CN102559704B - 一种在丙酮丁醇梭菌中敲除基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在梭菌中实现基因敲除、引入外源基因、点突变、大片段敲除的方法，以及在该方法中使用到的含SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸序列、构建物等，以及这些多核苷酸序列和构建物在梭菌中实现基因敲除、引入外源基因、点突变、大片段敲除的应用。本发明也涉及采用本发明方法制备得到的梭菌。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及到pSY9-1-adc和pSY14-thl两种重组质粒，可用于丙酮丁醇梭菌基因敲除。
背景技术
由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，生物丁醇目前受到越来越多的关注。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobylicum)是一种革兰氏阳性、可产孢子、专性厌氧的细菌，它可利用多种碳源，并且在发酵过程中会产生溶剂丙酮、丁醇和乙醇，因此，丙酮丁醇梭菌也受到各国研究者的普遍重视，近年来对丙酮丁醇梭菌的代谢工程研究越来越多1-3。
然而，该菌一直存在遗传操作系统缺乏的问题。2000年之前，研究者们都是以传统的同源重组方法在丙酮丁醇梭菌中完成基因敲除，主要分为2种，一种是将携带一段与目标基因内部同源序列的非复制型整合质粒通过单交换插入到靶基因内，使靶基因插入失活。另一种则是将含两段同源DNA序列及抗性基因的复制型整合质粒转入该菌，通过抗性的不同来选择外源DNA与靶基因发生双交换的缺失菌株。利用第一种方法，敲除的基因有buk，pta，aad，及solR基因4-7，这种方法得到的转化子属于插入失活，但留下较多无关的外源片段，有可能影响梭菌其他基因的功能。利用第二种方法，敲除的基因有spoOA8，此方法的不足之处在于梭菌的同源重组效率很低，很难挑选到发生双交换的突变株，而且即使获得了双交换转化子，抗性标记仍然留在基因组上，虽然可以通过Flp-Frt系统去除标记，但仍会留下“疤痕”。自2002年到2007年，没有再出现其他关于该菌基因敲除的报道。
2007年，有研究者在该菌中发展了Targetron技术9-12，该技术是以可移动的二类内含子来敲除靶基因，不依赖于同源重组，因而可以在梭菌中能有效地敲除基因。但是，该方法仍然属于插入失活，即使可以通过Flp-Frt系统去除抗性基因，仍然会留下内含子的序列。
总之，上述三种敲除方法都将外源的序列带入了基因组，难以完全去除。因此，本领域仍然需要一种无痕的基因敲除方法。
发明内容
基于这些问题，本发明人尝试了在丙酮丁醇梭菌中建立一种新的敲除技术，利用表达I-SceI归巢内切酶，克服该菌的同源重组效率低，而难以获得双交换转化子的问题，并且能完成无痕的基因敲除。
因此，本发明第一方面提供一种分离的多核苷酸序列，所述序列含有SEQ IDNO：1所示的序列。
在一具体实施例中，所述分离的多核苷酸序列由SEQ ID NO：1所示。
在一具体实施例中，所述分离的多核苷酸序列编码I-SceI归巢内切酶。
本发明第二方面提供一种构建物，所述构建物含有本发明的编码I-SceI归巢内切酶的多核苷酸序列。
在一具体实施例中，所述构建物以大肠杆菌-丙酮丁醇梭菌的穿梭载体作为骨架。
在一具体实施例中，所述构建物还含有thl启动子或ptb启动子。
在一具体实施例中，所述构建物还含有Cm抗性基因。
在一具体实施例中，所述构建物的序列如SEQ ID NO：3或26所示。
本发明第三方面涉及本发明分离的多核苷酸序列、I-SceI归巢内切酶或含该多核苷酸序列的构建物在敲除梭菌的基因、在梭菌基因组中引入外源基因和对梭菌基因组实施突变中的应用。
本发明第四方面提供一种在梭菌中敲除基因的方法，所述方法包括：
(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌的待敲除基因上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点而不含该待敲除基因；
(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点的菌株；和
(3)使用本发明的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将待敲除的基因从所述梭菌的基因组上敲除。
本发明第五方面提供一种在梭菌中引入外源基因的方法，所述方法包括：
(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌基因中待插入位点上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点，同时，该质粒还含有所述外源基因；
(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列、外源基因和I-SceI酶切位点的菌株；和
(3)使用本发明的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将所述外源基因引入所述梭菌的基因组中。
本发明第六方面提供一种在梭菌基因组中实施突变的方法，所述方法包括：
(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌基因中待突变基因上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点，同时，该质粒还含有发生了突变的该待突变基因序列；
(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列、外源基因和I-SceI酶切位点的菌株；和
(3)使用本发明的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将所述突变基因引入所述梭菌的基因组中。
在一具体实施例中，所述突变可以是任何突变，包括插入、缺失或突变。
在一具体实施例中，所述突变是点突变。
在一具体实施例中，所述梭菌选自梭菌选自丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumphytofermentans、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌。
在一具体实施例中，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii或Clostridium phytofermentans。
在一具体实施例中，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌或拜氏梭菌。
在一具体实施例中，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌，所述非复制型整合质粒和构建物经甲基化后再转入所述丙酮丁酸梭菌。
在一具体实施例中，所述方法可实现连续敲除多个基因或大片段基因删除。
在一具体实施例中，所述外源基因位于所述上下游两段同源序列之间。
在一具体实施例中，所述非复制型整合质粒含待敲除基因上下游两段同源序列、I-SceI酶切位点、和待插入基因，从而在引入外源基因的同时将该待敲除基因敲除。
本发明第七方面提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的构建物。
本发明的试剂盒可用于从梭菌中敲除基因、在梭菌基因组中引入外源基因或对梭菌基因组实施突变。
本发明第八方面提供一种梭菌，其采用本发明所述的方法制备得到。
在一具体实施例中，所述梭菌选自梭菌选自丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumphytofermentans、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌。
在一具体实施例中，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii或Clostridium phytofermentans。
在一具体实施例中，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌或拜氏梭菌。
附图说明
图1显示本发明pSY9-1-adc的质粒图谱。
图2显示本发明pSY14-thl的质粒图谱。
图3显示单交换示意图：将非复制型整合质粒pSY9-1-adc甲基化之后，转化丙酮丁醇梭菌ATCC 824，经Em筛选，得到的转化子分别以ch(a)primer/pl(a)primer和ch(b)primer/pl(b)primer两对引物鉴定，每对引物包括：一个来自基因组上的，故称作“ch”，另一个来自质粒上的“pl”。由于单交换的位置不同，可以产生两种结果，分别如图中的(1)和(2)两种结果。
图4显示PCR鉴定adc单交换。
图5显示单交换PCR的测序结果。
图6显示PCR鉴定adc单交换。
图7显示单交换PCR的测序结果。
图8显示双交换示意图。
图9显示菌落PCR。
图10显示PCR鉴定824Δadc(pSY14-thl)。
图11显示Δadc(pSY14-thl)的测序结果。
图12显示pUC19-adc酶切鉴定图。
图13显示pSY9-1-adc酶切鉴定图，其中3和4为正向克隆。
图14显示pSY14-thl酶切鉴定图。
图15显示pSY14-ptb的质粒图谱。
图16显示pSY14-ptb酶切鉴定图。
图17显示将甲基化的pSY14-ptb电转ATCC 824adc-cr1之后，菌落PCR结果发现No.18为野生型条带。
图18显示以824adc-cr1/pSY14-ptb No.18的Thia试管菌液为模板的PCR结果。
图19显示以824adc-cr1/pSY14-ptb No.18的Thia试管菌液为模板的PCR结果。
具体实施方式
本发明的目的在于建立一种新的无标记基因敲除的方法。本发明的目的可通过本发明所构建的I-SceI敲除系统而实现。
I-SceI是酿酒酵母线粒体基因内含子编码的一种归巢内切酶，参与将21S核糖体基因含内含子的等位基因复制到不含有内含子的同一基因内。I-SceI识别并切割18个碱基非对称序列，切割后留下两个不能配对的粘端。1995年，Choulika13等证明酵母的I-SceI内切酶可以有效地在哺乳动物细胞染色体的靶基因上引入双链的缺口，继而高效催化染色体DNA和外源DNA之间的同源同组的效率。1999年，Posfai14首先在原核生物的基因敲除中采用该方法，在大肠杆菌中成功地完成了无标记的基因敲除。自1999年，该方法首次在大肠杆菌中使用之后，它广泛应用在原核生物中，如：炭疽芽孢杆菌15、谷氨酸棒状杆菌16、伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)17、肠炎沙门氏菌18等。使用I-SceI系统，可以完成基因无痕缺失14-19、连续敲除15、17、大片段敲除14、17，并且能完成点突变15、及外源基因插入15。但目前，还未有将该系统应用在梭菌的报道。
本发明的I-SceI敲除系统可含有一种I-SceI构建物。本发明的I-SceI敲除系统还可含有如下文所述的各种非复制型整合载体。
本发明的I-SceI构建物以合适的载体作为骨架，含有I-SceI的编码序列。本发明的I-SceI构建物还可含有各种启动子，优选的启动子包括thl启动子(SEQ ID NO：3第4623～4775位)和ptb启动子(SEQ ID NO：26第3924～4039位)。
作为本发明I-SceI构建物的骨架，可使用各种已知的穿梭载体。这类穿梭载体包括但不限于例如：pMTL007(GenBank：EF525477.1)、pJIR750(GenBank：L02937.1)等大肠杆菌-丙酮丁醇梭菌穿梭载体。因此，在一具体实施例中，本发明的I-SceI构建物是一种载体。在更优选的实施例中，该构建物是一种表达载体，用于表达I-SceI归巢内切酶。在一具体实施例中，所述I-Sce I归巢内切酶的序列如SEQ ID NO：27所示。
可对本发明的构建物中的I-SceI的编码序列进行优化。在一个具体实施例中，所述构建物中的I-SceI的编码序列如SEQ ID NO：1所示。
应理解，可对本发明SEQ ID NO：1所示的序列做出一个或几个核苷酸突变(即“简并变异体”)，只要突变所得的多核苷酸序列仍然编码I-SceI氨基酸序列即可。
因此，在一个优选的实施例中，本发明的I-SceI构建物含有SEQ ID NO：1所示的序列或其简并变异体。在另一优选的实施例中，本发明的I-SceI构建物含有SEQ ID NO：1所示的序列或其简并变异体和thl启动子或ptb启动子。
在其它实施例中，本发明的I-SceI构建物还可含有Cm抗性基因(GenebankNC 002013.1)。
本发明一个具体的I-SceI构建物的序列如SEQ ID NO：3或26所示。
本发明的非复制型整合质粒含有待敲除基因、待插入位点或待突变基因的上下游两段同源序列和I-SceI的识别位点。
通常，本文所用“上下游两段同源序列”的长度在800bp～1.5kb左右。本领域技术人员可根据实际要敲除的靶基因、插入外源基因的位点、待突变基因的位置等选择合适长度的上、下游同源序列，这在本领域技术人员所掌握的知识范围之内。
待敲除的基因或待突变的基因可以是梭菌中的任意感兴趣的基因。本申请中，考虑到adc敲除以后丙酮产量明显下降，具有明显的表型，因此本申请选取该基因作为正表型对照。应理解，本申请并不限于丙酮丁酸梭菌adc基因的敲除。本申请系统和方法适用于梭菌中任意基因的敲除和任意基因的突变。
通常，引入的点突变会造成该突变基因编码的蛋白失活或活性下降，或者无法编码完整的蛋白。
待插入的外源基因也是各种感兴趣的基因，待插入的基因通常用于异源表达某个代谢途径或引入抗性基因以失活该基因。
对待插入的位点也无特殊限制，可根据实际需要在不同位点插入外源基因。例如，若插入外源抗性基因以中断靶基因，则可选取在靶基因内部的位置(50～200nt)。如果插入某个异源代谢途径，则可以插入在基因组某个目的启动子之后。
本申请中，还可在插入外源基因的同时将待敲除的基因敲除。为此，在设计非复制型整合质粒时，可将该非复制型整合质粒设计成含有待敲除基因上下游同源序列、待插入基因以及I-SceI的识别位点的质粒。该待插入基因可处于所述上下游同源序列之间。优选地，该非复制型整合质粒还含有该待插入基因的启动子序列。
通常，非复制型整合质粒中，该I-SceI的酶切位点(识别位点)处于所述下游同源序列的下游(位于同源臂的外部)。
通常，可使用例如pUC19载体作为本发明非复制型整合载体的骨架。
因此，本申请也涉及上述构建物和/或非复制型整合质粒在梭菌基因敲除中的应用。除基因敲除之外，该构建物还可用于在梭菌基因组上引入外源基因、实现连续敲除、点突变、及大片段删除。
通常，在将本发明的非复制型整合质粒转化宿主菌(例如，丙酮丁酸梭菌)之前，可先将其甲基化，然后将所得质粒转化宿主菌。
可采用本领域周知的方法进行甲基化。在一个具体实施方式中，通过将该非复制型整合质粒转入E.coli ER2275/pAN1中，从而实现在Cac8I位点甲基化。然后抽提质粒，再将甲基化的质粒转入宿主菌中。
然后，同样地，可先将本发明的构建物经E.coli ER2275/pAN1在Cac8I位点甲基化后，再转化入经非复制型整合质粒转化的宿主菌中。
应理解，可采用本领域熟知的各种转化技术将质粒转入宿主菌中。在优选的实施例中，将质粒电转入宿主菌中。可采用本领域周知的方法鉴定所转化的宿主菌是否为所需的宿主菌。例如，可采用PCR方法进行鉴定。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒含有本发明的构建物。在优选实施方式中，试剂盒还可含有实施本发明方法所需的各种试剂，例如实施转化所需的试剂、实施PCR所需的试剂等等。本发明的试剂盒还可包括一指导技术人员使用该试剂盒进行基因敲除的说明书。
本发明的方法和试剂盒可用于各种梭菌，包括但不限于丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌(ClostridiumSaccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridium phytofermentans、热纤梭菌(Clostridium themocellum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium Botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)等。
因此，本发明也包括采用本发明方法制备得到的目的基因已被敲除、且不保留抗性基因的梭菌、插入了外源基因的梭菌、以及插入了外源基因且目的基因已被敲除的梭菌。本发明也包括采用本发明的方法制备得到的目的基因发生了突变的梭菌。
本发明还包括I-SceI归巢内切酶在敲除梭菌的基因、在梭菌基因组中引入外源基因和对梭菌基因组实施点突变中的应用。
本文所用术语“I-SceI归巢内切酶”可以是本领域周知的I-SceI归巢内切酶。在一具体实施例中，所述I-SceI归巢内切酶的序列如SEQ ID NO：27所示。
与现有的方法方法相比，本发明能实现无标记的基因缺失，不会引起极性效应的问题，并且可以做连续敲除；具有在梭菌基因组操作大片段缺失的潜力；具有对梭菌基因组的序列做精密改造的潜力，例如：点突变；和具有引入外源基因到基因组目的序列的潜力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明使用的菌株和质粒为：pIMP1-ptb、pAN1质粒和E.coli ER2275，见参考文献10和19。
质粒pITC为pIMP1-ptb的衍生质粒(添加了thl启动子，并将原本的Em基因改为了Cm抗性基因)，如下构建：首先，将pIMP1-ptb启动子换成thl启动子(PstI+BamHI)，构建pIMP1-thl2；其次，从pC19420扩增氯霉素抗性基因表达盒〔SacI+ClaI，上下游引物分别为：TAGCGAGCTCGTTGGCCGATTCATTAATGC(SEQ IDNO：20)，atatcgatGAAAAGAAGTGAATGCGCAA(SEQ ID NO：21)〕，分别以ClaI+SacI酶切pIMP1(thl2)和氯霉素抗性基因表达盒，以T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在添加氯霉素的抗性LB板上；最后，提取质粒，PCR验证。质粒pSY7为pIMP1-ptb的衍生质粒，以引物Cm-1(PvuII)和Cm-2(ClaI)从pC19420扩增氯霉素抗性基因表达盒，〔Cm-1(PvuII)5’-CGCAGCTGTTTATGTTACAGTAATATTGAC-3’(SEQ ID NO：22)，Cm-2(ClaI)5’-CCATCGATTTATAAAAGCCAGTCATTAG-3’(SEQ ID NO：23)〕，PCR产物以PvuII和ClaI酶切，连入同样酶切的pIMP1-ptb质粒载体，从而将其红霉素抗性基因表达盒替换为氯霉素抗性基因表达盒。
本发明使用的酶和试剂为：限制性内切酶购自Fermentas公司；T4连接酶购自Takara公司；KOD DNA聚合酶购自Toyobo公司；EasyTaq聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；PCR纯化试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自华舜生物制品有限公司，琼脂购自西巴斯生物技术有限公司。其他常规试剂均为国产或进口分装。
CGM培养基配方(g/L)：(NH4)2SO42g；K2HPO41g；KH2PO40.5g；MgSO4.7H2O 0.1g；FeSO4.7H2O 0.015g；CaCl2 0.01g；MnSO4.H2O 0.01g；CoCl2 0.002g；ZnSO4 0.002g；Tryptone 2g；Yeast extraction 1g；Glucose 20g。
实施例1、pUC19-adc质粒载体的构建
1、pUC19-adc质粒载体构建
以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，分别以引物HindIII(adc-L1)和R1-L1(adc)通过PCR扩增adc上游同源臂adcL；通过引物L2-R2(adc)和BamHI(adc-R2)通过PCR扩增adc下游同源臂adcR；PCR产物回收后(方法见华舜胶回收Kit)，经BamHI和HindIII酶切连入相同酶切的质粒pUC19(方法见华舜胶回收Kit)；使用T4连接酶(Takara公司)连接酶切后的片断及载体，然后16℃过夜。所得质粒命名为pUC19-adc。
使用pUC19-adc转化E.coli DH5α感受态细胞，方法参见分子克隆3。然后挑取重组子，LB试管(Amp)37℃过夜培养，抽提质粒，用BamHI和HindIII酶切鉴定。其酶切鉴定图见图12。挑取正向的克隆子。
使用到的引物序列如下：
HindIII(adc-L1)：5`-CCCAAGCTTATGATTAATGATAAAAACCTA-3`(SEQ ID NO：4)
R1-L1(adc)：5`-GTGACTTTTTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATG-3`(SEQ ID NO：5)
L2-R2(adc)：5`-CTCTTATTTTTAAAAAGTCACCTTCCTAAATTTAAT-3`(SEQ IDNO：6)
BamHI(adc-R2)：5`-CGGGATCCTTAATTTAACTTTCTCTTTAG-3`(SEQ ID NO：7)
使用到的PCR反应体系：100ul
KOD酶1ul；KOD buffer 10ul；MgCl2(25uM)10ul；dNTP(2.5uM)8ul；引物In1(10uM)4ul；引物In2(10uM)4ul；质粒模板2ul；ddH2O 61ul。
使用到的PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 1min；72℃ 10min。
实施例2、pSY9-1-adc质粒载体的构建
以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，以引物NdeI(SceI-thl1)、Eml-Thl1通过PCR扩增thl启动子(包括rbs序列)，并且引入了I-SceI归巢酶识别位点18bp；同时以pIMP1质粒为模板，以Thl2-Em2、NdeI(XholI-Em-2)为引物，PCR扩增Em抗性基因，分别纯化的PCR产物，以之为模板，以Nde I(SceI-thl1)、NdeI(XholI-Em-2)为引物，通过Overlapping PCR，获得包含thl启动子+RBS+MLS的序列，NdeI酶切后，连入相同酶切的pUC19-adc质粒，经过酶切验证后(其酶切鉴定图见图13)，挑选正向的转化子，命名为pSY9-1-adc(见图1及SEQ IDNO：2)。
所使用到的引物序列如下：
NdeI(SceI-thl 1)：5`-GAATTCCATATGTAGGGATAACAGGGTAATGTGTTTTTTTTAACAAAATATAT-3`(SEQ ID NO：8)
Em1-Thl1：5`-TCTCGTTCATTCTAACTAACCTCCTAAATTTTG-3`(SEQ ID NO：9)
Thl2-Em2：5`-AGGTTAGTTAGAATGAACGAGAAAAATATAAAAC-3`(SEQ ID NO：10)
NdeI(XholI-Em-2)：5`-GGAATTCCATATGCTCGAGTTACTTATTAAATAATTTATAG-3`(SEQ ID NO：11)
其它操作步骤和条件如实施例1。
实施例3、pSY14-thl质粒载体的构建
由于I-SceI原始序列与梭菌中的密码子使用差距较大，本发明人优化了该基因的密码子，由南京金斯瑞基生物科技有限公司合成，将合成的基因克隆在市售的pUC57质粒上名为：pUC57-SceC。以引物SceC-1(BamHI)和引物SceC-2(SmaI)通过PCR将sceC序列(SEQ ID NO：1)扩增出来，BamHI和SmaI双酶切后，连入相同酶切的pITC质粒，经过酶切验证后(其酶切鉴定图见图14)，命名为pSY14-thl(见图2及SEQ ID NO：3)。
所使用到的引物序列如下：
SceC-1(BamHI)：5`-CGCGGATCCATGCATCAAAAGAATCAAGT-3`(SEQ ID NO：12)
SceC-2(SmaI)：5`-TCCCCCGGGTTATTTAAGAAAAGTTTCAC-3`(SEQ ID NO：13)
其它操作步骤和条件如实施例1。
实施例4、重组菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824adc-cr1构建
1.重组菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824adc-cr1构建
(1)pSY9-1-adc质粒的甲基化
首先，制备E.coli ER2275/pAN1的化学感受态；将pSY9-1-adc质粒转化E.coli ER2275/pAN1，转化方法见分子克隆。挑单菌至4ml LB试管，加Amp100μg/ml，Cm 25μg/ml，过夜培养。用试剂盒抽提质粒。
(2)电转pSY9-1-adc甲基化质粒至丙酮丁酸梭菌ATCC 824
接单菌至CGM培养基，37℃过夜培养；次日，以4％转接100ml CGM培养基，37℃培养；OD600至0.6左右，取75ml菌液，4000rpm，4℃离心10min去上清，以ETM缓冲液悬浮，4000rpm，4℃离心10min；去上清，以1.5ml ET缓冲液悬浮；取300ul，加入15μg质粒，混匀后，加入电转杯(2mm)，电击条件：2.0kV，电击后，加入CGM培养基1ml，37℃培养过夜；取出，以200l涂红霉素(10ug/ml)抗性平板。37℃，厌氧箱内培养48-96h小时，挑单菌至Em试管，生长起来的菌液，以菌液PCR验证。
ET缓冲液 ETM缓冲液
270mM蔗糖 270mM蔗糖
0.6mM Na2HPO4 0.6mM Na2HPO4
4.4mM NaH2PO4 4.4mM NaH2PO4
10mM MgCl2
(3)PCR验证(包括菌落PCR及抽提敲除菌基因组为模板的PCR)
PCR反应体系，参见实施例1。
PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 3min；72℃ 3min。
(4)DNA抽提方法：
采用生工基因组抽提试剂盒进行。
使用如下的adc单交换鉴定PCR引物：
ch(a)引物：5`-AGCTAAAACCGTAATAGTTG-3`(SEQ ID NO：14)
pl(a)引物：5`-TAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC-3`(SEQ ID NO：15)
ch(b)引物：5`-TGTTAATATGGCATTTAAAGAC-3`(SEQ ID NO：16)
pl(b)引物：5`-GTATGTTGTGTGGAATTGTGAG-3`(SEQ ID NO：17)
每对引物包括：一个来自基因组上的，故称作“ch”，另一个来自质粒上的“pl”。由于单交换的位置不同，可以产生两种结果，分别如图3中的(1)和(2)两种结果。
2.单交换实验结果：
以Em试管生长的菌液为模板，PCR鉴定，发现824/pSY9-1-adc(No.19)在ch(a)引物/pl(a)引物产生的条带大小为2.5kb左右(见图4)；以ch(b)引物/pl(b)引物条带大小约为1.8kb(见图6)。抽提菌落PCR中阳性重组菌19的基因组，分别以ch(a)/pl(a)引物扩增出的PCR产物纯化测序，结果与预期的序列相符(见图5)，包含了adcL-adc-adcR序列，adcL的上游是染色体上的序列，而adcR下游则是载体的，与图一的结果中的第(2)种单交换相符。以ch(b)引物/pl(b)引物扩增的PCR纯化后经测序，结果也与预期的序列相符(见图7)，包含了adcL-adcR的序列，adc-L上游为载体序列，adcR下游为染色体序列。也与图3的结果中的第(2)种单交换相符。
因此，我们所得到的824/pSY9-1-adc(No.19)发生的单交换属于第(2)种情况，将该菌命名为824adc-cr1。
实施例5、重组菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824Δadc构建
1、将pSY14-thl质粒经E.coli ER2275/pAN1在Cac8I位点甲基化后，电转丙酮丁醇梭菌ATCC 824 adc-cr1，复苏过夜后，取200ul细胞涂布Thia(17ug/ml)抗性平板。37℃，厌氧箱内培养48-96h小时，挑单菌由菌落PCR验证。
ATCC 824Δadc双交换的菌落PCR引物如下：
ch(a)引物：5`-AGCTAAAACCGTAATAGTTG-3`(SEQ ID NO：18)
ch(b)引物：5`-TGTTAATATGGCATTTAAAGAC-3`(SEQ ID NO：19)
2、ATCC 824Δadc敲除的其他验证：
抽提菌落PCR中阳性重组菌22的基因组，以ch(a)引物和ch(b)引物通过PCR扩增的产物，经纯化后，测序。具体操作步骤见实施例4。
Em抗性鉴定PCR引物如下：NdeI(SceI-thl1)(SEQ ID NO：8)；和NdeI(XholI-Em-2)(SEQ ID NO：11)。
3、双交换结果：
pSY14-thl是Thia抗性，在thl启动子下表达sceC基因。sceC基因是本发明根据丙酮丁醇梭菌的密码子优化之后合成的基因，蛋白序列与I-SceI相同。当sceC高效表达时，它可以识别I-SceI位点，产生双链DNA缺口，提高同源重组效率。双交换时，根据同源臂发生交换的位置，也可以产生两种结果，如图8所示，一种为野生型，另一种为缺失了adc的突变型。将甲基化的pSY14-thl转入824adc-cr1，转化效率约为103转化子/ug DNA。对此进行了菌落PCR验证(图9)，并挑选其中No.22(因其大小为突变型条带，并且条带单一)，进行进一步验证之后，发现该菌在Em试管里不生长，表明其丢失了第一步整合质粒pSY9-1-adc；同时，PCR验证表明它不含有pSY9-1-adc，并且双交换之后，是纯的突变株条带(见图10)，该菌命名为824Δadc。然后，将该条带纯化测序发现，结果确实缺失了adc基因，其他序列未有改变(见图11)。
将ATCC 824Δadc阳性重组菌22接至8％玉米(加CaCO3)发酵，48小时，取样，测溶剂含量。发酵结果表明，丙酮和乙醇的产量与TargeTron敲除adc的突变株表型吻合。结果如下表所示：
Δadc溶剂测定
| 溶剂(g/L) | Δadc No.22-1 | Δadc No.22-2 |
| 乙醇 | 0.512 | 0.506 |
| 丙酮 | 0.315 | 0.306 |
| 丁醇 | 4.44 | 4.38 |
| 乙酸 | 6.67 | 6.65 |
| 丁酸 | 2.9 | 2.85 |
实施列6、pSY14-ptb质粒构建
以引物SceC-1(NdeI)和引物SceC-2(NdeI-XhoI)通过PCR将sceC序列(SEQID NO：1)扩增出来，NdeI酶切后，连入相同酶切并去磷酸化的pSY7质粒，经过酶切验证后(其酶切鉴定图见图16)，命名为pSY14-ptb(见图15及SEQ IDNO：26)。
所使用到的引物序列如下：
引物SceC-1(NdeI)：
5`-GGAATTCCATATGCATCAAAAGAATCAAGT-3`(SEQ ID NO：24)
引物SceC-2(NdeI-XhoI)：
5`-GGAATTCCATATGCTCGAGTTATTTAAGAAAAGTTTCAC-3`(SEQ ID NO：25)
其它操作步骤和条件如实施例1。
pSY14-ptb酶切(BamHI和XhoI)鉴定，结果如图16，No.2和No.5为正向克隆。
实施列7、pSY14-ptb电转丙酮丁醇梭菌质粒构建824adc-cr1
1.将pSY14-ptb质粒经E.coli ER2275/pAN1，操作步骤和条件如实施例5.ATCC 824adc-cr1发生双交换的菌落PCR引物如下：ch(a)引物(SEQ IDNO：18)；ch(b)引物(SEQ ID NO：19)。
2.824adc-cr1/pSY14-ptb发生双交换的验证结果。
如图17，将甲基化的pSY14-ptb电转ATCC 824adc-cr1之后，菌落PCR结果发现No.18为野生型条带。
将824adc-cr1/pSY14-ptb No.18的单菌分别接入Em和Thia的抗性CGM试管，结果Em未长，Thia试管生长起来。
以824adc-cr1/pSY14-ptb No.18的Thia试管菌液为模板，PCR〔引物：NdeI(SceI-thl1)(SEQ ID NO：8)；NdeI(XholI-Em-2)(SEQ ID NO：11)〕；结果如图18：红霉素抗性片段PCR结果为阴性，表明pSY9-1-adc已丢失；如图19：ch(a)引物(SEQ ID NO：18)和ch(b)引物(SEQ ID NO：19)所得到的PCR结果，表明该菌株为野生型，即完整发生了双交换的结果。
实施例8、以I-SceI系统敲除丙酮丁醇梭菌buk基因
以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，扩增buk基因(CAC3075)上下游各1kb左右的同源臂，通过Overlapping PCR将上下游同源臂拼接起来。将pSY9-1-adc以BamHI和HindIII双酶切之后，以T4DNA聚合酶补平，与overlapping PCR产物连接，获得重组质粒pSY9-1-buk。
将pSY9-1-buk转入E.coli ER2275/pAN1进行甲基化，将甲基化的质粒电转丙酮丁醇梭菌ATCC 824，Em(10ug/ul)CGM平板上得到的转化子，单菌挑到Em(40ug/ul)的CGM试管，以菌液为模板，PCR鉴定pSY9-1-buk是否整合到824buk靶基因上。将发生了单交换的重组菌，命名为buk-cr1。
以824buk-cr1为出发菌株，电转甲基化的pSY14-thl。通过菌落PCR鉴定含Thia(17ug/ul)的CGM平板上长出的转化子。将经过双交换后条带单一的buk缺失菌，接入CGM(Thia)试管进一步验证。
同时，通过测序和发酵实验，再次验证buk基因删除的突变菌株。
实施例9、以I-SceI系统构建Δadc-buk双敲除菌株
以I-SceI将824Δadc通过连续传代，丢失pSY14-thl质粒。以该菌株为出发菌，电转pSY9-1-buk甲基化质粒。将甲基化的质粒电转丙酮丁醇梭菌ATCC824Δadc，Em(10ug/ul)CGM平板上得到的转化子，单菌挑到Em(40ug/ul)的CGM试管，以菌液为模板，PCR鉴定pSY9-1-buk是否整合到824Δadc的buk靶基因上。将发生了单交换的重组菌，命名为824Δadc(buk-cr1)。
以824buk-cr1为出发菌株，电转甲基化的pSY14-thl。通过菌落PCR鉴定含Thia(17ug/ul)的CGM平板上长出的转化子。将经过双交换后条带单一的buk缺失菌，接入CGM(Thia)试管进一步验证。
同时，通过测序和发酵实验，再次验证buk基因删除的突变菌株。
得到的这样的突变株命名为：824Δadc-buk。
实施例10、以I-SceI系统敲除拜氏梭菌的xylR基因
拜氏梭菌的xylR基因是参与木糖利用的调控蛋白，该基因缺失能提高木糖的利用率。本方明选择xylR基因测试该方法能否用于拜氏梭菌的基因敲除。
以pIEFBPR(DQ486035.1)为模板，通过PCR将壮观霉素基因(Spectinomycin)及其启动子扩增出来，通过SacI与ClaI双酶切，与同样酶切的pSY14-thl连接，构建的表达sceC质粒命名为pSY17-thl。
以拜氏梭菌基因组为模板，扩增xylR(GeneID：5293589)基因上下游各1kb左右的同源臂，通过Overlapping PCR，经BamHI和HindIII双酶切后，构建到pSY9-1-adc相应酶切的质粒上，获得重组质粒pSY9-1-xylR。
将pSY9-1-xylR电转拜氏梭菌NCIMB 8052，Em(10ug/ul)CGM平板上得到的转化子，单菌挑到Em(20ug/ul)的CGM试管，以菌液为模板，PCR鉴定pSY9-1-xylR是否整合到8052的xylR靶基因上。将发生了单交换的重组菌，命名为xylR-cr1。
以8052xylR-cr1为出发菌株，电转pSY17-thl。通过菌落PCR鉴定含Spec(750ug/ul)的CGM平板上长出的转化子。将经过双交换后条带单一的buk缺失菌，接入CGM(Spec)试管进一步验证。
同时，通过测序和发酵实验(5％木糖发酵)，再次验证xylR基因删除的突变菌株。
实施例11、以I-SceI系统敲除丙酮丁醇梭菌的果糖利用途径的基因簇
丙酮丁醇梭菌CAC1453-CAC1460所编码的基因簇是与果糖利用有关，该基因簇大小约为7.2kb。本方明试图敲除该基因簇，来测试I-SceI系统可否在丙酮丁醇梭菌中完成大片段敲除。
以丙酮丁醇梭菌基因组为模板，扩增CAC1453上游1kb左右、及CAC1460下游1kb左右的同源臂，通过Overlapping PCR扩增得到；pSY9-1-adc以BamHI和HindIII双酶切，以T4聚合酶补平，将载体和PCR产物连接，转化E.coli，获得重组质粒pSY9-1-fru。
将pSY9-1-fru转入E.coli ER2275/pAN1进行甲基化，将甲基化的质粒电转丙酮丁醇梭菌ATCC 824，Em(10ug/ul)CGM平板上得到的转化子，单菌挑到Em(40ug/ul)的CGM试管，以菌液为模板，PCR鉴定pSY9-1-fru是否整合到824CAC1453-1460的基因簇上。将发生了单交换的重组菌，命名为fru-cr1。
以824fru-cr1为出发菌株，电转甲基化的pSY14-thl。通过菌落PCR鉴定含Thia(17ug/ul)的CGM平板上长出的转化子。将经过双交换后条带单一果糖利用基因簇缺失的菌，接入CGM(Thia)试管进一步验证。
同时，通过测序、发酵实验(果糖60g/L)，再次验证果糖利用基因簇删除的突变菌株。
实施例12、以I-SceI系统构建丙酮丁醇梭菌pyrF突变菌株
pyrF(CAC2652，Gene ID：1118835)基因编码的是乳清苷酸脱羧酶，参与嘧啶核苷酸的从头合成，但它也能把5’-氟乳清酸(5’-FOA)转变为细胞毒性物质，使细胞无法生长。而缺乏了pyrF基因的细胞是尿嘧啶营养缺陷型的，因而可以抵抗5’-氟乳清酸的毒性。
本方明将CAC2651-CAC2653的同源序列克隆至pSY9-1-adc，该同源序列包含了pyrF基因，重组质粒名为pSY9-1-pyrF。以该质粒为模板，设计大片段引物，并在引物中引入2个点突变，分别是将第78位的碱基T突变为G，第100位的碱基A突变为T，结果使原来的酪氨酸和赖氨酸都突变为了终止密码子。通过PCR，克隆的重组质粒名为pSY9-1-pyrF*。由于pyrF*的翻译提前终止，无法形成有功能的蛋白，因而也不具有pyrF的酶活。
将pSY9-1-pyrF*转入E.coli ER2275/pAN1进行甲基化，之后将甲基化的质粒电转丙酮丁醇梭菌ATCC 824，Em(10ug/ul)CGM平板上得到的转化子，单菌挑到Em(40ug/ul)的CGM试管，以菌液为模板，PCR鉴定pSY9-1-pyrF*是否整合到824pyrF基因上。将发生了单交换的重组菌，命名为pyrF*-cr1。
以824pyrF*-cr1为出发菌株，电转甲基化的pSY14-thl。将电转的复苏液转接到含Thia(17ug/ul)的CGM试管中，之后稀释涂布含5’-FOA及Thia抗生素的平板。带有野生型pyrF基因无法在含5’-FOA的平板上生长，因此能生长的菌可以初步判断为双交换之后，产生了点突变的重组菌，之后再通过PCR，测序来进一步鉴定。
实施例13、以I-SceI系统构建将外源抗性基因替换丙酮丁醇梭菌的adc
为了测试I-SceI系统可以用于引入外源基因，本方明以pIEFBPR(DQ486035.1)为模板，通过PCR将壮观霉素基因(Spectinomycin)及其启动子扩增出来；同时以丙酮丁醇梭菌的基因组为模板，通过PCR将adc基因上下游各1kb的同源臂扩增出来；以Overlapping PCR将这三段PCR产物拼接起来，得到的adc中断盒为：adcL-Spec-adcR。将pSY9-1-adc以BamHI和HindIII双酶切之后，以T4DNA聚合酶补平，与adc中断盒连接，得到的重组质粒为pSY9-1-adc(Spec)。
将pSY9-1-adc(Spec)转入E.coli ER2275/pAN1进行甲基化，将甲基化的质粒电转丙酮丁醇梭菌ATCC 824，Em(10ug/ul)CGM平板上得到的转化子，单菌挑到Em(40ug/ul)的CGM试管，以菌液为模板，PCR鉴定pSY9-1-adc(Spec)是否整合到824靶基因上。将发生了单交换的重组菌，命名为adc(Spec)-cr1。
以824adc(Spec)-cr1为出发菌株，电转甲基化的pSY14-thl。通过菌落PCR鉴定含Thia(17ug/ul)、Spec(750ug/ul)的CGM平板上长出的转化子。通过菌落PCR，将经过双交换后条带单一spec替换的突变菌，分别接入CGM(Thia)试管和CGM(Em)试管，对Thia试管能生长，而Em试管不能生长的菌通过PCR、测序和发酵来进一步验证。
实施例14、以I-SceI系统构建将外源抗性基因整合到丙酮丁醇梭菌的adc内部
为了测试I-SceI系统可以在丙酮丁醇梭菌的特定位置引入外源基因，本方明以pIEFBPR(DQ486035.1)为模板，通过PCR将壮观霉素基因(Spectinomycin)及其启动子扩增出来；同时以丙酮丁醇梭菌的基因组为模板，通过PCR将adc基因第99nt上下游各1kb的同源臂扩增出来；以Overlapping PCR将这三段PCR产物拼接起来，得到的adc中断盒为：adc99ntL-Spec-adc99ntR。将pSY9-1-adc以BamHI和HindIII双酶切之后，以T4DNA聚合酶补平，与adc中断盒连接，得到的重组质粒为pSY9-1-adc99nt(Spec)。
将pSY9-1-adc99nt(Spec)转入E.coli ER2275/pAN1进行甲基化，将甲基化的质粒电转丙酮丁醇梭菌ATCC 824，Em(10ug/ul)CGM平板上得到的转化子，单菌挑到Em(40ug/ul)的CGM试管，以菌液为模板，PCR鉴定pSY9-1-adc99nt(Spec)是否整合到824靶基因上。将发生了单交换的重组菌，命名为adc99nt(Spec)-cr1。
以824adc99nt(Spec)-cr1为出发菌株，电转甲基化的pSY14-thl。通过菌落PCR鉴定含Thia(17ug/ul)、Spec(750ug/ul)的CGM平板上长出的转化子。通过菌落PCR，将经过双交换后条带单一spec替换的突变菌，分别接入CGM(Thia)试管和CGM(Em)试管，对Thia试管能生长，而Em试管不能生长的菌通过PCR、测序和发酵继续验证adc第99nt的位置是否插入了spec抗性基因。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (16)
1.一种分离的多核苷酸序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种构建物，其特征在于，所述构建物含有权利要求1所述的多核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述构建物以大肠杆菌-丙酮丁醇梭菌的穿梭载体作为骨架。
4.如权利要求2～3中任一项所述的构建物，其特征在于，所述构建物还含有thl启动子或ptb启动子和Cm抗性基因，其中，所述thl启动子如SEQ IDNO:3第4623～4775位所示，所述ptb启动子如SEQ ID NO:26第3924～4039位所示。
5.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述构建物的序列如SEQ IDNO:3或26所示。
6.权利要求1所述的多核苷酸序列或权利要求2～5中任一项所述的构建物在敲除梭菌的基因、在梭菌基因组中引入外源基因和对梭菌基因组实施突变中的应用。
7.一种在梭菌中敲除基因的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌的待敲除基因上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点而不含该待敲除基因；
(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点的菌株；和
(3)使用权利要求2～5中任一项所述的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将待敲除的基因从所述梭菌的基因组上敲除。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumphytofermentans、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌或艰难梭菌。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌和拜氏梭菌。
10.一种在梭菌中引入外源基因的方法，所述方法包括：
(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌基因中待插入位点上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点，同时，该质粒还含有所述外源基因；
(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列、外源基因和I-SceI酶切位点的菌株；和
(3)使用权利要求2～5中任一项所述的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将所述外源基因引入所述梭菌的基因组中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumphytofermentans、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌或艰难梭菌。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌和拜氏梭菌。
13.一种在梭菌基因组中实施突变的方法，所述方法包括：
(1)构建一非复制型整合质粒，该质粒含梭菌基因中待突变基因上下游两段同源序列和I-SceI酶切位点，同时，该质粒还含有发生了突变的该待突变基因序列；
(2)将所述非复制型整合质粒转化所述梭菌，筛选获得整合了所述上下游两段同源序列、外源基因和I-SceI酶切位点的菌株；和
(3)使用权利要求2～5中任一项所述的构建物转化步骤(2)所获得的菌株，从而将所述突变基因引入所述梭菌的基因组中。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、热纤梭菌、Clostridiumcarboxidivorans P7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumphytofermentans、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌或艰难梭菌。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述梭菌为丙酮丁酸梭菌和拜氏梭菌。
16.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2～5中任一项所述的构建物。
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