 6: pEC500E-miniPthl-Cas9 벡터 지도. pAMβ1, 씨. 아세토부틸리컴의 복제 기원. rep, 대장균의 복제 기원. bla, β-락타마제 유전자(암피실린 내성). ermB, 메틸라제(에리쓰로마이신 내성). CDS, 코딩 서열.
도 7: 야생형 균주 및 획득된 형질전환체에서 cas9에 의해 표적화된 구역의 서열분석. NC_003030, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 ATCC824의 서열(GenBank); crRNA, gRNA에 의해 인식되는 부위; PAM, protospacer adjacent motif, Cas9 결합에서 역할을 함. CDS, 코딩 서열. SEQ ID NO: 22는 도 7에 표시된 NC_003030 단편에 상응하고 SEQ ID NO: 23은 각각 "upp_중지 복구 주형", "ATCC824" 및 "ATCC824 upp-"로서 식별되는 서열의 도 7에 표시된 단편에 상응한다.
도 8: 증폭 결과.
A: catP_fwd x catP_rev(예상 크기: 709 bp)
B: RH_ctfB_R x V-CTFA-CAC2707_R(예상 크기: 351 bp)
1: 2-로그 마커(NEB). 2: H20, 음성 대조군. 3: 비형질전환 ATCC824. 4: pEC500E-miniPthl-cas9로 형질전환된 ATCC824. 5 & 6: pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C로 형질전환된 ATCC824(2종의 독립된 형질전환체). 7 & 8: pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C-gRNA_adhE로 형질전환된 ATCC824(2종의 독립된 형질전환체).
도 9: ATCC824로부터 유래된 균주의 α-아밀라제 활성의 검출. 1: ATCC824; 2: pEC500E 및 pEC750C로 형질전환된 ATCC824; 3: pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C로 형질전환된 ATCC824; 4: pEC500E 및 pEC750C-gRNA_adhE로 형질전환된 ATCC824; 5: pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C-gRNA_adhE로 형질전환된 ATCC824.
도 10: 야생형 균주 및 형질전환체의 발효 결과(2종의 기술적 복제물).
도 11: A/B. cas9을 위한 유도성 발현 플라스미드. repH, 씨. 아세토부틸리컴의 복제 기원. ColE1, 대장균의 복제 기원. ermB, 메틸라제(에리쓰로마이신 내성). tetR, 전사 억제인자 TetR을 코딩하는 유전자. CDS, 코딩 서열.
도 12: 프로모터 Pcm-2tetO1 및 Pcm-tetO2/1로부터 출발하는 발현에 대한 유도의 효과. 상기 프로모터들은 gusA 유전자의 하류에 위치시켰고, GusA 활성은 100 ng/mL의 aTc의 부재 또는 존재 하에, 씨. 아세토부틸리컴 ATCC824 세포에서 측정하였다. 문헌 [Dong et al., 2012]을 변형시킴.
도 13: pEC750C-gRNA_upp를 함유하는 형질전환체의 생존능에 대한 aTc 농도의 효과.
도 14: 5-FU-낸성 돌연변이체의 생성. 액체 배양액의 연속 희석물을 다양한 배지 상에 침적시켰다. 상동성 재조합 사건이 복구 주형의 삽입을 가능하게 한 형질전환체만이 2YTG + 5-FU 상에서 성장할 수 있었다. 백색 화살표는 후속되는 실험에 선택된 콜로니를 나타낸다. ND, 희석하지 않음.
도 15: upp_del 형질전환체의 PCR 분석.
A. upp 유전자 주변의 유전자 구성. 코딩 서열은 화살표로 나타낸다. 회색 직사각형은 upp_del 주형에서 부재하는 영역을 나타낸다. 사용된 프라이머는 삼각형으로 표시한다. CDS, 코딩 서열. PAM, protospacer adjacent motif, Cas9 결합에서 역할을 함.
B. 증폭 결과. M: 2-로그 마커(NEB). 1: H20, 음성 대조군. 2: 비형질전환된 ATCC824.
3: aTc에 노출 전 pFW0001-Pcm-2tetO1-cas9 및 pEC750CgRNA_upp-upp_del로 형질전환된 ATCC824. 4 & 5: 2YTG+5-FU 상에서 단리된, aTc에 노출 전 pFW0001-Pcm-2tetO1-cas9 및 pEC750CgRNA_upp-upp_del로 형질전환된 ATCC824(2종의 독립된 형질전환체).
도 16: 2YTG+5-FU 상에서 단리된 콜로니에서 cas9-표적화 구역의 서열분석.
NC_003030, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 ATCC824의 서열(GenBank); crRNA, gRNA에 의해 인식되는 부위; PAM, protospacer adjacent motif, Cas9 결합에서 역할을 함. CDS, 코딩 서열. SEQ ID NO: 24는 도 16에 표시된 ATCC824 균주의 게놈 서열의 단편에 상응하고 SEQ ID NO: 25는 각각 "upp_중지 주형", "클론 pFW0001-Pcm-2tetO1-cas9 - pEC750C-gRNA_upp-upp_중지1" 및 "클론 pFW0001-Pcm-tetO2/1-cas9 - pEC750C-gRNA_upp-upp_중지1" 및 "클론 pFW0001-Pcm-tetO2/1-cas9 - pEC750C-gRNA_upp-upp_중지2"로서 식별되는 서열의 도 16에 표시된 단편에 상응한다.
도 17: pEC750C-gRNA_upp-Δupp::ipa8 플라스미드. pIP404, 씨. 아세토부틸리컴의 복제 기원. ColE1, 대장균의 복제 기원. 아세틸트랜스퍼라제(클로람페니콜/티암페니콜 내성 유전자). CDS, 코딩 서열. RHA/LHA: upp 유전자의 측접 서열(ca_c2879).
도 18: 프라이머 CA_C2877 및 CA_C2882를 사용한 증폭 결과. M, 2-로그 크기 마커(NEB). P, pEC750C-gRNA_upp-Δupp::ipa8; WT, ATCC 824.
도 19: ATCC 824 및 돌연변이체 upp_del 및 Δupp::ipa8에 의한 용매의 생성. 오차 막대는 이중으로 수행된 실험의 표준 편차를 나타낸다. upp_del 및 Δupp::ipa8에 대해 획득된 데이터는 각 경우에서 2종의 생물학적으로 독립적인 돌연변이체에 대해 획득된 평균이다.
도 20: 엔도글루카나제 CelA(pWUR3) CelD(pWUR 4)를 발현하는 다양한 균주 및 빈 플라스미드를 발현하는 대조군 균주의 한천 상에서의 엔도글루카나제 활성 측정. 이들 다양한 균주는 0.2% CMC를 함유하는 페트리 디쉬 상에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 콩고 레드 염색으로 가시화시킨 가수분해 후광(halo)은 각 균주의 엔도글루카나제 활성을 특징짓는다. 대조군 균주 상에서는 후광을 검출할 수 없는 한편, 엔도글루카나제 CelA 또는 CelD를 발현하는 균주에서는 분명하게 볼 수 있다.
도 21: pSEC500E_X_Cas9 플라스미드. pAMB1, 씨. 베이제린키의 복제 기원; PxylB, xylB 프로모터; ColE1 기원, 대장균의 복제 기원; AmpR, 암피실린 내성 유전자; PermB, ermB 유전자 프로모터; ermB, 에리쓰로마이신 내성 유전자; 2 마이크론 ori, 효모의 복제 기원; URA3, 영양요구성 마커.
도 22: pS_celAS1 플라스미드. HS1 및 HS2, 상동성 서열; aad9, 스펙티노마이신 내성 유전자; pCB102, 씨. 베이제린키의 복제 기원; ColE1 기원, 대장균에서의 복제 기원. PeglA, eglA 유전자 프로모터.
도 23: 증가되는 농도의 자일로스를 함유하는 CGM 한천 배지 상에서의 씨. 베이제린키 NCIMB8052의 재조합 균주 (pEC500E_Xcas9, pS_celAS1)의 선택.
도 24: celA 유전자가 통합된 NCIMB8052 균주 및 NCIMB8052 균주의 PCR에 의한 확인. M, GeneRuler 1kb DNA 래더(ThermoFisher).
실시예
본 발명자들은 다음의 2종의 표적에 대해서 본 명세서에서 개시하고 청구한 유전자 도구를 시험하였다: upp 및 adhE 유전자.
upp 유전자의 불활성화
선택된 제1 표적은 간단한 스크리닝을 통해서, 디자인된 유전자 변형 기술을 검증할 수 있게 한다. upp 유전자는 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제를 코딩한다. 이 효소는 우라실로부터 우라실 모노포스페이트(UMP)를 형성할 뿐만 아니라, 또한 5-플루오로우라실(5-FU)로부터 5-플루오로우라실 모노포스페이트(5-FUMP)를 형성한다. 5-FUMP는 RNA 합성을 차단하는 세포에 유해한 화합물이다. 결과적으로, 이의 게놈에 upp 유전자를 함유하는 박테리아는 이 유전자를 발현하지 않는 균주와 대조적으로, 5-FU를 함유하는 배지 상에서 성장할 수 없을 것이다.
이 유전자의 표적화는 간단한 표현형 관찰에 의해, 변형 전략이 유효한지 여부를 간단하고 신속하게 결정할 수 있게 한다. upp를 표적으로 하는 3종의 플라스미드를 구축하였다(도 4 + SEQ ID NO: 9, 10 및 11 참조). 이들 3종 모두는 유전자를 표적으로 하는 동일한 gRNA를 함유하고, 이들 중 2종은 또한 결실 또는 점 돌연변이를 생성시키는 도구의 능력을 보여주기 위해 상이한 복구 주형을 함유한다:
● upp_del 주형(SEQ ID NO: 12)은 gRNA에 의해 결정되는 파괴 부위의 각 측면으로부터 150-nt에 위치된 2개의 500-뉴클레오티드(nt) 단편을 함유한다. 파괴를 복구하기 위한 이 주형의 사용은 upp 유전자의 코딩 서열 내에서 300-nt 결실을 야기하여, 후자가 이후에 불활성 단백질을 코딩하게 될 것이다.
● upp_중지 주형(SEQ ID NO: 13)은 Cas9이 불완전하고 불활성인 단백질을 코딩할 유전자를 더이상 표적으로 할 수 없는 방식으로 넌센스 돌연변이(중지 코돈으로의 아미노산을 코딩하는 코돈의 치환을 유도)의 존재에 의해 gRNA 인식 부위에서 변형되는, 파괴 부위의 각 측면 상에 위치된 2개의 650-nt 단편을 함유한다.
pSOL 플라스미드의 상실
선택된 제2 표적은 발효 과정에서 관심 대상이다: 용매형성에 관여하는 유전자 세트, 특히 adhE는 pSOL 메가플라스미드 상에 위치하고, 이의 상실이 아세톤 및 부탄올의 생성을 제거하는 것으로 확인되었다. pSOL 표적화 플라스미드를 사용하는 이들 발효 경로의 제거 후(도 5 참조), 게놈에 직접적으로 관심 유전자를 재도입시키는 것이 가능하다. pSOL을 더이상 함유하지 않는 균주를 획득하기 위해서, adhE를 표적화하기 위한 플라스미드를 구축하였다. 발명자들은 pSOL이 세포에 필수적인 기능을 함유하지 않아, 세포가 이의 존재 없이 생존할 수 있게 된다는 것을 보여주었다.
씨. 아세토부틸리컴 ATCC824에서 cas9 의 항상성 발현
선택된 전략은 2종의 플라스미드의 부수적인 사용을 필요로 한다:
- pEC500E 플라스미드로부터 유래된, 뉴클레아제의 항상성 발현을 위한 벡터:
pEC500E-miniPthl-Cas9 (도 6 + SEQ ID NO: 5 참조);
- pEC750C로부터 유래된, 뉴클레아제 파괴 부위를 결정하고 임의로는 파괴의 복구를 가능하게 하는, 표적화 벡터 중 하나:
● pEC750C-gRNA_upp (SEQ ID NO: 9), upp를 표적으로 하는 gRNA 함유;
● pEC750C-gRNA_upp-upp_del (SEQ ID NO: 10), upp를 표적으로 하는 gRNA 및 upp_del 주형 함유;
● pEC750C-gRNA_upp-upp_중지 (SEQ ID NO: 11), upp를 표적으로 하는 gRNA 및 upp_중지 주형 함유;
● pEC750C-gRNA_adhE (SEQ ID NO: 8), adhE를 표적으로 하는 gRNA 함유.
pEC500E-miniPthl-Cas9 발현 벡터 뿐만 아니라, 빈 벡터에 상응하는 대조군 플라스미드(pEC500E)를 ATCC824 균주에 도입시켰다. 그런 다음, 획득된 2종의 균주를 대조군으로 사용한, pEC750C 벡터로부터 유래된, 표적화 벡터로 형질전환시켰다. 이 제2 형질전환 단계의 결과를 하기 표 1에 표시하였다.
표 1: 형질전환 결과. ++, 획득된 수많은 형질전환체(형질전환 당 102 내지 103 콜로니를 획득함); -, 형질전환체 미획득.
Figure pct00001
획득된 형질전환 결과는 Cas9이 기능성임을 나타내었다. 실제로, 뉴클레아제가 발현되고 upp 유전자가 gRNA에 의해 표적화되는 경우, 게놈 DNA에 야기된 파괴 및 복구 주형의 부재에서 게놈의 복구를 수행하는 박테리아의 불능(pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C-gRNA_upp로 형질전환)으로 인해 형질전환체가 획득되지 않았다.
upp 의 표적화
표적화 벡터가 pEC500E를 함유하는 균주에 도입되는 경우 획득된 결과는, 형질전환체가 각각의 표적화 벡터로 획득되었으므로, ATCC824 균주의 게놈이 cas9 상동체를 함유하지 않는다는 것을 보여준다.
pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C-gRNA_upp-upp_중지를 함유하는 형질전환체를 이후에 수회 비선택적 배지 상에 재플레이팅하여, 함유하고 있는 플라스미드가 상실되게 하였다. 콜로니가 그들 플라스미드를 소거하여 항생제에 민감해 지면, upp 유전자(SEQ ID NO: 3)를 서열분석하였다(도 7 참조).
원하는 변형이 실제로 존재하였다. 따라서 2종의 플라스미드의 도입 및 강력한 항상성 프로모터에 의한 cas9 유전자의 발현을 포함하는 CRISPR-Cas9 유전자 도구는 실제로 기능성이다.
adhE 의 표적화
pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C_gRNA_adhE 플라스미드로의 야생형 균주 형질전환 동안 형질전환체가 획득되었다. cas9가 활성이므로, 이 결과는 pSOL 메가플라스미드의 파괴가 ATCC824의 생존능에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
pSOL의 가능한 상실을 확증하기 위해, 다양한 시험을 수행하였다:
- pSOL 상에 존재하는 유전자: ctfB 의 PCR 검출
catP_fwd x catP_rev를 사용하는 PCR은 pEC750C 플라스미드 상에 존재하는, 티암페니콜 내성 유전자의 검출을 가능하게 한다. 이의 검출은 표적화 벡터가 존재한다는 것을 확증시켜준다.
RH_ctfB_R x V-CTFA-CAC2707_R을 사용하는 PCR은 pSOL 메가플라스미드 상에 존재하는 ctfB 유전자의 일부분의 검출을 가능하게 하고, 후자가 세포에 존재하는지 여부를 알 수 있게 한다.
증폭은 pSOL 메가플라스미드가 pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C-gRNA_adhE 로 형질전환된 클론에 더이상 존재하지 않는다는 것을 나타내는 것으로 보인다(도 8 참조).
- pSOL 상에 존재하는 유전자에 의해 코딩되는 효소 활성의 검출
pSOL 메가플라스미드에 함유된 유전자 중에서, amyP는 α-아밀라제 활성을 갖는 세포외 효소를 코딩한다. 이 활성은 전분 및 포도당을 함유하는 고형 배지 상에서 검출할 수 있다(Sabathe et al., 2002). 액체 배양액의 희석물을 0.2% 포도당 및 2% 전분을 함유하는 한천 플레이트 상에 침적시키고 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음, α-아밀라제 활성을 요오드 염색에 의해 가시화시켰다. 박테리아 콜로니 주변의 투명한 후광은 α-아밀라제 활성의 존재를 나타낸다. pEC500E-miniPthl-cas9 및 pEC750C-gRNA_adhE를 함유하는 ATCC824 주변의 활성 부재는 amyP 유전자가 이 균주에서 발현되지 않는다는 것을 나타내어, 메가플라스미드가 더이상 존재하지 않는다는 것을 확증시켜준다(도 9 참조).
- 발효 결과
2종의 균주의 발효 결과를 확립하기 위해 게이프스(Gapes) 배지에서 24시간 동안 ATCC824 야생형 균주 및 형질전환체를 성장시켰다. 획득된 발효 결과는, 형질전환체에서 adhE, adhE1 및 adc 유전자(pSOL 메가플라스미드 상에 존재)의 부재로 인한 에탄올 생성의 감소 및 부탄올 및 아세테이트 생성의 제거를 보여준다(도 10 참조).
따라서 Cas9는 ATCC824 균주의 천연 플라스미드 또는 염색체 상에서 작용할 수 있어, 균주에 존재하는 염색체 및 임의의 염색체외 유전자 물질(플라스미드, 박테리오파지 등)로 이의 작용을 넓히는 것이 가능하다.
씨. 아세토부틸리컴 ATCC824에서 cas9 의 유도성 발현
게놈과 복구 주형 간의 상동성 재조합 사건을 가능하게 하기 위해, 뉴클레아제가 활성인 세포의 수를 증가시키는 것이 필요하다(pEC500E-miniPthl-cas9을 함유하는 ATCC824 균주를 표적화 벡터로 형질전환시켰을 때 103 까지). 이를 위해서, 뉴클레아제 발현이 제어되는 시스템이 필요하다. pFW0001 벡터로부터 유래된, cas9 유전자가 언히드로테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 위치하는 2개 벡터를 구축하였다:
● pFW0001-Pcm-2tetO1-cas9 (도 11A + SEQ ID NO: 6 참조);
● pFW0001-Pcm-tetO2/1-cas9 (도 11B + SEQ ID NO: 7 참조);
cas9 발현을 제어하는 프로모터는 전사 억제인자 TetR이 결합하는 오퍼레이터 서열, tetO1 및 tetO2를 함유한다. 이 억제는 언히드로테트라사이클린(aTc)의 존재에 의해 풀어진다. 이 시스템은 적은 누수로 제어된 방출을 가능케 한다. aTc의 존재 하에, 합성은 프로모터 Pcm-2tetO1로부터 출발하여 더 높아진다(도 12 참조).
씨. 아세토부틸리컴 ATCC824의 형질전환:
발현 벡터 및 빈 벡터(pFW0001)를 ATCC824에 도입시켰다. 이후에, 하기 플라스미드를 각 유형의 형질전환체에 도입시켰다(표 2 참조):
● pEC750C-gRNA_upp, upp를 표적으로 하는 gRNA 함유;
● pEC750C-gRNA_upp-upp_del, upp를 표적으로 하는 gRNA 및 upp_del 주형 함유;
● pEC750C-gRNA_upp-upp_중지, upp를 표적으로 하는 gRNA 및 upp_중지 주형 함유;
형질전환된 콜로니는 상이하게 희석하여, 다양한 고형 배지 상에 스트리킹하였다:
● 2YTG + 에리쓰로마이신 (세포 생존능 확인을 위함, 106의 희석 배수);
● 2YTG + 에리쓰로마이신 + 티암페니콜 (형질전환체의 선택을 위함);
● 2YTG + 에리쓰로마이신 + 티암페니콜 + aTc(200 ng/mL) (유도인자 존재 하 형질전환체의 선택을 위함).
표 2: 각각의 형질전환을 위한 각 유형의 배지에서 획득한 콜로니 수.
ery, 에리쓰로마이신. thiam, 티암페니콜. aTc, 언히드로테트라사이클린. 괄호 안, 희석 배수. ND, 희석하지 않음. -, 시험하지 않음.
Figure pct00002
빈 표적화 벡터(pEC750C, 대조군)가 사용된 경우에도, 존재하는 경우에 소수의 형질전환체가 획득되었으므로, aTc의 독성 효과가 관찰되었다. 예상한 바와 같이, gRNA_upp 카세트를 함유하는 pEC750C가 aTc 함유 배지 상에서 cas9을 발현하는 세포에 도입되었을 때 형질전환체가 획득되지 않았다. 다른 한편으로, aTc가 없는 배지 상에서 각 플라스미드 조합에 대해 많은 형질전환체가 획득되었는데, 이는 cas9이 발현되지 않음을 나타낸다.
aTc의 존재 하에서의 Cas9 발현:
에리쓰로마이신 및 티암페니콜을 함유하는 플레이트 상에서 획득된 다양한 변이체를 동일한 유형의 배지 상에 재플레이팅한 후, 항생제 둘 모두를 함유하는 액체 사전배양물을 접종하는데 사용하였다. 그런 다음, 이들 사전배양물을 시스템이 기능성인지 여부를 결정하기 위해 다양한 농도의 aTc를 함유하는 다른 액체 배양물을 접종하는데 사용하였다.
cas9의 유도:
3종의 형질전환체를 aTc의 존재 하에 cas9 발현을 유도하는 능력을 분석하는데 사용하였다:
pFW0001 및 pEC750C-gRNA_upp를 함유하는 ATCC824;
pFW0001-Pcm-2tetO1-cas9 및 pEC750C-gRNA_upp를 함유하는 ATCC824;
pFW0001-Pcm-tetO2/1-cas9 및 pEC750C-gRNA_upp를 함유하는 ATCC824
에리쓰로마이신, 티암페니콜 및 상승 농도의 aTc를 함유하는 액체 배지를 이들 형질전환체의 액체 사전배양물로부터 접종하였다(도 13 참조). 성장하는 세포의 능력은 72시간의 배양 후 광학 밀도의 측정을 통해 평가하였다.
뉴클레아제를 발현하지 않는 형질전환체는 aTc의 존재에 의해 약간의 영향을 받거나 또는 전혀 영향받지 않았다. 한편, 낮은 aTc 농도에서도, 프로모터 Pcm-2tetO1를 통해 cas9를 발현하는 플라스미드(pFW0001-Pcm-2tetO1-cas9) 및 오직 gRNA만을 함유하는 플라스미드(pEC750C-gRNA_upp)를 함유하는 형질전환체는 상당한 성장 지연을 나타냈다. 프로모터 Pcm-tetO2/1를 통해 cas9을 발현하는 플라스미드(pFW0001-Pcm-tetO2/1-cas9) 및 gRNA 만을 함유하는 플라스미드(pEC750C-gRNA_upp)를 함유하는 형질전환체는 낮은 aTc 농도에서 영향받지 않았다.
그러나, 150 ng/mL에서 출발하여, 강력한 성장 지연이 관찰되었고, 300 ng/mL에서 성장이 관찰되지 않았다. 따라서, 프로모터 Pcm-tetO2/1은 유도인자 부재 하에서 Pcm-2tetO1 보다 더 양호한 발현 억제를 가능하게 하는 것으로 보인다.
돌연변이체의 생성
이중 가닥 파괴를 복구하기 위한 표적화 플라스미드를 함유하는 형질전환체의 액체 배양물을 aTC의 부재 또는 존재(100 ng/mL) 하에서 제조하였다. 사용된 형질전환체는 표 3에 표시된 12개 플라스미드 조합 중 하나를 함유하였다.
표 3: 형질전환체에 존재하는 플라스미드 조합.
Figure pct00003
72시간 배양 후, 분취액을 다양한 배지 상에 침적시켰다:
● 티암페니콜 및 에리쓰로마이신을 함유하는 2YTG;
● 티암페니콜, 에리쓰로마이신, 및 100 ng/mL의 aTc를 함유하는 2YTG;
● 5-플루오로우라실을 함유하는 2YTG.
상동성 재조합 사건이 복구 주형의 삽입을 가능하게 하는 형질전환체만이 2YTG + 5-FU 상에서 성장할 수 있었다(도 14 참조).
upp_del 형질전환체의 분석:
2YTG + 5-FU 상에서 단리된 클론을 PCR에 의해 분석하였다(도 15 참조).
catP_fwd x catP_rev를 사용하는 PCR은 pEC750C 플라스미드 상에 존재하는 티암페니콜 내성 유전자의 검출을 가능하게 한다. 이의 검출은 표적화 벡터가 존재함을 확증시켜준다.
LHA_upp_fwd x RHA_upp_rev를 사용하는 PCR은 upp 유전자 뿐만 아니라 측접 영역의 증폭을 가능하게 한다. 하기에 표시된 프라이머를 upp_del 복구 주형의 구축에 사용하였다(도 15 + SEQ ID NO: 14-21 참조):
표 4:
Figure pct00004
upp_주형_fwd x upp_주형_rev를 사용하는 PCR은 upp_del 복구 주형이 부재하는, upp 유전자의 내부 단편의 증폭을 가능하게 한다.
획득된 결과는 분석된 형질전환체의 upp 유전자 내 결실을 확증시켜주었다.
upp_중지 돌연변이체의 분석:
upp 유전자를, aTc에 노출 후 2YTG+5-FU 상에서 단리된 3종의 클론에서 서열분석하였다(도 16 참조):
● 프로모터 Pcm-2tetO1를 통해 cas9을 발현하는 플라스미드(pFW0001-Pcm-2tetO1-cas9) 및 gRAN 뿐만 아니라 upp_중지 복구 주형을 함유하는 플라스미드(pEC750CgRNA_upp-upp_중지)를 함유하는 첫번째;
● 프로모터 Pcm-tetO2/1를 통해 cas9을 발현하는 플라스미드(pFW0001-Pcm-tetO2/1-cas9) 및 gRNA 뿐만 아니라 upp_중지 복구 주형을 함유하는 플라스미드(pEC750CgRNA_upp-upp_중지)를 함유하는 두번째.
따라서 제2 플라스미드에 존재하는 gRNA 및 유도성 프로모터의 제어 하의 cas9 유전자의 사용에 의해 유전자 변형 시스템을 개발하고자 하는 전략은 기능적이다. 항상성 프로모터 miniPthl의 사용과 비교하여, cas9 유전자의 유도는 효소의 작용을 제어하고 원하는 변형을 거친 형질전환체의 선택을 촉진시킬 수 있다.
오페론 ipa8로의 upp 유전자의 치환
만들어진 변형은, thl 유전자의 항상성 프로모터의 제어 하에 ATCC 824 균주의 adc, ctfA, ctfB 유전자(생성된 산의 재동화 및 아세톤의 형성을 가능하게 함) 및 씨. 베이제린키 DSM6423 유래의 adh 유전자(이소프로판올로의 아세톤의 전환을 가능하게 함)를 함유하는 오페론 ipa8의 씨. 아세토부틸리컴 ATCC 824 게놈 내로의 삽입으로 이루어진다. 이러한 3614-bp 오페론이 upp 유전자 대신 삽입된다.
upp 유전자의 각 측면 상에 위치된 1-kb 서열이 측접된 오페론으로 구성된 복구 주형을 pEC750-gRNA_upp 플라스미드에 삽입하여, pEC750C-gRNA_upp-Δ upp::ipa8 플라스미드를 획득하였다(도 17 및 SEQ ID NO: 26 참조).
이 플라스미드를 pFW0001-Pcm-tetO2/1-cas9 플라스미드를 함유하는 컴피턴트 ATCC 824 세포에 도입시켰다. cas9 발현의 유도는 티암페니콜, 에리쓰로마이신, 및 유도인자 aTc를 함유하는 2YTG 배지 상에서 수행하였다.
획득된 콜로니는 ATCC824 균주에서 2720-bp 생성물의 증폭을 가능하게 하는 프라이머 쌍 CA_C2877 및 CA_C2882를 사용하여 PCR에 의해 분석하였다:
CA_C2877: 5'-CTTTTTAAAAAAGTTAAATAAGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 27);
CA_C2882: 5'-GTTTAACTTAAGTTACAGAAAAGCTAGG-3' (SEQ ID NO: 28)
유도 후 획득된 4종의 독립 콜로니 및 다양한 대조군에 대해 수행된 PCR 검정의 결과는 ipa8 오페론으로의 upp 유전자의 치환을 확증시켜주었다(도 18).
획득된 돌연변이체 뿐만 아니라, WT 균주 및 Δupp 돌연변이체(대조군으로서 사용)에 대해서 72시간 동안 34℃ 및 150 rpm에서 게이프스 배지(Gapes et al., 1996) 중에서 발효를 수행하였다. 발효 상청액은 내부 표준물로서 0.5 g/L 프로판올 용액을 사용하여 HPLC를 통해 분석하였다. 탄수화물 농도는 굴절률 검출기(Varian 350 RI)가 장착된 Aminex®HXP-87P 컬럼(Biorad, 300 mm × 7.8 mm) 상에서 정량하였다. 컬럼 온도는 80℃였고 용리액은 0.4 mL/분의 유속의 황산으로 이루어졌다(Spectra System RI 150).
획득된 결과는 Δupp::ipa8 돌연변이체가 WT 균주 또는 Δupp 돌연변이체와 대조적으로 아세톤을 이소프로판올로 환원시킬 수 있다는 것을 보여주었다(도 19).
클로스트리듐 베이제린키 NCIMB8052의 게놈 내로의 celA 유전자의 삽입
만들어진 변형은, 클로스트리듐 사카로부틸리컴 NCP262 유래의 eglA 프로모터의 제어 하에 네오칼리마스틱스 파트리시아럼(Neocallimastix patriciarum) 유래의 celA 유전자의 씨. 베이제린키 NCIMB8052 게놈 내로의 삽입으로 이루어진다. 이 유전자는 CMC(카복시메틸 셀룰로스)라고 불리는, 셀룰로스 기질을 분해할 수 있는 효소를 코딩한다. 1667 bp 크기의 유전자 및 이의 프로모터를 hbd 유전자 이후에 삽입시켰고, 이 균주가 CMC를 분해할 수 있게 된다(도 20, Lopez-Contreras et al., 2001).
이러한 삽입을 수행하기 위해, 2종의 플라스미드를 사용하였다:
- pEC500E_X_cas9 플라스미드: 클로스트리듐 디피실 630 유래의 xylB 유도성 프로모터의 제어 하에서 cas9 유전자를 발현함(Nariya et al., 2011)(도 21 및 SEQ ID NO: 29 참조).
- xylB 프로모터의 제어 하에서 가이드 RNA를 발현하고 씨. 베이제린키 NCIMB8052 유래의 hbd 유전자를 표적으로 하는 pS_XR_celAS1 플라스미드. 이 플라스미드는 또한 가이드 RNA가 표적으로 하는 영역의 각 측면에 위치하는 1001 및 1017개 염기쌍의 2개 상동성 영역이 측접된, egl2 프로모터의 제어 하의 celA 유전자로 이루어진 복구 주형을 함유한다(도 22 및 SEQ ID NO: 30 참조).
이들 2종의 플라스미드를 순차적으로 NCIMB8052에 도입시켰다. cas9 발현의 유도는 스펙티노마이신 및 에리쓰로마이신 뿐만 아니라 상승 농도의 자일로스 유도인자를 함유하는 CGM(6.25 g/L 효모 추출물; 0.5 g/L MgSO4·7H2O; 0.95 g/L KH2HPO4; 0.95 g/L K2HPO4; 0.013 g/L MnSO4·7H2O; 0.013 g/L FeSO4·7H2O; 1.25 g/L NaCl; 2.5 g/L (NH4)2SO4; 2.5 g/L 아스파라긴) 상에서 수행하였다(도 24).
6% 자일로스를 함유하는 CGM 상에서 유도 후 획득된 콜로니는 NCIMB8052 균주에서 2070-염기쌍 생성물 및 celA 유전자를 통합한 경우 3718-염기쌍 생성물의 증폭을 가능하게 하는 프라이머 쌍 Cbei_325_F 및 Cbei_325_R을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다:
Cbei_325_F (celA) 5' - AGATAATTATGAAGTTAATCCTTAG - 3'(SEQ ID NO: 31)
Cbei_326_R (celA) 5' - CATTTGCTTTCAGGTCTTCTTTTGCTG - 3'(SEQ ID NO: 32)
대조군 균주 및 유도 후 획득된 독립 콜로니에 대해 수행된 PCR 검정의 결과는, NCIMB8052 내로의 celA 유전자의 삽입을 확증시켜주었다(도 25).
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Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val 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gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640 aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700 acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760 ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820 actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880 aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940 taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000 tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060 atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120 aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180 cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240 gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300 cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360 gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420 tattcagtcc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> upp_del <400> 12 catgaagata gcaataggta gtgatcatgc aggattttca ttgaaaaagg aagttataaa 60 acatttagag agtaaaaata ttgaggttaa agattttggc actctaactg atgaatcatg 120 tgattatcca gattatgcat taaaagtagc agaggaagtt gctcaaaaaa actttgagtt 180 tggaatactc atttgtggaa caggtatagg aataagcata tcagcaaata aggtgccagg 240 aataagagca gctgtatgta cagatacatt ctgtgctcat gcatcaagag aacataacaa 300 tgcaaatata cttgcaatgg gagaaagagt tgtaggacct ggattagcaa ttgatatagt 360 agatacattt ttaaattcaa aatttcaggg agataggcat caaagaagaa tagacaagat 420 tacacaaata gaaaaaaaat acaatggagg aatgaaataa tgagtaaagt tacacaaata 480 tcacatccac ttatattaca caaacttcct caagatatag aggaaagaga cataatagta 540 actgatccaa tgcttgcaac tggtgggtca gcaatagatg caataacact tcttaagaaa 600 agaggagcaa aatacataag acttatgtgt cttataggag caccagaagg tatagcagca 660 gtacaagaag cacatccaga tgtagatata tacctcgcat caatagatga aaagttagat 720 gaaaatggat atatagttcc tggtcttgga gatgctggag atagattatt cggtacaaaa 780 taaattgcat aaataaaaag ggctgaaaaa 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cgaatgtatt ttgcatattt cagtatcttt aataaactct ttgcaatttt tacaagtttt 8640 catatacgcc cttcttttca taaattaatt tatgaattct atgtattcca aggagctttt 8700 taaagctccc cctttcgtac tacttagcta caagcactat aaaagtcata atgtttactg 8760 ctaaagtcaa taatgatatt gctaatacct tgttatttga taagatactg ctttcctctg 8820 tcactttgct cacccccttt cattttcata aattaattat gaaaaaataa atatacttct 8880 aatttttatc aaataaaaaa gcctttgcgt actgcttcca atacacaaag gctataaact 8940 tctaaatctt acttattgca atttacattt atatctgtta agataatctc ataaattgaa 9000 tatatatagt taatgtttct cttgtatgtc ggtacatttg aaatattgct atagatagag 9060 ttctctaacg gcttgatgtg ttggtagcac atttaagttt tggcttatat actaagttgg 9120 tagcttaata tataagagct gaggacttat ttttttatta aatttttcaa cttgtctata 9180 ttttaacccg taattgaata cataacaagt attttttttt gtattcaatt aaacattcat 9240 aaatgagtat aattaatcat actaaattct ataattttct tttctgtaaa tttctttcta 9300 ttcagcactg ttatgccttt tgactatcac ttaataaaaa ataagaaatg aattgtcaat 9360 tgttcaa 9367 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 agataattat gaagttaatc cttag 25 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 catttgcttt caggtcttct tttgctg 27

Claims (15)

  1. 클로스트리듐(Clostridium) 속의 용매형성성(solventogenic) 박테리아의 상동성 재조합에 의한 형질전환을 가능하게 하는 유전자 도구로서,
    - 적어도 Cas9을 코딩하는 제1 핵산으로서, 여기서 Cas9 코딩 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인 제1 핵산, 및
    - 상동성 재조합 기전에 의해, Cas9-표적화 박테리아 DNA의 일부분의 관심 서열로의 치환을 가능하게 하는 복구 주형을 함유하는 적어도 제2 핵산
    을 포함하는 것을 특징으로 하고, i) 상기 핵산 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 더 코딩하거나, 또는 ii) 유전자 도구는 하나 이상의 가이드 RNA를 더 포함하며, 각각의 가이드 RNA는 Cas9-효소-결합 RNA 구조, 및 박테리아 DNA의 표적화 부분에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 서열은 프로모터가 선행되고 상기 프로모터 또는 Cas9 제어 프로모터는 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 박테리아 DNA의 표적화 부분은 박테리아 생존에 필수적인 유전자 또는 유전자 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아는 씨. 아세토부틸리컴(C. acetobutylicum), 씨. 셀룰롤리티컴(C. cellulolyticum), 씨. 피토퍼멘탄스(C. phytofermentans), 씨. 베이제린키(C. beijerinckii), 씨. 사카로부틸리컴(C. saccharobutylicum), 씨. 사카로퍼부틸아세토니컴(C. saccharoperbutylacetonicum), 씨. 스포로제네스(C. sporogenes), 씨. 부티리컴(C. butyricum), 씨, 아우란티부티리컴(C. aurantibutyricum) 및 씨. 티로부티리컴(C. tyrobutyricum)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  5. 제4항에 있어서, 용매형성성 박테리아가 씨. 아세토부틸리컴일 때, 상기 씨. 아세토부틸리컴 박테리아는 ATCC824 균주이고, 용매형성성 박테리아가 씨. 베이제린키일 때, 상기 씨. 베이제린키 박테리아는 DSM 6423 균주인 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 단백질은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 프로모터는 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 DNA 서열은 용매의 생성을 촉진하는 적어도 하나의 생성물, 전형적으로 알데하이드에서 알코올로의 전환에 관여하는 적어도 하나의 효소, 막 단백질, 전사 인자, 또는 이의 조합을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 도구 내에 존재하는 각각의 핵산은 별개의 발현 카세트 또는 별개의 벡터, 예를 들어 플라스미드에 속하는 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
  10. 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 상동성 재조합에 의해 형질전환시키기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 도구를 박테리아에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 적어도 하나의 유도성 프로모터를 포함하는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 도구를 박테리아에 도입시키는 단계, 및
    b) 박테리아를 유전자 변형시키기 위해 유도성 프로모터의 발현을 유도시키는 단계.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 존재하는 경우 단계 b) 이후에, i) 이미 도입된 것 또는 이미 도입된 것들과 상이한 복구 주형, 및 ii) 박테리아의 게놈의 표적화 구역으로 그들의 통합을 가능하게 하는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 n번째 핵산을 도입시키는 하나 이상의 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하고, 각각의 추가 단계는 이전에 도입시킨 복구 주형을 코딩하는 핵산을 제거하는 단계, 바람직하게는 이전에 도입시킨 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 서열을 제거하는 단계가 선행되는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 형질전환된 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 도구의 성분 및 임의로는 도구 내에서 사용되는 선택된 유도성 프로모터(들)에 적합화된 하나 이상의 유도인자를 포함하는, 클로스트리듐 속의 박테리아를 형질전환시키거나 또는 클로스트리듐 속의 박테리아를 사용하여 적어도 하나의 용매를 생성시키기 위한 키트.
  15. 산업적 규모로 용매 또는 용매의 혼합물, 바람직하게는 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 이소프로판올/부탄올 혼합물의 생성을 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 도구, 제10항 또는 제11항에 따른 방법, 또는 제12항의 방법에 따라 형질전환된 박테리아의 용도.
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