CN105126094A - 一种拟态弧菌菌影疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟态弧菌菌影疫苗及其制备方法和应用。该疫苗是拟态弧菌经过E裂解蛋白的诱导裂解以及随后的冻干处理后获得的完整细菌空壳冻干粉；其制备方法包括如下步骤：拟态弧菌电转感受态细胞制备、温控裂解质粒转化感受态细胞、重组拟态弧菌培养、诱导裂解、收集菌影、冷冻干燥得到疫苗。该疫苗的口服免疫方法可采用：按50尾鱼(50g左右/尾)计，每天将约5×10⁹个菌影拌入适量饲料中，上下午各投喂一次，免疫剂量约为10⁸个菌影/尾/天，连续投喂7天，间隔2-3周后再连续投喂7天。本发明的口服菌影疫苗具有安全高效、制备简单、成本低、方便使用、性质稳定，便于保存和运输等优点，可有效预防拟态弧菌感染引起的鱼类腹水病。

Description

一种拟态弧菌菌影疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属基因工程疫苗领域，具体涉及一种拟态弧菌菌影疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

拟态弧菌(Vibriomimicus)也即最小弧菌是水产养殖生产中常见的一种人和水生动物共患病病原菌。该菌可感染养殖鱼类引起严重的腹水病，威胁养鱼业的健康发展。目前鱼类细菌性疾病的防治方法仍以内服抗菌药物和外用化学消毒剂为主，但由此带来的各种副作用如细菌耐药性、水环境污染以及水产品质量安全危害日益明显。安全高效的鱼用疫苗具有无残留、不会造成耐药性且能保证环境安全等诸多优点，因此鱼类传染病免疫防治技术的研究越来越受到全业界的高度重视。迄今为止，已报道的拟态弧菌疫苗有灭活苗、重组外毒素疫苗、外毒素-脂多糖偶联亚单位疫苗和基因缺失减毒活疫苗。这些疫苗尚属于实验室研究阶段的，虽然具有一定的免疫保护效果，但也存在一些不足。

比如，传统的灭活苗在灭活过程(福尔马林灭活或紫外线照射)中造成某些抗原表位缺失或抗原性减弱，导致免疫效果不佳且副作用较大，不能用于口服免疫；重组外毒素疫苗和外毒素-脂多糖偶联亚单位疫苗虽然安全，但免疫原性较低，需与佐剂配合使用，才能发挥免疫保护作用，同样也不能用于口服免疫；基因缺失减毒活疫苗免疫效果较好，但有返毒的风险，存在安全隐患。目前鱼用疫苗的给予方式有注射、浸泡和口服。注射因易引起鱼体受伤，且费时费力，从而限制了鱼用疫苗的推广应用；浸泡因作用于鱼体外部，其具体作用原理尚不清楚，且免疫效果相对较差；而口服免疫不受时间、地点和鱼体的大小限制，减少了劳动强度和因水产动物的应激所带来的不良反应，适宜水产养殖生产中大规模应用，但是必须克服疫苗抗原受消化道酶类和胃酸的降解作用。故亟须研发安全高效、制备简单、成本低廉、适于口服免疫的新型拟态弧菌疫苗。

发明内容

本发明的目的之一是克服现有拟态弧菌疫苗的不足，提供一种新的可用于口服免疫的拟态弧菌菌影疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

1)、制备拟态弧菌电转感受态细胞；

2)、构建含有噬菌体裂解基因E的温控裂解质粒，再利用温控裂解质粒转化所述拟态弧菌感受态细胞，得到重组拟态弧菌；

3)、将含有温控裂解质粒的重组拟态弧菌进行振荡增殖培养；

4)、诱导上述裂解基因E的表达，收集菌影；

5)、将得到的菌影经冷冻干燥处理，得到无任何活菌残留的拟态弧菌口服菌影疫苗冻干粉。

优选的，所述温控裂解质粒的构建过程为：将裂解基因E连接到原核表达质粒pBV220中温控表达元件λpL/pR-cI857的下游，从而构建得到温控裂解质粒pBV220-LysisE。

所述原核表达质粒pBV220含有温控表达元件λpL/pR-cI857，且为广宿主质粒，能够实现裂解基因E的成功表达，当然需要指出的是，并非所有的质粒均能实现裂解基因E的成功表达。

优选的，所述拟态弧菌为人鱼共患病原拟态弧菌(也称最小弧菌)ATCC33653。

拟态弧菌(最小弧菌)ATCC33653保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1.1969。

进一步的，步骤3)中的振荡培养温度为28℃，此时cIts857合成阻遏蛋白并与启动子λpL/pR结合，抑制裂解基因E表达，从而使重组拟态弧菌得以生长繁殖。

优选的，步骤2)中，利用温控裂解质粒转化所述拟态弧菌感受态细胞时，所使用的转化方法为电转化方法。

优选的，步骤4)中当含有温控裂解质粒的重组拟态弧菌OD_600nm值为0.4时,在42℃培养温度条件下，诱导裂解基因E表达；具体的，在该温度下阻遏蛋白失活，启动子转录，裂解基因E表达，使菌体内外膜上形成跨膜孔道，因渗透压的作用，细胞浆和核酸成分通过跨膜孔道溢出而形成菌影。

优选的，将步骤5)得到的菌影分装至中性硼硅管制西林瓶，加丁基橡胶塞，-80℃预冻4h，然后真空冷冻干燥24h，即可得到无任何活菌残留的拟态弧菌口服菌影疫苗冻干粉。

本发明的目的之二是提供上述方法制备得到的拟态弧菌菌影疫苗。所述疫苗是拟态弧菌经过E裂解蛋白(也即PhiX174噬菌体裂解基因E编码的蛋白)的诱导裂解以及随后的冻干处理后获得的完整细菌空壳冻干粉。其外观为白色疏松体，用无菌磷酸盐缓冲液重溶后为澄清液体，内含细菌空壳不低于1×10¹⁰个/mL，无任何活菌残留。

本发明的目的之三是提供所述的拟态弧菌菌影疫苗在防治鱼类腹水病中的口服应用：

具体的，拟态弧菌菌影疫苗口服免疫使用方法如下所述，用无菌磷酸盐缓冲液溶解菌影冻干粉，按50尾鱼(50g左右/尾)计，每天将约5×10⁹个菌影拌入适量饲料中，为方便混合均匀，也可将饲料加工成粉状，混合菌影后再制成颗粒。上下午各投喂一次，约1×10⁸个菌影/尾/天，连续投喂7天进行口服免疫，间隔2-3周后再加强免疫一次，投喂天数、剂量和方法同初次免疫。

本发明的有益效果在于：

1)、本发明温控裂解质粒pBV220-LysisE对拟态弧菌的裂解率高达99.94％，由于细胞内含物几乎全部流失而呈细菌空壳，再经冷冻干燥处理后可获得无任何活菌残留的菌影疫苗。以10倍免疫剂量接种本发明疫苗后的草鱼无任何不良反应，达到了安全无毒的使用标准，具有较大的应用前景。

2)、细菌菌影(BacterialGhost，BG)是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性细菌中表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的完整细菌空壳。菌影制备过程温和且无需变性作用，完好地保留了菌体表面结构和各种抗原成分，具有良好的免疫原性和内在佐剂性。菌影疫苗的最大优势在于不仅能够实现口服免疫，而且易于被免疫系统所识别、诱导机体产生良好的免疫应答，获得坚实的免疫效果。此外，菌影疫苗可通过发酵技术而大量生产，不需要复杂的纯化工作，只需使用离心方法收集菌影即可，经冷冻干燥处理后的菌影冻干制剂可以常温下长期保存。

本发明中的菌影完好地保留了菌体外膜结构、相关抗原蛋白和免疫刺激成分，因而具有内在的免疫佐剂性和免疫系统靶向性，能有效诱导机体产生体液免疫应答、细胞免疫应答以及免疫保护反应。经鱼体免疫试验证实，经本发明疫苗免疫后草鱼头肾和脾脏中免疫相关基因的整体转录水平、血清抗体水平及其杀菌活性以及攻毒后的相对免疫保护率(高达83.3％)均显著高于灭活苗，能有效预防拟态弧菌感染所致的鱼类腹水病，也有效地保证了鱼体的存活率。

3)、本发明疫苗不会被消化道酸性环境和酶类所降解，与饲料混合后即可用于大规模口服免疫，解决了渔用疫苗在水产养殖生产中难以操作的问题，不仅使用方便，同时具有较大的商业开发价值。

4)、本发明疫苗可通过发酵罐规模化生产，发酵产物用离心方法进行收集，并以冻干的形式保存于室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。另外，本发明疫苗为冻干粉剂，性质稳定，便于保存和运输，有效降低了制备成本。

附图说明

图1为含温控裂解质粒的重组拟态弧菌PCR和双酶切鉴定电泳图。

图2为拟态弧菌的裂解曲线。

图3A为拟态弧菌菌影的扫描电镜图。

图3B为拟态弧菌菌影的透射电镜图。

图4为菌影疫苗免疫组和灭活苗免疫组草鱼脾脏和头肾中免疫相关基因mRNA相对表达量的对比试验图。

图5为免疫后不同时间菌影疫苗免疫组和灭活苗免疫组血清抗体效价的动态变化图。

图6为免疫后不同时间菌影疫苗免疫组、灭活苗免疫组和PBS对照组血清的杀菌率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

下述说明中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实验方法中的所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述说明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述说明中的比例，如无特别说明，均为体积比例。

试验材料

1、菌株及质粒

拟态弧菌(Vibriomimicus)，也称最小弧菌，ATCC33653菌株购自中国菌种保藏中心。该菌株对氨苄青霉素敏感，适宜生长温度为28-37℃。

噬菌体PhiX174购自Promega(北京)生物技术有限公司，作为PCR扩增裂解基因E的模板。

质粒pBV220购自上海生工生物工程有限公司,该质粒带有温控表达元件λpL/pR-cI857、多克隆酶切位点和氨苄青霉素抗性标记等。

温控裂解质粒pBV220-LysisE由本实验室自行构建，构建方法属于本领域的常规操作，可参照文献(蔡昆，包士中，史晶等，大肠杆菌细菌菌蜕的制备及初步研究，军事医学科学院院刊，2008，32(5)：436-438)进行操作。

2、主要试剂

限制性内切酶(大连宝生物工程有限公司)；质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、FastQuantcDNA第一链合成试剂盒、高保真聚合酶PrimeSTARMax以及SYBRGreenSuperRealPreMixPlus试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；SOC肉汤培养基和LB培养基(上海生工生物工程有限公司)。

3、主要仪器

DYY-8C型电泳仪和DYY-Ⅲ型水平电泳槽(北京六一仪器厂)；PCR扩增仪(BIO-RADMyCycler)；全自动凝胶成像系统分析仪(JS-680D，上海培清科技有限公司)；恒温振荡箱(IS-RSDA，美国精骐有限公司)；实时荧光定量PCR仪(ABIStepOne，美国AppliedBiosystems公司)；冷冻干燥机(FD8-3，金西盟仪器有限公司)；超微量分光光度计(NanoDrop2000c，ThermoFisherScientific有限公司)；电穿孔系统(BIO-RADGenePulserXcell)；台式高速冷冻离心机(Allegra64R，美国贝克曼库尔特商贸有限公司)；超低温保存箱(DW-86L-388A，海尔特种电器有限公司)；S-4800型扫描电镜和HT7700型透射电镜(日立公司)；CO₂临界点干燥仪(EMS850，北京中镜科仪技术有限公司)。

1.含有温控裂解质粒pBV220-LysisE的重组拟态弧菌构建

1.1拟态弧菌电转感受态细胞制备

挑取拟态弧菌单菌落接种于3mLLB液体培养基，30℃、150rpm振荡培养过夜。按1％比例转接到100mLLB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养至OD_600nm值达到0.4，离心收集菌体沉淀(5000rpm，10min)。用预冷的272mmol/L蔗糖缓冲液重悬菌体沉淀，离心洗涤菌体3次，每次蔗糖缓冲液加入量分别为40mL、20mL和10mL，最后用1mL蔗糖缓冲液重悬菌体沉淀，按50μL/管分装，-80℃保存备用。

1.2温控裂解质粒pBV220-LysisE电转拟态弧菌感受态细胞

将5μL温控裂解质粒pBV220-LysisE与50μL拟态弧菌感受态细胞混合均匀，加至预冷的2mm电击杯中，将电穿孔仪调至电压1.6kV、电容25μF、电阻200Ω进行电转化。电击结束后，迅速加入950μL预热至28℃的SOC液体培养基，28℃复苏培养4h，然后5000rpm离心4min，取菌体沉淀涂布于含Amp(100μg/mL)的LB琼脂平板上，28℃培养至长出菌落。

1.3重组拟态弧菌的验证

将上一步得到的阳性转化子扩大培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒进行PCR和双酶切鉴定。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增裂解基因E：PCR扩增体系(50.0μL)为质粒模板2.0μL，高保真聚合酶PrimeSTARMax25.0μL，SEQIDNO:1所示E基因核苷酸序列的正向引物(5'-CCGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACC-3',下划线部分为EcoRⅠ酶切位点)和SEQIDNO:2所示E基因核苷酸序列的反向引物(5'-TGCACTGCAGTCACTCCTTCCGCACGTAATT-3'，下划线部分为PstⅠ酶切位点)各1.0μL，双蒸水21.0μL。PCR循环参数为：94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃再延伸10min。双酶切反应体系为：10×HBuffer2.0μL，EcoRⅠ和PstⅠ各1.0μL，质粒10.0μL，ddH₂O6.0μL，总体系20.0μL，37℃酶切反应3h。结果如图1所示，PCR扩增到一条约为276bp的DNA条带(泳道1)，与裂解基因E大小一致；温控裂解质粒pBV220-LysisE经双酶切后获得两条大小分别为3667bp(pBV220质粒)和276bp(E基因)的预期目的条带(泳道2)，泳道3为抽提的温控裂解质粒对照。结果说明温控裂解质粒已转入拟态弧菌。

结论：至此，含有温控裂解质粒pBV220-LysisE的重组拟态弧菌构建成功。

2.拟态弧菌口服菌影疫苗的制备

2.1菌影制备与裂解效率测定

将含有温控裂解质粒pBV220-LysisE的重组拟态弧菌接种至3mL含Amp的LB培养液，28℃、180rpm振荡培养12h。按1:100接种量取1mL菌液加入到100mL含Amp的LB培养液中，28℃、220rpm振荡培养至OD_600nm值为0.4，迅速升温到42℃继续振荡培养5h。从开始诱导时起每隔30min取1mL样品测OD_600nm值，用于绘制裂解曲线。另外，取诱导前、后的培养物各1mL，经10倍系列稀释后，进行活菌计数、计算裂解率。裂解率(％)＝(1-诱导后CFU/诱导前CFU)×100％。结果由裂解曲线(图2)可见，42℃诱导后约30min，重组拟态弧菌的OD_600nm值达到峰值，之后OD_600nm值开始下降(即细菌开始裂解)，至3.5h降至最低值0.298，之后一直保持平稳，5h后细菌裂解完成。重组拟态弧菌培养物活菌数从诱导前的1.89×10⁸CFU/mL下降到诱导后的1.08×10⁵CFU/mL，裂解效率为99.94％。

2.2菌影冻干苗的制备、活菌计数与电镜观察

将上步试验收获的拟态弧菌菌影用预冷的0.01M无菌PBS离心洗涤3次后，分装至中性硼硅管制西林瓶，加丁基橡胶塞，-80℃预冻4h，然后置FD8-3冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，压铝塑盖、贴标签，室温保存备用。

取出菌影冻干苗，用适量的无菌PBS重悬，并进行10倍系列稀释，取不同稀释度菌液涂布LB琼脂平板培养基，每一稀释度做2个重复，28℃恒温培养48h，进行活菌计数，结果未检测到任何活菌残留。

取出菌影冻干苗，用PBS重悬并离心洗涤3次，加1mL2.5％戊二醛固定12h，PBS离心洗涤4次，收集菌体沉淀。菌体沉淀依次进行梯度乙醇脱水(30％、50％、70％、80％、95％和100％)、乙酸异戊酯置换、CO₂临界点干燥过夜和镀铂，扫描电镜观察可见拟态弧菌菌影保留了细菌的基本形态和外膜结构，细胞表面存在明显的跨膜溶菌孔道，由于细胞内容物流失，细胞发生明显皱缩(图3A，箭头所示为跨膜溶菌孔道)。同时，菌体沉淀经戊二醛固定和磷钨酸染色后，置透射电镜下观察，可见拟态弧菌菌影细胞几乎不含内容物，仅剩下细菌空壳(图3B)。

结论：成功制备出可用于口服免疫的拟态弧菌菌影冻干苗，其外观为白色疏松体，重溶后为澄清液体，内含细菌空壳不低于1×10¹⁰个/mL，且无任何活菌残留。

3.拟态弧菌菌影疫苗的安全性和稳定性检测

3.1安全性检测

健康实验草鱼(50g左右/尾)饲养于仿生态式循环水系统，水温26±1℃，空气湿度为50-60％，每天早晚各投喂饲料1次，投喂量为草鱼体重的3％，适应性饲养10天，确认健康后用于试验。用无菌PBS溶解菌影冻干疫苗，将其调整浓度至4×10⁹个细菌空壳/mL，用灌胃器灌喂10尾健康草鱼，每尾0.25mL(最终菌影量为10⁹个细菌空壳/尾，是免疫剂量的10倍)，连续观察14d，草鱼均正常进食，游动良好，未见发病症状，鱼剖检后内脏组织器官无任何病变，说明该菌影疫苗对鱼类是安全的。

3.2稳定性检测

取室温保存4月、6月、8月和1年的菌影冻干苗，用无菌PBS重悬，涂布LB固体平板，30℃培养72h，检测是否含有活菌，并进行电镜观察。结果显示，4个保存时间点的菌影疫苗在培养板上均未有任何细菌生长；扫描电镜观察菌影疫苗仍可见细胞表面的跨膜溶菌孔道，细胞发生明显皱缩；透射电镜观察可见细胞内含物大量流失，基本呈细菌空壳。结果说明该菌影疫苗室温下至少可保存1年。

结论：拟态弧菌菌影疫苗具有良好安全性和稳定性，在室温下至少可保存1年。

4.拟态弧菌菌影疫苗的口服免疫效果评价

用拟态弧菌菌影疫苗口服免疫实验动物草鱼，通过检测草鱼免疫后免疫相关基因的转录水平、血清抗体水平及其杀菌活性、以及攻毒后的相对免疫保护率，综合评价疫苗的口服免疫效果。

4.1实验草鱼分组与免疫

健康实验草鱼(50g左右/尾)暂养于仿生态式循环水系统2周，观察摄食和活动状态，确认健康后随机分成3组，100尾/组。第一组草鱼口服免疫拟态弧菌菌影疫苗(简称为VmGgroup)，用无菌磷酸盐缓冲液溶解菌影冻干粉，按50尾鱼(50g左右/尾)计，每天将约5×10⁹个菌影拌入适量饲料中，上下午各投喂一次，约1×10⁸个菌影/尾/天，连续投喂7天进行口服免疫，间隔2周后再加强免疫一次，投喂天数、剂量和方法同初次免疫；第二组草鱼口服免疫拟态弧菌甲醛灭活疫苗(简称为FKCgroup)，按50尾鱼(50g左右/尾)计，每天将约5×10⁹个灭活细菌拌入适量饲料中，上下午各投喂一次，约1×10⁸个灭活细菌/尾/天，连续投喂7天进行口服免疫，间隔2周后再加强免疫一次，投喂天数、剂量和方法同初次免疫；第三组为不免疫对照组。实验期间水温26±1℃，空气湿度为50-60％。

4.2免疫相关基因mRNA表达水平的检测

分别于免疫前及免疫后的第12h、1d、3d、7d、14d、21d和28d各实验组随机挑选5尾草鱼，采集头肾和脾脏，使用RNA提取试剂盒提取组织总RNA，再用FastQuantcDNA第一链合成试剂盒成cDNA。用实时荧光定量仪ABIStepOne采用SYBRGreenⅠ方法检测2种组织中IL-1β、IgM、G-typelysozyme、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱβ5种免疫相关基因mRNA表达水平。根据GenBank上已登录的草鱼cDNA序列设计的5对特异性引物见表1。定量PCR反应体系(20μL)为：SYBRGreenSuperRealPreMix10μL,上下游引物各0.23μL，ROXⅡ2μL，ddH2O6.54μL，cDNA模板1μL，每个样品做三个重复。循环条件为：95℃15min；95℃10sec、X℃15sec、72℃30sec，共进行40个循环。X表示退火温度，退火温度分别为58℃(IL-1β)、53℃(IgM)、56℃(G-typelysozyme)、57℃(MHC-Ⅰ)、54℃(MHC-Ⅱβ)、53-58℃(内参基因β-actin)。荧光定量PCR结束后Stepone系统自动运用2^-△△CT法得出各基因mRNA的相对表达量，其中△△CT＝(CT_目的基因－CT_β-actin)_免疫后－(CT_目的基因－CT_β-actin)_对照。实验所得数据通过软件SAS9.0进行单因素和两因素方差分析。结果如图4所示(A-B为菌影疫苗及灭活疫苗免疫草鱼后脾脏和头肾中IL-1βmRNA表达水平；C-D为2种组织中IgMmRNA表达水平；E-F为2种组织中G-typelysozymemRNA表达水平；G-H为2种组织中MHC-ⅠmRNA表达水平；I-J为2种组织中MHC-ⅡβmRNA表达水平)，菌影疫苗免疫组在各检测时间点5种免疫相关基因mRNA在草鱼头肾和脾脏中均上调表达，整体表达水平均极显著高于未免疫对照组(p<0.01)，显著高于甲醛灭活疫苗免疫组(p<0.05)。结果说明该菌影疫苗可有效激活免疫系统，表达产物可发挥非特异免疫和特异性免疫的作用。

表1实时荧光定量PCR检测免疫相关基因的引物序列

4.3血清抗体水平及其杀菌活性检测

分别于免疫前及免疫后的第7d、14d、21d、28d和35d各实验组随机挑选5尾草鱼，尾动脉采血，分离血清，-20℃保存备用。

全菌凝集试验：在96孔微量滴定板上，将待检血清用无菌PBS倍比稀释至第10孔，50μL/孔，然后每孔加入等体积的拟态弧菌全菌抗原(浓度为10⁷CFU/mL)，振荡5min后，置35℃湿盒中孵育18-24h，观察凝集情况，判断凝集效价。实验中分别以免疫前血清和已知兔抗拟态弧菌抗体(本实验室制备)作为阴性和阳性对照。单因素方差分析菌影疫苗免疫组和甲醛灭活疫苗免疫组免疫后同一时间点血清抗体平均凝集效价的差异性。结果如图5所示，菌影疫苗免疫组和灭活疫苗免疫组草鱼在免疫后7天，即可从其血清中检测到特异性抗体，两免疫组的全菌凝集抗体平均效价(每一时间点5尾草鱼血清抗体效价的平均值)均为1:2⁴。随着免疫时间延长，菌影疫苗免疫组血清抗体凝集效价持续上升，至免疫后35d平均凝集价达到1:2⁹，而灭活疫苗免疫组血清抗体凝集效价在免疫后21d达到峰值，平均凝集效价为1:2⁶，随后基本保持不变。免疫后21d、28d和35d菌影疫苗免疫组的血清抗体平均凝集效价均显著高于灭活疫苗免疫组血清抗体平均凝集效价(p<0.01)。

免疫血清杀菌活性试验：分别取菌影疫苗免疫组和甲醛灭活疫苗免疫组免疫血清各500μL于不同无菌离心管中，每管加入培养至对数生长中期的拟态弧菌菌液500μL(浓度为1×10⁸CFU/mL)混匀，28℃孵育1h。采用平板倾注法测定免疫血清处理后菌液的细菌总数，同时测定PBS对照组草鱼血清处理后菌液的细菌总数。通过计算免疫血清杀菌率(Serumbactericidalrate)评价其杀菌活性。免疫血清杀菌率(％)＝(1－免疫血清处理组菌悬液的活菌数/PBS菌悬液的活菌数)×100％。多因素方差分析(采用Tukey’s方法进行多重比较)菌影疫苗免疫组血清、灭活疫苗免疫组血清和PBS对照组血清平均杀菌率(每一时间点5尾草鱼血清杀菌率的平均值)的差异性。结果如图6所示，PBS对照组血清的平均杀菌率在各时间点保持不变，均为13.11％；菌影疫苗免疫组血清的平均杀菌率随着免疫时间延长而持续上升，至免疫后35d平均杀菌率达到72.59％；灭活疫苗免疫组血清的平均杀菌率在免疫后21天达到最高(44.78％)，28天略下降至40.86％，35天又略微上升到43.69％。免疫后35d内菌影疫苗免疫组和灭活疫苗免疫组的血清平均杀菌率均显著高于PBS对照组(p<0.01)；免疫后21d、28d和35d菌影疫苗免疫组的血清平均杀菌率均显著高于灭活疫苗免疫组的血清平均杀菌率(p<0.01)。

4.4疫苗对草鱼的免疫保护作用检测

疫苗免疫后第36天，从菌影疫苗免疫组、灭活疫苗免疫组和PBS对照组分别随机取30尾草鱼转入3个攻毒实验鱼缸中适应环境，并缓慢将水温升高至28±1℃。用5LD₅₀拟态弧菌菌液(浓度为2.69×10⁸CFU/mL，0.2mL/尾)腹腔注射攻击各组实验鱼。连续观察14d，记录各组草鱼发病及死亡情况，根据公式计算相对免疫保护率(RPS)，RPS＝(1-免疫组死亡数/对照组死亡数)×100％，同时对死亡草鱼及时剖检和病原分离鉴定，以确定死亡原因。结果发现PBS对照组草鱼全部死亡；菌影疫苗免疫组草鱼存活25尾，相对免疫保护率为83.3％；灭活疫苗免疫组草鱼存活17尾，相对免疫保护率为56.7％。剖检死亡草鱼，眼观呈典型腹水病病变，并从肝脏中分离到大量细菌，其菌落特征与形态染色特性均与拟态弧菌一致。

结论：拟态弧菌菌影疫苗的口服免疫效果明显优于甲醛灭活苗，可良好保护养殖鱼类抵抗拟态弧菌感染。

Claims (9)

1.一种拟态弧菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、制备拟态弧菌电转感受态细胞；

2)、构建含有噬菌体裂解基因E的温控裂解质粒，再利用温控裂解质粒转化所述拟态弧菌感受态细胞，得到重组拟态弧菌；

3)、将含有温控裂解质粒的重组拟态弧菌进行振荡增殖培养；

4)、诱导上述裂解基因E的表达，收集菌影；

5)、将得到的菌影经冷冻干燥处理，得到无任何活菌残留的拟态弧菌口服菌影疫苗冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种拟态弧菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：所述温控裂解质粒是将裂解基因E连接到原核表达质粒pBV220中温控表达元件λpL/pR-cI857的下游，从而构建得到温控裂解质粒pBV220-LysisE。

3.根据权利要求1所述的一种拟态弧菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：所述拟态弧菌为人鱼共患病原拟态弧菌ATCC33653。

4.根据权利要求3所述的一种拟态弧菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：步骤3)中的振荡培养温度为28℃，此时cIts857合成阻遏蛋白与启动子λpL/pR结合，抑制裂解基因E表达，从而使重组拟态弧菌得以生长繁殖。

5.根据权利要求1所述的一种拟态弧菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：步骤2)中，利用温控裂解质粒转化所述拟态弧菌感受态细胞时，所使用的转化方法为电转化方法。

6.根据权利要求1所述的一种拟态弧菌口服菌影疫苗的制备方法，其特征在于：步骤4)中当含有温控裂解质粒的重组拟态弧菌OD_600nm值为0.4时,在42℃培养温度条件下，诱导裂解基因E表达。

7.根据权利要求1所述的一种拟态弧菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于：将步骤5)得到的菌影分装至中性硼硅管制西林瓶，加丁基橡胶塞，-80℃预冻4h，然后真空冷冻干燥24h，即可得到无任何活菌残留的拟态弧菌口服菌影疫苗冻干粉。

8.由权利要求1～7任一项所述的制备方法得到的拟态弧菌菌影疫苗。

9.权利要求8所述的拟态弧菌菌影疫苗在防治鱼类腹水病中的口服应用。