FR3025803A1 - Cassette d'expression et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente demande est relative à une cassette de gènes comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins : - un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur, - le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 placé sous le contrôle d'un promoteur, et le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13, ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, - le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3'. Une fois intégrée, cette cassette permet après transformation ultérieure avec un vecteur adapté, une souche « fille » intégrant in fine des modifications génétiques (délétion, insertion ou délétion et insertion) mais aucun marqueur de sélection (par ex : de gène de résistance à un antibiotique) ni autre élément génétique ne correspondant pas aux modifications génétiques réalisées.

Description

1 La présente demande se rapporte à une nouvelle cassette d'expression de gènes, et à son incorporation dans un micro-organisme pour obtenir une souche plateforme. Les bactéries Clostridia solvantogènes sont des micro-organismes anaérobies capables de synthétiser une variété importante de produits comme l'acide acétique, l'acide butyrique, l'isopropanol, l'acétone, le butanol, l'éthanol, l'acétoïne, le 2,3 butanediol et du dihydrogène à partir de sucres fermentescibles. Ces produits sont synthétisés par les Clostridia lors des fermentations ABE (Acétone-Butanol-Ethanol) ou IBE (Isopropanol-Butanol-Ethanol), très étudiées ces quatre dernières décennies.

Les récents développements en biologie moléculaire ont permis d'explorer plus en profondeur la génétique et le métabolisme des Clostridia solvantogènes, afin de mettre en avant des voies d'amélioration possibles pour ces micro-organismes. L'amélioration génétique ciblée des souches de Clostridium requiert l'acquisition et/ou le développement de techniques du génie génétique permettant l'expression, l'insertion et la délétion de gènes. Classiquement la surexpression de gènes se fait par l'insertion d'un plasmide. L'utilisation d'un plasmide présente plusieurs inconvénients pour l'utilisation des micro-organismes à des fins industrielles. En effet, le maintien du plasmide requiert la présence d'un agent de sélection, le plus souvent un antibiotique, dans le milieu de culture. De plus, la quantité de gènes insérés reste limitée. Afin de construire des souches de Clostridium modifiées et stables, l'insertion du gène d'intérêt dans le génome semble être la meilleure solution. Différentes techniques décrivent l'insertion d'ADN dans le génome de C. acetobutylicun.

Zhang et al. (2006) (Nucleic Acid Res., 34(9) :71) ont développé une cassette mazF pour Bacillus subtilis contenant les gènes de la toxine mazF d'E. coli et le gène de résistance à la spectinomycine spc. L'expression du gène mazF est placée sous le contrôle d'un promoteur inductible à l'IPTG: P - spac - Une séquence d'ADN de 125 paires de base, nommée DR (Directly Repeated sequence), a été flanquée à chaque extrémité (5' et 3') de la cassette mazF. La cassette mazF est également flanquée aux extrémités 3' et 5' du gène amyE de Bacillus subtilis 1A751 codant pour une a-amylase non essentielle. Ces séquences d'ADN permettent l'insertion ciblée, sous forme linéarisée, de la cassette mazF au sein du gène amyE. In fine, par double recombinaison homologue, puis culture dans un milieu avec IPTG, seules les souches ayant expulsé la cassette mazF sont capables de pousser. Cependant, cette méthode est 3025803 2 adaptée à Bacillus subtilis et laisse des cicatrices dues à l'utilisation de séquences DR. En outre, elle n'est pas adaptée à la simple insertion d'une séquence dans le génome. Al-Hinai et al. (2012) (Appl Environ Microbiol, 78(22) :8112-21) ont développé un système 5 similaire dédié à C. acetobutylicum ATCC 824. Dans ce système, des séquences flanquant la région à déléter sont introduites, les séquences FRT. Là encore, cette méthode laisse des cicatrices dues à l'utilisation de ces séquences FRT. Malgré l'existence de ces quelques outils, il existe donc un besoin de disposer d'un outil de 10 recombinaison qui soit efficace, simple et rapide à mettre en oeuvre, notamment pour l'obtention de souches destinées à la production de molécule d'intérêt à l'échelle industrielle. Cet outil doit être particulièrement applicable à Clostridium, notamment à C. acetobutylicun, qui est très difficilement modifiable sans recours à des outils permettant le maintien des modifications génétiques par une pression de sélection (antibiotique ou marqueur 15 auxotrophique). En outre, cet outil doit être adapté à un large éventail d'événements de recombinaisons génétiques se produisant au sein des micro-organismes ciblés. Enfin, cet outil doit permettre l'obtention de cellules recombinantes stables, lesdites cellules se dispensant de l'utilisation d'antibiotiques. Cet avantage permet d'envisager une utilisation 20 de ces souches à l'échelle industrielle avec des contraintes et des coûts de production réduits, ainsi qu'un impact environnemental réduit. De manière surprenante, les inventeurs ont mis au point une souche, appelée « souche plateforme », pouvant être modifiée selon le but à atteindre. Cette souche plateforme est facile 25 à produire et à utiliser, notamment pour l'obtention de souches utilisables en conditions industrielles. Elle permet en effet, après une seconde étape de recombinaison homologue, l'obtention d'une souche finale qui ne contient aucun marqueur de sélection (antibiotique et toxine). La souche finale (souche « fille ») s'affranchit donc de toute utilisation d'antibiotique, qui peut être 30 coûteuse lors d'un passage à l'échelle industrielle. La présente invention vise donc tout d'abord une cassette de gènes, schématisée dans la Figure 1, et comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène 3025803 3 procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins : un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur, le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle 5 d'un promoteur, et le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant 10 l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3'. La présente invention vise également un vecteur comprenant une telle cassette. La présente invention vise également un procédé de préparation d'une cellule isolée de Clostridium, comprenant au moins une étape a) de transformation d'au moins une cellule de 15 Clostridium avec ledit vecteur, qui est de préférence un plasmide. La cellule isolée de Clostridium ainsi transformée correspond à la souche plateforme. La présente invention a également pour objet une cellule isolée de Clostridium obtenue par ledit procédé. La présente invention a également pour objet une cellule isolée de Clostridium comprenant 20 dans son génome au moins la cassette de gènes selon l'invention, dans laquelle le gène de résistance à un antibiotique est sous le contrôle d'un promoteur endogène. Enfin, la présente invention a pour objet une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum accessible auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), déposée selon le Traité de 25 Budapest, le 25 juillet 2014 sous le numéro I-4878. Dans la présente demande, la cellule isolée de Clostridium est de préférence une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium beijerinckii ou de Clostridium butylicum.

30 Selon un premier aspect, la présente invention vise une cassette de gènes comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins : 3025803 4 un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur, le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle d'un promoteur, et le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un 5 variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3'.

10 Cette cassette contient tous les éléments nécessaires à la cellule de Clostridium qui la contient dans son génome (appelée souche plateforme), pour permettre des modifications ultérieures de son génome, et ainsi obtenir des souches « filles » présentant une insertion d'un gène exogène, une délétion d'un gène endogène, ou à la fois une insertion d'un gène exogène et une délétion d'un gène endogène.

15 Précisément, cette cassette comprend au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium. En effet, les gènes flanquant les extrémités 5' et 3' sont choisis en raison de leur proximité dans le génome de la cellule de 20 Clostridium considérée. Ils sont présents de façon adjacente dans le génome de la cellule de Clostridium considérée, i.e. ils sont consécutifs. Par exemple, les gènes flanquant les extrémités 5' et 3' sont respectivement les gènes hbd (SEQ ID NO :1) et Ca C2707 (SEQ ID NO :2). Entre ces deux gènes flanquants, les gènes d'intérêt sont insérés.

25 Ces gènes d'intérêt sont les suivants : un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur, par exemple le gène de résistance à l'érythromycine ermB de Clostridium difficile (SEQ ID NO :3), le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 placé sous le contrôle d'un promoteur (SEQ ID NO :4), et 30 le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630. Les séquences listées dans la présente invention sont repertoriées dans le tableau suivant : 3025803 5 SEQ ID NO : Séquence nucléique codée 1 Gène hbd de Clostridium acetobutylicum ATCC824 2 Gène Ca C2707 de Clostridium acetobutylicum ATCC824 3 Gène ermB de Clostridium difficile 4 Gène xylR de Clostridium difficile ssp.

630 5 Gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 6 Promoteur de l'opéron BCS de Clostridium acetobutylicum ATCC824 7 Cassette EXY II entière 8 Promoteur des gènes Xy1B et Xy1R de Clostridium difficile ssp.

630 9 Plasmide pEC500C EXyll 2707.5 10 Plasmide pEC500C 11 Plasmide pEC500C EXY 12 Plasmide pSR426 EXY 13 Plasmide pSEC500C 14 à 29 Amorces Le gène de résistance à l'antibiotique peut être choisi parmi tous les gènes de résistance aux antibiotiques existants, et notamment parmi les gènes de résistance à l'érythromycine, à 5 l'ampicilline, au chloramphénicol, à la tétracycline, à la spectinomycine, ou à la vancomycine. De préférence, on utilise le gène de résistance à l'érythromycine, de préférence le gène ermB de Clostidium difficile (SEQ ID NO :3). Ce gène de résistance à l'antibiotique doit satisfaire à deux conditions : - il doit être présent dans la cassette sans son promoteur, et 10 - il doit être adjacent à l'un des deux gènes flanquants, i.e. le gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou le gène procaryote flanquant l'extrémité 3'. En effet, grâce à ces deux caractéristiques, le gène de résistance sera intégré, dans le génome de la cellule de Clostridium considérée, de façon adjacente à l'un des gènes flanquants, et fonctionnera ainsi sous la dépendance du promoteur de ce gène flanquant, ledit promoteur 15 étant présent dans le génome et pouvant contrôler, dans le cadre d'un opéron, plusieurs gènes dont l'un des deux gènes flanquants est situé en fin dudit opéron. En d'autres termes, le gène 3025803 6 de résistance sera lié de façon fonctionnelle, in fine dans la souche plateforme, à un promoteur endogène de ladite souche. Par exemple, dans le cas où les gènes flanquant les extrémités 5' et 3' sont respectivement les gènes hbd et Ca C2707, et où le gène de résistance est adjacent à hbd, ce gène de résistance 5 sera lié de façon fonctionnelle, in fine dans la souche plateforme, au promoteur endogène du gène hbd de ladite souche. Le promoteur endogène du gène hbd contrôlera donc l'expression à la fois d' hbd mais aussi du gène de résistance à l'antibiotique. Par ailleurs ce promoteur contrôle l'expression d'autres gènes, car le gène hbd est le dernier gène de l'opéron BCS comprenant également les gènes crt, bcd, etfB et etfA (Z.L. Boynton, G.N. Bennett, F.B.

10 Rudolph Cloning, sequencing, and expression of clustered genes encoding P-hydroxybutyrylcoenzyme A (CoA) dehydrogenase, crotonase, and butyryl-CoA dehydrogenase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824, J. Bacteriol., 178 (1996), pp. 3015-3024). Par « promoteur », on désigne une région de régulation située en amont d'un cadre de lecture 15 ouvert (ORF), à proximité de son extrémité 5'. Dans la présente demande, on utilisera les termes « ORF » et « gène » de façon interchangeable. Un promoteur comporte certaines séquences nucléotidiques caractéristiques permettant la fixation du complexe d'initiation de la transcription ainsi que la fixation de régulateurs transcriptionnels. De préférence, le promoteur endogène qui contrôle l'expression du gène de résistance à 20 l'antibiotique est un promoteur fort, i.e. un promoteur qui permet une grande vitesse de transcription. Un tel promoteur est notamment le promoteur de l'opéron BCS, qui comprend plusieurs gènes dont le gène hbd situé en fin d'opéron (SEQ ID NO :6). Les caractéristiques ci-dessus mentionnées relatives au gène de résistance à l'antibiotique sont 25 importantes pour l'obtention d'une souche plateforme selon l'invention. En effet, des cassettes similaires ont été construites, mais avec le promoteur propre du gène de résistance à l'antibiotique. Les résultats obtenus avec ces cassettes ne sont pas concluants, car la pression de sélection exercée sur les cellules de Clostridium n'est pas suffisante pour obtenir des évènements de recombinaison homologue stable.

30 Les cellules de Clostridium présentent en effet naturellement une très faible fréquence de recombinaison homologue, et, sans pression de sélection efficace, le plasmide comprenant la cassette peut être intégré en entier, ce qui favorise ensuite des recombinaisons simples.

3025803 7 La cassette selon l'invention comprend également le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle d'un promoteur. De préférence, ce gène est placé sous le contrôle de son propre promoteur. Le gène xylR est présent en tant que tel, mais peut également être présent sous forme de 5 variant. Par « variant », on entend un acide nucléique présent au moins 80% d'identité, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, 95%, 97%, 99% d'identité avec le gène xylR. Enfin, la cassette selon l'invention comprend le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis 10 DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :8). Le gène ydcE code pour la toxine YdcE ou EndoA. L'expression de ce gène est placée sous le contrôle du promoteur du gène xylB (SEQ ID NO :8). Ainsi, le gène ydcE n'est exprimé qu'en présence de xylose dans le milieu de culture. In fine, les souches plateformes selon 15 l'invention, qui portent la cassette, sont incapables de croître en présence de xylose. L'opéron ydcE (endoA) code pour un système toxine-antitoxine appartenant à la famille de MazF/ChpAK/PemK. Ces gènes encodent des endo-ribonucléases qui clivent les ARN messagers au niveau de sites spécifiques. Le gène ydcE est présent en tant que tel, ou bien sous forme de variant. Par « variant », on 20 entend un acide nucléique présent au moins 80% d'identité, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, 95%, 97%, 99% d'identité avec le gène ydcE. Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques au sens de la présente invention, on désigne un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux 25 séquences à comparer. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière significative, la séquence d'acides nucléiques à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement significatif entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour 30 lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par « alignement significatif », on désigne l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité 3025803 8 déterminé comme ci-après est le plus élevé. Préférentiellement, on utilisera le programme BLAST pour obtenir un alignement significatif. De préférence, la cassette selon l'invention comprend, dans le sens 5' à 3': 5 un gène procaryote flanquant l'extrémité 5', un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur et adjacent au gène procaryote flanquant l'extrémité 5', le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle de son propre promoteur, 10 le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3'.

15 La présente invention vise également tout acide nucléique purifié ou isolé comprenant au moins la cassette de gènes conforme à l'invention. Préférentiellement, la présente invention a pour objet tout acide nucléique isolé ou purifié comprenant au moins la séquence SEQ ID NO :7.

20 Dans le contexte de l'invention, le terme « acide nucléique » désigne un enchaînement précis de nucléotides, pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN, et/ou un fragment d'ARN. Selon un mode préféré de réalisation, l'acide nucléique conforme à l'invention est un acide 25 nucléique recombinant. Par « acide nucléique recombinant », on désigne une molécule d'acide nucléique, simple ou double brin, qui a été modifiée par une intervention humaine de manière à contenir des fragments d'acides nucléiques combinés ou juxtaposés selon un arrangement n'existant pas à l'état naturel.

30 L'invention a également pour objet tout vecteur comprenant au moins la cassette conforme à l'invention. Par « vecteur », on désigne une molécule d'acide nucléique extrachromosomique, notamment un plasmide, ayant une réplication autonome et pouvant être incorporé dans une cellule hôte, en l'occurrence une cellule de Clostridium.

3025803 9 Typiquement, un vecteur est conçu pour permettre le transport de la cassette et contient un ou plusieurs sites de reconnaissance pour des enzymes de restriction qui permettent l'insertion ou clonage de ladite cassette, ce qui permet l'identification et la sélection des cellules de Clostridium transformées par ledit vecteur (notamment par le gène de résistance à 5 l' antibiotique). Un vecteur préféré selon l'invention est le plasmide pEC500C EXyll 2707.5 de séquence SEQ ID NO :9. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une cellule isolée de 10 Clostridium, comprenant au moins une étape a) de transformation d'au moins une cellule de Clostridium avec un vecteur, de préférence un plasmide, selon l'invention. L'étape a) de transformation est typiquement réalisée selon le protocole suivant : Les cellules sont rendues électrocompétentes par une méthode inspirée de celle décrite par Oultram et al., 1988 (FEMS Microbiology Letters, vol.56, Issue 1, 83-88). Seules les étapes 15 de centrifugation sont réalisées hors de la chambre anaérobie, mais dans des tubes scellés. Brièvement, 180 mL de milieu mCGM sont ensemencés avec 20 mL d'une préculture, obtenue à partir d'une suspension de spores. L'incubation s'effectue à 35 °C jusqu'à obtention d'une densité optique (DO) de 0,7 à 600 nm. Le culot, après centrifugation de 10 min à 6000 rpm, est lavé dans 20 mL de tampon d'électroporation (Saccharose 270 mM ; Tampon 20 phosphate pH 7,4 7mM; MgC12 1 mM) puis repris dans 4 mL de ce même tampon après nouvelle centrifugation. Les cellules compétentes ainsi obtenues sont aliquotées par 700 [tL dans des cryotubes conservés à -80 °C en conditions anaérobies (tubes placés dans des flacons scellés et désoxygénés). L'ADN plasmidique est inséré par électroporation. 300 [tL de suspension de 25 cellules compétentes sont placés dans une cuve d'électroporation (fente de 2 mm) en présence de 1 à 5 lag de plasmide méthylé (Heap et al 2007 ; L. Mermelstein & Papoutsakis, 1993). L'ensemble est électroporé à 1,25 kV, 25 [tF et 100 52,, sachant que le temps d'électroporation doit être compris entre 1,2 et 2,1 ms. Le contenu des cuves est ensuite transféré dans 3 mL de milieu mCGM frais et incubé à 37 °C dans la chambre anaérobie pendant au moins 3h. 2mL 30 sont ensuite centrifugés et repris dans 200 [tL de mCGM avant étalement sur boîte de sélection appropriée. De préférence, le procédé selon l'invention peut également comprendre, après l'étape a) : - une étape b) d'incubation de Clostridium obtenue à l'étape a) ; 3025803 10 - une étape c) de repiquage(s) des colonies obtenues à l'issue de l'étape b) ; puis - une étape d) de vérification de l'intégration correcte de la cassette de gènes dans le génome de la cellule de Clostridium. Les différentes constructions et souches transformées sont typiquement vérifiées par PCR sur 5 thermocycleur. Les conditions de température et les temps d'incubation sont adaptés en fonction des fragments à amplifier et des amorces utilisées. L'ADN des souches transformées de Clostridium est notamment obtenu après dépôt de 8 pL de culture sur plaque FTA. Ces plaques contiennent des agents qui lysent les cellules, dénaturent les protéines et protègent les acides nucléiques des nucléases, de l'oxydation et des UV. Pour les analyses, un poinçon peut être 10 prélevé sur la plaque et utilisé directement après rinçage à l'eau. De préférence, l'étape d) se fait par PCR, notamment par PCR multiples. En effet, après transformation du vecteur dans la cellule, l'intégration correcte de la cassette dans le génome doit être recherchée, notamment par différentes PCR.

15 A cette fin, on peut utiliser avantageusement les PCR suivantes : - la PCR A: cette PCR utilise une amorce dont la séquence s'hybride avec des portions endogènes, en 5' et en 3', extérieures auxdits gènes flanquants. Cette PCR A permet de vérifier l'intégration de la cassette dans le génome de la cellule ; - les PCR B et C : ces PCR permettent de vérifier la présence de la cassette sur le vecteur.

20 Elles utilisent chacune deux amorces dont les séquences s'hybrident sur des portions d'acide nucléique de la cassette et sur une partie spécifique du vecteur (non intégré à terme dans le génome). Ces PCR B et C servent à vérifier la présence de vecteurs résiduels contenant la cassette non intégrée dans le génome des cellules de Clostridium. De préférence, les amorces suivantes sont utilisées dans les PCR A à C : 25 PCR A: séquences SEQ ID NO: 24 et 25, PCR B: séquences SEQ ID NO: 26 et 27, PCR C: séquences SEQ ID NO: 28 et 29. A l'issue du procédé selon l'invention, on obtient donc une cellule isolée de Clostridium 30 transformée de façon stable par la cassette de gènes. Cette cellule est appelée souche plateforme. Par transformation ultérieure avec un vecteur adapté, notamment un plasmide, comprenant éventuellement un gène d'intérêt, puis par recombinaison homologue, la souche « fille » obtenue comprend in fine des modifications génétiques (délétion, insertion ou délétion et insertion) telles qu'elle ne contient plus ni marqueur de sélection (par exemple un 3025803 11 gène de résistance à un antibiotique), ni aucun autre élément génétique ne correspondant pas aux modifications génétiques réalisées. La souche plateforme est donc un outil essentiel pour l'obtention de souches utilisables à l'échelle industrielle.

5 La présente invention a également pour objet une cellule de Clostridium isolée susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. La présente invention vise également une cellule isolée de Clostridium comprenant dans son génome au moins la cassette de gènes selon l'invention, dans laquelle le gène de résistance à 10 un antibiotique est sous le contrôle d'un promoteur endogène. Plus précisément, la cellule isolée de Clostridium, qui comprend dans son génome au moins la cassette de gènes selon l'invention, est telle que le gène de résistance à un antibiotique et un gène endogène sont tous deux sous le contrôle d'un promoteur endogène unique.

15 Les expressions « sous le contrôle d'un promoteur » et « lié de façon fonctionnelle à un promoteur » qualifient un gène et sont équivalentes. Elles désignent le fait que le promoteur permet la transcription dudit gène. Un exemple d'une telle cellule isolée de Clostridium acetobutylicum est accessible auprès de 20 la CNCM sous le numéro I-4878. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration des objets de l'invention, dont ils ne constituent 25 en aucune manière une limitation. LISTE DES FIGURES 30 Figure 1. Schéma de la cassette EXy II (Erythromycine, xylR, ydcE II). Figure 2. Schéma de la PCR A utilisée pour distinguer les souches C. acetobutylicum ATCC 824 ayant intégré la cassette EXy II de celles qui ne l'ont pas intégrée.

3025803 12 Figure 3. Résultats de la PCR A effectuée sur certaines souches C. acetobutylicum ATCC 824 transfectées. Il apparaît que les clones 1 et 25 ont intégré la cassette EXy II. Les clones 14 et 22 ne l'ont pas intégrée, et sont identiques à la souche sauvage (WT).

5 Les clones 11 et 35 ont intégré en partie la cassette EXy II. Figure 4. Schéma des PCR B et C utilisée pour identifier les souches C. acetobutylicum ATCC 824 ayant correctement intégré la cassette EXy II. Les PCR B et C sont spécifiques de l'ADN plasmidique. Elles identifient donc les clones qui 10 présentent la cassette dans le plasmide. Figure 5. Résultats des PCR B et C effectuées sur certaines souches C. acetobutylicum ATCC 824 transfectées. Il apparaît que tous les clones mentionnés sur la figure présentent la cassette EXy II dans le 15 plasmide. Cela est particulièrement vrai pour le clone 11.6. EXEMPLE 1 : Construction de la cassette EXy II 20 Milieux de culture Les souches d'E. coli et de Bacillus licheniformis ont été cultivées sur milieu LB liquide et agar. Les milieux de culture ont pu être complémentés par des antibiotiques (ampicilline (1001..tg/mL) et ou chloramphénicol (30 idg/mL)) lorsque ceux-ci étaient recommandés.

25 Les souches de S. cerevisiae (W303 et ses transformants) ont été cultivées sur milieu CSM- URA. Extraction de l'ADN génomique Les ADN génomiques des souches cultivées ont été extraits en utilisant le kit "GenEluteTM 30 Bacterial Genomic" de Sigma Aldrich. Construction génétique Les constructions génétiques (cassettes et plasmides), décrites ci-dessous, ont été réalisées par recombinaison homologue dans la souche de Saccharomyces cerevisiae W303.

3025803 13 Construction de pSEC500E, pSEC500C et pSEC501E Les plasmides pSEC500E et pSEC500C sont dérivés des vecteurs E. coli1Clostridium plasmides pMTL500E et pMTL500C. Une cassette "Saccharomyces" contenant le gène 5 URA3 et l'origine de réplication 41 du plasmide pSR426 a été insérée dans ces deux plasmides. Pour chacun de ces plasmides, la cassette "Saccharomyces" peut être retirée aisément par digestion avec l'enzyme de restriction avril suivie d'une autoligation. Le plasmide pSEC501E est un plasmide dérivé de pSEC500E. La séquence d'ADN allant du promoteur du gène ampr à l'origine de réplication pAMf31 a été amplifiée avec les couples 10 d'oligonucléotides 13 ermB amp F/13 URA3 pAMf31 F. La séquence d'ADN de pSEC500C allant du promoteur du gène ermB' au gène URA3 a été amplifiée avec les oligonucléotides 13 amp ermB F et 13 pAMB1 URA3 R. Les deux fragments PCR ont été utilisés pour transformer S. cerevisiae W303. Le plasmide pSEC501E, à la différence de pSEC500E, contient un site de restriction spel entre les gènes ermB' et amer. Ainsi en 15 digérant pSEC501E par Avril et spel, les gènes ermBr, URA3 et l'origine de réplication 41 peuvent être excisés pour donner pMTL501. Construction de la cassette EXy 20 Les plasmides et les amorces utilisés lors de ces expériences sont répertoriés dans les tableaux 1 et 2. Tableau 1 : Nom de l'amorce Séquence (5'->3') Tm SEQ ID NO : (Bases soulignées correspondant à la zone d'amorce PCR) G pAMB1 2707 F caactgttgggaagggcgatcgccaagtatctacaggaaatgc > 75 14 G ydcE- xR 2707 R tgaaagttgcgtttacaagaatccccattatc 64,4 15 G 2707 ydcE- xR F tcttgtaaacgcaactttcatcaatattaaaaatc 61,3 16 G hbd ermB R attcaaaataaaagaaggagtgattacatgaac 60,8 17 G ermB hbd F actccttcttttattttgaataatcgtagaaacc 62,2 18 3025803 14 G colE1 hbd R agcgagtcagtgagcgaggaggaagagcggaggtctgtttaatgaaaaag > 75 19 Tableau 2 : Matrice Amorces Amplification ATCC824 SEQ ID CAC2707 NO :14 & 15 SEQ ID hbd NO :18 & 19 pEC500C eXYII 2707.5 SEQ ID exyII NO :16 & 17 Le gène de l'érythromycine dépourvu de son promoteur a été amplifié à partir du plasmide 5 pMTL500E avec les amorces 13 pAMB1 ermB F (agctggcgaaagggggatgtg ctgcactgccgggcctcttgcgggatc, SEQ ID NO :20) et 13 xylR ermB R (ataaccctttaaattatacattcctttccaaa tttacaaaagcgactc, SEQ ID NO :21). Le produit de PCR mesure 1100 bp. Le gène du régulateur Xy1R et le promoteur du gène xylB ont été synthétisés de novo par Eurofins mwg et introduits dans le plasmide pUC57. Le gène 10 xylR et le promoteur du gène xylB ont été amplifiés par PCR à partir du plasmide pUC57 xylR avec les amorces 13 ermB xylR R et 13 ydcE xylR F. Le produit de PCR mesure 1463 bp. L'ADN génomique de la souche B. licheniformis DSM 13 a été extrait à partir d'une culture nocturne. Le gène ydcE (ou ndoA) a été amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique de B. 15 licheniformis DSM 13 avec les amorces 13 xyl ydcE F et 13 426 ydcE R. Le produit de PCR mesure 400 bp. Le plasmide pSR426 a été linéarisé par xhol et bamHl et purifié sur gel. Un mix contenant 41.1.L de chaque PCR et 41.1.L du plasmide pSR426 linéarisé a été utilisé pour transformer S. cerevisiae W303. Les cellules transformées ont été étalées sur une gélose de CSM-URA.

20 L'ADN total est ensuite extrait des transformants de S. cerevisiae et utilisé pour transformer des E. coli compétentes Top10 et obtenir un plasmide pSR426 EXY (SEQ ID NO :12). La cassette EXY une fois construite dans ce plasmide a été ensuite intégré par amplification PCR (colE1 hbd f : gcggataacaatttcacacaggaaacagctgggaggtctgtttaatgaa SEQ ID NO :22 / 13 pAMB1 2706 R agctggcgaaagggggatgtgCTCGAGccaagtatctacaggaaatg SEQ ID NO :23) 25 au sein du plasmide vecteur pEC500C (SEQ ID N :10) pour former le plasmide pEC500C EXY (SEQ ID NO :11).

3025803 15 Construction de la cassette d'insertion EXY II Une partie de l'ORF Ca_C2707 et le gène hbd ont été amplifiés à partir de l'ADN génomique de C. acetobutylicum ATCC 824. Le couple d'oligonucléotides G pAMB1 2707 F et 5 G ydcE-xR 2707 R a été utilisé pour le fragment Ca_C2707 et le couple d'oligonucléotides G ermB hbd F et G colE1 hbd R pour le gène hbd. Des amplifications PCR sont réalisées avec les couples d'amorces G 2707 ydcE-xR F / G hbd ermB R pour amplifier la cassette EXy II à partir du plasmide pEC500C EXy. Les amplifications PCR sont transformées dans S. cerevisiae W303 avec le plasmide pSEC500C (SEQ ID NO :13) digéré par PvuI/SapI. Une 10 fois récupéré, ce plasmide est digéré par Avril et retransformé dans E. coli afin de récupérer le plasmide pEC500C EXYII 2707.5 (SEQ ID NO :9). Obtention du plasmide La cassette de sélection EXy II a donc été intégrée au sein d'un vecteur plasmidique nommé 15 pEC500C Exyll 2707.5 contenant : une origine de réplication E. coli (Co1E1), un gène de résistance au chloramphenicol (CatP), une origine de réplication Clostridium (pAM(31), la cassette de sélection EXy II insérée entre les gènes hbd et CAC 2707 du génome de Clostridium.

20 Sélection par la cassette EXy II Le plasmide pEC500C_EXyII_2707.5 est transformé dans la souche C. acetobutylicum ATCC 824. La croissance de la souche est ensuite observée. Les géloses utilisées contiennent toutes 25 p.g/mL d'érythromycine. Seule la souche sauvage (WT) est inhibée par cet antibiotique, les souches contenant un plasmide (pEC500E ou 25 pEC500C_EXyII_2707.5) ne le sont pas (données non montrées). Cette observation montre que le gène de l'érythromycine de la cassette EXy II contenu dans le plasmide pEC500C_EXyII_2707.5 est fonctionnel. L'effet du xylose sur la croissance des souches est également observé. En effet, les souches ATCC 824(pEC500E) et ATCC824(pEC500C EXyll 2707.5) montrent une croissance faible sur une gélose contenant 30 uniquement du xylose comme source de carbone. Cette faible croissance ne permet pas d'observer l'effet du xylose sur la croissance de la souche ATCC 824 (pEC500C_EXyII_2707.5). La présence de glucose dans la gélose permet d'augmenter le taux de croissance des deux souches. Cultivée sur une gélose contenant 1 % de glucose et 4 % de xylose, la croissance de la souche ATCC 824 (pEC500E) n'est pas inhibée. La croissance de 3025803 16 la souche C. acetobutylicum ATCC 824 (pEC500C EXIT 2707.5) cultivée dans les mêmes conditions est inhibée par le xylose. L'effet du xylose semble être fonction de la densité cellulaire de l'inoculum, avec un phénotype clairement visible pour des inocula de faibles densités.

5 EXEMPLE 2 : Construction de la souche plateforme C. acetobutylicum ATCC 824 EXY II 2707.5 10 Le plasmide pEC500C EXyII 2707.5 est transformé dans la souche C. acetobutylicum ATCC 824. L'intégration de la cassette EXy II dans le génome de la souche entre les ORFs Ca C2707 et Ca C2708 (hbd) est ensuite recherchée par différentes PCR, les PCR A à C. Les amorces utilisées pour ces dernières sont décrites dans les Tableaux 3 à 5.

15 Une amplification PCR (PCR A) est tout d'abord réalisée sur les génomes des clones d'ATCC 824(pEC500C EXyll 2707.5) générés (Figure 2). Des souches recombinantes d'ATCC 824(pEC500C EXyll 2707.5) ont été obtenues et testées par amplification PCR A pour l'insertion de la cassette EXy II. Les clones 1 et 25 montrent une insertion de la cassette EXy II au bon emplacement (Figure 3). L'amplification PCR A effectuée sur l'ADN extrait des 20 clones 11 et 35 montre qu'il existe pour ces clones une population mixte : avec et sans insertion de la cassette EXy II. Pour définitivement vérifier l'intégration de la cassette il faut donc avoir recours à une série de repiquages sur boîte de sélection contenant de l'érythromycine suivie d'un contrôle de l'intégration de la cassette via les PCR B et C détaillées en Figure 4.

25 L'analyse des PCRs B et C (Figure 5) confirme la présence de clones possédant la cassette présente au sein d'un plasmide circulaire (clones 11.6 et 34) ou d'un plasmide intégré dans le génome (clones 1, 13 et 22). Les clones 11.1 et 25 ne possèdent plus que la cassette intégrée dans le génome (absence d'amplification des PCR B et C correspondant au contrôle dit 30 « plasmide »).

3025803 17 Tableau 3 : Nom de l'amorce Séquence (5'->3') Tm SEQ ID NO: V 2706 2707 F ctctttgagggcttcttaacaca 58,9 24 V etfa hbd R cagcatttagcaggtatgcaag 58,4 25 V pamB1 2707 F ctaaaacgtcgaggggcag 58,8 26 V ydce 2707 R gaaatgatggaaaaggtcaacg 56,5 27 V ermb hbd F gacgcatggctttcaaaaac 55,3 28 V colE1 hbd R gggaaacgcctggtatcttt 57,3 29 Tableau 4 : PCR Matrice Amorces Amplification A ATCC824 SEQ ID hbd-2707 NO :24 & 25 B pEC 500C EXyII 2707,5 SEQ ID 2707 NO :26 & 27 C SEQ ID hbd NO :28 & 29 Tableau 5 : Amorces des 5 PCR (A à C) utilisées pour le screening de la cassette EXy II chez C. acetobutylicum ATCC 824 PCR PCR A PCR B PCR C Amorces /V etfA hbd R /V 2706 2707 F /V ydce 2707 R /V pamB1 2707 F /V colE1 hbd R /V ermb hbd F Echantillon ADN Pas d'intégration de EXy II aucun produit - EXy II intégré 4796 bp aucun produit aucun produit pEC500C EXyll 2707.5 2226 bp 1235 bp 1518 bp 5 10

Claims (13)

1. REVENDICATIONS1. Cassette de gènes comprenant au moins un gène procaryote flanquant l'extrémité 5' et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3', lesdits gènes étant choisis parmi deux gènes présents de façon adjacente dans un génome de Clostridium, et entre lesquels sont insérés au moins : un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur, le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle d'un promoteur, et le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, le gène de résistance à l'antibiotique étant adjacent audit gène procaryote flanquant l'extrémité 5' ou audit gène procaryote flanquant l'extrémité 3'.
2. 2. Cassette selon la revendication 1, comprenant, dans le sens 5' à 3': un gène procaryote flanquant l'extrémité 5', un gène de résistance à un antibiotique, dépourvu de son promoteur et adjacent au gène procaryote flanquant l'extrémité 5', le gène xylR de Clostridium difficile ssp. 630 (SEQ ID NO :4) placé sous le contrôle de son propre promoteur, le gène ydcE de la souche Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO :5), ou un variant de celui-ci, ledit gène ou variant étant placé sous le contrôle du promoteur du gène xylB de Clostridium difficile ssp. 630, et un gène procaryote flanquant l'extrémité 3'.
3. 3. Cassette de gènes selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le gène de résistance à un antibiotique est le gène de résistance à l'érythromycine ermB de Clostridium difficile, de préférence de séquence SEQ ID NO :3. 3025803 19
4. 4. Cassette de gènes selon la revendication 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend les séquences suivantes : SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5, de préférence en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID NO :7. 5
5. 5. Vecteur, de préférence plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette de gènes selon l'une des revendications 1 à 4.
6. 6. Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est le plasmide pEC500C EXyll 2707.5 de séquence SEQ ID NO :9. 10
7. 7. Procédé de préparation d'une cellule isolée de Clostridium, comprenant au moins une étape a) de transformation d'au moins une cellule de Clostridium avec un vecteur, de préférence un plasmide, selon la revendication 5 ou 6. 15
8. 8. Procédé selon la revendication 7, comprenant, après l'étape a) : - une étape b) d'incubation de Clostridium obtenue à l'étape a), pendant un temps suffisant pour que la recombinaison homologue s'effectue dans la cellule ; - une étape c) de repiquage(s) des colonies obtenues à l'issue de l'étape b) ; puis - une étape d) de vérification de l'intégration correcte de la cassette de gènes dans le génome 20 de la cellule de Clostridium.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape d) se fait par PCR, de préférence par les PCR A à C qui utilisent les amorces suivantes : PCR A: séquences SEQ ID NO: 24 et 25, 25 PCR B: séquences SEQ ID NO: 26 et 27, PCR C: séquences SEQ ID NO: 28 et 29.
10. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la cellule isolée de Clostridium est une cellule isolée de Clostridium acetobutylicum, Clostridium 30 saccharolyticum, Clostridium beijerinckii ou de Clostridium butylicum. 3025803 20
11. 11. Cellule isolée de Clostridium susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 7 à 10.
12. 12. Cellule isolée de Clostridium comprenant dans son génome au moins la cassette de gènes 5 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le gène de résistance à un antibiotique est sous le contrôle d'un promoteur endogène.
13. 13. Cellule isolée de Clostridium acetobutylicum accessible auprès de la CNCM sous le numéro I-4878. 10