KR101311619B1 - 클로스트리디아에서 ｄｎａ 서열 대체 및 염색체 통합하기 위한 방법 - Google Patents

클로스트리디아에서 ｄｎａ 서열 대체 및 염색체 통합하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산업 수준으로 적용 가능하고 수행하기 용이한, 클로스트리디아 (Clostridia)에서 DNA 서열을 고 효율로 대체 또는 결실시키기 위한 신규 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 클로스트리디아에서의 몇 가지 유전자 자리를 통상적인 방식으로 변형시키는 데에 유용하다. 상기 방법은 둘 이상의 마커 유전자를 수반하는 복제 벡터에 기초한다.
클로스트리디아 균주, 염색체 통합, DNA 대체, 마커 유전자, 복제 벡터

Description

클로스트리디아에서 ＤＮＡ 서열 대체 및 염색체 통합하기 위한 방법 {Process for chromosomal integration and DNA sequence replacement in Clostridia}
클로스트리디아 (Clostridia)는 용매, 특히 부탄올, 에탄올 및 아세톤 뿐만 아니라 디올, 예를 들어 1,3-프로판디올, 유기 산, 예를 들어 아세트산, 부티르산 또는 락트산 및 백신을 생성시킬 수 있는 능력 때문에 산업 분야에서 광범위하게 사용되고 있는 그램 양성, 혐기성 및 저 GC 세균이다.
재조합 클로스트리디아를 구축하는 것은 해당 분야에 관한 개발에 있어서 중요한 부분이다. 클로스트리듐 (Clostridium) 균주를 그들의 산업적 능력을 개선시키기 위해 유전적으로 변형시킨다.
이러한 변형을 수행하기 위해, 모든 종류의 유기체에서 가장 많이 사용되고 있는 기술이 상동 재조합이다. 몇 가지 미생물에서의 형질전환 및 상동 재조합이 당해 분야에 광범위하게 보고되었다 [참고: 예를 들어, Datsenko and Wanner; PNAS, 2000 and Fabret et al., Molecular Microbiology, 2002].
클로스트리디아는 천연상으로는 형질전환 가능하지 않고, 이들을 형질전환시키기 위해 현재 이용 가능한 방법은 비효율적이며, 다중 돌연변이의 도입을 허용하지 않는다. 이는 해당 분야에서의 산업적 개발을 방해하였다.
클로스트리디아는 통상적으로, 형질전환을 위해 세포 내로 도입하기 전 및 후에 외래 DNA를 분해시키는 제한 효소 및 세포외 DNAse를 생산한다. 이. 콜라이 (E. coli) 또는 효모와 같은 많은 미생물에서 잘 작동하는 PCR 단편의 도입에 기초한 전통적인 방법은 이들 유기체에서 실행할 수 없는데, 이는 재조합될 DNA 구조물의 세포외 및 세포내 반감기가 너무 짧고 재조합 효율이 일반적으로 낮기 때문이다. 다른 유기체에서는, 이러한 난제들이 숙주에서 복제하는 벡터를 사용하여 재조합 사건 가능성을 증가시킴으로써 교묘하게 회피되었다. 그럼에도 불구하고, 재조합 사건 후 본래의 표적 DNA 서열을 수반하게 되는 벡터를 제거해야만 하였다. 이러한 문제점은 증식 불허 온도에서 제거될 수 있는 온도-민감성 레플리콘 (replicon)을 사용함으로써 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis) [참고: Biswas et al., J Bacteriol., 1993]에서 해결되었다. 이들 특징을 수반한 벡터는 현재 클로스트리디아에 대해 이용 가능하지 않다. 따라서, 클로스트리디아에서 돌연변이체를 구축하는 것은 지금까지 극히 힘들었고 종종 성공적이지 못하였다.
클로스트리디아에서의 유전자의 불활성화가 다음 문헌에 보고되었다 (표 1 참고):
Figure 112009019957217-pct00001
유전자 불활성화는 지금까지, 표적 균주에서는 복제될 수 없었던 환상 DNA를 이용하여 형질전환시킴으로써 클로스트리디아에서 수행하였다. 클로스트리디아에 존재하는 DNAse 및 DNA 제한 엔도뉴클레아제는 도입된 DNA를 신속하게 분해시키고, 일반적으로 이러한 속에서의 재조합 빈도는 그리 높지 않기 때문에, 돌연변이체의 입수는 극히 힘들었다.
또한, 지금까지 보고된 재조합 균주 (상기 참고)는 MLS 또는 클로람페니콜 (chloramphenicol)에 대해 모두 내성이 있고, 상응하는 마커 유전자는 재조합 사건이 일어난 후에는 제거할 수 없다. 이로써, 이들 세균에서 입수 가능한 내성 마커의 수에 대한 가능한 재조합 수는 최대 3으로 제한된다. 더우기, 이들 세균을 산업적으로 사용하는 경우에는, 항생제 내성 유전자가 발효 배지 내로 방출되는 것을 피하기 위하여 마커가 없는 균주를 사용하는 것이 유용할 수도 있다.
더우기, 단일 재조합 사건에 의해 수득된 이들 균주 중의 몇몇은 이들을 어떠한 선택 압력없이 배양할 경우에 안정적이지 못하다라는 단점을 지니고 있다.
결과적으로, 동일한 균주에서 성공적인 DNA 서열 대체를 허용하여, 유전적으로 안정하고 마커가 없는 재조합 클로스트리디아를 유발시켜 주는 용이한 재조합 균주 선택 단계를 이용하여, 클로스트리디아를 고 효율로 형질전환시키기 위한 방법이 여전히 당해 분야에 요망된다.
본 발명은 산업 수준으로 적용 가능하고 수행하기 용이한, 클로스트리디아에서 DNA 서열을 대체 또는 결실시키기 위한 신규 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 클로스트리디아에서의 몇 가지 유전자 자리를 통상적인 방식으로 변형시키는 데에 유용하다.
상기 방법은 클로스트리디아를 고 효율로 형질전환시키는 데에 유용한 복제 벡터에 기초한다.
게놈으로부터 내성 카세트 제거하고, 이를 후속 DNA 서열 대체 라운드에 재사용함으로써, 상기 신규 방법을 사용하여 무제한 수의 돌연변이를 게놈 내로 도입할 수 있다.
다중 돌연변이를 클로스트리디아 내로 효율적으로 도입함으로써, 기존의 산업 균주를 개선시키고 신규 공정을 개발할 수 있게 해주어야 한다.
본 발명은
- 클로스트리디아 균주를,
- 클로스트리디아에서의 복제를 허용해 주는 복제 기점;
- 카세트를 재조합할 수 있게 하는, 표적 DNA 서열 주변에서 선택된 영역과 상동성인 2개 서열에 의해 둘러싸인 제1 마커 유전자를 포함하는 대체 카세트; 및
- 제2 마커 유전자
를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계,
- 제1 마커 유전자를 발현하는, 그들의 게놈 내에 상기 카세트를 통합시킨 균주를 선택하는 단계; 및
- 제2 마커 유전자를 발현하지 않는, 상기 벡터를 제거시킨 균주를 선택하는 단계
를 포함하는, 클로스트리디아에서 상동 재조합에 의해 표적 DNA 서열을 대체시키는 방법을 제공한다.
본 발명을 실현시키기 위해 사용된 모든 분자 생물학 기술은 다음 문헌에 상세히 보고되었다 [참고: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, by Sambrook, Fritsch and Maniatis].
본 발명의 맥락에서 사용된 용어 표적 DNA 서열의 "대체"는 본래의 것과는 상이한 서열을 표적 DNA 서열의 유전자 자리에 도입하는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, DNA 서열은 유전자, 또는 유전자간 서열로서 정의된다. 둘 다 프로모터 또는 조절성 서열을 포함할 수 있다.
표현 "표적 DNA 서열"은 당업자에 의해 선택된 관심있는 모든 유전자, 유전자간 영역, 프로모터 또는 조절성 서열을 의미한다. 이는 특히, 관심있는 단백질, 예를 들어 세포성 대사에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 의미한다.
치환된/삽입된 DNA 서열은 암호화될 수 있거나 그렇치 않을 수 있다. 이는 표적 유전자, 프로모터 또는 조절성 서열의 돌연변이된 서열 및/또는 마커, 예를 들어 항생제 내성 유전자 또는 발색 효소일 수 있다. 이는 2개의 상동성 영역 간에 떨어진 거리에 따라서, 대체된 서열 보다 더 길거나 짧을 수 있다.
삽입으로 인해, 표적 유전자의 발현은 통상적으로 변동되거나, 부분적 또는 완전히 저해되거나, 또는 증가된다. 표적 DNA 서열을 본래의 것과 근접하긴 하지만 돌연변이를 포함하는 서열로 대체시키면, 돌연변이된 단백질, 프로모터 또는 조절성 서열의 실제적 발현이 유발된다.
표적 DNA 서열의 대체에 따른 결과로서 상기 DNA 서열이 완전히 제거되는 경우, 이러한 유전자는 "결실된" 것으로 간주된다.
표현 "상동 재조합"은 DNA 절편을, 동일한 영역 (상동성) 또는 거의 동일한 영역을 보유하고 있는 또 다른 것으로 치환시킨 사건을 지칭한다. 이러한 사건은 DNA 교차로 불리우기도 한다.
용어 "형질전환"은 외인성 핵산이 특정 세포에 의해 혼입되는 것을 지칭하는데, 이러한 신규 유전자의 획득은 일시적이거나 (유전자를 수반하는 벡터가 제거되는 경우) 또는 영구적이다 (외인성 DNA가 염색체 내로 통합되는 경우).
용어 "벡터"는 통상적으로는 환상 이중 가닥의 DNA 분자 형태이지만, 단일 가닥의 DNA 분자일 수도 있는, 유전자 또는 카세트를 수반하는 염색체외 요소를 지칭한다. 용어 "벡터"와 "플라스미드" 둘 다는 차별없이 사용된다.
본 발명에 따르는 벡터는 복제 벡터이다. 이는 하나 이상의 복제 기점, 및 우선적으로 수 개의 복제 기점을 포함하여, 상이한 종에서 기능적이 되도록 할 수 있다.
특히, 바람직한 벡터는 다음 2개의 복제 기점을 포함할 수 있다:
- 이. 콜라이에서 기능적인 Ori;
- 클로스트리디아에서 기능적인, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)로부터 유래된 pIM13으로부터의 RepL [참고: Mermelstein et al., Biotechnology, 1992].
표현 "표적 DNA 서열과 상동성인 서열"은 표적 서열의 선택된 영역과 높은 서열 유사성을 지닌 서열을 지칭한다. 용어 "마커 유전자"는 클로스트리디아에서 기능적인 조절성 요소의 제어 하에 마커 단백질을 암호화하는 서열을 지칭한다. 이러한 단백질은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 당업자는 항생제 내성 유전자, 형광성 또는 착색 마커, 또는 영양요구성 마커를 사용할 수 있다. 유용한 마커 유전자의 예가 다음에 제공될 것이다.
재조합 사건이 발생한 후, 벡터는 본래의 표적 DNA 서열을 수반하게 되므로, 결과적으로 이를 제거시켜야만 한다. 복제 벡터의 제거는 일반적으로, 클론을 연속적으로 배양한 다음, 이러한 벡터가 제거된 클론을 음성 또는 양성 선택하는 것을 수반한다. 벡터의 제거는 벡터 내에 존재하는 DNA 서열을 특이적으로 절단시켜 주는 엔도뉴클레아제를 사용하는, 해당 방법의 활성 단계일 수도 있다. 일단 벡터가 제거되면, 균주는 제2 마커 유전자를 더 이상 발현하지 않고, 이러한 특징에 기초하여 균주를 선택할 수 있다.
본 발명의 특별한 양태에서, 제2 마커 유전자는 항생제 내성 유전자이다. 유용한 항생제 내성 유전자 중에서 가장 적당한 것을 당업자는 인지할 수 있을 것이다. 예를 들어, 다음 유전자를 사용할 수 있다: 클로람페니콜 및 티암페니콜 (thiamphenicol)에 대한 내성을 제공해 주는 CatP 유전자, 또는 에리트로마이신에 대한 내성을 제공해 주는 MLSR 유전자.
본 발명의 바람직한 양태에서, 제2 마커 유전자는 역-선택 가능한 마커 유전자이다.
역-선택 가능한 마커는 특정 환경, 예를 들어 그의 동족 기질의 존재 하에서는 그의 존재가 숙주 유기체에 치명적인 유전자이다. 역-선택 가능한 마커는 플라스미드의 상실에 대한 양성 선택으로서 사용될 수 있다.
바람직하게, 역-선택 가능한 마커 유전자는 부재하거나 결실된 비필수 내인성 유전자의 활성을 복원시켜 주는 유전자이다. 가장 널리 사용되고 있는 역-선택 가능한 마커는 슈크로스, 스트렙토마이신 또는 푸사르산 민감성을 부여해 주는 유전자이다. 이는 몇 가지 세균성 균주에서 돌연변이체 또는 백신 균주를 구축하기 위해 사용되었다. 이에 대한 상세 내역은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Reyrat et al., 1998, Infection and Immunity]. 클로스트리디아에서 사용될 수 있는 역-선택 가능한 마커에는 5-플루오로-우라실 (5-FU), 감마-글루타밀 히드라지드 (GBS) 또는 8-아자-2,6-디아미노푸린 (8ADP)에 대한 민감성을 제공해 주는 유전자가 포함된다.
바람직한 양태에서, 역-선택 가능한 마커는 5-플루오로-우라실 (5-FU)을 독성 생성물로 변환시키는 것을 증진시켜 주는 우라실 포스포리보실-트랜스퍼라제를 암호화하는 upp 유전자이다. Upp 활성을 지닌 세포는 5-FU 배지 상에서 성장할 수 없다.
이러한 역-선택 가능한 마커를 사용하는 것은, 형질전환된 클로스트리디아가 △upp인 경우에 특히 유용하므로, 결과적으로 벡터를 형질전환시키기 전 및 벡터를 제거한 후에 5-FU를 포함하는 배지 상에서 성장시킬 수 있다. 벡터를 제거시킨 균주가 양성적으로 선택될 수 있다.
5-FU의 존재 하에 upp 유전자를 생성시킬 수 있는 억제인자 돌연변이체는 종종, 플라스미드의 상실과 관련하여 잘못된 전제를 가져다줄 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 벡터는 추가로 제3 마커, 우선적으로는 항생제에 대해 민감성인 균주의 제2 선택을 허용해 주는 항생제 내성 유전자를 포함한다. upp 유전자에 기초한 양성 선택 이외에도 상기 음성 선택을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 벡터는 재조합 사건이 발생한 후 엔도뉴클레아제로 분해시킴으로써 없앤다. 우선적으로, 벡터에는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고 이와 동시에, 사용된 클로스트리듐 종의 게놈 중에 부재하는 DNA 서열이 정착되어 있다. 따라서, 벡터는 클로스트리듐 게놈의 완전성을 상실하지 않고서도 특이적으로 파괴된다.
제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 부위인 특이적 염기 서열의 위치에서 DNA 분자를 절단시키는 효소이다. 당업자는 제한 엔도뉴클레아제 부위가 관심있는 클로스트리듐 균주의 게놈 중에 부재한다는 것을 결정할 수 있을 것이다. 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum)에 적용할 수 있는 가능한 제한 엔도뉴클레아제는 AscI, FseI, NotI, SfiI, SrfI이다. 또 다른 양태에서는, 대형 (12-45 bp) DNA 표적 부위를 인식하는 메가뉴클레아제 (meganuclease), 예를 들어 I-SceI, HO 또는 I-CreI를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 균주에는 그의 게놈 상에, 벡터 상에 존재하는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 인식하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 암호화 유전자가 정착되어 있다. 임의로, 제한 엔도뉴클레아제 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
유도성 프로모터는 상응하는 유도인자를 부가함으로써 표적 서열의 조건부 발현을 허용해 주는 DNA 요소이다. 예를 들어, 당업자에게 공지되어 있는 클로스트리듐 중에서의 유도성 프로모터 시스템은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Girbal et al., 2003, Appl. Env. Microbiol. 69:4985-8].
재조합 사건이 발생한 후, 및 벡터를 제거시킨 균주를 스크리닝하기 전에, 제한 엔도뉴클레아제의 발현을 유도시킬 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제는 클로스트리디아에 존재하는 벡터를 절단시켜 그를 제거시킬 것이다.
임의로, 제한 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를, 벡터를 균주 내로 도입하기 전에 게놈 상에 삽입할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 제한 엔도뉴클레아제 암호화 유전자는 환상 DNA 보다 더 우수하게 재조합하는 것으로 공지되어 있는 세포 중의 선형 DNA의 양을 증가시킴으로써 플라스미드를 없애기 전에 재조합 빈도를 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 특별한 양태에서, 제1 마커 유전자는 대체 카세트의 중앙에 도입된 항생제 내성 유전자이다.
본 발명의 구체적 양태에서, 이러한 제1 마커 유전자는 형질전환시킨 클로스트리듐 균주의 게놈으로부터 제거할 수 있다. 특히, 제1 마커 유전자는 2개의 재조합효소 표적 부위에 둘러싸인 다음, 상동 재조합 사건이 발생한 후에 재조합효소의 작용에 의해 제거될 수 있다.
본 발명의 유리한 양태에서, 재조합효소는 상응하는 유전자를 수반하는 제2 벡터에 의해 발현되는데, 이러한 벡터는 형질전환에 의해 클로스트리디아 내로 도입된다.
우선적으로, 재조합효소 표적 부위는 FRT 서열이다. 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터의 FLP 재조합효소는 (FLP 재조합효소 표적의 경우) FRT 서열로 명명되는, 특별한 34 염기 쌍 DNA 서열에서 활성이다. 이들 FRT 부위 중의 2개가 존재하는 경우, FLP 효소는 DNA 가닥 내에 이중 가닥 절단물을 창출시키고, 제1 FRT의 말단을 제2 표적 서열의 말단으로 교환시킨 다음, 이와 같이 교환된 가닥을 재부착시켜 준다. 이러한 공정으로 인해, 두 부위 사이에 놓인 DNA가 결실된다.
본 발명을 수행하는 특이적 방식으로, 표적 DNA 서열 주변에서 선택된 영역과 상동성인 서열은 재조합 사건을 위해 사용된 DNA 단편을 구성하는 염기 쌍의 10% 이하에서 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 유리한 양태에서는, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 균주로부터 제한 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 결실시킨다. 이들 균주는 어떠한 선행 생체내 플라스미드 메틸화 없이도 용이하게 형질전환 가능하다는 이점을 지니고 있다.
본 발명의 또 다른 유리한 양태에서는, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 균주로부터 세포외 DNAse를 암호화하는 유전자를 결실시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 형질전환시키고자 하는 클로스트리디아로부터 upp 유전자를 결실시킨다.
본 발명의 또 다른 유리한 양태에서는, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 균주가 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베제이린키이 (Clostridium bejeirinckii), 클로스트리듐 삭카로페르부틸아세토니쿰 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 부틸리쿰 (Clostridium butylicum), 클로스트리듐 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 클로스트리듐 페르프링겐스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 클로스트리듐 스포로게네스 (Clostridium sporogenes), 클로스트리듐 더모셀룸 (Clostridium thermocellum), 클로스트리듐 삭카롤리티쿰 (Clostridium saccharolyticum) [현재 명칭: 더모안애로박터 삭카롤리티쿰 ( Thermoanaerobacter saccharolyticum)], 클로스트리듐 더모설푸로게네스 (Clostridium thermosulfurogenes) [현재 명칭: 더모안애로박터 더모설푸리게네스 (Thermoanaerobacter thermosulfurigenes)], 클로스트리듐 더모히드로설푸리쿰 (Clostridium thermohydrosulfuricum) [현재 명칭: 더모안애로박터 에탄올리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus)] 중에서 선택된다.
바람직한 클로스트리듐 균주는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰이다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주가 제한 엔도뉴클레아제 Cac 824I를 암호화하는 유전자를 결실시킨 균주 △Cac15이다. 이러한 균주는 어떠한 선행 생체내 플라스미드 메틸화 없이도 용이하게 형질전환 가능하다는 이점을 지니고 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서는, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주가 그의 upp 유전자를 결실시킨 균주 (△upp로 명명됨)이다. 상기 균주를 upp 유전자를 수반하는 벡터로 형질전환시킨 결과로서, 5-FU 배지에 대해 민감성인 균주를 선택한 다음, 5-FU 배지에 대해 더 이상 민감하지 않는 플라스미드를 상실한 균주를 양성 선택할 수 있게 해준다.
형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주는 △Cac15△upp일 수도 있다. 이러한 방법은 유리하게, 동일한 클로스트리듐 균주에서 상동 재조합함으로써 둘 이상의 표적 유전자를 연속해서 대체시키는 데에 사용한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 방법에 의해 수득될 감수성인 재조합 클로스트리듐 균주에 관한 것이다. 유리하게, 본 발명에 따르는 방법을 사용하여, 유전자 cac15가 결실된 재조합 클로스트리듐 균주 (균주 △cac15), 유전자 upp가 결실된 재조합 클로스트리듐 균주 (균주 △upp), 및 유전자 cac15와 upp 둘 모두가 결실된 재조합 클로스트리듐 균주 (균주 △Cac15△upp)를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 균주를 형질전환시키기 위한 벡터에 관한 것이다.
도 1: pUC18-FRT-MLS2 벡터의 지도.
도 2: pCons2-1 벡터의 지도.
도 3: pCIP2-1 벡터의 지도.
도 4: pCons::UPP 벡터의 지도.
도 5: pCLF1 벡터의 지도.
도 6: 클로스트리디아에 대한 결실 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
다음 단계를 연속적으로 수행하였다:
A - 표적 DNA 서열 주변에서 선택된 2개 영역의 증폭; 1, 2, 3, 4는 PCR 프라이머를 나타낸다.
B - 수득된 PCR 단편을 클로닝 벡터 pTOPO 내로 클로닝함.
C - PCR 프라이머에 존재하는, StuI 제한 부위에서 마커를 삽입함.
D - pCONS 2.1의 BamHI 부위에서 대체 카세트를 클로닝함; pREP clo Y 벡터의 구축.
E - 클로스트리듐을 pREP cloY 벡터로 형질전환시킴.
F - 계대배양 동안 이중 교차에 의한 대체 카세트의 염색체 통합.
G - EryR 및 ThiamS 표현형을 이용하여 클론을 스크리닝함.
H - 유전자 대체 및 플라스미드 상실에 관하여 검사하기 위한 PCR 분석
또는
D' - pCONS::UPP의 BamHI 부위에서 대체 카세트를 클로닝함; pREP clo Y:UPP 벡터의 구축.
E' - 클로스트리듐 △upp를 pREP cloY:UPP 벡터로 형질전환시킴.
F' - 계대배양 동안 이중 교차에 의한 대체 카세트의 염색체 통합.
G' - EryR 및 5-FUR (ThiamS) 표현형을 이용하여 클론을 스크리닝함.
H' - 유전자 대체 및 플라스미드 상실에 관하여 검사하기 위한 PCR 분석.
실시예 1: 벡터의 구축
1.1 pUC18-FRT-MLS2의 구축
본 플라스미드는 클로스트리디아에서 기능적이고 2개의 FRT 부위와 2개의 StuI 부위에 의해 플랭킹된 MLSr 유전자를 함유하고 있고, 대체 카세트를 구축하는 데에 유용하다. FRT 부위를 수반하지만 Kmr 마커는 수반하지 않는 플라스미드 영역을 증폭시키기 위한 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 PKD4.1 및 PKD4.2를 이용하고 주형 플라스미드로서 pKD4를 이용하며 Pwo DNA 폴리머라제 [참고: Datsenko and Wanner, 2000]를 사용하여 역위 폴리머라제 연쇄 반응 (IPCR)을 수행하였다. 이러 한 평활 말단 단편을 나중에, pETSPO 플라스미드 [참고: Harris et al, 2002, J. Bacteriol]의 HindIII 분해 및 클레노우 (Klenow) 처리 후에 수득된 MLSr 유전자에 연결시켰다. 이어서, 상응하는 플라스미드 (pKD4-Ery1)를 주형으로서 사용하여, 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 FRT-MLSR-F 및 FRT-MLSR-R를 이용하고 Pwo DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR 반응에서 2개의 FRT 부위와 2개의 StuI 부위에 의해 플랭킹된 MLSr 유전자를 증폭시켰다. 이 단편을 SmaI 분해시킨 pUC18 내로 직접 클로닝하여 pUC18-FRT-MLS2 플라스미드 (도 1)를 수득하였다.
Pcr 프라이머:
Figure 112009019957217-pct00002
1.2 pCons 2.1의 구축
본 플라스미드는 클로스트리디아에서 기능적인 pIM13 복제 기점 (롤링 서클 복제 기전), 티암페니콜에 대한 내성을 부여해 주는 catP 유전자 및 대체 카세트를 클로닝하기 위한 유일한 BamHI 부위를 함유하고 있다. 본 플라스미드는 폴리링커의 일부와, 특히 BamHI 및 EcoRI 부위를 제거하기 위하여 pETSPO 플라스미드 [참고: Harris et al, 2002, J. Bacteriol]로부터 2 단계 공정으로 구축하였다. 주형 플라스미드로서 pETSPO를 이용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 PCONSAccI 및 PCONSEcoRI를 이용하며 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 IPCR을 수행하고, PCR 생성물을 인산화시킨 다음 연결시켰다. 이. 콜라이를 형질전환시킨 후, pConsO 플라스 미드를 수득하였다. 이어서, 이 플라스미드를 BamHI로 분해시켜 spoOA 카세트를 제거하고, 적당한 DNA 단편을 정제한 다음 연결시켜 플라스미드 pCons2-1을 수득하였다. pCons2-1의 지도가 도 2에 제시되었다.
PCR 프라이머:
Figure 112009019957217-pct00003
1.3 pCIP2 -1 벡터의 구축
본 구축에서는, pCons2-1로부터의 pIM13 복제 기점을 θ 복제 기전을 지닌 플라스미드인 pSOL1 플라스미드의 복제 기점으로 대체시켰다. 이를 위하여, 주형으로서 씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 총 DNA를 이용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 ori-3-D 및 ori-4-R을 이용하며 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여, pSOL1의 복제 기점을 PCR 증폭시켰다. 이러한 PCR 생성물을 pCR-BluntII-TOPO에서 클로닝시키고, 이로써 생성되는 플라스미드를 EcoRI에 의해 분해시키며, 2.2 kb 단편을 정제하였다. 유사하게, pCons2.1 플라스미드를 EcoRI에 의해 분해시키고 2.4 kb 단편을 정제한 다음, pSOL1의 복제 기점을 함유하는 2.2 kb EcoRI 단편에 연결시켜 플라스미드 pCIP2-1 (도 3)을 수득하였다.
Pcr 프라이머:
Figure 112009019957217-pct00004
1.4 pCons :: upp 벡터의 구축
자신의 리보솜 결합 부위 (rbs)를 수반한 upp 유전자를 CatP 유전자 바로 하류의 BcgI 부위에서 pCons2.1 내로 클로닝하여 CatP 프로모터의 제어 하에 발현된 upp를 수반한 인공 오페론을 구축하였다. 이러한 방식으로, 플라스미드 상실에 대한 역-선택 가능한 마커로서 upp 유전자를 사용하는 추가의 결실 실험에서 △cac15△upp 균주 중에서의 upp 유전자의 염색체 통합을 허용해줄 수 있는 상동성 영역을 전혀 도입하지 않았다.
프라이머로서 올리고뉴클레오티드 REP-UPP F 및 REP-UPP R을 사용하여 게놈 씨. 아세토부틸리쿰 DNA로부터, 자신의 rbs를 수반한 upp 유전자를 PCR (Pfu) 증폭시켰다. 664 bp PCR-생성물을 PvuII에 의해 분해시키고, BcgI에 의해 분해되고 평활 말단에 대한 T4 DNA 폴리머라제로 처리시킨 pCons2.1 내로 클로닝하였다. 이러한 방식으로, pCons::UPP (도 4 참고) 복제 벡터를 수득하였다.
PCR 프라이머:
Figure 112009019957217-pct00005
1.5 pCLF1 벡터의 구축
FLP 재조합효소를 암호화하는 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)의 FLP1 유전자를, 씨. 아세토부틸리쿰 유기체에서의 고 발현을 허용해 주는 씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 티올라제 (thl) 유전자로부터의 RBS 및 프로모터의 제어 하에 pCons2.1 벡터에서 클로닝하였다.
프라이머로서 FLP1-D 및 FLP1-R 올리고뉴클레오티드를 사용하고 주형으로서 pCP20 플라스미드 [참고: Datsenko and Wanner, 2000]를 사용하여, FLP1 유전자를 PCR (Pfu) 증폭시켰다.
PCR 프라이머:
Figure 112009019957217-pct00006
FLP1-D는 BamHI 부위를 포함한 5' 연장부와 thl의 RBS 서열을 갖고 있었다. FLP1-R은 PCR 생성물의 3'에 SfoI 부위를 도입하였다.
PCR 생성물을 BamHI 및 SfoI에 의해 분해시키고, 동일한 효소로 분해시킨 바 있는 pSOS95 발현 벡터 내로 직접 클로닝하여 pEX-FLP1 (6281 pb) 플라스미드를 수득하였다.
FLP1 발현 카세트를 함유하는 pEX-FLP1의 SalI 단편 (1585 pb)을 pCONS2.1의 SalI 부위에서 클로닝하여 pCLF1 (4878 pb) 플라스미드 (도 5)를 수득하였다.
실시예 2: 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 cac824I 제한 효소를 암호화하는 cac1502 유전자의 결실
본 발명의 방법을 도식적으로 나타낸 도 6을 참고할 수 있다.
Cac824I 암호화 유전자 (CAC1502)를 둘러싸고 있는 2개의 DNA 단편을, 주형으로서 씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 총 DNA를 이용하고 프라이머로서 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍 (표 2 참고)을 이용하며 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 프라이머 쌍 CAC 1B-CAC 2 및 CAC 3-CAC 4B를 사용하여, 1493 bp 및 999 bp DNA 단편을 각각 수득하였다. 양 프라이머 CAC 1B 및 CAC 4B는 BamHI 부위를 도입하는 반면, 프라이머 CAC 2 및 CAC 3은 StuI 부위를 도입시키는 상보적 5' 연장된 서열을 갖고 있다. DNA 단편 CAC 1B-CAC 2 및 CAC 3-CAC 4B를 프라이머 CAC 1B 및 CAC 4B와 함께 PCR 융합 실험에서 연결시키고, 이로써 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt 벡터에서 클로닝하여 pTOPO:cac15를 수득하였다. pTOPO:cac15의 유일한 StuI 부위에서, 양 측면 상에 FRT 서열을 수반한 항생제 내성 MLSr 유전자가 정착되어 있는 pUC18-FRT-MLS2의 1372 bp StuI 단편을 도입하였다. 이로써 생성되는 플라스미드를 BamHI 분해시킨 후 수득한 cac1502 대체 카세트를 BamHI 부위에서 pCons2-1 내로 클로닝하여 pREPCAC15 플라스미드를 수득하고, pCIP2.1 내로 클로닝하여 pCIPCAC15를 수득하였다. pREPCAC15 및 pCIPCAC15 플라스미드를 생체 내에서 메틸화하고 사용하여, 전기천공에 의해 씨. 아세토부틸리쿰을 형질전환시켰다. 페트리 (Petri) 판 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml) 내성 클론에 대하여 선택한 후, 각 형질전환체의 1개 집락을, 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 액상 합성 배지에서 24시간 동안 배양한 다음, 항생제를 수반하지 않은 액상 2YTG 배지에서 계대배양하였다. 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 강화된 클로스트리듐 한천 (RCA) 상에 적당한 희석물을 도말하였다. pREPCAC15 또는 pCIPCAC15 벡터가 상실된 구성요소를 선택하기 위하여, 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 RCA와 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 RCA 둘 다 상에 에리트로마이신 내성 클론을 반복 도말하였다. pREPCAC15 형질전환체를 사용해서는 목적하는 표현형을 지닌 수 개의 집락을 수득하였지만, pCIPCAC15 형질전환체를 사용해서는 이러한 집락을 전혀 수득하 지 못하였다. 이는 pCIPCAC15의 θ 복제 기전이 롤링 서클 기전 보다 씨. 아세토부틸리쿰에서의 이중 교차를 증진시키는 데에 있어서 덜 선호된다는 것을 입증해준다. 에리트로마이신에 대해 내성이고 티암페니콜에 대해 민감성인 클론의 유전자형을 PCR 분석에 의해 검사하였다 (CAC15 대체 카세트의 외부에 위치한 프라이머 CAC 0 및 CAC 5와, cac1502의 내부에 위치한 프라이머 CAC D 및 CAC R을 사용한다). pREPCAC15를 상실한 △cacl5::mls R 균주를 단리하였다.
△cacl5::mls R 균주를, 에스. 세레비지애로부터의 Flp 재조합효소를 암호화하는 FLP1 유전자를 발현하는 pCLF1 벡터를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환시키고 페트리 판 상에서 티암페니콜 (50 ㎍/ml)에 대한 내성을 선택한 후, 1개 집락을 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 합성 액상 배지 상에서 배양하고, 적당한 희석물을 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 RCA 상에 도말하였다. 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 RCA와 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 RCA 둘 다 상에 티암페니콜 내성 클론을 반복 도말하였다. 에리트로마이신에 대해 민감성이고 티암페니콜에 대해 내성인 클론의 유전자형을, 프라이머 CAC 0 및 CAC 5B를 사용하여 PCR 분석함으로써 검사하였다. 에리트로마이신 민감성과 티암페니콜 내성을 지닌 △cacl5 균주를 2회 연속해서 24시간 동안 배양하여 pCLF1을 유리시켰다. pCLF1을 상실한 △cacl5 균주를 에리트로마이신 및 티암페니콜 둘 다에 대한 그의 민감성에 따라서 단리시켰다. 이 균주를 씨. 아세토부틸리쿰 MGC△cacl5로 명명하였다.
Figure 112009019957217-pct00007
실시예 3: 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 △cacl5에서 우라실 포스포리보실-트랜스퍼라제를 암호화하는 upp 유전자의 결실
upp (CAC2879)의 상류 및 하류의 2개 DNA 단편을, 주형으로서 씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 총 DNA를 이용하고 프라이머로서 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍 (표 3 참고)을 이용하며 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 프라이머 쌍 UPP 1-UPP 2 및 UPP 3-UPP 4를 사용하여, 1103 bp 및 1105 bp DNA 단편을 각각 수득하였다. 양 프라이머 UPP 1 및 UPP 4는 BamHI 부위를 도입하는 반면, 프라이머 UPP 2 및 UPP 3은 StuI 부위를 도입시키는 5' 연장된 서열을 갖고 있다. DNA 단편 UPP 1-UPP 2 및 UPP 3-UPP 4를 프라이머 UPP 1 및 UPP 4와 함께 PCR 융합 실험에서 연결시키고, 이로써 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt 벡터에서 클로닝하여 pTOPO:upp를 수득하였다. pTOPO:upp의 유일한 StuI 부위에서, 양 측면 상에 FRT 서열을 수반한 항생제 내성 MLSr 유전자가 정착되어 있는 pUC18-FRT-MLS2의 1372 bp StuI 단편을 도입하였다. 이로써 생성되는 플라스미드를 BamHI 분해시킨 후 수득한 upp 대체 카세트를 BamHI 부위에서 pCons2-1 내로 클로닝하여 pREPUPP 플라스미드를 수득하였다.
플라스미드 pREPUPP를 사용하여, 기존의 생체내 메틸화를 수반하지 않고 전기천공에 의해 씨. 아세토부틸리쿰 MGC△cacl5 균주를 형질전환시켰다. 페트리 판 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml) 내성 클론에 대하여 선택한 후, 1개 집락을, 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 액상 합성 배지에서 24시간 동안 배양한 다음, 항생제를 수반하지 않은 액상 2YTG 배지에서 계대배양하였다. 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 RCA 상에 적당한 희석물을 도말하였다. pREPUPP 벡터가 상실된 구성요소를 선택하기 위하여, 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 RCA와 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 RCA 둘 다 상에 에리트로마이신 내성 클론을 반복 도말하였다. 에리트로마이신에 대해 내성이고 티암페니콜에 대해 민감성인 클론의 유전자형을 PCR 분석에 의해 검사하였다 (UPP 대체 카세트의 외부에 위치한 프라이머 UPP 0 및 UPP 5와, UPP의 내부에 위치한 프라이머 UPP D 및 UPP R을 사용한다). pREPUPP를 상실한 △cacl5△upp::mls R 균주를 단리하였다. 앞서의 cacl5 결실은 제1 실시예에서 이미 기재된 바와 같이 확인하였다. △cacl5△upp::mls R 균주는 △cacl5 균주에 대한 50 μM과 비교해서 400 μM 5-FU에 대해 내성이었다.
△cacl5△upp::mls R 균주를, 에스. 세레비지애로부터의 Flp 재조합효소를 암호화하는 FLP1 유전자를 발현하는 pCLF1 벡터를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환시키고 페트리 판 상에서 티암페니콜 (50 ㎍/ml)에 대한 내성을 선택한 후, 1개 집락을 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 합성 액상 배지에서 배양하고, 적당한 희석물을 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 RCA 상에 도말하였다. 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 RCA와 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 RCA 둘 다 상에 티암페니콜 내성 클론을 반복 도말하였다. 에리트로마이신에 대해 민감성이고 티암페니콜에 대해 내성인 클론의 유전자형을, 프라이머 UPP 0 및 UPP 5를 사용하여 PCR 분석함으로써 검사하였다. 에리트로마이신 민감성과 티암페니콜 내성을 지닌 △cacl5△upp 균주를 2회 연속해서 24시간 동안 배양하여 pCLF1을 유리시켰다. pCLF1을 상실한 △cacl5△upp 균주를 에리트로마이신 및 티암페니콜 둘 다에 대한 그의 민감성을 결정함으로써 단리시켰다.
Figure 112009019957217-pct00008
실시예 4: 플라스미드 상실에 대한 양성 선택으로서 upp 및 5-플루오로우라실을 사용한 cac3535 유전자의 결실
씨. 아세토부틸리쿰의 제2 제한-변형 시스템을 암호화하는 cac3535 유전자의 상류 및 하류의 2개 DNA 단편을, 주형으로서 씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 총 DNA를 이용하고 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍 (표 4 참고)을 이용하며 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 프라이머 쌍 RM 1-RM 2 및 RM 3-RM 4를 사용하여, 1 kbp 및 0.9 kbp DNA 단편을 각각 수득하였다. 양 프라이머 RM 1 및 RM 4는 BamHI 부위를 도입하는 반면, 프라이머 RM 2 및 RM 3은 StuI 부위를 도입시키는 상보적 5' 연장된 서열을 갖고 있다. DNA 단편 RM 1-RM 2 및 RM 3-RM 4를 프라이머 RM 1 및 RM 4와 함께 PCR 융합 실험에서 연결시키고, 이로써 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt 벡터에서 클로닝하여 pTOPO:cac3535 플라스미드를 수득하였다. pTOPO:cac3535의 유일한 StuI 부위에서, 양 측면 상에 FRT 서열을 수반한 항생제 내성 MLSr 유전자가 정착되어 있는 pUC18-FRT-MLS2의 1372 bp StuI 단편을 도입하였다. 이로써 생성되는 플라스미드를 BamHI 분해시킨 후 수득한 CAC3535 대체 카세트를 BamHI 부위에서 pCons::upp 내로 클로닝하여 pREPCAC3535::upp 플라스미드를 수득하였다.
pREPCAC3535::upp 플라스미드를 사용하여, 전기천공에 의해 씨. 아세토부틸리쿰 MGC△cacl5△upp 균주를 형질전환시켰다. 페트리 판 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml) 내성 클론에 대하여 선택한 후, 1개 집락을, 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 액상 합성 배지에서 24시간 동안 배양한 다음, 에리트로마이신 40 ㎍/ml 및 5-FU 400 μM을 수반한 RCA 상에 100 ㎕의 희석되지 않은 배양물을 도말하였다. 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 수반한 RCA와 티암페니콜 50 ㎍/ml을 수반한 RCA 둘 다 상에, 에리트로마이신과 5-FU 둘 다에 대해 내성인 집락을 반복 도말하여 5-FU 내성이 티암페니콜 민감성과 연관이 있다는 사실을 검증하였다. 에리트로마이신에 대해 내성이고 티암페니콜에 대해 민감성인 클론의 유전자형을 PCR 분석에 의해 검사하였다 (cac3535 대체 카세트의 외부에 위치한 프라이머 RM 0 및 RM 5와, ca3535 유전자의 내부에 위치한 프라이머 RM D 및 RM R을 사용한다). 이러한 방식으로, pREPCAC3535::upp를 상실한 △cacl5△upp△cac3535::mls R 균주를 단리하였다.
Figure 112009019957217-pct00009
참고문헌
Figure 112009019957217-pct00010
Figure 112009019957217-pct00011
SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> PROCESS FOR CHROMOSOMAL INTEGRATION AND DNA SEQUENCE REPLACEMENT IN CLOSTRIDIA <130> 350034 D24607 <160> 36 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 1 ctggcgccct gagtgcttgc ggcagcgtga gggg 34 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 2 agcccgggga tctcatgctg gagttcttcg ccc 33 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 tacaggcctt gagcgattgt gtaggctgga gc 32 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 aacaggcctg ggatgtaacg cactgagaag ccc 33 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 5 ccggggtacc gtcgacctgc agcc 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 6 gaattccgcg agctcggtac ccggc 25 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 ccatcgatgg gggtcatgca tcaatactat cccc 34 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 8 gcttccctgt tttaatacct ttcgg 25 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 9 aaaacagctg ggaggaatga aataatgagt aaagttacac 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 10 aaaacagctg ttattttgta ccgaataatc tatctccagc 40 <210> 11 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 11 aaaaggatcc aaaaggaggg attaaaatgc cacaatttgg tatattatgt aaaacaccac 60 ct 62 <210> 12 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 12 aaatggcgcc gcgtacttat atgcgtctat ttatgtagga tgaaaggta 49 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 13 aaaggatcca tgcacactca taaatttact gtaggaagtc tg 42 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 14 ggggaggcct aaaaaggggg gtcccaaata atatttgcca tagtaaccac c 51 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 15 cccccttttt aggcctcccc tcgaacttat tagaatgatt aagattccgg 50 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 16 aaaggatcct cattaaattt cctccatttt aagcctgtc 39 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 17 gtgatataat tttcctttaa atggaggagg atctg 35 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 18 gccgttaata gacattataa ttccattggc 30 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 19 gaattcttaa aaatatttgg atcattaagc gg 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 20 gttgtattgg aatctttgtt attatttctc cc 32 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 21 aaaaggatcc tcctgatcta ttaattcttg atgaaccc 38 <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 22 ggggaggcct aaaaaggggg attgcataaa taaaaagggc tgaaaaataa atttcag 57 <210> 23 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 23 cccccttttt aggcctcccc ttatttcatt cctccattgt attttttttc tatttg 56 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 24 aaaaggatcc gctattatga ataggttaaa taagtcagct gg 42 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 25 aatacaagca aagagaatag gctatgtgcc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 26 aatacaagca aagagaatag gctatgtgcc 30 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 27 ggcatatgaa gtaacaagag aaatgcagc 29 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 28 ataatctatc tccagcatct ccaagacc 28 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 29 aaaaggatcc gcagctttct ggaaggacta cggcg 35 <210> 30 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 30 ggggaggcct aaaaaggggg catttactta tggtacggtt cacccc 46 <210> 31 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 31 cccccttttt aggcctcccc gtctttaaaa agtaatttat caaaggcatc aaggc 55 <210> 32 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 32 cccccttttt aggcctcccc gtctttaaaa agtaatttat caaaggcatc aaggc 55 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 33 cacattgtca tttataaaag tccctaggg 29 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 34 gtagtaattc caacttcaac tcttgccac 29 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 35 cttagaatag ctgatattgc ttgcgg 26 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 36 agcatctctc ttaatgattc tccgg 25

Claims (41)

  1. - 클로스트리디아 (Clostridia) 균주를,
    - 클로스트리디아에서의 복제를 허용해 주는 복제 기점;
    - 카세트를 재조합할 수 있게 하는, 표적 DNA 서열 주변에서 선택된 영역과 상동성인 2개 서열에 의해 둘러싸인 제1 마커 유전자를 포함하는 대체 카세트; 및
    - 역-선택 가능한 마커인 제2 마커 유전자
    를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계,
    - 제1 마커 유전자를 발현하면서 상기 카세트가 게놈 내에 통합된 균주를 선택하는 단계; 및
    - 상기 제2 마커 유전자를 발현하지 않는, 상기 벡터를 제거시킨 균주를 선택하는 단계
    를 포함하는, 클로스트리디아에서 상동 재조합에 의해 표적 DNA 서열을 대체시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 역-선택 가능한 마커가, 부재하거나 결실된 비필수 유전자의 활성을 복원시켜 주는 유전자인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 역-선택 가능한 마커가 upp 유전자인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 벡터가, 이러한 벡터를 제거시킨 균주의 음성 선택을 허용해 주는 제3 마커를 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 벡터가, 이러한 벡터를 제거시킨 균주의 음성 선택을 허용해 주는 제3 마커를 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 벡터가, 엔도뉴클레아제로의 분해에 의해 제거되는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 벡터가, 엔도뉴클레아제로의 분해에 의해 제거되는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 벡터가, 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고 이와 동시에, 사용된 클로스트리듐 (Clostridium) 균주의 게놈 중에는 부재하는 DNA 서열을 보유하는 것인 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 사용된 클로스트리듐 균주가 그의 게놈 상에, 벡터에 존재하는 제한 부위에 대해 특이적이며 유도성 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 보유하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 제1 마커 유전자가 항생제 내성 유전자인 방법.
  13. 제5항에 있어서, 제1 마커 유전자가 항생제 내성 유전자인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 제1 마커 유전자가 2개의 재조합효소 표적 부위에 둘러싸인 방법.
  15. 제5항에 있어서, 제1 마커 유전자가 2개의 재조합효소 표적 부위에 둘러싸인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 제1 마커 유전자가, 상동 재조합 사건이 발생한 후 재조합효소의 작용에 의해 제거되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 재조합효소가 상기 균주 내로 도입된 제2 벡터에 의해 운반된 유전자에 의해 발현되는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 재조합효소 표적 부위가 FRT 서열이고, 재조합효소가 FLP 재조합효소인 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리디아로부터 제한 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 결실시킨 방법.
  22. 제5항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리디아로부터 제한 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 결실시킨 방법.
  23. 제1항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리디아로부터 DNAse 암호화 유전자를 결실시킨 방법.
  24. 제5항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리디아로부터 DNAse 암호화 유전자를 결실시킨 방법.
  25. 제1항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리디아로부터 upp 유전자를 결실시킨 방법.
  26. 제5항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리디아로부터 upp 유전자를 결실시킨 방법.
  27. 제1항에 있어서, 클로스트리듐 균주가 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베제이린키이 (Clostridium bejeirinckii), 클로스트리듐 삭카로페르부틸아세토니쿰 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 부틸리쿰 (Clostridium butylicum), 클로스트리듐 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 클로스트리듐 페르프링겐스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 클로스트리듐 스포로게네스 (Clostridium sporogenes), 클로스트리듐 더모셀룸 (Clostridium thermocellum), 클로스트리듐 삭카롤리티쿰 (Clostridium saccharolyticum) [현재 명칭: 더모안애로박터 삭카롤리티쿰 (Thermoanaerobacter saccharolyticum)], 클로스트리듐 더모설푸로게네스 (Clostridium thermosulfurogenes) [현재 명칭: 더모안애로박터 더모설푸리게네스 (Thermoanaerobacter thermosulfurigenes)], 클로스트리듐 더모히드로설푸리쿰 (Clostridium thermohydrosulfuricum) [현재 명칭: 더모안애로박터 에탄올리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus)] 중에서 선택되는 방법.
  28. 제5항에 있어서, 클로스트리듐 균주가 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 베제이린키이, 클로스트리듐 삭카로페르부틸아세토니쿰, 클로스트리듐 부틸리쿰, 클로스트리듐 부티리쿰, 클로스트리듐 페르프링겐스, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 스포로게네스, 클로스트리듐 더모셀룸, 클로스트리듐 삭카롤리티쿰 [현재 명칭: 더모안애로박터 삭카롤리티쿰], 클로스트리듐 더모설푸로게네스 [현재 명칭: 더모안애로박터 더모설푸리게네스], 클로스트리듐 더모히드로설푸리쿰 [현재 명칭: 더모안애로박터 에탄올리쿠스] 중에서 선택되는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 클로스트리듐 균주가 클로스트리듐 아세토부틸리쿰인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주가 △cac15인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주가 △upp인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 형질전환시키고자 하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주가 △Cac15△upp인 방법.
  33. 제1항에 따르는 방법을 연속해서 2회 이상 수행하는, 동일한 클로스트리듐 균주에서 상동 재조합함으로써 둘 이상의 표적 유전자를 대체시키는 방법.
  34. 제5항에 따르는 방법을 연속해서 2회 이상 수행하는, 동일한 클로스트리듐 균주에서 상동 재조합함으로써 둘 이상의 표적 유전자를 대체시키는 방법.
  35. 제1항에 따르는 방법에 의해 수득되는 재조합 클로스트리듐 균주.
  36. 제5항에 따르는 방법에 의해 수득되는 재조합 클로스트리듐 균주.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 유전자 cac15가 결실된 재조합 클로스트리듐 균주.
  38. 제35항 또는 제36항에 있어서, 유전자 upp가 결실된 재조합 클로스트리듐 균주.
  39. 제35항 또는 제36항에 있어서, 유전자 cac15와 upp 둘 모두가 결실된 재조합 클로스트리듐 균주.
  40. - 클로스트리디아에서의 복제를 허용해 주는 복제 기점;
    - 카세트를 재조합할 수 있게 하는, 표적 DNA 서열 주변에서 선택된 영역과 상동성인 2개 서열에 의해 둘러싸인 제1 마커 유전자를 포함하는 대체 카세트; 및
    - 역-선택 가능한 마커인 제2 마커 유전자
    를 포함하는 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 역-선택 가능한 마커가 upp 유전자인 벡터.
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