FR3111642A1 - Souches de bacteriesclostridiumresistantes au 5-fluorouracile, outils genetiques et utilisations de ceux-ci - Google Patents
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Abstract
SOUCHES DE BACTERIE CLOSTRIDIUM RESISTANTES AU 5-FLUOROURACILE, OUTILS GENETIQUES ET UTILISATIONS DE CEUX-CI
La présente invention concerne des bactéries recombinantes du genre Clostridium résistantes au 5-fluorouracile (5-FU), les outils et procédés permettant leur obtention, ainsi que les utilisations desdites souches recombinantes et desdits outils, notamment pour modifier génétiquement une bactérie du même genre. L’invention concerne également les procédés de modification génétique d’une bactérie du genre Clostridium comprenant une étape de transformation d’une bactérie recombinante selon l’invention.
Description
La présente invention concerne la modification génétique de bactéries, plus particulièrement de bactéries appartenant au genreClostridium, par exemple de bactéries solvantogènes. Elle concerne plus particulièrement des bactéries recombinantes résistantes au 5-fluorouracile (5-FU) appartenant au genreClostridium, les outils et procédés permettant leur obtention, ainsi que les utilisations desdites souches recombinantes et desdits outils, notamment pour modifier génétiquement une bactérie du même genre. L’invention concerne également l’utilisation, comme gène(s) marqueur(s) dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genreClostridium, de plusieurs gènes choisis parmi les gènesupp, udpet/ouudk, et les procédés de modification génétique d’une bactérie du genreClostridiumcomprenant une étape de transformation d’une bactérie recombinante selon l’invention.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Le genreClostridiumcontient des bactéries à Gram positif, anaérobies strictes et sporulantes, appartenant au phylum des Firmicutes. LesClostridiasont un groupe d’importance pour la communauté scientifique pour plusieurs raisons. La première est qu’un certain nombre de maladies graves (e.g. tétanos, botulisme) sont dues à des infections de membres pathogènes de cette famille (John & Wood, 1986 ; Gonzaleset al., 2014). La deuxième est la possibilité d’utiliser des souches dites acidogènes ou solvantogènes en biotechnologie (Moonet al., 2016). CesClostridia, non pathogènes, ont naturellement la capacité de convertir une variété importante de sucres pour produire des espèces chimiques d’intérêt, et plus particulièrement de l’acétone, du butanol, et de l’éthanol (John & Wood, 1986) au cours d’un processus nommé fermentation ABE. De manière similaire, la fermentation IBE est possible chez certaines espèces particulières, capables de réduire en proportion variable l’acétone en isopropanol (Chenet al., 1986, Georgeet al., 1983) grâce à la présence dans le génome de ces souches de gènes codant des alcool déshydrogénases secondaires (s-ADH ; Ismaelet al., 1993, Hiuet al., 1987).
Bien qu’utilisées en industrie depuis plus d’un siècle, les connaissances sur ces bactéries ont longtemps été limitées par les difficultés rencontrées pour les modifier génétiquement. Différents outils génétiques ont été conçus au cours des dernières années pour optimiser les souches de ce genre, la dernière génération étant basée sur l’utilisation de la technologie CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR-associated protein).
C. beijerinckiiDSM 6423 est une souche solvantogène du genreClostridiumqui a la particularité de produire de l’isopropanol, en mélange avec du n-butanol et de l’éthanol (métabolisme IBE). Cette capacité la rend intéressante pour la production de biocarburants avancés ou pour la chimie verte.
Jusqu’à encore récemment, peu d’informations étaient disponibles sur cette souche, ce qui limitait son utilisation. Les inventeurs ont récemment mis au point des outils et méthodes décrits dans le brevet EP3 362 559 et dans les demandes EP3 578 662, PCT/FR2019053227 et FR19/05485 permettant de modifier de façon ciblée le génome des bactéries appartenant au genreClostridium, dont ce microorganisme. L’une des preuves de concept employées par les inventeurs pour démontrer l’efficacité de leurs outils et méthodes consistait à supprimer le gèneupp(CIBE_0562 – SEQ ID NO : 1) codant une uracile phosphoribosyltransférase. Ce gène est un orthologue du gène CA_C2879 (SEQ ID NO : 5) provenant deC. acetobutylicumATCC 824, une espèce voisine. D’après la demande de brevet WO2008/040387 (2006), l’inactivation de CA_C2879 entraîne chezC. acetobutylicumune résistance au 5-fluorouracile (5-FU), un analogue organofluoré de l’uracile, car Upp permet la conversion du 5-FU en 5-Fluorouridine monophosphate (5-FUMP), un composé toxique pour la cellule bactérienne qui interfère notamment avec la synthèse d’ARN. Il est ainsi envisageable de remplacer le gèneupppar une séquence nucléique d’intérêt, la souche recombinante devenant capable de croître en milieu liquide ou gélosé contenant du 5-FU. Toutefois, comme ont pu le constater les inventeurs, chezC. beijerinckiiDSM 6423, l’inactivation du gène CIBE_0562 ne permet pas d’obtenir une souche résistante au 5-FU (cf. FR 19/05485 et exemple 1 de la partie expérimentale).
Peu de marqueurs de contre-sélection ont été développés pour les bactéries du genreClostridium, notamment pourC. beijerinckii(Josephet al., 2018 ; Littleet al., 2018 ; Wenet al., 2020), et aucun ne l’a été pour la souche naturellement productrice d’isopropanol DSM 6423. L’identification d’un tel marqueur et la mise au point de nouveaux outils permettant de l’utiliser seraient particulièrement utiles pour faciliter la sélection des souches recombinantes et, d’une manière générale, la modification du génome des bactéries appartenant au genreClostridium.
La présente invention décrit des bactéries recombinantes résistantes au 5-fluorouracile (5-FU) ainsi que les outils et procédés permettant leur obtention et leur manipulation. Elle facilite ainsi considérablement et de manière très avantageuse la sélection des souches recombinantes d’intérêt, et donc l’exploitation, en particulier à l’échelle industrielle, des bactéries appartenant au genreClostridium.
Les inventeurs décrivent, dans le contexte de la présente invention, des bactéries recombinantes appartenant au genreClostridium, en particulier à l’espèceClostridium beijerinckii, avantageusement capables de croître en présence de 5-fluorouracile (5-FU).
Ils décrivent ainsi pour la première fois une bactérie recombinante du genreClostridiumrésistante au 5-fluorouracile (5-FU) caractérisée en ce qu’elle est dépourvue d’au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU, en particulier une bactérie recombinante appartenant à l’espèceClostridium beijerinckii.
Ils décrivent aussi le procédé permettant d’obtenir une telle bactérie recombinante et l’utilisation de ladite bactérie recombinante dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genreClostridium, par exemple pour fabriquer une bactérie dérivée, modifiée génétiquement, de préférence utilisable à l’échelle industrielle pour produire un solvant ou un mélange de solvants.
Un procédé particulier décrit par les inventeurs permet la modification génétique d’une bactérie du genreClostridium. Il comprend une ou plusieurs étapes de transformation d’une bactérie du genreClostridiumà l’aide d’un ou plusieurs acides nucléiques comprenant une séquence ciblant et inactivant les gènesuppetudp, permettant de rendre ladite bactérie résistante au 5-fluorouracile (5-FU). Sont également décrites les bactéries recombinantes du genreClostridiumrésistantes au 5-fluorouracile (5-FU) caractérisée en ce qu’elles ont été obtenues par un tel procédé.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique utilisé pour transformer une bactérie du genreClostridiumcomprend une séquence ciblant et inactivant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le gèneuppet le gèneudpet/ou le gèneudkde la bactérie, ladite bactérie du genreClostridiumcomprenant de préférence au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU et étant de préférence sélectionnée parmiC. beijerinckii,C. saccharoperbutylacetonicum,C. saccharobutylicum,C. botulinum,C. perfringens,C. diolis,C. taeniosporumetC. butyricum.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l’acide nucléique utilisé pour transformer une bactérie du genreClostridiumcomprend une séquence permettant l’insertion d’un intron dans le gèneupp, le gèneudpet/ou le gèneudkde la bactérie, ladite bactérie du genreClostridiumcomprenant de préférence au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU et étant de préférence sélectionnée parmiC. beijerinckii,C. saccharoperbutylacetonicum,C. saccharobutylicum,C. botulinum,C. perfringens,C. diolis,C. taeniosporumetC. butyricum.
Dans le contexte de la présente invention, le procédé de modification génétique de la bactérie est de préférence l’un de ceux mis au point par les inventeurs décrits dans le brevet EP 3 362 559 et dans les demandes EP 3 578 662 et FR18 73492.
La présente description vise par ailleurs l’utilisation des gènesupp,udpet/ouudkcomme marqueur(s) de contre-sélection, typiquement en présence de 5-FU, dans un procédé de modification génétique d’une bactérie recombinante du genreClostridiumselon l’invention.
Les inventeurs décrivent aussi un procédé avantageux de modification génétique d’une bactérie du genreClostridiumcomprenant une étape de transformation d’une bactérie recombinante du genreClostridiumtelle que décrite dans le présent texte à l’aide d’un acide nucléique comprenant une séquence permettant la modification, par un mécanisme de recombinaison homologue, du matériel génétique de la bactérie par mutation, insertion ou délétion d’une séquence d’intérêt.
Les inventeurs décrivent aussi un kit pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genreClostridium, ou pour produire au moins un solvant, par exemple un mélange de solvants, à l’aide d’une telle bactérie. Ils décrivent également l’utilisation d’un tel kit ou de l’un ou de plusieurs des éléments de ce kit, pour la mise en œuvre d’un procédé décrit dans le présent texte de transformation, et idéalement de modification génétique, d’une bactérie appartenant au genreClostridium, et/ou pour la production de solvant(s) ou de biocarburant(s), ou de mélanges de ceux-ci, de préférence à l’échelle industrielle, à l’aide d’une bactérie recombinante selon l’invention. Ce kit comprend de préférence une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte et du 5-FU.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les méthodes classiques de modification génétique basées sur l'intégration dans le génome de fragments d’ADN linéaires et qui fonctionnent bien dans de nombreux micro-organismes tels queE. coliou la levure ne sont pas réalisables dans les bactéries du genreClostridium, ce qui a considérablement limité les possibilités de modification génétique de ces micro-organismes. En effet, outre les faibles efficacités de transformation de ces bactéries, la demi-vie d’un acide nucléique à recombiner est faible en raison de la présence de nucléases dégradant les acides nucléiques exogènes, tandis que l'efficacité (fréquence) de la recombinaison dans ce genre bactérien est particulièrement faible. Par exemple, la soucheC. beijerinckiiDSM 6423 souffre naturellement d’une efficacité de transformation très faible (inférieure à 5 colonies/µg de plasmide préparé dans une souche d’Escherichia coliDam+ Dcm+), et il serait vain de tenter l’intégration directe par double événement de recombinaison homologue d’un fragment d’ADN linéaire dans le génome de ce micro-organisme.
Très récemment, les inventeurs ont mis au point des outils et méthodes, décrits dans le brevet EP3 362 559 et dans la demande EP3 578 662 ainsi que dans les demandes PCT/FR2019053227 et FR19/05485, permettant de modifier de façon ciblée le génome de ce microorganisme. Ils ont en particulier décrit un outil faisant intervenir la technologie CRISPR-Cas comprenant deux acides nucléiques, l’un contenant les éléments génétiques permettant l’expression contrôlée de la nucléase Cas (qui réalise une coupure double brin au sein d’une molécule d’acide nucléique), et l’autre au moins un ARN guide (ARNg) ciblant la région d’ADN à modifier ainsi qu’une matrice de réparation. De manière préférée (cf. EP 3 578 662), au moins l’un desdits acides nucléiques comprend en outre une séquence codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. L’outil génétique peut autrement comprendre en outre un troisième acide nucléique codant une protéine anti-CRISPR de préférence placée sous le contrôle d’un promoteur inductible.
Les inventeurs ont construit la souche C. beijerinckii IFP962 ∆upp qui est un mutant de la souche DSM 6423 dans laquelle le gène upp (CIBE_0562, SEQ ID NO : 1) a été inactivé (cf. Figure 1). Les inventeurs ont pu constater que, contrairement à ce qui est observé chez C. acetobutylicum ATCC 824 suite à l’inactivation du gène upp (brevet WO2008/040387), les mutants C. beijerinckii DSM 6423 ∆upp obtenus restent sensibles au 5-fluorouracile (5-FU) (cf. ), du fait de l’accumulation de 5-Fluorouridine monophosphate (5-FUMP) qui entraîne un important effet cytotoxique conduisant à l’arrêt de la croissance de la cellule (mort cellulaire). Un schéma illustrant cette voie métabolique toxique est détaillé en .
L’uracile est un intermédiaire métabolique de la voie de sauvetage des pyrimidines permettant de recycler les bases pyrimidiques Cytosine (C) et Uracile (U).
Les inventeurs sont, de manière très avantageuse, parvenu à mettre au point une bactérie recombinante du genreClostridiumrésistante au 5-fluorouracile (5-FU) caractérisée en ce qu’elle est dépourvue d’au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU.
Cette bactérie recombinante du genreClostridiumest typiquement une souche comprenant à l’état sauvage au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU, par exemple deux, trois, quatre ou cinq gènes responsables d’une telle production.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie recombinante du genreClostridiumest la bactérieC. botulinumou la bactérieC. perfringens.
Dans un mode de réalisation préféré, la bactérie recombinante du genreClostridiumest sélectionnée parmiC. beijerinckii,C. saccharoperbutylacetonicum,C. saccharobutylicum,C. botulinum,C. perfringens,C. diolis,C. taeniosporumetC. butyricum. Elle est de préférence sélectionnée parmiC. beijerinckii,C. saccharoperbutylacetonicum,C. diolisetC. butyricum.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré, la bactérie recombinante du genreClostridiumest une bactérie sensible à un antibiotique appartenant à la classe des amphénicols tel que par exemple le chloramphénicol, le thiamphénicol, l’azidamfénicol ou le florfénicol, de préférence au chloramphénicol et/ou au thiamphénicol, par exemple une bactérie n’exprimant plus une amphénicol-O-acetyltransférase, par exemple une bactérie exprimant à l’état sauvage le gènecatB, et dépourvue dudit gènecatBou incapable d’exprimer ledit gènecatB.
Une bactérie particulièrement préférée appartient à l’espèceC. beijerinckii.
La bactérieC. beijerinckiipeut être une bactérie sensible au thiamphénicol tel que par exemple la soucheC. beijerinckiienregistrée le 6 décembre 2018 sous le numéro de dépôt LMG P-31151 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique), ou la soucheC. beijerinckiienregistrée le 20 février 2019 sous le numéro de dépôt LMG P-31277 auprès de la BCCM.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie modifiée génétiquement grâce à un procédé décrit dans le présent texte, est une bactérie du genreClostridiumn’exprimant pas le gèneuppet l’un ou l’autre des gènesudpetudk, caractérisée en ce qu’elle est en outre sensible à un antibiotique appartenant à la classe des amphénicols comme décrit ci-dessus.
La description vise, à côté des bactéries recombinantes selon l’invention, toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celles-ci, par exemple toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée restant résistante au 5-FU.
Les inventeurs ont découvert l’existence de plusieurs enzymes capables de métaboliser le 5-FU au sein de bactéries appartenant au genreClostridiumet sont parvenus à mettre au point un procédé permettant d’obtenir des bactériesClostridiumrecombinantes résistantes au 5-FU.
Un procédé particulier de modification génétique d’une bactérie du genreClostridiumdécrit par les inventeurs comprend une étape de transformation d’une bactérie du genreClostridiumà l’aide d’un acide nucléique permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de rendre ladite bactérie résistante au 5-fluorouracile (5-FU). Ce procédé comprend typiquement les étapes d’une méthode décrite dans le brevet EP3 362 559 ou dans la demande EP3 578 662.
Le terme « transformation » fait référence à l'incorporation d'acide nucléique exogène par une cellule, cette acquisition de nouveaux gènes étant transitoire (si l’acide nucléique exogène porteur des gènes peut par la suite être éliminé) ou permanente (dans le cas où l’acide nucléique exogène est intégré dans l’ADN de la cellule hôte).
L'expression "recombinaison homologue" fait référence à l'événement de substitution d'un segment d'ADN par un autre qui possède des régions identiques (homologues) ou presque.
Un procédé préféré comprend une étape de transformation d’une bactérie du genreClostridiumtelle que décrite dans le présent texte à l’aide de tout ou partie d’un outil de modification (également identifié dans le présent texte en tant que «séquence exogène» ou «acide nucléique exogène») par recombinaison homologue caractérisé typiquement i) en ce qu’il comprend au moins :
- un « premier » acide nucléique codant au moins une endonucléase d’ADN, par exemple l’enzyme Cas9, dans lequel la séquence codant l’endonucléase d’ADN est placée sous le contrôle d’un promoteur, et
- au moins un « deuxième » acide nucléique contenant une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement d’une portion de l’ADN bactérien ciblée (« séquence d’ADN cible ») par l’endonucléase par une « séquence d’intérêt »,
en ce que ii) au moins l’un desdits acides nucléiques code en outre un ou plusieurs ARN guides (ARNg) ou en ce que l’outil génétique comprend en outre un ou plusieurs ARN guides, chaque ARN guide comprenant une structure ARN de fixation à l’endonucléase d’ADN et une séquence complémentaire de la portion ciblée de l’ADN bactérien, et de préférence iii) en ce que au moins l’un desdits acides nucléiques comprend en outre une séquence codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible, ou en ce que l’outil génétique comprend en outre un troisième acide nucléique codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible.
L'expression «séquence d'ADN cible» désigne tout gène, région intergénique, promoteur et/ou séquence régulatrice d'intérêt choisi par l'homme du métier. Il s'agit notamment de gènes codant pour des protéines d'intérêt, par exemple des enzymes impliquées dans le métabolisme cellulaire.
L'expression «séquence d'intérêt» désigne une séquence codante ou non. Il peut s'agir d'une séquence mutée de la séquence d’ADN cible, par exemple du gène cible, du promoteur ou de la séquence régulatrice et/ou d'un marqueur tel qu'un gène de résistance aux antibiotiques ou une enzyme génératrice de couleur.
La séquence d’intérêt peut être plus longue ou plus courte que la séquence remplacée (« séquence d'ADN cible »), selon la distance séparant les deux régions homologues.
La protéine anti-CRISPR est une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action de l’endonucléase d’ADN, typiquement de Cas, et/ou une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action d’un système CRISPR-Cas, par exemple d’un système CRISPR-Cas de type II lorsque la nucléase est une nucléase de type Cas9, de préférence durant la phase d’introduction des séquences d’acide nucléique de l’outil génétique dans la souche bactérienne d’intérêt.
Cette séquence est typiquement placée sous le contrôle d’un promoteur inductible différent des promoteurs contrôlant l’expression de l’endonucléase d’ADN et/ou du ou des ARNg, et est inductible par un autre agent inducteur. Ce promoteur peut être par exemple sélectionné parmi le promoteur Pbgal (inductible au lactose), le promoteur du gènetetA, du gènexylAou du gènelacI, ou un dérivé de ceux-ci. Le promoteur contrôlant l’expression de la protéine anti-CRISPR permet de maîtriser avantageusement l’action de l’endonucléase d’ADN, par exemple de l’enzyme Cas9, et d’ainsi faciliter la transformation des bactéries et l’obtention de transformants ayant subi les modifications génétiques souhaitées.
La protéine anti-CRISPR est typiquement une protéine « anti-Cas9 » ou une protéine « anti-MAD7 », i.e. une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action de Cas9 ou de MAD7. La protéine anti-CRISPR est avantageusement une protéine « anti-Cas9 », par exemple sélectionnée parmi AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC1, AcrIIC2 et AcrIIC3 (Pawluket al, 2018). De manière préférée la protéine « anti-Cas9 » est AcrIIA2 ou AcrIIA4. De manière encore plus préférée la protéine « anti-Cas9 » est AcrIIA4. Une telle protéine est typiquement capable de limiter très significativement, idéalement d’empêcher, l’action de Cas9, par exemple en se fixant sur l’enzyme Cas9 (Donget al, 2017 ; Rauchet al, 2017). Une autre protéine anti-CRISPR avantageusement utilisable est une protéine « anti-MAD7 », par exemple la protéine AcrVA1 (Marinoet al, 2018).
Les inventeurs décrivent en particulier un tel outil génétique comprenant au moins :
- un « premier » acide nucléique codant au moins une endonucléase d’ADN, dans lequel la séquence codant l’endonucléase d’ADN est placée sous le contrôle d’un promoteur, et
- un « autre » acide nucléique comprenant, ou consistant en, une séquence d’« acide nucléique OREP », i.e. comprenant, ou consistant en, i) tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 41 et ii) une séquence permettant la modification du matériel génétique d’une bactérie par mutation, insertion ou délétion d’une séquence d’intérêt et/ou l’expression au sein de ladite bactérie d’une séquence d’ADN partiellement ou totalement absente du matériel génétique présent au sein de la version sauvage de ladite bactérie.
Dans un mode de réalisation particulier le « deuxième acide nucléique contenant une matrice de réparation » tel que décrit ci-dessus comprend cet « autre acide nucléique ».
La séquence « d’acide nucléique OREP » comprend une séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 41) codant une protéine impliquée dans la réplication d’un acide nucléique OPT d’intérêt. Cette protéine impliquée dans la réplication est également identifiée dans le présent texte en tant que protéine « REP » (SEQ ID NO : 42 - « MNNNNTESEELKEQSQLLLDKCTKKKKKNPKFSSYIEPLVSKKLSERIKECGDFLQMLSDLNLENSKLHRASFCGNRFCPMCSWRIACKDSLEISILMEHLRKEESKEFIFLTLTTPNVKGADLDNSIKAYNKAFKKLMERKEVKSIVKGYIRKLEVTYNLDKSSKSYNTYHPHFHVVLAVNRSYFKKQNLYINHHRWLSLWQESTGDYSITQVDVRKAKINDYKEVYELAKYSAKDSDYLINREVFTVFYKSLKGKQVLVFSGLFKDAHKMYKNGELDLYKKLDTIEYAYMVSYNWLKKKYDTSNIRELTEEEKQKFNKNLIEDVDIE »). La protéine REP possède un domaine conservé chez les firmicutes, nommé « COG 5655 » (Plasmid rolling circle replication initiator protein REP), de séquence SEQ ID NO : 43. Elle facilite la transformation des bactéries en améliorant le maintien au sein desdites bactéries de l’ensemble du matériel génétique introduit.
Un procédé particulier comprend avantageusement une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie de tout ou partie d’un outil génétique tel que décrit dans le présent texte, en particulier d’un acide nucléique comprenant, ou consistant en, i) tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 41 et ii) une séquence permettant la modification du matériel génétique d’une bactérie et/ou l’expression au sein de ladite bactérie d’une séquence d’ADN partiellement ou totalement absente du matériel génétique présent au sein de la version sauvage de ladite bactérie.
Dans le cadre de la présente description, l’acide nucléique utilisé pour transformer une bactérie, ou une population de bactéries, désigne une entité (l’« acide nucléique exogène ») se présentant typiquement sous la forme d’une cassette d’expression (ou « construction ») telle que par exemple un acide nucléique comprenant au moins un promoteur transcriptionnel ou une séquence régulatrice d’intérêt, lié(e) de manière opérationnelle (au sens où l’entend l’homme du métier) à une ou plusieurs séquences (codantes ou non) d’intérêt, par exemple à un opéron comprenant plusieurs séquence codantes d’intérêt dont les produits d’expression concourent à la réalisation d'une fonction d’intérêt au sein de la bactérie, ou un acide nucléique comprenant en outre une séquence activatrice et/ou un terminateur de transcription. Il se présente typiquement sous la forme d’un vecteur, circulaire ou linéaire, simple ou double brin, par exemple un plasmide, un phage, un cosmide, un chromosome artificiel ou synthétique, comprenant une ou plusieurs cassettes d’expression telles que définies ci-dessus. De manière préférée, le vecteur est un plasmide.
Les acides nucléiques d’intérêt, typiquement les cassettes ou vecteurs d’expression, peuvent être construits par des techniques classiques bien connues de l’homme du métier et peuvent comporter un(e) ou plusieurs promoteurs, origines de réplication bactérienne (séquences ORI), séquences de terminaison, gènes de sélection, par exemple gènes de résistance à un antibiotique, et séquences (« régions flanquées ») permettant l’insertion ciblée de la cassette ou du vecteur. Par ailleurs, ces cassettes et vecteurs d’expression peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques bien connues de l’homme du métier.
Des séquences ORI d’intérêt peuvent être choisies parmi pIP404, pAMβ1, repH (origine de réplication chezC. acetobutylicum), ColE1 ou rep (origine de réplication chezE. coli), ou toute autre origine de réplication permettant le maintien du vecteur, typiquement du plasmide, au sein d’une cellule deClostridium. Des séquences de terminaison d’intérêt peuvent être choisies parmi celles des gènesadc, thl, de l’opéronbcs, ou de tout autre terminateur, bien connu de l’homme de l’art, permettant l’arrêt de la transcription au sein d’une cellule bactérienne. Des gènes de sélection (gènes de résistance) d’intérêt peuvent être choisis parmiermB,catP,bla,tetA,tetM, et/ou tout autre gène de résistance à l’ampicilline, à l’érythromycine, au chloramphenicol, au thiamphénicol, à la spectinomycine, à la tétracycline ou à tout autre antibiotique pouvant être utilisé pour sélectionner des bactéries du genreClostridiumbien connu de l’homme de l’art.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
- d’introduction dans la bactérie d’un outil de modification par recombinaison homologue tel que décrit ci-dessus, de préférence en présence d’un agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR, et
- de culture de la bactérie transformée obtenue à l’issue de l’étape a) sur un milieu ne contenant pas (ou dans des conditions n’impliquant pas) l’agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR, et permettant typiquement l’expression du complexe ribonucléoprotéique endonucléase d’ADN/ARNg, par exemple Cas9/ARNg (afin de stopper la production de ladite protéine anti-CRISPR et de permettre l’action de l’endonucléase).
Un procédé particulier tel que décrit ci-dessus vise, dans le contexte de la présente invention, à rendre une bactérie du genreClostridium(par exemple une bactérie telle que décrite dans le présent texte comprenant au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU) résistante au 5-FU. Dans un tel procédé, la séquence d’intérêt utilisée comprend typiquement, ou consiste en, une séquence ciblant et inactivant le gèneupp, et l’un et/ou l’autre des gènesudpetudk, et permet, par un mécanisme de recombinaison homologue, de rendre la bactérie résistante au 5-fluorouracile (5-FU).
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique utilisé dans le procédé comprend, ou consiste en, une séquence ciblant et inactivant les gènesupp et udp, les gènesupp et udk, ou les gènesupp,udpetudk.
Dans un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique utilisé dans le procédé comprend, ou consiste en, une séquence ciblant et inactivant les gènesupp et udp.
Dans un autre mode de réalisation préféré, l’acide nucléique utilisé dans le procédé comprend, ou consiste en, une séquence ciblant et inactivant les gènesupp et udk.
Deux acides nucléiques particuliers décrits par les inventeurs permettent, par des mécanismes de recombinaison homologue, de rendre résistante au 5-fluorouracile (5-FU) une bactérie du genreClostridiumcomprenant au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU. Ces acides nucléiques comprennent, dans un mode de réalisation particulier, une séquence ciblant et inactivant le gèneupp, et le gèneudpet/ou le gèneudk. Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est sélectionnée parmiC. beijerinckii,C. diolis,C. saccharobutylicum,C. taeniosporum,C. botulinum,C. saccharoperbutylacetonicum,C. butyricumetC. perfringens, de préférence parmiC. beijerinckii,C. diolis,C. saccharoperbutylacetonicumetC. butyricum. Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie est la bactérieC. botulinumou la bactérieC. perfringens.
Le gèneuppest le gène de séquence SEQ ID NO : 1 présent chezC. beijerinckii, ou un gène analogue codant ou présentant l’activité d’une uracile phosphoribosyl-transférase, dont la séquence est identique à au moins 70%, 75% ou 80%, de préférence identique à au moins 81%, 82%, 83% ou 84%, de manière encore plus préférée identique à au moins 85%, à la séquence SEQ ID NO : 1.
Le gèneudpest le gène de séquence SEQ ID NO : 2 présent chezC. beijerinckii, ou un gène analogue codant ou présentant l’activité d’une uridine phosphorylase, dont la séquence est identique à au moins 70%, 75% ou 80%, de préférence identique à 81%, 82%, 83% ou 84%, de manière encore plus préférée identique à au moins 85%, à la séquence SEQ ID NO : 2.
Le gèneudkest le gène de séquence SEQ ID NO : 3 présent chezC. beijerinckii, ou un gène analogue codant ou présentant l’activité d’une uridine kinase, dont la séquence est identique à au moins 70%, 75% ou 80%, de préférence identique à 81%, 82%, 83% ou 84%, de manière encore plus préférée identique à au moins 85%, à la séquence SEQ ID NO : 3, ou le gène de séquence SEQ ID NO : 4 ou un gène analogue codant ou présentant l’activité d’une uridine kinase, dont la séquence est identique à au moins 70%, de préférence à au moins 80%, de manière encore plus préférée à au moins 85%, à la séquence SEQ ID NO : 4.
Des gènes équivalents sur le plan fonctionnel aux gènesupp,udpetudksont présents chez d’autres Clostridies (cf. Figures 3, 4, 5 et 6). L’analyse phylogénétique des souches deC. beijerinckiiréalisée par les inventeurs indique que cette voie métabolique est largement répandue dans cette espèce. On retrouve par exemple des séquences quasi identiques par exemple au sein des espècesC. beijerinckii,C. saccharoperbutylacetonicum,C. saccharobutylicum,C. botulinum,C. perfringens,C. diolis,C. taeniosporumetC. butyricum.
Les inventeurs se sont aperçus que les bactéries recombinantes obtenues par ce procédé, elles aussi objets de la présente invention, étaient, de manière à la fois surprenante et très avantageuse, résistantes au 5-fluorouracile. Le 5-FU peut dès lors être utilisé comme agent de contre-sélection de bactéries présentant une modification génétique d’intérêt, dérivées (/obtenues à partir) desdites bactéries recombinantes selon l’invention, typiquement comme agent de contre-sélection de bactéries présentant une/des mutations dans le/les gènesupp,udpet/ouudp, ou comprenant une séquence exogène d’intérêt insérée dans l’un desdits gènes.
Une bactérie recombinante préférée selon l’invention, est une bactérie du genreClostridiumdépourvue des gènesupp et udp. Une bactérie recombinante selon l’invention, dépourvue des gènesupp et udp, particulièrement préférée est la bactérieC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udp(« IFP965 ») enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31854 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique). Une telle bactérie est typiquement utilisable comme outil de laboratoire pour obtenir des souches de bactéries du genreClostridiumgénétiquement améliorées.
Un objet préféré de la présente description vise ainsi l’utilisation d’une bactérie recombinante selon l’invention, de préférence la bactérieC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udp(« IFP965 ») enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31854 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique), dans un procédé de modification/d’amélioration génétique d’une bactérie du genreClostridium.
Une autre bactérie recombinante préférée selon l’invention est une bactérie du genreClostridiumdépourvue des gènesupp et udk. Une bactérie recombinante selon l’invention, dépourvue des gènesupp et udk, particulièrement préférée est la bactérieC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udk(« IFP966 ») enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31855 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique). Une telle bactérie est typiquement utilisable comme outil de laboratoire pour obtenir des souches de bactéries du genreClostridiumgénétiquement améliorées.
Un autre objet préféré de la présente description vise ainsi l’utilisation d’une bactérie recombinante selon l’invention, de préférence la bactérieC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udk(« IFP966 ») enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31855 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique), dans un procédé de modification/d’amélioration génétique d’une bactérie du genreClostridium.
Un tel procédé est typiquement similaire aux procédés de modification génétique d’une bactérie du genreClostridiumdécrits dans le présent texte comprenant une étape de transformation d’une bactérie à l’aide d’un outil génétique exogène (« acide nucléique exogène ») comprenant une séquence permettant la modification, comme expliqué plus haut, par un mécanisme de recombinaison homologue, du matériel génétique de la bactérie typiquement par mutation, insertion ou délétion d’une séquence d’intérêt. Ce procédé de modification génétique vise à obtenir une bactérie recombinante présentant des propriétés améliorées lui permettant d’être exploitée directement à l’échelle industrielle, par exemple pour produire un biocarburant. Les propriétés améliorées de la bactérie obtenue par un tel procédé sont directement liées à la ou aux modifications apportées à son génome, et donc à la ou aux séquences d’intérêt sélectionnées, introduites de manière stable dans son génome.
Dans le procédé selon l’invention, l’acide nucléique exogène comprend avantageusement tout ou partie de la séquence codant Upp, Udp et/ou Udk et rend les bactéries dans lesquelles il est présent sensibles au 5-FU.
Selon un aspect particulier, les inventeurs décrivent ainsi, comme expliqué ci-dessous, l’utilisation comme marqueur(s) de contre-sélection les gènesupp,udpet/ouudkdans un procédé de modification génétique d’une bactérie recombinante du genreClostridiumselon l’invention. Ils décrivent de préférence leur utilisation comme marqueur(s) de contre-sélection en présence de 5-FU.
L’expression « gène marqueur » fait référence à une séquence codant une protéine marqueur sous le contrôle d'éléments régulateurs fonctionnels permettant la synthèse de ladite protéine dans Clostridia. Les gènes marqueurs de sélection peuvent être divisés en plusieurs sous-catégories selon qu'ils confèrent une sélection positive ou négative, et selon que la sélection est conditionnelle ou non-conditionnelle à la présence de substrats externes.
Les gènes marqueurs dits « de sélection positive » favorisent la croissance des cellules dont le génome a été génétiquement modifiée. La détection de ces gènes marqueurs à sélection positive est subordonnée à l'utilisation d'agents toxiques (antibiotiques, herbicides ou médicaments). Ces gènes sont par exemple des gène de résistance à un antibiotique comme les gènesnptIetnptIIconférant une résistance à l'antibiotique kanamycine; dans ce cas, toutes les cellules ayant acquis le transgène résisteront à l'antibiotique alors que les autres seront tuées. L'utilisation de gènes marqueurs de sélection positive de ce type présente le double « avantage » de permettre à la fois le repérage et un tri rapide des cellules génétiquement modifiées (les seuls à survivre), par rapport à celles n'ayant pas acquis le transgène.
Inversement, les gènes marqueur dits « de contre-sélection » ou « de sélection négative », « négativement sélectionnables » provoquent la mort des cellules ou organismes génétiquement modifiés dans certaines conditions, contrôlables et connues de l'expérimentateur.
Classiquement, une fois que l'événement de recombinaison s'est produit dans le cadre du procédé de modification génétique selon l’invention, l’acide nucléique exogène (se présentant de manière préférée sous la forme d’un vecteur réplicatif, par exemple d’un plasmide) doit être éliminé. L'élimination d'un vecteur réplicatif se produit généralement avec des cultures successives de clones, suivies d'une sélection négative ou positive de clones ayant éliminé ce vecteur. La présente invention permet avantageusement de se dispenser de ces cultures successives. Elle permet en effet d’éliminer (/de purger) très simplement, en présence de 5-FU, les cellules bactériennes de l’acide nucléique exogène (se présentant typiquement sous la forme d’un vecteur) grâce à la présence au sein dudit acide nucléique exogène de la séquence codant Upp, Udp et/ou Udk qui rend les bactéries comprenant toujours l’acide nucléique exogène sensible au 5-FU contrairement aux bactéries l’ayant éliminé. Les souches n'expriment plus les gènesupp,uppetudp,uppetudk, ouupp,udpetudk, peuvent ainsi être sélectionnées sur cette caractéristique.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de modification génétique d’une bactérie du genreClostridiumdécrit par les inventeurs comprend ainsi une étape de transformation d’une population de bactéries recombinantes du genreClostridiumselon l’invention, et comprend en outre i) une étape de sélection des seules bactéries ayant été modifiées par mutation, insertion ou délétion de la séquence d’intérêt, et ii) une étape de sélection desdites bactéries modifiées ne possédant plus l’acide nucléique contenant le ou les marqueurs de contre-sélection, lesdites bactéries se multipliant en présence de 5-FU à la différence des bactéries n’ayant pas perdu ledit acide nucléique.
Selon un aspect particulier, la bactérie recombinante visée par l’étape de transformation du procédé selon l’invention n’exprime pas le gèneuppet n’exprime pas en outre le gèneudpou le gèneudk. Ladite bactérie est avantageusement transformée, dans le cadre d’un procédé particulier de modification génétique de ladite bactérie, à l’aide d’un acide nucléique comprenant le gèneuppou les gènesuppetudpou les gènesuppetudk, ledit/lesdits gènes étant utilisé(s) comme marqueur(s) de contre-sélection.
Typiquement, la bactérie recombinante est transformée à l’aide d’un acide nucléique exogène comprenant le, ou plusieurs des, gène(s) (typiquementupp,udpet/ouudk) dont son génome a été délété conformément à l’enseignement fourni par les inventeurs dans le présent texte.
L'utilisation du marqueur de contre-sélection est particulièrement utile car lesClostridiarecombinantes selon l’invention sont capables de croître sur un milieu comprenant du 5-FU avant la transformation et après l'élimination de l’outil génétique exogène (« acide nucléique exogène »), typiquement du vecteur. Les souches ayant éliminé ledit outil exogène peuvent ainsi être sélectionnées positivement.
Dans un procédé préféré, ladite bactérie est transformée à l’aide d’un acide nucléique comprenant le gèneuppledit gène étant utilisé comme marqueur de contre-sélection.
Dans un autre procédé préféré, ladite bactérie est transformée à l’aide d’un acide nucléique comprenant le gèneudpet/ouudk, ledit/lesdits gènes étant utilisé(s) comme marqueur(s) de contre-sélection.
Dans un autre procédé préféré, ladite bactérie est transformée à l’aide d’un acide nucléique comprenant les gènesuppetudpet/ouudp, ledit/lesdits gènes étant utilisé(s) comme marqueur(s) de contre-sélection.
Selon un aspect particulier de l’invention, les inventeurs décrivent l’utilisation d’une bactérie recombinante selon l’invention pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement, utilisable à l’échelle industrielle pour produire un solvant ou un mélange de solvants, ainsi que les bactéries recombinantes dérivées ainsi obtenues. Ils décrivent aussi l’utilisation de la bactérie recombinante dérivée ainsi obtenue, pour produire, grâce à l’expression du ou des acides nucléiques d’intérêt introduits volontairement dans son génome, un ou plusieurs solvants, de préférence au moins l’isopropanol, de préférence à l’échelle industrielle.
La description concerne également un kit (trousse) pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genreClostridiumpour produire au moins un solvant, par exemple un mélange de solvants, à l’aide d’une telle bactérie. Ce kit comprend de préférence une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte et du 5-FU. Il peut en outre comprendre un acide nucléique tel que décrit dans le présent texte, tout ou partie des éléments d’un outil génétique tel que décrit dans le présent texte permettant de transformer, et typiquement modifier génétiquement une telle bactérie, en vue de produire un variant amélioré de ladite bactérie, et/ou un inducteur adapté à un promoteur inductible présent au sein de l’outil, par exemple un promoteur inductible de l’expression de la protéine anti-CRISPR sélectionnée.
Le kit selon l’invention peut en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels qu’un milieu de culture, au moins un ARNg, une nucléase, une ou plusieurs molécules de sélection, ou encore une notice explicative.
La description concerne également l’utilisation d’un kit selon l’invention, ou de l’un ou de plusieurs des éléments de ce kit, pour la mise en œuvre d’un procédé décrit dans le présent texte de transformation, et idéalement de modification génétique, d’une bactérie appartenant au genreClostridiumet/ou pour la production de solvant(s) ou de biocarburant(s), ou de mélanges de ceux-ci, de préférence à l’échelle industrielle, à l’aide d’une telle bactérie.
Des solvants susceptibles d’être produits sont typiquement l’acétone, le butanol, l’éthanol, l’isopropanol ou un mélange de ceux-ci, typiquement un mélange éthanol/isopropanol, butanol/isopropanol, ou éthanol/butanol, de préférence un mélange isopropanol/butanol.
L’utilisation de bactéries transformées selon l’invention permet typiquement la production par an à l’échelle industrielle d’au moins 100 tonnes d’acétone, d’au moins 100 tonnes d’éthanol, d’au moins 1000 tonnes d’isopropanol, d’au moins 1800 tonnes de butanol, ou d’au moins 40 000 tonnes d’un mélange de ceux-ci.
Les exemples et figures ci-après ont pour but d’illustrer plus pleinement l’invention sans pour autant en limiter la portée.
FIGURES
EXEMPLES
EXEMPLE n°1
Comme décrit dans la demande FR19/05485, les inventeurs ont étudié l’inactivation du gèneuppchezC. beijerinckii. Pour ce faire, ils ont utilisé l’outil CRISPR-Cas9 décrit dans la demande EP3 578 662.
Un clone de la soucheC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatBa été au préalable transformé avec le vecteur pCas9acrne présentant pas de méthylation aux niveaux des motifs reconnus par les méthyltransférases de type dam et dcm (préparé à partir d’une bactérieEscherichia coliprésentant le génotypedam - dcm -).
Un clone résistant à l’érythromycine a ensuite été transformé avec pEC750C-Δupppréalablement déméthylé. Les colonies ainsi obtenues ont été sélectionnées sur du milieu contenant de l’érythromycine (20 µg/mL), du thiamphénicol (15 µg/mL) et du lactose (40 mM).
Plusieurs de ces clones ont ensuite été resuspendus dans 100 µL de milieu de culture (2YTG) puis dilués en série dans du milieu de culture (jusqu’à un facteur de dilution de 104). Cinq µL de chaque dilution ont été déposés sur une boîte de Pétri contenant de l’érythromycine, du thiamphénicol et de l’anhydrotétracycline (200 ng/mL). Pour chaque clone, deux colonies résistantes à l’aTc ont été testées par colonie PCR avec des amorces destinées à amplifier le locus upp (cf. ). La résistance de ces clones au 5-FU (50 mg/L) a ensuite été testée, et l’ensemble des bactéries recombinantes C. beijerinckii DSM 6423 ΔcatB Δupp était sensible à ce composé. La croissance de l’une de ces bactéries recombinantes (« IFP962 ∆upp » ou « IFP964 » - souche enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31853 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique), désignée dans la figure comme « ∆upp ») ainsi que de la bactérie C. beijerinckii DSM 6423 ∆catB (« IFP962 » - souche enregistrée le 6 décembre 2018 sous le numéro de dépôt LMG P-31151 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique), désignée dans la figure comme « WT ») sur milieu 2YTG et sur milieu 2YTG complémenté en 5-FU est présentée en .
EXEMPLE n°2
MATERIELS & METHODES
Les inventeurs ont étudié l’inactivation des gènesudpetudkchezC. beijerinckii.
Pour ce faire, ils ont également utilisé l’outil CRISPR-Cas9 décrit dans la demande EP3 578 662.
Comme décrit ci-dessous, les inventeurs sont parvenus à éliminer les deux gènes cibles (gènesudpetudk) au sein des souchesC. beijerinckiiDSM 6423 ∆catB(« IFP962 » - souche enregistrée le 6 décembre 2018 sous le numéro de dépôt LMG P-31151 auprès Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent – Belgique)) etC. beijerinckiiDSM 6423 ∆catB∆upp(« IFP962 ∆upp» ou « IFP964 » - souche enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31853 auprès Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique)).
La méthode décrite dans la demande EP3 578 662 comprend une étape d’introduction dans la souche d’un premier plasmide, « pCas9acr», qui permet d’exprimer l’enzyme Cas9 sous contrôle de plusieurs éléments régulateurs (promoteur inductible et présence transitoire de la protéine anti-CRISPR AcrIIA4). Dans une seconde étape, un second plasmide dit « de ciblage » est introduit dans ladite souche. Le plasmide de ciblage comprend :
- le plasmide « pNF3C », utilisé comme vecteur de base ;
- une matrice de réparation correspondant aux zones d’homologies entourant la région à supprimer par recombinaison homologue ; et
- une cassette d’expression d’un ARN guide ciblant la région du chromosome à modifier.
SOUCHES ET CONDITIONS DE CULTURE
La soucheE. coliNEB 10-beta (New England Biolabs, Ref C3019) est utilisée pour les différents clonages. Pour la préparation des plasmides avant transformation chezC. beijerinckiiDSM 6423, une souche d’E. coliDam-Dcm-exprimant les produits des gènes codant certaines méthyl-transférases deC. beijerinckii(CIBE_3327, CIBE_3328, CIBE_3322) placés sous le contrôle d’un promoteur inductible à l’arabinose (concentration utilisée : 1 mM) a été employée. Les différentes souches d’E. coliont été cultivées sur milieu LB (tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L, NaCl 5 g/L, agar 0 ou 15 g/L si liquide ou solide, respectivement).
Pour la construction des souches ∆udpet ∆udk, la souche « IFP 962 » (soucheC. beijerinckiienregistrée le 6 décembre 2018 sous le numéro de dépôt LMG P-31151 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique) - demande de brevet FR 1905485) a été utilisée. Pour la construction des souches ∆upp∆udpet ∆upp∆udk, la souche « IFP 962 ∆upp »(ou « IFP964 » - souche enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31853 auprès Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent – Belgique)) obtenue dans l’exemple n°1 a été utilisée. Toutes ces souches sont cultivées sur milieu 2YTG (tryptone : 16 g/L, extrait de levure : 10 g/L, glucose : 5 g/L, NaCl : 4 g/L) liquide (équilibré à pH 5.2) ou solide (supplémenté avec 15 g/L d’agar).
De l’érythromycine (à des concentrations de 20 ou 500 mg/L respectivement en milieu 2YTG ou LB), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L-1respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg/L en milieu 2YTG) et de l’ampicilline (100 mg/L en milieu LB solide ou liquide) ont été utilisés, si nécessaire. Pour les tests de sensibilité au 5-fluorouracile (5-FU), le milieu 2YTG solide a été supplémenté avec 50 mg/L de 5-fluorouracile (Sigma-Aldrich).
AMORCES ET PLASMIDES
Amorces
Les amorces utilisées dans cette étude sont décrites ci-dessous, par ordre d’apparition :
Nom Séquence d’ADN
RH159 5’-GTGGGTCACGCGGTATCATTGC-3’
RH160 5’-GCAATGATACCGCGTGACCCAC-3’
M13-rev 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
pEC750C-fwd 5’-CAATATTCCACAATATTATATTATAAGCTAGC-3’
RH163 5’-CAACAACTAGAAATACTGAACCTACTATAATACCTCCATTTATTTCACG-3’
RH164 5’-CGAAAAAGAAAAACTGCCGGGATCCGGTAATCTACTTCCTTCTGG-3’
RH161 5’-ATCATAGTTACATTAATACGGATCCGGAGTATGTTTTTCTAATAATTCAAC-3’
RH162 5’-GTAGGTTCAGTATTTCTAGTTGTTG-3’
RH165 5’-ATCATAGTTACATTAATACGGATCCGCTTTAAAAAATATAACTTTCAGG-3’
RH166 5’-CCTCCATAAGTAATCTAATATAATTATAC-3’
RH167 5’-AATTATATTAGATTACTTATGGAGGTAGCAGTACATAATTTTTAAGTAG-3’
RH168 5’-CGAAAAAGAAAAACTGCCGGGATCCCTTTCCAATAATTCAAGAGC-3’
udk-guide-fwd 5’-TCATCGTTGATCCGAGTAAGAGAA-3’
udk-guide-rev 5’-AAACTTCTCTTACTCGGATCAACG-3’
udp-guide-fwd 5’-TCATGTAAATACGTAATATTACCA-3’
udp-guide-rev 5’-AAACTGGTAATATTACGTATTTAC-3’
RH010 5’-CGGATATTGCATTACCAGTAGC-3’
RH011 5’-TTATCAATCTCTTACACATGGAGC-3’
RH171 5’-AAAGGACATTGGTAATAATTCTTCG-3’
RH172 5’-CACCAATTAATTTAGATAGTTCAGG-3’
RH175 5’-GTAAAGTGGGTGATATGTTAAATG-3’
RH176 5’-TCAACTTGATCTCCACAAAC-3’
Plasmides
Des plasmides décrits dans la demande de brevet EP3 578 662 ont été utilisés, en particulier les plasmides pCas9acr (SEQ ID NO : 32- cf. séquence SEQ ID NO : 23 et de EP3 578 662), pGRNAind (SEQ ID NO : 33 - cf. séquence SEQ ID NO : 82 de EP3 578 662) et pNF3C (SEQ ID NO : 34 - cf. séquence SEQ ID NO : 125 et figure 29 de EP3 578 662).
Dans la présente étude, plusieurs sous-clonages ont permis de produire les plasmides pNF3C-∆udpde séquence SEQ ID NO : 39 et pNF3C-∆udkde séquence SEQ ID NO : 40.
Dans un premier temps, le plasmide pNF3C a dû être modifié pour enlever un site de restriction BsaI. Pour ce faire, une méthode de type «Quickchange» a été employée. Le vecteur a été amplifié avec les amorces RH159 et RH160, puis digéré avec DpnI. Le produit de PCR a ensuite été introduit chezE. coli, ce qui a permis d’obtenir le vecteur pNF3C-∆BsaI de séquence SEQ ID NO : 35 (cf. ).
Afin d’obtenir un vecteur similaire au pGRNAind avec l’origine de réplication du pNF2, ce vecteur a ensuite été modifié pour incorporer la région permettant d’exprimer un ARN guide avec une séquenceprotospacerfacilement modifiable. Pour ce faire, cette zone a été amplifiée par PCR avec les amorces M13-rev et pEC750C-fwd à partir du pGRNAind. Le produit de PCR a ensuite été digéré par SacI puis cloné par ligation (T4 DNA Ligase, NEB) dans le pNF3C-∆BsaI, préalablement digéré par SacI et déphosphorylé avec l’enzymeAntarctic Phosphatase(NEB), ce qui a permis d’obtenir le pNF3C-GRNAind de séquence SEQ ID NO : 36 (cf. ).
Dans ce nouveau vecteur, des zones d’homologie amont et aval des gènes CIBE_3715 et CIBE_1796 ont été intégrées afin d’obtenir les plasmides pNF3C-GRNAind-udp-HR de séquence SEQ ID NO : 37 (cf. ) et pNF3C-GRNAind-udk-HR de séquence SEQ ID NO : 38 (cf. ). Pour ce faire, les zones ciblées ont été amplifiées par PCR à partir de l’ADN génomique de la souche DSM 6423 (udp : amont avec RH163 et RH164, aval avec RH161 et RH162 ; udk : amont avec RH165 et RH166, aval avec RH167 et RH168). Pour chaque cible, les deux produits de PCR ont été assemblés par fusion PCR. Les deux matrices de réparation ainsi obtenues ont ensuite été clonées en BamHI dans le pNF3C-gRNAind, préalablement déphosphorylé avec l’enzyme Antarctic Phosphatase (NEB).
La dernière étape consistait à introduire dans ces deux vecteurs les séquences variables (protospacer) des ARN guides ciblant udp et udk. Ces séquences ont été déterminées in silico grâce au logiciel Geneious R10 (https://www.geneious.com). Pour chaque protospacer, une paire d’amorces est hybridée dans un thermocycleur (dénaturation thermique à 95°C, puis baisse graduelle de la température jusqu’à température ambiante). Les paires udp-guide-fwd / udp-guide-rev et udk-guide-fwd / udk-guide-rev ont été utilisées pour cibler les gènes udp et udk respectivement. Les produits d’hybridation ont ensuite été intégrés dans les vecteurs pNF3C-GRNAind-udp-HR et pNF3C-GRNAind-udk-HR par assemblage Golden Gate en BsaI, ce qui a permis d’obtenir les vecteurs finaux pNF3C-∆udp de séquence SEQ ID NO : 39 (cf. ) et pNF3C-∆udk de séquence SEQ ID NO : 40 (cf. ).
Transformation bactérienne
Le même protocole que précédemment décrit (Dialloet al, 2020) a été employé pour transformer la souche avec 20 µg d’ADN. La différence principale provient de l’utilisation d’ADN préparé dans une souche particulière d’E. coli(cf. sous-partie « Souches et conditions de culture »).
Inactivation des gènes udp et udk
Après introduction du plasmide pCas9acrdans les souches IFP 962 et IFP 962 ∆upp, les souches résultantes sont à nouveau transformées avec les vecteurs pNF3C-∆udpet pNF3C-∆udk. Les transformants sont sélectionnés sur milieu sélectif en présence de lactose (40 mM) pour induire le système anti-CRISPR décrit dans les demandes EP3 578 662 et FR 19/05485. Des colonies individuelles sont suspendues dans de l’eau, puis des dilutions sérielles sont déposées sur milieu solide sélectif supplémenté en anhydrotétracycline (200 ng/mL).
Les colonies résistantes à l’anhydrotétracycline sont repiquées puis leurs génotypes sont testées par PCR sur colonie et leurs phénotypes par exposition sur boîte à du 5-fluorouracile (50 mg/L).
PCR sur colonie
Une colonie isolée deC. beijerinckiiDSM 6423 est mise en suspension dans 100 µL de Tris 10 mM pH 7,5 EDTA 5 mM. Cette solution est chauffée à 98 °C pendant 10 min sans agitation. 900 µL d’eau sont rajoutés, puis les tubes sont centrifugés à vitesse maximale pendant 3 min. 0,5 µL du surnageant de ce lysat bactérien peuvent alors être utilisés comme matrice de PCR dans des réactions de 10 µL avec la polymérase Phusion (Thermo Scientific).
Les couples d’amorces RH10/RH11, RH171/RH172 et RH175/RH176 sont utilisés pour vérifier l’inactivation des gènesupp,udpetudk, respectivement. Chacun de ces couples permet d’amplifier une région comprenant les zones d’homologies utilisées pour inactiver chacun de ces gènes, de telle sorte que le produit de PCR ne peut provenir que d’une amplification de l’ADN génomique au locus ciblé.
RESULTATS
Deux plasmides de ciblage ont été construits, pNF3C-∆udpet pNF3C-∆udk(ciblant respectivement les gènesudpetudk), qui ont ensuite été introduits dans les souches IFP 962 (soucheC. beijerinckiienregistrée le 6 décembre 2018 sous le numéro de dépôt LMG P-31151 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique) et IFP 962 ∆upp(ou « IFP964 » - souche enregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31853 auprès Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent – Belgique)).
Après induction du système CRISPR, des mutants corrects ont été obtenus avec un taux de fréquence de 100% (données non montrées). La montre les profils types obtenus par PCR sur colonie pour chaque type de souche obtenue.
La croissance des différents mutants a ensuite été testée en présence de 5-FU sur milieu gélosé (cf. ).
Les résultats (taille et nombre des colonies, vitesse de croissance) indiquent que seuls les contextes génétiques ∆upp∆udp, et, dans une sensiblement moindre mesure, ∆udpseul, permettent d’obtenir une croissance sur milieu gélosé 5-FU, et donc une résistance à ce composé. Ce résultat suggère aussi que la voie catalysée par l’enzyme Udp est la principale utilisée pour le métabolisme du 5-fluorouracile chezC. beijerinckiiDSM 6423. A l’inverse, l’inactivation du gèneudkn’entraîne pas de résistance au 5-fluorouracile, même pour une souche dans laquelle le gèneuppa été inactivé.
CONCLUSIONS
Dans l’optique de disposer de nouveaux outils génétiques dédiés aux clostridies, des souchesC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udpetC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udkrésistantes au 5-fluorouracile ont été obtenues par génie génétique. Ces phénotypes sont avantageux en ce qu’ils permettent l’utilisation d’un marqueur de contre-sélection (le gèneupp, le gèneudpet/ou le gèneudk) pour obtenir des souches deC. beijerinckiine possédant pas d’autre modification génétique que celle désirée. Un tel marqueur peut ainsi être utilisé pour accélérer la phase d’élimination des plasmides exogènes après une modification génétique donnée, étape qui, avant la présente invention, nécessitait de nombreux repiquages sur milieu non sélectif.
Les voies métaboliques responsables de l’assimilation du 5-FU chezC. beijerinckiiDSM 6423 sont également présentes dans un certain nombre de clostridies, i.e.C. beijerinckii,C. diolis,C. saccharoperbutylacetonicum,C. saccharobutylicum,C. taeniosporum,C. botulinum,C. butyricum,C. perfringens, C. saccharobutylicum, chez lesquelles il est également possible de supprimer les gènesudpetupp.
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Claims (13)
- Bactérie recombinante du genreClostridiumrésistante au 5-fluorouracile (5-FU) caractérisée en ce qu’elle est dépourvue d’au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU.
- Bactérie recombinante du genreClostridiumselon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie du genreClostridiumest une souche comprenant au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU, de préférence sélectionnée parmiC. beijerinckii,C. saccharoperbutylacetonicum,C. saccharobutylicum,C. botulinum,C. perfringens,C. diolis,C. taeniosporumetC. butyricum.
- Bactérie recombinante du genreClostridiumselon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu’elle est dépourvue des gènesupp et udp.
- Bactérie recombinante du genreClostridiumselon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la bactérie recombinante est la bactérieC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udpenregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31854 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique) ou la bactérieC. beijerinckiiDSM 6423 ΔcatB∆upp∆udkenregistrée le 9 juin 2020 sous le numéro de dépôt LMG P-31855 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique).
- Utilisation d’une bactérie recombinante selon l’une des revendications 1 à 4 dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genreClostridium, ou pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement, utilisable à l’échelle industrielle pour produire un solvant ou un mélange de solvants.
- Utilisation des gènesupp,udpet/ouudkcomme marqueur(s) de contre-sélection, en présence de 5-FU, dans un procédé de modification génétique d’une bactérie recombinante du genreClostridiumselon l’une des revendications 1 à 4.
- Procédé de modification génétique d’une bactérie du genreClostridiumcomprenant une étape de transformation d’une bactérie recombinante du genreClostridiumtelle que décrite dans l’une des revendications 1 à 4 à l’aide d’un acide nucléique comprenant une séquence permettant la modification, par un mécanisme de recombinaison homologue, du matériel génétique de la bactérie par mutation, insertion ou délétion d’une séquence d’intérêt.
- Procédé selon la revendication 7 de modification génétique d’une bactérie du genreClostridium, caractérisé en ce que la bactérie recombinante visée par l’étape de transformation n’exprime pas le gèneuppet n’exprime pas en outre le gèneudpou le gèneudk, et en ce que ladite bactérie est transformée à l’aide d’un acide nucléique comprenant le gèneuppou les gènesuppetudpou les gènesuppetudk, utilisé(s) comme marqueur(s) de contre-sélection.
- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de transformation d’une population de bactéries recombinantes du genreClostridiumtelles que décrites dans l’une des revendications 1 à 4, et en ce qu’il comprend en outre i) une étape de sélection des seules bactéries ayant été modifiées par mutation, insertion ou délétion de la séquence d’intérêt, et ii) une étape de sélection desdites bactéries modifiées ne possédant plus l’acide nucléique contenant le ou les marqueurs de contre-sélection, lesdites bactéries se multipliant en présence de 5-FU à la différence des bactéries n’ayant pas perdu ledit acide nucléique.
- Procédé de modification génétique d’une bactérie du genreClostridiumcomprenant une étape de transformation d’une bactérie du genreClostridiumà l’aide d’un acide nucléique permettant de rendre ladite bactérie résistante au 5-fluorouracile (5-FU) par un mécanisme de recombinaison homologue, dans lequel ledit acide nucléique comprend une séquence ciblant et inactivant les gènesupp et udp.
- Bactérie recombinante du genreClostridiumrésistante au 5-fluorouracile (5-FU) caractérisée en ce qu’elle a été obtenue par un procédé selon la revendication 10.
- Procédé selon l’une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l’acide nucléique utilisé pour transformer la bactérie ou la population de bactéries est une cassette d’expression ou un vecteur, par exemple un plasmide.
- Acide nucléique permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de rendre résistante au 5-fluorouracile (5-FU) une bactérie du genreClostridiumcomprenant au moins deux gènes responsables de la production de 5-FUMP à partir de 5-FU, caractérisé en ce que la bactérie est sélectionnée parmiC. beijerinckii,C. saccharoperbutylacetonicum,C. saccharobutylicum,C. botulinum,C. perfringens,C. diolis,C. taeniosporumetC. butyricum, et en ce que ledit acide nucléique comprend une séquence ciblant et inactivant le gèneupp, et le gèneudpet/ou le gèneudk.
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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-
2021
- 2021-06-23 WO PCT/FR2021/051143 patent/WO2021260322A1/fr active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008040387A1 (fr) | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Metabolic Explorer | Procédé d'intégration chromosomique et de remplacement de séquences d'adn dans clostridia |
| FR3042506A1 (fr) * | 2015-10-16 | 2017-04-21 | Ifp Energies Now | Outil genetique de transformation de bacteries clostridium |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021260322A1 (fr) | 2021-12-30 |
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