CN102952793A - 利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，包括：1）PCR扩增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重组基因的同源序列；2）抗性基因片段与克隆质粒连接后，转化至大肠杆菌中，经筛选得到克隆质粒；3）以步骤2）得到的克隆质粒为模板，设计引物PCR扩增包含抗性基因、短同源臂以及相邻的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段；4）将同源重组DNA片段电击转化至含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；5）转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，筛选获得阳性重组子。该方法不需要将目的重组基因克隆，简单、快捷，且能进行多次基因操作，具有广泛的应用前景。

Description

利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法

技术领域

本发明涉及一种基因重组的方法，特别是涉及一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法。

背景技术

克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae）是一株革兰氏阴性细菌，是克雷伯氏菌属的模式种，属于肠杆菌科。克雷伯氏肺炎杆菌具有生长速度快、可以利用多种碳源和代谢产物丰富等特点，目前主要作为2,3-丁二醇和1,3-丙二醇等化学品的生产用菌，同时克雷伯氏肺炎杆菌可以代谢合成3-羟基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氢气等化学品，克雷伯氏肺炎杆菌还可以作为宿主细胞构建3-羟基丙酸等化合物生产菌，使得克雷伯氏肺炎杆菌成为一种具有广阔工业化应用前景的微生物。

由于克雷伯氏肺炎杆菌特殊的细胞结构和遗传背景，适应于克雷伯氏肺炎杆菌的遗传改造方法操作比较复杂。目前，对克雷伯肺炎杆菌进行基因改造的主要方法有转座子插入突变和同源重组敲除目的基因，而同源重组方法主要涉及到用自杀性质粒和用线性的DNA进行重组。

转座子插入突变是利用转座子随机的插入染色体上，使被插入的基因失活。常见的转座子有Tn5、Tn10、Tn916、Tn917等。Chang HY等利用Tn5在克雷伯氏肺炎杆菌CG43的染色体上插入失活得到荚膜缺失的菌株[Chang HY,et al.,Virulence and outer membrane propertiesof a galUmutant of Klebsiella pneumoniae CG43.Microbial pathogenesis,1996,20(5):P.255-261]。

自杀性质粒的方法是通过向克雷伯氏菌中引入自杀性质粒，使处于质粒上的序列与染色体上的同源序列发生重组，从而实现基因的替换。利用该方法Yang等通过构建自杀质粒转进E.coli SM10中，然后与产酸克雷伯氏菌M5al接合，进而敲出了产酸克雷伯氏菌M5al乳酸脱氢酶基因（ldhA）[Yang G,et al.,Fermentation of 1,3propanediol by a lactatedeficient mutant of Klebsiella oxytoca under microaerobic conditions.Appliedmicrobiology and biotechnology,2007,73(5):P.1017-1024]。Xu等通过自杀质粒敲除了克雷伯氏肺炎杆菌HR526的乳酸脱氢酶基因[Xu Y.Z.,et al.,Metabolism in 1,3-propanediol fed-batch fermentation by a D-lactate deficient mutant of Klebsiellapneumoniae.Biotechnology and bioengineering,2009,104(5):P.965-972]。另外，Horng等利用自杀质粒通过同源重组成功将克雷伯氏肺炎杆菌合成1,3-丙二醇途径dhaD和dhaK两个基因进行了失活[Horng,Y.T.,et al.,Inactivation of dhaD and dhaK abolishesby-product accumulation during1,3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2010.37:P.1-10]。

线性DNA重组是利用电击转化的方法将线性DNA转入克雷伯氏肺炎杆菌，使得位于线性DNA上的同源序列与染色体上的目的序列发生重组，实现重组替换。Seo等将抗性标记两端带有500bp的同源臂的线性DNA片段转入到克雷伯氏肺炎杆菌Cu中，利用细胞本身具有的重组功能，成功将菌株的甘油脱氢酶基因和1,3-丙二醇氧化还原酶基因进行了敲除[Seo,M.Y.,etal.,Elimination of by-product formation during production of 1,3-propanediol inKlebsiella pneumoniae by inactivation of glycerol oxidative pathway.Appliedmicrobiology and biotechnology,2009.84(3):P.527-534]。郝健等发明了一种利用Red重组酶辅助的用于克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，在大肠杆菌中利用携带短同源臂的线性DNA与质粒进行重组制备具有长同源臂的线性DNA，将长同源臂的DNA转入克雷伯氏肺炎杆菌，利用质粒pDK6-red表达Red重组酶的，成功的将克雷伯肺炎杆菌中编码二羟基丙酮激酶的基因进行了敲除[郝健等，克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，中国专利申请号201110435825；Wei D.,et al.,Red recombinase assisted gene replacement in klebsiellapneumoniae.Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2012.39:P.1219-1226]。

但对于克雷伯氏肺炎杆菌基因重组，已有的技术都采用较长的同源臂，需要将目的基因克隆出来用于构建长同源臂，需要更加简单、方便的方法，促进研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法。该方法不需要克隆目的基因，同源臂直接设计在PCR引物上，简单、快捷，且能进行多次基因操作，具有广泛的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明的利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，包括以下步骤：

1）PCR扩增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重组基因的同源序列，具体如下：

以携带第一抗性基因（抗性标记）的质粒为模板，进行PCR扩增，获得第一抗性基因片段；

其中，PCR扩增引物的5’端设计成与需要进行重组的基因序列同源的序列，同源序列长度在39-50碱基范围，PCR扩增引物的3’端设计成与需要扩增的抗性基因两侧同源的序列，使扩增获得的线性DNA中间为第一抗性基因，第一抗性基因的两侧连接有用于进行基因重组的短的同源序列；

所述扩增抗性基因的引物设计方法以及携带抗性基因的质粒特征见[Gust B.,et al.,PCR-targeting system in streptomyces coelicolor A3(2).John Innes Centre:Norwich,2002]详细描述。

2）将扩增的第一抗性基因片段与克隆质粒连接后，将连接产物转化至大肠杆菌中，经筛选，得到阳性克隆质粒；

3）PCR制备用于基因重组的DNA片段

以步骤2）的克隆质粒上的克隆位点上下游序列作为保护序列，设计PCR扩增引物，并以步骤2）得到的阳性克隆质粒为模板，进行PCR扩增，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段；本步骤中，通过设计引物、PCR扩增包含抗性基因、短同源臂以及相邻的上下游序列；

其中，该同源重组DNA片段（线性DNA片段）中间为第一抗性基因，第一抗性基因两侧是短同源臂，短同源臂两侧是来源于克隆质粒上的序列，即第一抗性基因的两侧连接有用于基因敲除的短同源臂，短同源臂外侧连接有来自克隆质粒的序列作为保护序列；该短同源臂由步骤1）中的设计于引物上的短的同源序列形成。

4）将步骤3）获得的同源重组DNA片段，电击转化至含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；

5）将步骤4）的转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，筛选获得阳性重组子，从而获得基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞。

所述利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，还可包括：

6）步骤5）获得的基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞（重组子），通过利用携带第N抗性基因的质粒，可以重新按照步骤1）～5）进行操作，制备同时携带第N抗性基因（其他抗性标记）的同源重组DNA片段，以进行第二次或多于两次的基因重组操作。其中，携带第N抗性基因的质粒中，N是大于或等于2的整数，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；该携带第N抗性基因的质粒包括：携带氯霉素抗性的质粒、携带四环素抗性的质粒、携带链霉素抗性的质粒或携带安普霉素抗性的质粒；即第N抗性基因包括：氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因或安普霉素抗性基因。

另外，本发明利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法中，当需要重组后将抗性基因消除时，可在步骤1）中加入如下步骤：在抗性基因（抗性标记）的两端添加FRT序列gaagttcctatactttcta gagaataggaacttc（如SEQ ID NO.1所示）。

所述步骤1）中，携带第一抗性基因的质粒包括：携带安谱霉素抗性的质粒（如携带安谱霉素抗性的pIJ773质粒），携带链霉素（壮观霉素）抗性的质粒，携带四环素抗性的质粒，或携带氯霉素抗性的质粒。

步骤1）中，短的同源序列是指可以设计在PCR引物上的、与需要进行重组的目的基因同源的序列，长度在39到50碱基。

所述步骤3）中，保护序列可以是任意的DNA序列，如长度为200-2000碱基对的保护序列，其中优选长度为400-700碱基对的保护序列。

所述步骤5）中的阳性重组子，能通过卡那霉素筛选质粒pDK6-red丢失的克雷伯氏肺炎杆菌的菌株，然后，转进pDK6-flp质粒来消除插入染色体的两端连接有FRT序列的抗性基因，获得消除抗性标记的菌株。其中，该消除抗性标记的菌株，再通过卡那霉素筛选丢失质粒pDK6-flp的菌株后，再转进质粒pDK6-red后，可以按照上述步骤1）-6）重新进行基因同源重组操作。

上述pDK6-red质粒和pDK6-flp质粒是携带卡那霉素抗性基因的质粒，受乳糖操纵子调控，分别表达Red重组酶和Flp重组酶，见[Wei D.,et al.,Red recombinase assisted genereplacement in klebsiella pneumoniae．Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology,2012.39:P.1219-1226]详细描述。

本发明通过两轮PCR和一步克隆制备用于克雷伯氏肺炎杆菌同源重组的DNA片段，该片段携带短的同源臂，短同源臂外侧添加保护序列的。短同源臂是直接设计到PCR引物上，通过引物合成而不用通过基因克隆获得。将制备的线性DNA片段转进携带pDK6-red质粒的克雷伯肺炎杆菌制作的电转化感受态细胞中，在Red重组酶的帮助下，即可实现基因的重组替换。因此，本发明具有操作简单、快速，能进行多次基因重组操作等优点，使克雷伯氏肺炎杆菌容易进行基因的敲除以及在染色体上添加基因，改变出发菌株的性能。

具体实施方式

以下实施例中使用的核酸内切酶、连接酶、一些基本质粒、PCR试剂以及DNA片段回收等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。

本发明通过用于同源重组的线性DNA片段的同源臂只有39到50碱基对，同源臂两侧连接有保护序列，保护序列是任意的DNA序列。在Red重组酶的辅助下，将上述线性DNA片段转化入克雷伯氏肺炎杆菌细胞，进行基因重组，通过抗性筛选获得重组子。具体的操作如下：

克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞的制作：参照“J.莎姆布鲁克著，黄培堂译《分子克隆实验指南》科学出版社2005”中的所述大肠杆菌电击转化感受态细胞制作方法制作，而区别在于当细胞培养30min后加入终浓度为0.7mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）继续培养细胞，直到OD600达到0.7时收集细胞制作感受态细胞。具体详见[魏东，等．克雷伯氏肺炎杆菌电击转化条件的优化，中国酿造，2012.31(4):18-20]。

携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌菌株感受态细胞的制备与不携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌菌株感受态制备相似，只是在细胞培养30min后不仅加入EDTA还要加入终浓度0.8mmol/L的IPTG来诱导Red重组酶的表达。

pDK6-red质粒转入克雷伯氏肺炎杆菌菌株：取pDK6-red质粒与克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞混合，使用2mm的电转杯在2kV的电压下电击转化,见[魏东，等．克雷伯氏肺炎杆菌电击转化条件的优化，中国酿造，2012.31(4):18-20]，利用卡那霉素抗性筛选，获得携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌菌株。而线性DNA电击转化携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌与质粒转入克雷伯肺炎杆菌中的方法相同，转化后用线性DNA片段上携带的抗性标记进行筛选，获得线性DNA与基因组染色体发生替换的重组菌株。

同源重组片段的制备：分为两轮PCR和一步克隆完成。

第一轮PCR：参照文献[Gust B.,et al.,PCR-targeting system in streptomycescoelicolor A3(2).John Innes Centre:Norwich,2002.]的描述设计引物，引物的5’端是短的同源序列，以携带抗性基因的质粒为模板，扩增抗性基因，如果需要重组后消除抗性标记，则待扩增的抗性基因两端需添加FRT序列。

克隆：将第一轮PCR扩增的片段通过TA克隆与克隆质粒连接，转化大肠杆菌，筛选阳性重组子。

第二轮PCR：在克隆位点上下游设计引物，以克隆筛选得到的阳性重组子为模板，扩增得到同源臂两端分别添加保护序列的同源重组片段。

利用电击的方法将同源重组片段转化入携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞中。

培养转化细胞，利用抗性或其他标记对转化细胞进行筛选，挑出重组子。

筛选得到的重组子可以进行下一轮的基因重组操作：重组子再次按照上述方法制备感受态细胞。选用携带其他抗性或选择标记的质粒为模板，按照上述的方法制备敲除其他基因的同源重组片段。这样就可以在同一株菌中进行多次基因重组，得到一株具有多种选择标记的重组子。

下面再举具体实例对本发明方法予以说明。

实例1

利用本发明的方法，在克雷伯氏肺炎杆菌GMCC1.6366菌株（GMCC1.6366菌株为中国普通微生物保藏中心保藏，具有氨苄青霉素抗性）中敲除依赖于ATP的二羟基丙酮激酶基因dhak1，具体步骤如下：

1）GMCC1.6366感受态细胞的制备

按照如上所述的具体实施方式中的“克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞的制作”进行操作。

2）pDK6-red质粒转入GMCC1.6366菌株

取pDK6-red质粒2μL，与制备好的100μL GMCC1.6366感受态细胞混合，设定电压2000伏特，利用2mm电转杯进行电击转化操作。转化后，细胞加入1ml的LB液体培养基37℃摇床，200转/min复苏1小时。然后，涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养，挑选长出的菌落10个，提取质粒，通过电泳进行验证，10个菌落都正确，命名为GMCC1.6366-pDK6-red。

3）GMCC1.6366-pDK6-red感受态细胞的制备

与GMCC1.6366感受态细胞制备方法相同，仅在细胞培养30min后添加IPTG（异丙基-3-D-硫代半乳糖苷）至终浓度0.8mmol/L。

4）用于进行染色体上dhak1基因重组的DNA片段制备。具体操作如下：

a．设计引物dhak1-FRT-s1和dhak1-FTR-a1，引物的5’端是与目的基因同源的39或40bp的碱基，而3’端是含有与抗性盒同源的序列，序列分别为：ATGTCTCAATTCTTTTTTAACCAGCGCGCCAGCCTCGT CATTCCGGGGATCCGTCGACC（如SEQ ID NO.2所示）和GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGTTCGCCGTGGATGCCCATT TGTAGGCTGGAGCTGCTTC（如SEQ ID NO.3所示）。其中，引物dhak1-FRT-s1的ATGTCTCAATTCTTTTTTAACCAGCGCGCCAGCCTCGT序列和引物dhak1-FTR-a1的GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGTTCGCCGTGGATGCCCATT序列与dhak1基因同源。利用引物dhak1-FRT-s1和dhak1-FTR-a1，以质粒pIJ773为模板，利用PCR扩增出长约1.5kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与dhak1上游和下游部分序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773的安普霉素抗性基因aac(3)IV,并且在aac(3)IV基因两侧具有FRT序列（如SEQ ID NO.1所示）。

b．回收上一步扩增的抗性基因，按照宝生物工程有限公司的pMD18-t simple试剂盒的方法进行连接。

c．筛选阳性克隆。将步骤b获得的连接产物加入到制作好的大肠杆菌感受态细胞中，进行转化。转化后，涂布在含氨苄青霉素的LB平板上过夜培养，氨苄青霉素用量为50mg/L。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落接种在氨苄青霉素的试管中培养，然后，提质粒进行电泳验证。提取的6个质粒中有一个为假阳性，其余5个均为阳性克隆，得到的阳性克隆命名为pMD18-t-k1。

d．设计引物pMD18t-s4和pMD18t-a4，序列分别为：GACGGTGAAAACCTCTGACACATGC（如SEQ ID NO.4所示）和TGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTC（如SEQ ID NO.5所示）。利用引物pMD18t-s4和pMD18t-a4，以质粒pMD18-t-k1为模板进行PCR，获得2.3kb的DNA片段，即同源重组片段。引物的位点分别位于TA克隆位点上下游各409bp处，因此扩增得到的DNA片段两端是来源于pMD18-t simple的409bp保护序列，与保护序列连接的是与dhak1同源的39或40bp的同源臂，同源臂的内侧连接的是FRT序列，而FRT序列之间的是aac(3)IV基因。

5）上述获得的同源重组DNA片段电击转化GMCC1.6366-pDK6-red感受态细胞。取DNA片段2μL，与制备好的100μL GMCC1.6366-pDK6-red感受态细胞（菌体OD₆₀₀值30）混合，使用2mm电转杯，设定电压2kv进行电击转化。转化后，加入1ml的LB液体培养基于37℃，200转/min摇床复苏1小时。然后，涂布在添加有50mg/L的安普霉素的LB固体平板，37℃过夜培养。

6）重组菌的验证。设计验证引物dhak1s和Yanzheng773z，序列分别为CCGATGCACTGCGGCTAT（如SEQ ID NO.6所示）和GCAAATACGGCATCAGTTACC（如SEQ ID NO.7所示）。其中，Yanzheng773z对应安谱霉素抗性基因aac(3)IV中间的一段序列。利用引物dhak1s和Yanzheng773z，以长出的菌株总DNA为模板进行PCR，产物DNA片段为700bp，而以出发菌株（CGMCC1.6366）总DNA为模板进行PCR无特异性条带，表明获得的重组菌为阳性，命名为GMCC1.6366-pDK6-red-dhak1。

通过以上过程获得的GMCC1.6366-pDK6-red-dhak1菌株，是克雷伯氏肺炎杆菌GMCC1.6366染色体上依赖于ATP的二羟基丙酮激酶基因dhak1与制备的含有同源臂的线性DNA片段的发生同源重组，使得染色体上的dhak1基因部分序列被安普霉素抗性基因替换，实现了菌株染色体上dhak1基因的敲除。由于该菌株具有核酸外切酶的活性，所以在同源臂的5’端添加了400bp左右的保护序列以供宿主消化，而宿主的消化能力有限，同源臂受到了保护。这样即可以发生同源重组。

本发明获得的GMCC1.6366-pDK6-red-dhak1菌株，由于该菌株染色体dhak1基因敲除失活，是研究依赖于ATP的二羟基丙酮激酶功能的材料。

综上所述，本发明主要通过：1）利用PCR扩增抗性基因DNA片段，其中在PCR引物上设计添加需要进行重组的基因的同源序列，获得两端连接有目的重组基因短同源臂的抗性基因DNA片段；2）将扩增的抗性基因片段连接到克隆质粒，将连接产物转化至大肠杆菌中，经筛选，得到阳性克隆质粒；3）设计PCR引物，以步骤2）得到的阳性克隆质粒为模板，扩增包含抗性基因、短同源臂以及相邻的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段；4）将步骤3）获得的同源重组DNA片段，电击转化至含有pDK6red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内，通过抗性筛选获得阳性重组子。该方法不需要将目的重组基因克隆，简单、快捷，且能进行多次基因操作。因此，具有广泛的应用前景。

Claims (9)

1.一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以携带第一抗性基因的质粒为模板，进行PCR扩增，获得第一抗性基因片段；

其中，PCR扩增引物的5’端设计成与需要进行重组的基因序列同源的序列，PCR扩增引物的3’端设计成与需要扩增的抗性基因两侧同源的序列，使扩增获得的DNA中间为第一抗性基因，第一抗性基因的两侧连接有用于进行基因重组的短的同源序列；

2）将扩增的第一抗性基因片段与克隆质粒连接后，将连接产物转化至大肠杆菌中，经筛选，得到阳性克隆质粒；

3）以步骤2）的克隆质粒上的克隆位点上下游序列作为保护序列，设计PCR扩增引物，并以步骤2）得到的阳性克隆质粒为模板，进行PCR扩增，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段，该同源重组DNA片段中间为抗性基因，抗性基因两侧是短同源臂，短同源臂两侧是来源于克隆质粒上的序列；

4）将步骤3）获得的同源重组DNA片段，电击转化至含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；

5）将步骤4）的转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，抗性筛选获得阳性重组子，从而获得基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，携带第一抗性基因的质粒包括：携带安谱霉素抗性的质粒，携带链霉素抗性的质粒，携带四环素抗性的质粒，或携带氯霉素抗性的质粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，短的同源序列是指设计在PCR引物上的、与需要进行重组的目的基因同源的序列，长度在39到50碱基。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，保护序列是任意的DNA序列。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述保护序列是长度为200-2000碱基对的保护序列。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述保护序列是长度为400-700碱基对的保护序列。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括：步骤5）获得的基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞，通过利用携带第N抗性基因的质粒，重新按照步骤1）～5）进行操作，制备同时携带第N抗性基因的同源重组DNA片段，以进行第二次或多于两次的基因重组操作；

其中，携带第N抗性基因的质粒中，N是大于或等于2的整数，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；该携带第N抗性基因的质粒包括：携带氯霉素抗性的质粒、携带四环素抗性的质粒、携带链霉素抗性的质粒或携带安普霉素抗性的质粒。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法中，当需要重组后将抗性基因消除时，在步骤1）中加入如下步骤：

在抗性基因的两端添加如SEQ ID NO.1所示的FRT序列。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5）中的阳性重组子，能通过卡那霉素筛选质粒pDK6-red丢失的克雷伯氏肺炎杆菌的菌株，然后，转进pDK6-flp质粒来消除插入染色体的两端连接FRT序列的抗性基因，获得消除抗性标记的菌株；

其中，该消除抗性标记的菌株，再通过卡那霉素筛选丢失质粒pDK6-flp的菌株后，再转进质粒pDK6-red后，能按照如权利要求1所述的方法，重新进行基因同源重组操作。