CN101926986A

CN101926986A - 一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101926986A
Application number: CN 201010260094
Authority: CN
Inventors: 吴后波; 苏晓波
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2010-08-20
Publication date: 2010-12-29

Abstract

本发明公开了一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用。本发明抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法包括线形打靶DNA的设计和制备、含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建、电击感受态拟态弧菌的制备、电击转化、基因敲除突变株的筛选、突变株中抗性基因的剔除和减毒活疫苗的制备。本发明所述抗弧菌病的减毒活疫苗是对拟态弧菌外毒素基因进行剔除后得到的，可以产生较好的免疫保护性，其免疫保护率可达84％。本发明抗弧菌病的减毒活疫苗可用于免疫多种海水养殖鱼类，可提高鱼类产量，适合推广应用。

Description

一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体涉及一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

弧菌病是海水养殖动物中常见的流行病，在现有的技术中，目前只有鳗弧菌菌体疫苗的生产和应用，尚未见弧菌减毒活疫苗的生产和应用。鳗弧菌菌体疫苗在水产养殖生产中具有较专一的抗弧菌特异性，对抗鳗弧菌引起的疾病具有较高的抗性，但正是由于其作用专一，对其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用较差，在生产应用中存在非常明显的局限性。此外，传统的细菌疫苗的生产工序上在最后环节加入灭活用药物，残留于疫苗中，导致存在副作用。因此，迫切需要一种可以对多种弧菌病均有抗性的、无副作用的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的抗弧菌病疫苗中存在的作用专一、对除鳗弧菌之外的弧菌引起的疾病的防御性较差、灭活用药用残留于疫苗中存在副作用的问题，提供一种对多种弧菌病均有抗性的、无副作用的抗弧菌病的减毒活疫苗。

本发明另一目的在于提供上述抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述抗弧菌病的减毒活疫苗的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明抗弧菌病的减毒活疫苗产生菌种为拟态弧菌(Vibrio mimicus)，其特性能完全为作用动物所接受。

本发明所述的抗海水养殖动物弧菌病的减毒活疫苗的制备通过以下步骤实现的：

1，线形打靶DNA的设计和制备。

2，含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建。

3，电击感受态拟态弧菌的制备。

4，电击转化。

5，基因敲除突变株的筛选。

6，突变株中抗性基因的剔除。

7，减毒活疫苗的制备。

本发明提供的减毒活疫苗的生产工艺，具体制备方案是这样实现的：

(1)线形打靶DNA的设计和制备

设计一对引物，引物序列如SEQ ID NO：1～2所示，其中一条引物5’末端的40-50bp与外毒素基因5’端同源，3’与卡那霉素(Km)抗性基因同源；另一条引物5’末端的40-50bp与外毒素基因3’端同源，3’与卡那霉素(Km)抗性基因的另一端同源。以含卡那霉素(Km)抗性基因的质粒为模板，通过PCR扩增出中间为卡那霉素(Km)抗性基因、两端为40-50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位点的线形打靶DNA。

(2)含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建

将含有Red系统3个基因的质粒转化到宿主菌拟态弧菌中，通过调节温度和加入诱导剂来控制Red系统的表达。本专利拟采用辅助质粒pKD20，该质粒含有整套Red系统，有优化的核糖体结合位点，在阿拉伯糖启动子ParaB控制下高效表达λ蛋白、β蛋白和Exo核酸外切酶。此外，该质粒还是一个温度敏感性复制子，37℃生长时就能轻易从宿主中消除。

(3)电击感受态拟态弧菌的制备

将含Red系统的宿主菌拟态弧菌培养过夜，再将隔夜培养的菌株转接到含卡那霉素的培养基中继续培养，在终止前不同时间加入不同量的L-阿拉伯糖来诱导Red系统的表达。离心收集菌体，制成所需的电击感受态菌体。

(4)电击转化

利用电击转化的方法将线形打靶DNA转入感受态拟态弧菌，获得外毒素基因缺失并对卡那霉素具有抗性的突变株。电击转化的电压设置为不同的数值，以期找到最佳的电击电压值。

(5)基因敲除突变株的筛选

由于所用的线形打靶DNA中间含卡那霉素(Km)抗性基因，与外毒素基因片段置换后即可整合到宿主菌拟态弧菌的染色体上表达卡那霉素抗性，根据这个特点，利用选择培养基筛选外毒素基因敲除的阳性突变株。

(6)突变株中抗性基因的剔除

本发明拟选择一个能表达FLP重组酶的帮助质粒pCP20去除卡那霉素(Km)抗性基因，FLP重组酶作用于卡那霉素(Km)抗性基因两端的FRT位点，通过重组将卡那霉素(Km)抗性基因剔除。帮助质粒pCP20和辅助质粒pKD20一样，都属于温度敏感性复制子，37℃生长时就能轻易从宿主中消除。

(7)减毒活疫苗的制备

FLP/FRT系统对抗性基因的剔除有可能只发生在部分突变株中，因此，需要进一步筛选抗性基因已剔除的突变株。本发明拟采用平板影印接种法(replicaplating)进行不含抗性基因的突变株筛选。筛选出的不含抗性基因的突变株即为减毒活疫苗。

本发明减毒活疫苗可以用于免疫海水养殖鱼类或提高养殖产量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所提供的抗海水养殖动物减毒活疫苗的用途，是可应用于海水养殖动物弧菌病的免疫，这种疫苗能产生较好的免疫保护性，其免疫保护率平均可达84％。该疫苗适用于免疫多种海水养殖鱼类，并具有提高养殖产量的效果。利用上述制备的疫苗经浸泡免疫养殖动物，其保护效果见表1～2：

表1疫苗在网箱养殖真鲷中的试用效果

表2疫苗在网箱养殖石斑鱼中的试用效果

附图说明

图1为线形打靶DNA的制备，其中，氯霉素抗性基因；

与外毒素基因同源的短序列T1和T2；口FRT位点。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

1.取经活化的拟态弧菌10ml，接种于1000ml经过滤的普通海水营养培养基，30℃、200rpm摇床培养18-20小时。

2.实验引物：设计一对引物，其中引物T1-A1的5`末端的21bp与外毒素基因5’端同源，3`与氯霉素抗性基因同源；另一条引物T2-A25`末端的21bp与外毒素基因3`端同源，3`与氯霉素抗性基因的另一端同源。

3.线形打靶DNA的制备：以含氯霉素抗性基因的质粒pKD3为模板，通过PCR扩增出中间为氯霉素抗性基因、两端为50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位点的线形打靶DNA。

4.电击感受态拟态弧菌的制备：将质粒pKD46转化到宿主菌拟态弧菌中，在含有氨苄青霉素和氯霉素的平板上30℃培养过夜，转接至液体TCBS培养基中30℃继续培养至OD600为0.20-0.25，并在培养终止前1h加入10％的L-阿拉伯糖，使终浓度约为6mmol/L。离心收集菌体，用灭菌去离子水洗涤2次，再用10％灭菌甘油洗1次，最后用10％灭菌甘油悬浮，使感受态细胞的最终浓度为1010cells/μl，制成含有质粒pKD46的电击感受态拟态弧菌。

5.电击转化：用上述扩增产生的一次PCR产物0.5-3μg与50μl含pKD46的电击感受态拟态弧菌细胞混合，将混合物加入0.1cm的Bio-Rad电击杯中进行电击转化。电击转化参数为电阻200Ω，电容25μF，电压设置为不同的数值，以期找到最佳的电击电压值(电击电压值2.5kv，电击时间5ms)。电击细胞用1ml SOC培养基悬浮，37℃，225r/min，复苏1.5h，然后涂布于含氯霉素(12.5g/ml)TCBS平板上，37℃培养。

6.基因敲除突变株的筛选：由于所用的线形打靶DNA中间含氯霉素抗性基因，与外毒素基因片段置换后即可整合到宿主菌拟态弧菌的染色体上表达氯霉素抗性，根据这个特点，利用选择培养基筛选外毒素基因敲除的阳性突变株。

7.突变株中抗性基因的剔除：将氯霉素抗性筛选出的宿主菌拟态弧菌制成化学感受态，导入质粒pCP20，于含氨苄青霉素和氯霉素的平板上30℃培养筛选阳性转化子，然后转接至无抗性培养基中，30℃培养8h，热诱导FLP重组酶表达，后提高到42℃过夜，质粒也逐渐丢火。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到氯霉素抗性平板上，不能生长的为氯霉素抗性基因已被FLP重组酶删除。

8.减毒活疫苗的制备：FLP/FRT系统对抗性基因的剔除有可能只发生在部分突变株中，因此，采用平板影印接种法(replica plating)进行不含抗性基因的突变株的进一步筛选，筛选出的不含抗性基因的突变株即为减毒活疫苗。

实施例2减毒活疫苗对海水养殖真鲷和青石斑鱼的生物安全性

采用肌肉注射的方法，将减毒活疫苗对海水养殖真鲷和青石斑鱼进行人工攻毒感染，检查减毒活疫苗的致死性，以病原菌强毒菌株作对照，结果见表3～4。

由表3～4可知，减毒活疫苗对实验鱼没有致病性。

表3减毒活疫苗对养殖真鲷的致病性检查

注：“+”示有症状，“++”示症状较严重，“+++”示症状最严重，“-”示无症状。

表4减毒活疫苗对养殖青石斑鱼的致病性检查

实施例3减毒活疫苗对海水养殖真鲷和青石斑鱼的免疫保护性

实验免疫组分加佐剂(福氏完全佐剂FCA)和不加佐剂组，免疫方式采用每尾实验鱼注射减毒活疫苗0.2ml的腹腔注射方式和将实验鱼在含10⁹cells/ml减毒活疫苗的海水中浸泡3分钟的直接浸泡方式，对真鲷和青石斑鱼进行免疫，对照组注射0.85％的生理盐水。初次免疫2周后采用同法进行强化免疫。采用肌肉注射的方法，利用病原菌对初次免疫2周后及强化免疫2周后免疫组及对照组的实验鱼进行人工攻毒感染，每尾实验鱼注射病原菌0.3ml，检查减毒活疫苗的免疫保护性。

减毒活疫苗按不同的免疫方式对真鲷进行免疫2周后，对实验鱼均具有免疫保护性，强化免疫后，菌体疫苗对实验鱼的免疫保护性均有所提高。其免疫保护率在初次免疫后高达70％(见表5)，强化免疫后其免疫保护率可提高到80％(见表6)。注射免疫比浸泡免疫的免疫效果好。

表5减毒活疫苗初次免疫真鲷的免疫保护性

注：免疫组1的抗原为减毒活疫苗，免疫方式为腹腔注射；免疫组2的抗原为减毒活疫苗+FCA，免疫方式为腹腔注射；免疫组3的抗原为减毒活疫苗，免疫方式为浸泡；免疫组4的抗原为减毒活疫苗+FCA，免疫方式为浸泡。

表6减毒活疫苗强化免疫真鲷后的免疫保护性

减毒活疫苗按不同的免疫方式对青石斑鱼进行免疫2周后，对实验鱼均具有免疫保护性，强化免疫后，菌体疫苗对实验鱼的免疫保护性均有所提高。其免疫保护率在初次免疫后高达80％(见表7)，强化免疫后其免疫保护率可提高到90％(见表8)。注射免疫比浸泡免疫的免疫效果好。

表7减毒活疫苗初次免疫青石斑鱼的免疫保护性

表8减毒活疫苗强化免疫青石斑鱼后的免疫保护性

Claims

1.一种抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述方法包括线形打靶DNA的设计和制备、含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建、电击感受态拟态弧菌的制备、电击转化、基因敲除突变株的筛选、突变株中抗性基因的剔除和制备减毒活疫苗；其中，所述线形打靶DNA的设计和制备是：设计一对引物，引物序列如SEQ ID NO：1～2所示，一条引物5’末端的40～50bp与外毒素基因5’端同源3’端与卡那霉素抗性基因的一端同源；另一条引物5’末端的40～50bp与外毒素基因3’端同源，3’端与卡那霉素抗性基因的另一端同源；以含卡那霉素抗性基因的质粒为模板，通过PCR扩增出中间未卡那霉素抗性基因、两端为40～50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位点的线形打靶DNA。

2.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建是将含有Red系统3个基因的质粒转化到宿主菌拟态弧菌中，通过调节温度和加入诱导剂来控制Red系统的表达。

3.根据权利要求2所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述质粒为pKD20。

4.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述电击感受态拟态弧菌的制备方法是将含Red系统的宿主菌拟态弧菌培养过夜，再将隔夜培养的菌株转接到含卡那霉素的培养基中继续培养，在终止前加入L-阿拉伯糖来诱导Red系统的表达，离心收集菌体，制成所需的电击感受态菌体。

5.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述电击转化是利用电击转化的方法将线形打靶DNA转入感受态拟态弧菌，获得外毒素基因缺失并对卡那霉素具有抗性的突变株。

6.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述基因敲除突变株的筛选是利用选择培养基筛选外毒素基因敲除的阳性突变株。

7.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述突变株中抗性基因的剔除是用表达FLP重组酶的质粒去除卡那霉素抗性基因。

8.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述制备减毒活疫苗是用平板影印接种法进行不含抗性基因的突变株筛选，筛选出的不含抗性基因的突变株即为减毒活疫苗。

9.一种抗弧菌病的减毒活疫苗，其特征在于所述疫苗通过权利要求1～8中任意一条权利要求所述制备方法制得。

10.权利要求9所述抗弧菌病的减毒活疫苗在免疫海水养殖鱼类或提高养殖产量中的应用。