CN113873894A - 用于稳定和保存微生物的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本公开涉及稳定微生物组合物的方法，所述方法包括将保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及包装和密封所述保存的微生物细胞和所述WAS的混合物。本公开进一步涉及稳定的微生物组合物及其用途。

Description

用于稳定和保存微生物的方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年4月10日提交的美国临时申请第62/832,181的优先权，将其内容通过引用完整并入本文。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以代替纸质副本的文本格式提供，通过引用将其并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为ASBI-020_01WO_ST25.txt。该文本文件为5.56KB，创建于2020年4月9日，并通过EFS-Web以电子方式提交。

背景技术

微生物在自然界中作为群落共存并参与各种相互作用，从而导致个体群落成员之间的合作和竞争。微生物生态学的进步揭示了在大多数群落中高水平的物种多样性和复杂性。微生物在环境中普遍存在，栖息在生物圈内的一系列广泛的生态系统中。单个微生物及其对应的群落在海洋环境(深海和海洋表面)、土壤和动物组织(包括人体组织)等环境中发挥着独特的作用。

发明内容

在一些实施方案中，本公开提供了一种方法，其包括：将保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及包装和密封保存的微生物细胞和WAS的混合物。

在一些实施方案中，本公开提供了一种方法，其包括：保存微生物细胞群，以提供保存的微生物细胞群；从保存的微生物细胞群收获活的微生物细胞，以提供活的保存的微生物细胞群；将活的保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及包装和密封活的保存的微生物细胞群和MMWAS的混合物。

在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括鉴定目标微生物和/或微生物菌株；培养目标微生物和/或微生物菌株，以产生微生物细胞群；制备用于保存的微生物细胞群。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括将保存的微生物细胞群与至少一种稀释剂混合。

在一些实施方案中，所述至少一种稀释剂包括碳酸钙。

在一些实施方案中，WAS是微孔矿物WAS、中孔矿物WAS或大孔矿物WAS。在一些实施方案中，所述至少一种MWAS选自沸石、活性粘土、硅胶、氧化钙、硫酸钙、膨润土、山梨醇、氯化钙、聚(丙烯酸)钠盐、氯化钠和罗望子种子半乳糖木糖葡聚糖。在一些实施方案中，所述至少一种WAS包括微孔铝硅酸盐矿物。

在一些实施方案中，保存微生物细胞群包括汽化保存(PBV)。在一些实施方案中，将保存的微生物细胞以玻璃态保存。在一些实施方案中，保存的微生物细胞具有高玻璃化转变温度。

在一些实施方案中，所述至少一种WAS是包含介于20％和50％之间的孔隙率百分比的微孔矿物WAS。在一些实施方案中，所述至少一种WAS是微孔矿物WAS，其包含连接成三维框架的孔和共角铝硅酸盐四面体。在一些实施方案中，所述至少一种WAS是包含复合式(Na,K,Ca)2-3Al3(Al,Si)2Si13O36-12H2O的微孔矿物WAS。在一些实施方案中，所述至少一种WAS包括沸石。在一些实施方案中，所述至少一种WAS包括斜发沸石(ClinoptiloliteZeolite)。

在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括下列一种或多种：梭菌属物种(Clostridium spp.)细菌、琥珀酸弧菌属物种(Succinivibrio spp.)细菌、丁酸弧菌属物种(Butyrivibio spp.)细菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)细菌、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)细菌、普雷沃菌属物种(Prevotella spp.)细菌、互营球菌属物种(Syntrophococcus spp.)细菌或瘤胃球菌属物种(Ruminococcus spp.)细菌。在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp.)真菌、毕赤酵母属物种(Pichia spp.)真菌、根囊鞭菌属物种(Orpinomyces spp.)真菌或梨囊鞭菌属物种(Piromyces spp.)真菌。在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括毛螺菌科(Lachnospiraceae)的物种。

在一些实施方案中，梭菌属物种包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；琥珀酸弧菌属物种包含与SEQID NO:11具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；毕赤酵母属物种包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的ITS序列；芽孢杆菌属物种包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；乳杆菌属物种包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；普雷沃菌属物种包含与SEQ ID NO:10具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；或者，毛螺菌科的物种包含与SEQ ID NO:12具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列。

在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)细菌或盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp)真菌。在一些实施方案中，目标微生物细胞群包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)细菌、丁酸梭菌新物种(Clostridium butyricum sp.nov.)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)细菌、拜氏梭菌新物种(Clostridium beijerinckiisp.nov.)细菌、克鲁维毕赤酵母(Pichia kudriazevii)真菌、克鲁维毕赤酵母新物种(Pichia kudriazevii sp.nov.)真菌、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibio fibrosolvens)细菌、牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌或溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinosolvens)细菌。

在一些实施方案中，鉴定目标微生物和/或微生物菌株包括：处理从样品动物群收集的多个样品，以鉴定一种或多种目标微生物和/或微生物菌株，所述处理包括：对于多个样品的每个样品：测量与样品动物群相关的至少一个元数据；检测多个微生物类型的存在并确定检测到的微生物类型的细胞的绝对数；确定多个微生物类型的检测到的微生物类型的一个或多个菌株的相对测量值；基于检测到的微生物类型的细胞的绝对数和该微生物类型的一个或多个微生物菌株的相对测量值，确定一组目标微生物和/或微生物菌株以及对应的绝对细胞计数，并通过活性水平进行过滤；以及用测量的元数据分析该组目标微生物和/或微生物菌株和对应的绝对细胞计数，以鉴定目标微生物和/或微生物菌株与测量的元数据之间的关系。

在一些实施方案中，保存的微生物细胞是孢子。在一些实施方案中，保存的微生物细胞是营养细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含保存的微生物细胞群和水分活度清除剂(WAS)的产品。

在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括下列一种或多种：梭菌属物种(Clostridium spp.)细菌、琥珀酸弧菌属物种(Succinivibrio spp.)细菌、丁酸弧菌属物种(Butyrivibio spp.)细菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)细菌、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)细菌、普雷沃菌属物种(Prevotella spp.)细菌、互营球菌属物种(Syntrophococcus spp.)细菌或瘤胃球菌属物种(Ruminococcus spp.)细菌。在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp.)真菌、毕赤酵母属物种(Pichia spp.)真菌、根囊鞭菌属物种(Orpinomyces spp.)真菌或梨囊鞭菌属物种(Piromyces spp.)真菌。在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括毛螺菌科(Lachnospiraceae)的物种。

在一些实施方案中，梭菌属物种包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；琥珀酸弧菌属物种包含与SEQID NO:11具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；毕赤酵母属物种包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的ITS序列；芽孢杆菌属物种包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；乳杆菌属物种包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；普雷沃菌属物种包含与SEQ ID NO:10具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；或者，毛螺菌科的物种包含与SEQ ID NO:12具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列。

在一些实施方案中，保存的微生物细胞群包括牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)细菌或盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp)真菌。在一些实施方案中，目标微生物细胞群包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)细菌、丁酸梭菌新物种(Clostridium butyricum sp.nov.)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)细菌、拜氏梭菌新物种(Clostridium beijerinckiisp.nov.)细菌、克鲁维毕赤酵母(Pichia kudriazevii)真菌、克鲁维毕赤酵母新物种(Pichia kudriazevii sp.nov.)真菌、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibio fibrosolvens)细菌、牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌或溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinosolvens)细菌。

附图简述

图1提供了展示根据本公开的方法的工艺流程图。

图2提供了展示根据本公开的用于两个微生物菌株的方法的工艺流程图。

图3提供了根据一些实施方案在具有碳酸钙+5％的各种添加剂的模拟混合中的水分活度随时间变化的结果。

图4提供了包括2％沸石的示例性营养微生物的加速稳定性测试的结果。

图5提供了包括2％沸石的示例性营养微生物的加速稳定性测试的结果。

图6显示了温度对用沸石稳定的微生物1的货架稳定性的影响。

图7显示了温度对用沸石稳定的微生物2的货架稳定性的影响。

图8显示了湿度对用沸石稳定的微生物的货架稳定性的影响。

图9显示了湿度对没有沸石的微生物的货架稳定性的影响。

图10显示了用10％沸石稳定的微生物在50℃下的货架稳定性。

图11显示了用5％沸石稳定的微生物在50℃下的货架稳定性。

具体实施方式

概述

用于动物健康和营养行业的微生物和微生物组合物需要在环境温度下具有货架稳定性。然而，对于使用常见的保存材料和方法(比如汽化保存(PBV))的稳定性，需要保持低水分含量，这在工业规模上很难实现，因为这样的材料在研磨、加工、混合和/或包装过程中迅速吸收水分。通过包括水分活度清除组分，本公开着手解决这些挑战，所述水分活度清除组分对水分比在保存期间使用的材料具有更高的亲和力。因此，将这些水分活度清除组分添加到保存的微生物种群中可有助于保持最终包装的微生物产品的低水分含量及其在环境温度下的稳定性。

根据本公开的一些实施方案，公开了用于稳定和保存微生物的方法和系统。作为非限制性实例，这样的方法可用于形成如下详述的稳定的合成集合体、稳定的合成生物集合体和/或稳定的微生物补充剂。这样的稳定的组合物含有和/或包含一种或多种稳定的和/或保存的微生物(在一些实施方案中，营养微生物)。在一些实施方案中，这样的合成集合体含有和/或包含一种或多种稳定的和/或保存的微生物，例如，在下列一者或多者中公开的一种或多种微生物：美国专利申请公开号2018/0310592、2018/0333443和2018/0223325(出于所有目的，将每篇专利通过引用明确并入本文)。

定义

如在本说明书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文另外明确规定。因而，例如，术语“生物类型”预期表示单个生物类型或多个生物类型。又例如，术语“环境参数”可以表示单个环境参数或多个环境参数，因此不定冠词“一个”或“一种”不排除存在多于一个环境参数的可能性，除非上下文明确要求有一个且只有一个环境参数。

贯穿本说明书所提及的“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一个方面(one aspect)”或“一个方面(an aspect)”、“一个实施方式(oneimplementation)”或“一个实施方式(an implementation)”表示结合该实施方案描述的具体特征、结构、特性被包括在本公开的至少一个实施方案中。因而，贯穿本说明书在各处出现短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”或“在一个实施方案中(in anembodiment)”不一定全部是指同一个实施方案。此外，具体的特征、结构或特性可在一个或多个实施方案中以任何适合的方式组合。

如本文所用的，在特定实施方案中，当在数值之前时，术语“约”或“大约”表示所述值加或减10％的范围。在提供一系列值的情况下，应当理解的是，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另有明确规定，否则直至下限的单位的十分之一)以及在该陈述范围内的任何其他陈述值或中间值都被包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小范围内，也被包括在本公开内，受制于所陈述范围内的任何特别排除的极限值。当陈述范围包括极限值之一或两者时，排除这些被包括的极限值的任一者或两者的范围也包括在本公开中。

如本文所用的，“载体”、“可接受的载体”或“药物载体”是指与微生物集合体一起使用或在微生物集合体中使用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，比如花生油、大豆油、矿物油等等。优选采用水或含水盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油水溶液作为载体，在一些实施方案中将其用作注射溶液。可替代地，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘合剂(用于压制丸剂)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。载体的选择可以根据预期的给药途径和标准的药物实践进行选择。参见Hardee和Baggo(1998.Development andFormulation of Veterinary Dosage Forms.第2版，CRC Press.504pg.)；E.W.Martin(1970.Remington’s Pharmaceutical Sciences.第17版，Mack Pub.Co.)；和Blaser等人(US Publication US20110280840A1)，将每篇文献明确地通过引用完整并入本文。

术语“微生物(microorganism)”和“微生物(microbe)”在本文中可互换使用，是指属于细菌域、真核生物域或古细菌域的任何微生物。微生物类型包括但不限于细菌(例如,支原体属、球菌、芽孢杆菌属、立克次体、螺旋菌属)、真菌(例如，丝状真菌、酵母)、线虫、原生动物、古细菌、藻类、甲藻、病毒(例如，噬菌体)、类病毒和/或其组合。生物菌株是生物类型的亚分类群，并且可以是例如特定微生物的种、亚种、亚型、基因变体、致病变型或血清变型。

如本文所用的，“孢子”是指由细菌和真菌产生的适于存活和扩散的结构。孢子通常表征为休眠结构；然而，孢子能够通过萌发过程分化。萌发是孢子分化成具有代谢活性、能够生长和繁殖的营养细胞。单个孢子的萌发产生单个真菌或细菌营养细胞。真菌孢子是无性繁殖的单位，并且在一些情况下是真菌生命周期中的必要结构。细菌孢子是针对通常可能不利于营养细胞存活或生长的存活条件的结构。

如本文所用的，“微生物组合物”是指包含一种或多种本公开的微生物的组合物。

如本文所用的，“单个分离物”应当被理解为表示包含在与一种或多种其他微生物分离后的微生物的占优势的单个属、种或菌株的组合物或培养物。该短语不应当理解为指示微生物已分离或纯化的程度。然而，“单个分离物”可以实质上仅包含微生物的一个属、种或菌株。

如本文所用的，“微生物组”是指栖息在动物消化道或胃肠道(如果所述动物是反刍动物，则包括瘤胃)和微生物的物理环境的微生物的集合(即，微生物组具有生物和物理成分)。微生物组是流动的，并且可受到许多天然存在条件和人工条件(例如，饮食改变、疾病、抗微生物剂、另外的微生物的流入等)的调节。可通过施用本公开组合物实现的瘤胃微生物组的调节可以采取以下形式：(a)增加或减少微生物的特定科、属、种或功能分组(即，改变瘤胃微生物组的生物成分)和/或(b)增加或减少瘤胃中的挥发性脂肪酸，增加或降低瘤胃pH值，增加或减少对瘤胃健康重要的任何其他物理参数(即，改变瘤胃微生物组的非生物成分)。

如本文所用的，“益生菌”是指基本上纯的微生物(即，单个分离物)或期望的微生物的混合物，并且还可包括可施用于哺乳动物以恢复微生物群的任何其他成分。本发明的益生菌或微生物接种剂组合物可以与药剂一起施用，以允许微生物在胃肠道环境中存活，即，抵抗低pH值并且在胃肠道环境中生长。在一些实施方案中，本发明组合物(例如，微生物组合物)在一些方面是益生菌。

如本文所用的，术语“生长培养基”是适合于支持微生物生长的任何培养基。举例来说，培养基可以是天然的或人工的，包括胃泌素补充琼脂、LB培养基、血清和组织培养凝胶。应当理解的是，培养基可以单独使用或与一种或多种其他培养基结合使用。它也可以在添加或不添加外源营养素的情况下使用。可以用另外的化合物或成分，例如，可有助于特定微生物群的相互作用和/或选择的成分，将培养基改良或富集。例如，可以存在抗生素(比如青霉素)或杀菌剂(例如季铵盐和氧化剂)，并且/或者，可以将物理条件(比如盐度、营养素(例如有机和无机矿物质(比如磷、含氮盐、氨、钾以及微量营养素(比如钴和镁)、pH和/或温度)改良。

如本文所用的，“改进”应当广义地理解为，相比于对照组或相比于与所讨论的特征相关的已知平均量，涵盖感兴趣的特征的改进。例如，通过将用本文教导的微生物处理的有蹄动物所产生的奶与未经处理的有蹄动物的奶进行比较，可以证明与应用本公开的有益微生物或集合体相关的“改进的”奶产量。在本公开中，“改进”并不一定要求数据是统计学上显著的(即p<0.05)；相反，证明一个值(例如，平均处理值)不同于另一个值(例如，平均对照值)的任何可量化差异都可以上升到“改进”水平。

如本文所用的，“抑制和阻抑”等术语不应当被解释为需要完全抑制或阻抑，尽管在一些实施方案中这可能是期望的。如本文所用的，术语“标志物”或“独特标志物”是独特微生物类型、微生物菌株或微生物菌株活性的指示物。在生物样品中的标志物可以测量，并且包括但不限于基于核酸的标志物，比如核糖体RNA基因、基于肽或蛋白质的标志物和/或代谢物或其他小分子标志物。

如本文所用的，术语“分子标志物”或“遗传标志物”是指用于将核酸序列特征差异可视化的方法中的指示物。这样的指示物的实例是限制性片段长度多态性(RFLP)标志物、扩增片段长度多态性(AFLP)标志物、单核苷酸多态性(SNP)、插入突变、微卫星标志物(SSR)、序列特征扩增区(SCAR)、切割的扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工酶标志物或本文所述的定义特定基因和染色体位置的标志物的组合。标志物进一步包括编码16S或18SrRNA和内部转录间隔区(ITS)序列的多核苷酸序列，所述内部转录间隔区序列是在小亚基和大亚基rRNA基因之间发现的序列，已证明它们在相互比较时在阐明关系或区别方面是特别有用的。等位基因附近的分子标记作图是可由分子生物学技术领域的普通技术人员进行的程序。

如本文所用的，术语“性状”是指特征或表型。例如，在本公开的一些实施方案的上下文中，所产生的乳脂的量涉及在奶中存在的甘油三酯、三酰基甘油酯、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、磷脂、胆固醇、糖脂和脂肪酸的量。期望性状还可包括其他的奶特征，包括但不限于：短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸占优势；诸如乳糖、葡萄糖、半乳糖和其他寡糖之类的碳水化合物的量；诸如酪蛋白和乳清之类的蛋白质的量；维生素的量、矿物质、产奶量/体积；甲烷排放或粪肥的减少；氮利用效率的提高；干物质摄入量的提高；饲料效率和消化率的提高；纤维素、木质素和半纤维素的降解增加；诸如乙酸、丙酸和丁酸之类的脂肪酸的瘤胃浓度增加；等等。

性状可以显性或隐性方式遗传，也可以部分或不完全显性方式遗传。性状可以是单基因的(即，由单个基因座决定)或多基因的(即，由多于一个基因座决定)，或者，也可因一个或多个基因与环境的相互作用而产生。在本公开的上下文中，性状还可因一个或多个哺乳动物基因与一个或多个微生物基因的相互作用而产生。

如本文所用的，术语“纯合的”表示在二倍体生物的细胞中当两个完全相同的等位基因位于特定基因座但单独定位于相应的同源染色体对上时存在的遗传状况。相反，如本文所用的，术语“杂合的”表示在二倍体生物的细胞中当两个不同的等位基因位于特定基因座但单独定位于相应的同源染色体对上时存在的遗传状况。

如本文所用的，术语“表型”是指因个体的基因构成(即，基因型)与环境之间的相互作用而产生的单个细胞、细胞培养物、生物(例如，反刍动物)或生物群的可观察特征。

如本文所用的，当描述核酸序列或蛋白质序列时，术语“嵌合”或“重组”是指至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子或其中至少一个天然核酸或蛋白质序列的一个或多个元件重排的核酸或蛋白质序列。例如，术语“重组”可以指两个原本分离的序列区段的人工组合，例如，通过化学合成或通过基因工程技术对分离的核酸区段的操作。

如本文所用的，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是在自然界中的存在未知或非天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其他天然存在的核苷酸序列相比时，这样的合成核苷酸序列将包含至少一个核苷酸差异。

如本文所用的，术语“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，其为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、或其类似物。这个术语是指分子的一级结构，因而包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。它还包括修饰的核酸，比如甲基化和/或加帽的核酸、含有修饰碱基、骨架修饰的核酸，等等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换使用。

如本文所用的，术语“基因”是指与生物学功能相关的任何DNA区段。因而，基因包括但不限于，编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还可包括，例如，形成其他蛋白质的识别序列的非表达DNA区段。基因可以从多种来源获得，包括从感兴趣的来源进行克隆或根据已知或预测的序列信息进行合成，并且可包括设计成具有期望参数的序列。

如本文所用的，术语“同源的”或“同源物”或“直向同源物”是本领域已知的，是指共享共同祖先或家族成员并且基于序列同一性的程度确定的相关序列。术语“同源性”、“同源的”、“基本上相似”和“基本上对应”在本文中可互换使用。它们指的是核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生特定表型的能力。这些术语还指对本公开的核酸片段的修饰，例如相对于初始未修饰片段的一个或多个核苷酸的缺失或插入，所述修饰基本上不改变所得核酸片段的功能特性。因此，如本领域技术人员将理解的，应当理解本公开不只是涵盖特定的示例性序列。这些术语描述了在一个物种、亚种、品种、栽培品种或品系中发现的基因与另一个物种、亚种、品种、栽培品种或品系中的相应或等效基因之间的关系。出于本公开的目的，将同源序列进行比较。“同源序列”或“同源物”或“直向同源物”被认为、相信或已知在功能上相关。功能关系可以多种方式中的任何一种表示，包括但不限于：(a)序列同一性的程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，表示(a)和(b)两者。同源性可以使用本领域容易获得的软件程序来确定，所述程序例如在Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987)增刊30，7.718部分，表7.71.中讨论的那些。一些比对程序是MacVector(Oxford Molecular Ltd,Oxford,U.K.)、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)和AlignX(Vector NTI,Invitrogen,Carlsbad,CA)。另一个比对程序是Sequencher(Gene Codes,AnnArbor,Michigan)，其使用默认参数。

如本文所用的，术语“核苷酸变化”是指例如本领域熟知的核苷酸取代、缺失和/或插入。例如，突变含有产生沉默替换、添加或缺失的改变，但不改变编码蛋白质的特性或活性或蛋白质如何产生。

如本文所用的，术语“蛋白质修饰”是指例如本领域熟知的氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入。

如本文所用的，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”是指具有此类序列的最小尺寸特征的部分或全长分子的任何较大片段(至多并包括全长分子)。本公开的多核苷酸片段可编码遗传调控元件的生物活性部分。通过分离包含遗传调控元件的本公开的多核苷酸之一的一部分并且如本文所述评估活性，可以制备遗传调控元件的生物活性部分。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸等(至多为全长多肽)。待使用部分的长度将取决于特定应用。可用作杂交探针的核酸的一部分可以短至12个核苷酸；在一些实施方案中，其为20个核苷酸。可用作表位的多肽的一部分可以短至4个氨基酸。执行全长多肽功能的多肽的一部分通常比4个氨基酸长。

变体多核苷酸还包括来源于诱变和引起重组的程序(比如DNA改组)的序列。这样的DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如Stemmer(1994)PNAS 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri等人，(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore等人，(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等人，(1997)PNAS 94:4504-4509；Crameri等人，(1998)Nature 391:288-291；和美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。对于本文公开的多核苷酸的PCR扩增，可以设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，用于扩增来自cDNA的相应DNA序列或从任何感兴趣的生物提取的基因组DNA。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常是本领域已知的，并且公开于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。还参见Innis等人编辑，(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications(Academic Press,New York)；Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)；以及Innis和Gelfand编辑，(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

如本文所用的，术语“MIC”表示最大信息系数。MIC是一种类型的非参数网络分析，其鉴定本公开的活性微生物菌株和至少一个测量的元数据(例如，乳脂)之间的评分(MIC评分)。此外，将2016年7月22日提交的美国申请第15/217,575号(2017年1月10日作为美国专利第9,540,676号发布)通过引用完整并入本文。

如本文所用的，“货架稳定”是指通过根据本公开配制的微生物获得的功能属性和新效用，其使得所述微生物能够在其自然环境之外以有用/活性状态存在(即，显著不同的特征)。因此，货架稳定是由本公开的制剂/组合物产生的功能属性，表示配制成货架稳定的组合物的微生物可以在自然环境之外和环境条件下存在一段时间，所述时间取决于所使用的特定制剂，但通常意味着微生物可以被配制为存在于在环境条件下持续至少几天(通常至少一周)稳定的组合物中。

稳定方法

在一些实施方案中，本公开提供了用于稳定微生物的方法、装置和系统。这样的方法例如可以用于形成如下详述的稳定的合成集合体、稳定的合成生物集合体和/或稳定的微生物补充剂。这样的稳定的组合物含有和/或包含一种或多种稳定的微生物。在一些实施方案中，微生物是营养微生物，例如，在下列一者或多者中公开的一种或多种微生物：美国专利申请公开号2018/0310592、2018/0333443和2018/0223325(出于所有目的，将每篇专利通过引用明确并入本文)。

在一些实施方案中，本公开提供了用于稳定保存的微生物细胞(例如，营养细胞、孢子等)的方法，其包括：将保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平以及包装和密封保存的微生物细胞和MMWAS的混合物。

环境温度下的货架稳定性对于用于动物健康和营养的微生物产品的功效而言是重要因素。例如，可以使用保存方法以高产量成功保存营养微生物，但保存材料的稳定性可取决于保持低水分含量。这在工业规模上很难实现，因为保存的微生物材料在研磨、加工、混合和包装过程中迅速吸收空气中的水分。本公开提供了通过包括水分活度清除剂(WAS)例如对水分具有比对保存材料更高的亲和力的微孔矿物水分活度清除剂(MMWAS)来保持保存材料中低水分含量的方法。以这种方式使用，WAS可以有效地使保存材料干燥并且保持所述材料在环境温度下的稳定性。

水分活度清除成分

在一些实施方案中，本公开提供了稳定微生物组合物的方法，其包括将保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合。在一些实施方案中，水分活度清除成分是微孔矿物水分活度清除剂(MMWAS)。

在一些实施方案中，WAS是矿物WAS。矿物WAS包括微孔矿物WAS(即，包含<2nm孔径的矿物WAS)、中孔矿物WAS(即，包含2nm-50nm孔径的矿物WAS)和大孔矿物WAS(即，包含>50nm孔径的矿物WAS)。示例性WAS包括沸石、活性粘土、硅胶(比如二氧化硅)、氧化钙、硫酸钙、膨润土、山梨醇、氯化钙、聚(丙烯酸)钠盐、氯化钠和罗望子种子半乳糖木糖葡聚糖。

矿物WAS可包括微孔铝硅酸盐矿物。在一些实施方案中，矿物WAS包含在20％和50％之间、在30％和40％之间或在33％和35％之间的孔隙率百分比。在一些实施方案中，MMWAS包含约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％或约35％的孔隙率百分比。在一些实施方案中，矿物WAS包含约34％的孔隙率百分比。在一些实施方案中，矿物WAS包含连接成三维框架的孔和共角铝硅酸盐(AlO₄和SiO₄)四面体。在一些实施方案中，矿物WAS的孔结构的特征在于可通过直径约

的通道互相连接的直径大约

的多个笼，并且可由12个连接的四面体的环组成。矿物WAS可包括在其中限定的大空间或笼状结构。在一些实施方案中，矿物WAS可包含二氧化硅和氧化铝四面体的微孔排列。

在一些实施方案中，矿物WAS具有复合式：(Na,K,Ca)_2-3Al₃(Al,Si)₂Si₁₃O₃₆·12-H₂O。在一些实施方案中，矿物WAS是沸石。在一些实施方案中，沸石是天然沸石或合成沸石。在一些实施方案中，沸石选自片沸石、方沸石、菱沸石、斜发沸石、钠沸石、辉沸石和钙十字沸石。在一些实施方案中，矿物WAS是斜发沸石(Clinoptilolite Zeol ite)。

在一些实施方案中，将多于一种WAS与保存的微生物细胞群混合。例如，在一些实施方案中，可以将两种、三种、四种、五种或更多种WAS与微生物细胞群混合。在一些实施方案中，将WAS混合，以实现关于吸湿性的协同作用。例如，可以根据WAS组分的吸水率将它们混合–例如，将快速吸收的WAS与缓慢吸收的WAS混合，以延长吸收水分的时间范围。参见，例如图3。另外，可以根据WAS组分在不同温度范围内的吸水能力将它们混合–例如，将在较高温度下具有高吸收能力的WAS与在较低温度下具有高吸收能力的WAS混合。

在一些实施方案中，将WAS以相对于微生物细胞的预定比率与保存的微生物细胞群混合。在一些实施方案中，WAS与微生物细胞的比率为约10:1至约100:1。例如，在一些实施方案中，WAS与微生物细胞的比率为约10:1、约20:1、约30:1、约40:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1或约100:1。在一些实施方案中，将WAS以相对于稀释剂的预定比率与保存的微生物细胞群混合。在一些实施方案中，WAS与稀释剂的比率在约1:100和约100:1之间。

可以制备WAS(例如，通过在200℃下干燥4小时)。然后，可以将计算量的稀释剂和计算量的WAS混合(例如，在低剪切固体混合器中)，并且可以添加计算量的保存菌株。将组分混合直到达到期望的异质性阈值时为止，并且一旦完成，可以将稳定的合成集合体、稳定的合成生物集合体和/或稳定的微生物补充剂包装。

稀释剂

在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括将保存的微生物细胞群与至少一种稀释剂混合。示例性稀释剂包括碳酸钙、膨润土、蒙脱石和高岭土。另外的稀释剂是本领域已知的，参见例如Micheal和Irene Ash,Handbook of fillers,extenders,anddiluents,Synapse Information Resources,Inc.第2版，2008。在一些实施方案中，稀释剂可用作WAS。例如，膨润土是一种经常用作稀释剂的价廉物质，但另外具有清除水分活度的特性。

碳酸钙可以用作本文所述的保存的微生物细胞和菌株的稀释剂，因为它价廉、容易获得并且有营养。然而，碳酸钙具有很低的持水能力。因而，在包装过程中存在的任何环境水分将分配到保存的微生物材料中。随着保存的微生物材料吸收水分，玻璃化转变温度(Tg)急剧下降。本公开方法允许通过保持保存的微生物材料的高(Tg)来维持保存的微生物在环境温度下的货架稳定性。因此，在没有本公开方法的情况下，与碳酸钙或任何其他载体混合的保存的微生物材料将具有差的持水能力并且将吸收水分，导致保存的微生物材料的Tg下降和货架期的急剧降低。因此，本公开方法提供了环境货架稳定性的高Tg的维持。

保存方法

在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括保存的微生物细胞的稳定，所述稳定包括保存微生物细胞群，以提供保存的微生物细胞群；从保存的微生物细胞群收获活的微生物细胞，以提供活的保存的微生物细胞群；将活的保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及包装和密封活的保存的微生物细胞群和WAS的混合物。

一旦保存，就可以确定每个菌株的每单位测量的活力(例如，CFU/g或孢子/g)。然后，针对期望的批量大小，确定每个保存菌株的批量。批量大小是指材料的总质量(例如，所有载体、保存菌株、WAS等的总质量)。批量是指必须添加到批次中以达到期望剂量的特定保存菌株的量。例如，若微生物材料为5CFU/克，如果期望剂量为1CFU/克，那么5克批量大小将需要1克微生物1的批量。在一些实施方案中，根据期望的批量大小和活力/单位确定菌株的批量。然后可以确定稀释剂的量，例如，根据期望的批量大小，确定每个保存菌株的批量。然后，可以确定水分活度清除剂的批量，例如，根据期望的批次大小和计算的保存菌株批量。

在一些实施方案中，例如，通过与保存溶液混合，制备用于保存的微生物细胞。作为非限制性示例，保存溶液的实例可包括：细胞内保护剂(例如，糖类，尤其是非还原糖；糖醇类，比如山梨醇；和/或类似物)、pH缓冲剂(例如，谷氨酸单钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和/或类似物)、膜保护剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮K-15和/或类似物)，以及有助于保存的成分(例如，在适用情况下，用于玻璃形成的蔗糖，等等)和有助于质量控制的成分(例如，氧化还原指示剂，比如与厌氧微生物一起使用的刃天青，等等)。

在一些实施方案中，细胞内保护剂选自山梨醇、甘露醇、甘油、麦芽糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和甲基葡萄糖苷。在一些实施方案中，膜保护剂选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糖糊精和聚乙二醇。在一些实施方案中，保存溶液包含一种或多种缓冲剂，例如磷酸盐。

在一些实施方案中，将保存溶液定制为在系列保存方法中使用的保存挑战类型。本领域技术人员将熟悉保存溶液的要素(例如，细胞内保护剂、pH缓冲剂、膜保护剂等)以及适用于每种保存方法的组合。例如，与用于其他的保存挑战类型的保存溶液相比，用于通过泡沫形成保存或通过蒸发保存的保存溶液可能需要更高浓度的糖。

保存溶液的非限制性实例提供在下表1-3中。本领域中描述了另外的保存溶液，例如美国专利6,872,357。

表1：示例性保存溶液

表2：示例性保存溶液

表3：示例性保存溶液

可以通过本领域已知的多种方式完成微生物细胞的保存，包括冷冻干燥、冻干、冷冻保存、蒸发保存、泡沫形成保存、玻璃化、玻璃形成稳定、汽化保存、喷雾干燥、吸附干燥、挤压干燥或流化床干燥。在一些实施方案中，通过汽化保存(PBV)实现保存。

在一些实施方案中，通过导致实现高玻璃化转变温度的保存方法例如通过PBV保存微生物细胞，使得微生物在环境条件下稳定。根据一些实施方案，对于不同微生物和/或不同菌株可以有不同的保存方法(例如，在毕赤酵母菌株是第一菌株并且梭菌菌株是第二菌株的实例中，可以通过一种或多种不同的保存方法保存每个菌株)。

冷冻干燥(FD)/冻干

在一些实施方案中，通过冷冻干燥(也称为冻干保存)保存目标微生物细胞群。冷冻干燥或冻干是已知的并且应用于保存各种类型的蛋白质、细胞、病毒和微生物。FD通常包括一次干燥和二次干燥。冷冻干燥可用于以工业量产生稳定的生物活性物质。冻干可能损害细胞成分，并可导致活力降低，并且常规冻干产品通常仅在0℃或接近0℃下稳定，这可能需要从制造时起就将生物活性材料产品冷藏，一直到使用它时为止，在储存和运输过程中需要冷藏。

A.一次冷冻干燥

如上所述，冷冻干燥的局限性的原因部分地在于，在冷冻干燥过程中需要使用低压(或高真空)。高真空是需要的，因为在一次冷冻干燥过程中材料的温度应当低于其塌陷温度，所述塌陷温度大约等于Tg′。在如此低的温度下，一次干燥需要很多个小时(有时数天)，因为在低于-25℃的温度下，在冰上方的平衡压力小于0.476托。因此，新的工艺必须允许更短的生产时间。

在冷冻干燥方法中使用的低真空压力限制了可以因干燥而除去的水的量。通过在接近或低于Tg′(在冷却过程中在冰晶之间保持未冻结的溶液变成固体(玻璃化)时的温度)的温度下使冷冻标本中的冰升华来进行一级冷冻干燥。根据传统观念，在如此低的温度下进行冷冻干燥是重要的，原因至少有两个。在低温(即低于Tg′)下冷冻干燥很重要的第一个原因是确保在通过升华(一次干燥)除去冰之后剩余的滤饼是“固体”并且是机械稳定的，即它不会塌陷。在一次冷冻干燥后保持滤饼处于机械稳定的“固体”状态对于确保冷冻干燥材料的有效重构是重要的。提出了若干方法来测量特定材料的Tg′。这些方法依赖于对DSC(差示扫描量热仪)热分析图中可见的特征的不同解释。确定Tg′的最可靠方法是基于对冰开始融化的温度和在缓慢冷却过程中保持未冻结的水的浓度(Wg′)的评价。通常支持低温(即，低于Tg′)冷冻干燥重要性的第二个原因是，如果一次冷冻干燥在较低温度下进行，则在冷冻干燥之后生物活性物质的存活率更高。

FD可能对敏感的生物活性物质造成损害。在冷冻(形成冰晶)和随后在冰升华过程中的中等低温下冷冻标本的平衡期间，都会发生强烈的FD诱导的损伤。众所周知，在冷冻过程中引起细胞损伤的因素包括：冷冻诱导的脱水、在冰结晶和重结晶过程中细胞的机械损伤、细胞膜的相变、电解质浓度增加，等等。另外，在冰晶之间保持未冻结状态的液相中的较大pH值变化可能对冻结的生物活性物质引起损害。这种异常的pH值变化与结晶水解相关。

发生结晶水解是因为冰晶捕获正离子和负离子的差异。这会在冰晶内部产生显著的(约107V/m)电场。由于冰晶内部以与冰中水分子解离的常数成正比的速率电解，因此发生该电场的中和。这种中和导致保留在冰晶之间的液体的pH值变化。通过减少冷冻过程中形成的冰的表面并且通过增加保留在冰晶之间的液相体积，可以降低结晶水解的损害作用。这种保留的液体还减轻了(i)增加的电解质(或任何其他高反应性分子)浓度和(ii)对冰晶之间的细胞的机械损伤的损害作用。通过(i)增加在冷冻之前添加的保护剂的初始浓度以及(ii)通过减少样品中形成的冰的量，可以实现冰晶之间的液体增加。

避免冷冻至等于或低于Tg′的温度(通常在该温度下进行冷冻干燥)将允许显著减少保存生物损害的量。因此，允许保存生物活性物质而不使生物活性物质经受接近或低于Tg′的温度的新方法将显著提高保存材料的质量。

B.二次冷冻干燥

在通过升华(一次干燥)除去冰完成之后，可以将样品描述为多孔饼。在一次干燥结束时的样品中的水的浓度高于在低于Tg′(Wg′)的温度下在冰晶之间的玻璃状通道中保持未冻结的水的浓度。Tg′强烈依赖于溶液的组成，而对于大多数溶质，Wg′为约20wt％。在如此高的水浓度下，饼材料的玻璃化转变温度低于一次冷冻干燥温度，和/或显著低于-20℃。进行二次干燥以除去保留的(约20wt％)水并提高饼材料的玻璃化转变温度。实际上，不能在Tg′或更低温度下进行二次干燥，因为水从玻璃态材料中的扩散非常缓慢。由于这个原因，通过在给定时刻将饼加热至干燥温度Td来进行二次干燥，所述干燥温度高于饼材料的玻璃化转变温度Tg。如果在二次干燥步骤中，Td显著高于Tg，则滤饼将“塌陷”并且形成非常粘稠的浆，从而不可能进行标准重构。因此，饼的塌陷是非常不希望的。

塌陷现象本质上是动力学的，已在文献中有广泛讨论。随着饼材料的粘度降低，塌陷率增加。为避免塌陷或使塌陷过程达到可忽略不计的程度，在二次干燥过程中使Td保持接近Tg，从而保证饼材料的粘度高，塌陷速度慢。

玻璃化(玻璃形成)保存

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的玻璃化保存。“玻璃化保存”是从液体转变为高度固定的、非晶态的、无定形的固态，称为“玻璃态”。这样的过程也可以称为“玻璃形成保存”。“玻璃态”是无定形固态，其可以通过初始处于液态的材料的过冷来实现。玻璃化材料(例如，“玻璃”)中的扩散以极低的速率发生。因而，需要多于一个部分的相互作用的化学和生物变化实际上完全受到抑制。玻璃通常表现为均质、透明、易碎的固体，可以被研磨或碾磨成粉末。在高于被称为玻璃化转变温度(Tg)的温度时，粘度迅速下降，材料从玻璃态转变为所谓的可变形“橡胶态”。随着温度升高，材料转变为液态。只有在Tg高于储存温度的条件下，才能保证用于长期储存的玻璃化的最佳益处。

玻璃化已被广泛用于保存生物和高反应性化学品。玻璃化的基本前提是所有扩散受限的物理过程和化学反应(包括负责生物材料降解的过程在内)都停止在玻璃态。一般而言，玻璃是热力学不稳定的无定形材料，在其粘度非常高(1012-1014Pa/s.)时是机械稳定的。与玻璃态下的10^-14m/s相比，典型液体具有10m/s的流速。

生物活性物质可以保存在-196℃。纯水的Tg为约-145℃。如果在冷却过程中形成冰晶，则在冰晶之间的通道中保持未冻结的溶液将在Tg′(高于纯水的Tg)玻璃化。在冰生长过程中被排斥在通道中的生物活性物质在低于Tg′的温度下将是稳定的。如果将生物活性物质置于具有高Tg的浓缩保存溶液中，可以在显著高于-145℃的温度下使它们稳定。例如，对于含有80％蔗糖的溶液，Tg为约-40℃。含有99％蔗糖的溶液的特征在于约52℃的Tg。样品中水的存在导致强的增塑作用，使Tg降低。Tg直接取决于存在的水的量，因此可以通过控制水合作用水平加以调节—水越少，Tg越高。因此，必须将标本(有待在环境温度下玻璃化)通过干燥剧烈脱水。然而，干燥可能损害生物活性物质。因此，为了使生物活性物质在室温下稳定并且仍然保存其活力和功能，需要在保护性赋形剂(即保护剂)或赋形剂组合的存在下将它们干燥，这些赋形剂的玻璃化转变温度Tg高于室温。

蒸发保存

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的蒸发保存。“蒸发保存”是指包括通过蒸发干燥除去水的过程。

在一些实施方案中，通过小滴的蒸发干燥而干燥的生物活性物质的活性与冷冻干燥样品的活性相当。例如，已经表明不稳定的酶(萤光素酶和异柠檬酸脱氢酶)可以通过蒸发干燥在50℃下保存超过一年，而在干燥和在50℃下的后续储存期间没有任何可检测的活性损失。因为含有保护剂的脱水溶液变得粘稠，即使是小滴溶液，也可能需要长时期才能蒸发水分。

泡沫形成保存

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的泡沫形成保存。在泡沫形成保存(PFF)过程中，生物材料首先通过在高于凝固点的环境温度下在真空下沸腾而转化为机械稳定的干燥泡沫(称为一次干燥)。其次，在升高的温度下进行样品的稳定性干燥，以升高玻璃化转变温度。通过正确选择在PFF之前溶于悬浮液中的保护剂(例如，糖类)，并且通过正确选择在PFF过程中的真空和温度方案，实现在保存样品再水化之后的存活或活性产率(参见，Bronshtein,Victor.(2004).Bronshtein 2004Preservation by Foam Formulation.PharmTech.Pharmaceutical Technology.28.86-92)。

汽化保存

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的气化保存。汽化保存(PBV)是包括一次干燥和稳定性干燥的保存工艺。通过在显著高于Tg′的温度(大约10℃或更高)下将来自部分冻结但同时过热的材料的水的集中汽化来进行一次干燥(即，在真空压力低于水蒸气的平衡压力的情况下)。

在PBV期间，在一次干燥过程中的沸腾不产生大量飞溅，因为在零下温度的雪泥(slush)以上的平衡压力较低，并且雪泥表面的冰晶阻止或抑制了飞溅。通常，经过PBV干燥的材料(例如，冷冻溶液或悬浮液)看起来像部分覆盖有一层薄冻干饼皮(skim)的泡沫。

与泡沫形成保存(PFF)不同，汽化保存(PBV)可以非常有效地保存在藻酸盐凝胶制剂和其他凝胶制剂中包含或掺入的生物活性物质。可以通过在真空下在小的负(基于摄氏温标)温度下将冷冻凝胶颗粒干燥来进行PBV过程。对于这样的水凝胶系统，汽化包括冰晶的同时升华、未冻结微包裹体中的水的沸腾以及从凝胶表面的蒸发。

PBV可与冷冻干燥不同，因为冷冻干燥表明在一次干燥过程中产品加工温度处于或低于T_g′(通常低于-25℃)，并且因为冷冻干燥表明在一次干燥和二次干燥过程中都避免“塌陷”现象。PBV包括在显著高于T_g′的温度(即高于-15℃，更好地高于-10℃，并且还更好地高于-5℃)进行干燥。

另外关于PBV和其他挑战的详细信息可以在美国专利申请公开号2008/0229609中找到，出于所有目的特此将其全部内容通过引用明确并入本文。

冷冻保存

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的冷冻保存。冷冻保存是指使用非常低的温度来保存结构完整的活细胞和组织。冷冻保存的损害作用主要与以下因素相关：冷冻诱导的脱水、pH值变化、细胞外电解质浓度的增加、在低温下生物膜和大分子的相变以及与冰结晶相关的其他过程。在依赖于冷冻生物活性物质的方法中，潜在的冷冻损害是缺点。通过使用冷冻保护赋形剂(保护剂)，例如，甘油、乙二醇、二甲亚砜(DMSO)、蔗糖和其他糖类、氨基酸、合成聚合物和/或生物聚合物等，可以降低这种损害。

喷雾干燥

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的喷雾干燥保存。喷雾干燥是指通过用热气体快速干燥液体或浆液而生产干粉的方法。喷雾干燥通常包括在热空气流中在腔室中喷射微生物悬浮液，所述腔室包括加热空气入口、用于排出空气的出口和用于回收干燥的微生物粉末的出口。用于喷雾干燥方法的示例性温度、腔室体积和气体可以在美国专利6,010,725中找到。

吸附干燥

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的吸附干燥保存。吸附干燥是指一种包括通过扩散到诸如氧化铝、硅胶、分子筛和其他化学干燥剂的有孔(pourous)材料中并且吸附其上而除去水分的方法。

挤压

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的挤压保存。挤压是指其中将材料强制通过模具以便使其成形的方法。在一些实施方案中，使目标微生物细胞分散在载体或基质中，以便保护它们免受氧气、热、水分等影响。

流化床干燥

在一些实施方案中，进行目标微生物细胞群的流化床干燥保存。流化床干燥是指其中颗粒在床中流化并干燥的方法。当将一定量的固体颗粒物置于使固体材料表现得像流体一样的条件下时，就形成了流化床。在流化床干燥系统中，入口空气提供大量气流以支撑颗粒的重量。

稳定性干燥

在一些实施方案中，通过干燥方法进行目标微生物细胞群的保存(例如，冷冻干燥、玻璃化/玻璃形成保存、蒸发保存、泡沫形成保存、汽化保存、喷雾干燥、吸附干燥或流化床干燥)，并且干燥保存方法进一步包括稳定性干燥。进行稳定性干燥(1)以便进一步提高干燥材料的玻璃化转变温度，(2)以便使其在无真空的环境温度下是机械稳定的，以及(3)以便在环境温度下在长期储存过程中保存生物的效力和功效。

为了将材料的T_g增加到例如37℃并由此确保在该温度下的稳定，稳定性干燥步骤应当在显著高于37℃的温度下进行许多个小时，以便从已经干燥的材料的内部除去水分。

如果用于干燥的温度高于适用的蛋白质变性温度，那么在升高温度下的生物标本脱水过程可能对主题生物活性物质非常有害。为了保护样品免受可能因升高温度引起的损害，稳定性脱水过程(即稳定性干燥)可能需要分步进行。应当在起始温度下进行第一步(在空气中或真空中)，以确保脱水而无生物的活力和效力的显著丧失。在这样的第一干燥步骤之后，通过在每个后续步骤期间在逐渐升高的温度下干燥，可以在后续步骤中继续脱水过程。每个步骤将允许同时提高可实现的脱水程度和在随后的步骤期间用于干燥的温度。

鉴定目标微生物和/或菌株

在一些实施方案中，所述方法进一步包括，例如，基于例如在美国专利第9,938,558号中公开的发现平台来鉴定一种或多种目标微生物和/或菌株。然后，一旦鉴定一个或多个目标菌株，就培养每个菌株的培养物，并且并从培养物收获每个菌株的细胞。收获后，可以确定每个菌株的初始活力/单位(例如，CFU/g或孢子/g)。因而，在一些实施方案中，本文提供的方法包括鉴定目标微生物和/或微生物菌株；培养目标微生物和/或微生物菌株，以产生微生物细胞群；制备用于保存的微生物细胞群(例如，通过与保存溶液混合)；保存微生物细胞群，以提供保存的微生物细胞群；从保存的微生物细胞群收获活的微生物细胞，以提供活的保存的微生物细胞群；将活的微生物细胞群与至少一种MMWAS混合至期望的同质性水平；以及包装和密封活的保存的微生物细胞群和MMWAS的混合物。

示例性稳定方法

示例性稳定方法展示在图1和图2中。根据一些实施方案，如图1中的流程图展示，鉴定目标菌株30001。鉴定目标菌株可包括一种或多种发现方法，如在美国专利第9,938,558号中详述，出于所有目的，将其全部内容通过引用明确并入本文。例如，在本公开的一个方面，公开了从多个样品鉴定一种或多种活性微生物的方法，所述方法包括：确定样品中一种或多种活性微生物菌株的绝对细胞数，以及用至少一个元数据分析微生物，其中一种或多种活性微生物菌株存在于样品的微生物群落中。

在鉴定目标菌株30001后，培养该菌株的培养物30003。然后从培养物收获细胞30006。在收获30006后，可以任选地设置/建立保存前活力和/或测试初始活力/单位30009。在收获后，例如，通过与保存溶液混合，制备用于保存的细胞30012。在制备细胞30012后，进行/执行保存30015。

在进行/执行保存30015后，确定保存菌株/细胞的活力/单位30018，并且对于期望的批量大小，确定保存菌株的保存菌株批量30021，例如，根据批量大小和确定的活力/单位。然后，可以根据批量大小和计算的保存菌株批量确定稀释剂批量30024。然后，可以将计算量的稀释剂和计算量的MMWAS混合30033(例如，在低剪切固体混合器中)，并且添加计算量的保存菌株30036。将混合物混合30039，直到达到一定的异质性时为止30042，然后可以包装和密封混合物30045。

图2显示了两种微生物的示例性方法，其中第一步可包括鉴定第一目标菌株和第二目标菌株40001。例如，通过本文公开的方法之一鉴定第一和第二活性微生物菌株。在一些实施方案中，所述第一和第二微生物是通过以下步骤鉴定的活性微生物菌株：处理从样品动物群收集的多个样品，所述处理包括：对于多个样品的每个样品：测量与样品动物群相关的至少一个元数据；检测多个微生物类型的存在并确定检测到的微生物类型的细胞的绝对数；确定多个微生物类型的检测到的微生物类型的一个或多个菌株的相对测量值；基于检测到的微生物类型的细胞的绝对数和该微生物类型的一个或多个微生物菌株的相对测量值，确定一组活性微生物菌株和对应的绝对细胞计数，并通过活性水平进行过滤；以及用测量的元数据分析该组活性微生物菌株和对应的绝对细胞计数，以鉴定在活性微生物菌株与测量的元数据之间的关系；以及基于所述关系至少鉴定第一活性微生物菌株和第二活性微生物菌株。然后可以继续步骤40003a/b，直到包装和密封40045。

在一些实施方案中，完成混合，将产品包装在密封的具有低的湿蒸汽传输率(MVTR)的袋中。用于混合和包装的示例性程序以及关于在包装产品中包含MMWAS的益处的说明性数据提供在实施例1中。展示当根据本文所述的方法稳定微生物组合物时微生物存活率提高的示例性数据提供在实施例2中。

微生物来源

在一些实施方案中，本公开提供了使包含一种或多种目标微生物的微生物组合物稳定的方法。目标微生物群可以是适合于通过本文所述的方法稳定的任何微生物。如本文所用的，术语“微生物”应当广义地理解。它包括但不限于两个原核生物域，细菌和古细菌，以及真核生物真菌、原生生物和病毒。举例来说，微生物可包括以下属的物种：梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium)、糖发酵菌属(Saccharofermentans)、乳头杆菌属(Papillibacter)、暗色厌氧香肠状菌属(Pelotomaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、坦纳菌属(Tannerella)、普雷沃菌属(Prevotella)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、Vrystaatia、根囊鞭菌属(Orpinomyces)、新美鞭菌属(Neocallimastix)和叶点霉属(Phyllosticta)。微生物还可包括属于毛螺菌科和酵母菌目的物种。在一些实施方案中，微生物可包括本文公开的任何属的物种。

在一个实施方案中，微生物获自动物(例如哺乳动物、爬行动物、鸟类等)、土壤(例如根际)、空气、水(例如海洋、淡水、废水污泥)、沉积物、油、植物(例如，根、叶、茎)、农产品和极端环境(例如，酸性矿井排水或热液系统)。在一个另外的实施方案中，微生物获自海洋或淡水环境，比如海洋、河流或湖泊。在一个另外的实施方案中，微生物可以来自水体的表面或水体的任何深度(例如，深海样品)。

可以从基本上纯的或混合的培养物中分离出本公开的微生物。可以将它们浓缩、稀释或以它们在源材料中发现的天然浓度提供。例如，通过将沉积物悬浮在淡水中并使沉积物落到底部，可以从盐沉积物分离出用于本公开的的微生物。可以通过在适当的沉降时间后倾析移出含有大量微生物的水，将其施用于有蹄动物的胃肠道，或通过过滤或离心浓缩，稀释至适当的浓度并施用于有蹄动物的胃肠道，其中去除大部分盐。作为进一步的实例，可以类似地处理来自矿化或有毒来源的微生物，以回收微生物应用于有蹄动物，从而将对动物的损害的可能性降至最低限度。

在另一个实施方案中，微生物以粗制形式使用，其中它们未从它们天然存在于其中的源材料分离。例如，微生物被提供为与它们存在于其中的源材料相结合的形式；所述源材料例如，在胃肠道中所见的粪便物、反刍的食物或其他组成。在这个实施方案中，源材料可包括一个或多个微生物的物种。

在一些实施方案中，将混合的微生物群用于本公开的方法中。在其中微生物从源材料(例如，它们天然存在于其中的材料)中分离的本公开的实施方案中，可以使用技术人员容易知道的多种标准技术中的任何一种或其组合。然而，举例来说，这些技术通常采用这样的方法，通常通过在固体微生物生长培养基表面上的物理分离或通过到液体微生物生长培养基中的体积稀释分离，通过所述方法可以获得基本上纯的形式的单一微生物的固体或液体培养物。这些方法可包括从干燥材料、液体悬浮液、浆液或匀浆中分离，其中所述材料以薄层形式散布在适当的固体凝胶生长培养基上，或将所述材料连续稀释制成无菌培养基并接种到液体或固体培养基中。

在一些实施方案中，可以在分离方法之前预处理含有微生物的材料，以便使材料中的所有微生物繁殖。然后可以从富集的材料中分离微生物。

经受本文所述的稳定方法的目标微生物可以来源于包括微生物群落的任何样品类型。例如，用于本文提供的方法的样品包括但不限于动物样品(例如，哺乳动物、爬行动物、鸟类)、土壤、空气、水(例如，海洋、淡水、废水污泥)、沉积物、油、植物、农产品、植物、土壤(例如根际)和极端环境样品(例如，酸性矿井排水、热液系统)。在海洋或淡水样品的情况下，所述样品可以来自水体的表面或水体的任何深度(例如，深海样品)。在一个实施方案中，水样品是海洋样品、河流样品或湖泊样品。

在一个实施方案中，动物样品是体液。在另一个实施方案中，动物样品是组织样品。非限制性动物样品包括牙齿、汗液、指甲、皮肤、毛发、粪便、尿液、精液、粘液、唾液、胃肠道。动物样品可以是例如人、灵长类动物、牛、猪、犬、猫、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、马或鸟样品。在一个实施方案中，鸟样品包括来自一只或多只鸡的样品。在另一个实施方案中，样品是人的样品。人微生物组包括在皮肤表面和深层、乳腺、唾液、口腔粘膜、结膜和胃肠道中发现的微生物的集合。在微生物组中发现的微生物包括细菌、真菌、原生动物、病毒和古细菌。身体的不同部位表现出不同的微生物多样性。微生物的数量和类型可能标志着个体的健康或患病状态。细菌分类群的数目以千计，病毒可能是同样丰富的。在身体的给定部位的细菌组成因人而异，不仅在类型上，而且在丰度或数量上也不同。

在另一个实施方案中，样品是瘤胃样品。牛等反刍动物依靠多样的微生物群落来消化它们的饲料。这些动物已经演化为使用营养价值差的饲料，因为它们具有改良的上消化道(网状瘤胃或瘤胃)，饲料保留在其中同时被厌氧微生物群落发酵。瘤胃微生物群落非常密集，具有约每毫升3×10¹⁰个微生物细胞。在瘤胃中，厌氧发酵微生物占优势。瘤胃微生物群落包括所有三个生命域的成员：细菌、古细菌和真核生物。它们对应的宿主需要瘤胃发酵产物来维持身体和生长以及产奶(van Houtert(1993).Anim.Feed Sci.Technol.43，第189-225页；Bauman等人.(2011).Annu.Rev.Nutr.31，第299-319页；出于所有目的，将每篇文献通过引用完整并入本文)。而且，据报道，奶产量和组成与瘤胃微生物群落相关(Sandri等人，(2014).Animal 8，第572-579页；Palmonari等人，(2010).J.Dairy Sci.93，第279-287页；出于所有目的，将每篇文献通过引用完整并入本文)。在一个实施方案中，通过在Jewell等人，(2015).Appl.Environ.Microbiol.81，第4697-4710页中描述的方法收集瘤胃样品，出于所有目的，将该文献通过引用完整并入本文。

在另一个实施方案中，样品是土壤样品(例如，大块土壤或根际样品)。据估计，1克土壤含有数万个细菌分类群，多达10亿个细菌细胞以及约2亿个真菌菌丝(Wagg等人，(2010).Proc Natl.Acad.Sci.USA 111，第5266-5270页；出于所有目的，将其通过引用完整并入本文)。细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物和病毒都存在于土壤中。土壤微生物群落多样性涉及土壤微环境的结构和肥力、植物的养分获取、植物多样性和生长以及在地上和地下群落之间的资源循环。因此，评估随时间的土壤样品的微生物含量和活性微生物的共存(以及活性微生物的数量)对微生物提供了有关环境元数据参数(比如养分获取和/或植物多样性)的深入了解。

在一个实施方案中，土壤样品是根际样品，即，直接受根分泌物和相关土壤微生物影响的狭窄土壤区域。根际是其中观察到微生物活性升高并且植物根通过养分和生长因子的交换与土壤微生物相互作用的群密集区域(San Miguel等人，(2014).Appl.Microbiol.Biotechnol.DOI 10.1007/s00253-014-5545-6，出于所有目的通过引用完整并入本文)。由于植物分泌许多化合物到根际中，因此根际中生物类型的分析可用于确定微生物生长在其中的植物的特征。

在另一个实施方案中，样品是海洋或淡水样品。海洋水每毫升含有多达一百万种微生物和数千种微生物类型。这些数字在沿海水域可以是更高的数量级，因为它们的生产力更高，并且有机物质和养分的负荷更高。海洋微生物对于下述项是至关重要的：海洋生态系统的功能；维持产生的和固定的二氧化碳之间的平衡；通过蓝藻、硅藻、超微浮游植物和微微型浮游植物等海洋光养微生物产生超过50％的地球上的氧气；提供新的生物活性化合物和代谢途径；通过占据海洋食物网中关键的底部营养水平，确保海产品的可持续供应。在海洋环境中发现的生物包括病毒、细菌、古细菌和一些真核生物。海洋病毒可通过病毒裂解在控制海洋细菌群方面发挥重要作用。作为其他小的微生物的食物来源以及有机物质的生产者，海洋细菌是重要的。在整个海洋水柱中发现的古细菌是远洋古细菌，其丰度与海洋细菌相媲美。

在另一个实施方案中，样品包括来自极端环境(即具有对地球上大多数生命有害的条件的环境)的样品。在极端环境中茁壮成长的生物被称为嗜极生物。虽然古细菌域包含熟知的嗜极生物的例子，但细菌域也可有这些微生物的代表。嗜极生物包括：在3或更低的pH水平生长的嗜酸生物；在9或更高的pH水平生长的嗜碱生物；厌氧生物，比如不需要氧气而生长的Spinoloricus Cinzia；隐藏岩内生物(cryptoendolith)，其生活在充满地下水的深层地下的岩石、裂缝、含水层和断层内部的微观空间中；在至少约0.2M浓度的盐中生长的嗜盐生物；在高温(约80-122℃)下茁壮成长例如在热液系统中发现的超嗜热生物；生活在寒冷沙漠中岩石下面的石下生物；无机自养生物，比如欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)，其从黄铁矿等还原矿物化合物中获取能量，在地球化学循环中是活跃的；耐受高水平溶解重金属比如铜、镉、砷和锌的耐金属生物；在营养受限环境中生长的贫营养生物；在高糖浓度环境中生长的嗜高渗生物；在高压下茁壮成长比如在海洋深处或地下发现的的嗜压生物(或嗜压菌)；在约-15℃或更低的温度下存活、生长和/或繁殖的嗜冷生物/嗜寒生物；耐高水平电离辐射的抗辐射生物；在45-122℃的温度下茁壮成长的嗜热生物；能在极度干燥条件下生长的嗜旱生物。多重嗜极生物是在多于一个类别下被定性为嗜极生物的生物，包括嗜热嗜酸生物(优选温度为70-80℃，pH在2和3之间)。古细菌的泉古菌门(Crenarchaeota)组包括嗜热嗜酸生物。

样品可包括来自一个或多个域的微生物。例如，在一个实施方案中，样品包含细菌和/或真菌的异质群(在本文中也称为细菌或真菌菌株)。例如，一种或多种微生物可以来自细菌域、古细菌域、真核生物域或其组合。细菌和古细菌是原核生物，具有非常简单的细胞结构，没有内部细胞器。细菌可分类为革兰氏阳性/无外膜、革兰氏阴性/存在外膜和未分组的门。古细菌构成了单细胞微生物的域或界。虽然在视觉上与细菌相似，但古细菌拥有与真核生物更密切相关的基因和几种代谢途径，值得注意的是参与转录和翻译的酶。古细菌生物化学的其他方面是独特的，比如在它们的细胞膜中存在醚脂质。古细菌分为四个公认的门：奇古菌门(Thaumarchaeota)、曙古菌门(Aigarchaeota)、泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Korarchaeota)。

真核生物域包括由膜结合的细胞器(比如细胞核)定义的真核生物。原生动物是单细胞真核生物。所有多细胞生物都是真核生物，包括动物、植物和真菌。真核生物被分类为四个界：原生生物界、植物界、真菌界和动物界。然而，存在几种替代分类。另一种分类将真核生物分为六个界：古虫界(Excavata)(各种鞭毛虫原生动物)；变形虫界(amoebozoa)(叶状类变形虫和粘丝状真菌)；后鞭毛生物(Opisthokonta)(动物、真菌、领鞭毛虫类)；有孔虫界(Rhizaria)(有孔虫门、放射虫和各种其他类变形虫原生动物)；囊泡藻界(Chromalveolata)(不等鞭毛类(褐藻、硅藻)、定鞭藻门(Haptophyta)、隐藻门(Cryptophyta)(或隐藻)和囊泡虫总门(Alveolata))；泛植物界(Archaeplastida)/原始色素体植物(Primoplantae)(陆生植物、绿藻、红藻和灰藻)。

在真核生物域内，真菌是微生物群落中占优势的微生物。真菌包括酵母和丝状真菌等微生物以及人们熟悉的蘑菇。真菌细胞具有含葡聚糖和甲壳素的细胞壁，这是这些生物的独特特征。真菌形成共享共同祖先的单组相关生物，命名为真菌门(Eumycota)。已估计真菌界有150万至500万个物种，其中这些物种中约5％已被正式分类。大多数真菌的细胞生长为管状、细长和丝状结构，称为菌丝，其可含有多个细胞核。一些物种通过出芽或二元裂变繁殖而生长为单细胞酵母。真菌的主要门(有时称为分界)主要基于它们的有性生殖结构的特征而分类。目前，提出了七个门：微孢子门(Microsporidia)、壶菌门(Chytridiomycota)、芽枝菌门(Blastocladiomycota)、新美鞭菌门(Neocallimastigomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。

通过本文描述的方法检测和定量的微生物也可以是病毒。病毒是仅在其他生物的活细胞内复制的小传染因子。病毒可以感染真核生物域、细菌域和古细菌域的所有类型的生命形式。病毒颗粒(称为病毒体)由两个或三个部分组成：(i)遗传物质，可以是DNA或RNA；(ii)保护这些基因的蛋白质外壳；以及在一些情况下，(iii)当它们在细胞外时围绕所述蛋白质外壳的脂质包膜。已经为病毒建立了七个目：有尾噬菌体目(Caudovirales)、疱疹病毒目(Herpesvirales)、线状病毒目(Ligamenvirales)、单股反链病毒目(Mononegavirales)、网巢病毒目(Nidovirales)、小核糖核酸病毒目(Picornavirales)和芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)。病毒基因组可以是单链(ss)或双链(ds)、RNA或DNA，并且可以使用或可以不使用逆转录酶(RT)。另外，ssRNA病毒可以是有义(+)或反义(-)。这种分类将病毒分为七个组：I：dsDNA病毒(比如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)；II：(+)ssDNA病毒(比如细小病毒)；III：dsRNA病毒(比如呼肠孤病毒)；IV：(+)ssRNA病毒(比如小核糖核酸病毒、披膜病毒)；V：(-)ssRNA病毒(比如正粘病毒、弹状病毒)；VI：在生命周期中具有DNA中间体的(+)ssRNA-RT病毒(比如逆转录病毒)；VII：dsDNA-RT病毒(比如嗜肝DNA病毒)。

通过本文描述的方法检测和定量的微生物也可以是类病毒。类病毒是已知最小的传染性病原体，仅由短链环状单链RNA组成，没有蛋白质外壳。它们主要是植物病原体，其中一些具有经济重要性。类病毒基因组的大小非常小，范围为从约246个至约467个核碱基。

分离的微生物

如本文所用的，“分离物”、“分离的”、“分离的微生物”和类似术语旨在表示一种或多种微生物已从与其在特定环境(例如土壤、水、动物组织等)中结合的材料中的至少一种分离。因此，“分离的微生物”不存在于在其天然存在的环境中；相反，通过本文所述的各种技术，微生物已被从其天然环境中移除并置于非天然存在的存在状态。因而，分离的菌株可以例如与可接受的载体结合的生物学纯的培养物或孢子的形式(或菌株的其他形式)存在。

在本公开的某些方面，分离的微生物以分离的和生物学纯的培养物的形式存在。本领域技术人员将理解的是，特定微生物的分离的和生物学纯的培养物表示所述培养物基本上不含(在科学理性中)其他的活生物体并且仅含有所讨论的单个微生物。培养物可以含有不同浓度的所述微生物。本公开注意到分离的和生物学上纯的微生物通常必然不同于不太纯或不纯的物质。参见，例如In re Bergstrom,427 F.2d 1394,(CCPA 1970)(讨论纯化的前列腺素类)，还参见，In re Bergy,596 F.2d 952(CCPA 1979)(讨论纯化的微生物)，还参见，Parke-Davis&Co.v.H.K.Mulford&Co.,189 F.95(S.D.N.Y.1911)(Learned Hand讨论纯化的肾上腺素)，部分确认，部分修改，196 F.496(2d Cir.1912)，将每篇文献通过引用并入本文。此外，在一些方面，本公开提供了必定存在于分离的和生物学纯的微生物培养物中的浓度或纯度限制的某些定量测量。在某些实施方案中，这些纯度值的存在是将本公开的微生物与以天然状态存在的那些微生物区分开的一种另外的属性。参见，例如，Merck&Co.v.Olin Mathieson Chemical Corp.,253 F.2d 156(4th Cir.1958)(讨论由微生物产生的维生素B12的纯度限制)，将其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种属于下列分类学科：梭菌科(Clostridiaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、普雷沃菌科(Prevotellaceae)、新美鞭菌科(Neocallimastigaceae)、酵母科(Saccharomycetaceae)、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichia)、厌氧绳菌科(Anaerolinaeceae)、奇异菌科(Atopobiaceae)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)、真杆菌科(Eubacteriaceae)、无胆甾原体科(Acholeplasmataceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、月形单孢菌科(Selenomonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自梭菌科的属，包括厌氧醋菌属(Acetanaerobacterium)、醋弧菌属(Acetivibrio)、氨基酸杆菌属(Acidaminobacter)、嗜碱菌属(Alkaliphilus)、厌氧杆菌属(Anaerobacter)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、无氧碱菌属(Anoxynatronum)、布兰特氏菌属(Bryantella)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、卡尔德厌氧菌属(Caldanaerocella)、喜热菌属(Caloramator)、喜热厌氧杆菌属(Caloranaerobacter)、热液口嗜热梭菌(Caminicella)、分节丝状菌(Candidatus Arthromitus)、梭菌属(Clostridium)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、多尔氏菌属(Dorea)、产乙醇杆菌(Ethanologenbacterium)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、硫酸盐还原菌(Garciella)、科古根海姆艾拉菌属(Guggenheimella)、赫斯佩尔氏菌属(Hespellia)、Linmingia、Natronincola、产醋杆菌属(Oxobacter)、副孢子杆菌属(Parasporobacterium)、八迭球菌属(Sarcina)、泽恩根氏菌(Soehngenia)、孢杆菌属(Sporobacter)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、温暖杆菌属(Tepidibacter)、热微菌属(Tepidimicrobium)、热分歧菌属(Thermobrachium)、热卤杆菌属(Thermohalobacter)和丁达尔氏菌属(Tindallia)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自瘤胃菌科的属，包括瘤胃球菌属(Ruminococcus)、醋弧菌属(Acetivibrio)、孢杆菌属(Sporobacter)、厌氧细杆菌属(Anaerofilium)、乳头杆菌属(Papillibacter)、颤螺菌属(Oscillospira)、芽殖菌属(Gemmiger)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、苛求球菌(Fastidiosipila)、厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、产乙醇杆菌属((Ethanolingenens)、厌氧醋菌属(Acetanaerobacterium)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium)和厌氧氨氧化菌属(Candidadus Soleaferrea)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自毛螺菌科的属，包括丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、罗斯氏菌属(Roseburia)、毛螺菌属(Lachnospira)、聚乙酸菌属(Acetitomaculum)、粪球菌属(Coprococcus)、约翰森氏菌属(Johnsonella)、卡托氏菌属(Catonella)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、互营球菌属(Syntrophococcus)、孢子菌属(Sporobacterium)、副孢子杆菌属(Parasporobacterium)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、Shuttleworthia、多尔氏菌属(Dorea)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、赫斯佩尔氏菌属(Hespellia)、马文布莱恩特氏菌(Marvinbryantia)、奥里杆菌属(Oribacterium)、莫瑞菌属(Moryella)、布劳特氏菌属(Blautia)、罗宾氏菌属(Robinsoniella)、解纤维素菌属(Cellulosilyticum)、毛绒厌氧杆菌属(Lachnoanaerobaculum)、口腔杆菌属(Stomatobaculum)、纺锤链杆菌属(Fusicatenibacter)、产醋菌属(Acetatifactor)和艾森伯格氏菌属(Eisenbergiella)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自氨基酸球菌科的属，包括氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)和琥珀酸螺菌属(Succinispira)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自消化球菌科的属，包括脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、消化球菌属(Peptococcus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、共养香肠样杆菌属(Syntrophobotulus)、脱卤杆菌属(Dehalobacter)、芽孢肠状菌属(Sporotomaculum)、脱硫芽孢弯曲菌属(Desulfosporosinus)、脱磺酸盐生孢杆菌属(Desulfonispora)、暗色厌氧香肠状菌属(Pelotomaculum)、栖热泉菌(Thermincola)、隐厌氧菌(Cryptanaerobacter)、脱亚硫酸盐杆菌属(Desulfitibacter)、金矿菌(CandidatusDesulforudis)、脱硫孢菌属(Desulfurispora)和脱亚硫酸盐孢菌属(Desulfitospora。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自紫单胞菌科的属，包括卟琳单胞菌属(Porphyromonas)、营发酵单胞菌属(Dysgonomonas)、坦纳菌属(Tannerella)、臭杆菌属(Odoribacter)、嗜蛋白质菌属(Proteiniphilum)、佩特里单胞菌属(Petrimonas)、帕鲁丁杆菌(Paludibacter)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、巴尼斯菌属(Barnesiella)、Candidatus Vestibaculum、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、屠场杆状菌属(Macellibacteroides)和粪杆菌属(Coprobacter)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自厌氧绳菌科的属，包括厌氧绳菌属(Anaerolinea)、Bellilinea、纤绳菌属(Leptolinea)、Levilinea、长绳菌属(Longilinea)、Ornatilinea和Pelolinea。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自奇异菌科的属，包括奇异菌属(Atopbium)和欧陆森氏菌属(Olsenella)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自真杆菌科的属，包括醋酸杆菌属(Acetobacterium)、碱杆状菌属(Alkalibacter)、嗜碱菌属(Alkalibaculum)、Aminicella、厌氧梭菌属(Anaerofustis)、真杆菌属(Eubacterium)、硫酸盐还原菌(Garciella)和假枝杆菌属(Pseudoramibacter)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自无胆甾原体科的属，包括无胆甾原体属(Acholeplasma)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自琥珀酸弧菌科的属，包括厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、琥珀酸单胞菌属(Succinatimonas)、琥珀酸单胞菌属(Succinimonas)和琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自乳杆菌科的属，包括乳杆菌属(Lactobacillus)、副乳杆菌属(Paralactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)和夏普氏菌属(Sharpea)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自月形单孢菌科的属，包括厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、石胡荽属(Centipeda)、巨单胞菌属(Megamonas)、光冈菌属(Mitsuokella)、梳状菌属(Pectinatus)、丙酸螺菌属(Propionispira)、施瓦茨氏菌属(Schwartzia)、月单胞菌属(Selenomonas)和嗜发酵菌属(Zymophilus)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自伯克氏菌科的属，包括伯克氏菌属(Burkholderia)、几丁质单胞菌属(Chitinimonas)、贪铜菌属(Cupriavidus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、池杆菌属(Limnobacter)、潘多拉菌属(Pandoraea)、副伯克氏菌属(Paraburkholderia)、少单胞菌属(Paucimonas)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、青枯菌属(Ralstonia)、嗜热丝菌属(Thermothrix)和沃特氏菌属(Wautersia)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自链球菌科的属，包括乳球菌属(Lactococcus)、乳卵形菌属(Lactovum)和链球菌属(Streptococcus)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自厌氧绳菌科的属，包括河口微菌属(Aestuariimicrobium)、蛛网菌属(Arachnia)、小月属(Auraticoccus)、布克劳氏菌属(Brooklawnia)、弗莱德门菌属(Friedmanniella)、颗粒球菌属(Granulicoccus)、黄球菌属(Luteococcus)、Mariniluteicoccus、小月菌属(Microlunatus)、微白霜菌属(Micropruina)、诺曼菌(Naumannella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、产丙酸细胞菌属(Propionicicella)、产丙酸棒形菌属(Propioniciclava)、丙酸产生菌属(Propioniferax)、产丙酸微球菌(Propionimicrobium)和四球菌属(Tessaracoccus)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自普雷沃菌科的属，包括副普雷沃菌属(Paraprevotella)、普雷沃菌属(Prevotella)、霍氏菌属(hallella)、木聚糖菌属(Xylanibacter)和拟普雷沃菌属(Alloprevotella)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自新美鞭菌科的属，包括厌氧鞭菌属(Anaeromyces)、盲肠鞭菌属(Caecomyces)、枝梗鞭菌属(Cyllamyces)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、根囊鞭菌属(Orpinomyces)和梨囊鞭菌属(Piromyces)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自酵母科的属，包括酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、固囊酵母属(Citeromyces)、复膜孢酵母属(Cyniclomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、哈萨克斯坦酵母菌属(Kazachstania)(与阿斯霉属(Arxiozyma)同义)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、驹形氏酵母(Komagataella)、库氏酵母(Kuraishia)、拉茜斯酵母属(Lachancea)、洛德酵母属(Lodderomyces)、纳卡氏菌属(Nakaseomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、刀孢酵母属(Spathaspora)、四重孢酵母菌属(Tetrapisispora)、范氏酵母属(Vanderwaltozyma)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、拟威尔酵母属(Williopsis)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)和接合有孢酵母属(Zygotorulaspora)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自丹毒丝菌科的属，包括丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、索拉杆菌属(Solobacterium)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、栖粪杆菌属(Faecalibaculum)、栖粪球菌属(Faecalicoccus)、屎豆属菌(Faecalitalea)、霍尔德曼氏菌(Holdemanella)、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)、迪尔玛菌属(Dielma)、埃格特菌属(Eggerthia)、分枝丹毒梭菌(Erysipelatoclostridium)、异杆菌属(Allobacterium)、Breznakia、布雷德菌属(Bulleidia)、链型杆菌属(Catenibacterium)、链球形菌属(Catenisphaera)和粪芽孢菌属(Coprobacillus)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自暗球腔菌科的属，包括Barria、Bricookea、Carinispora、Chaetoplea、锈生壳属(Eudarluca)、Hadrospora、Isthmosporella、Katumotoa、Lautitia、Metameris)、Mixtura、新暗球腔菌属(Neophaeosphaeria)、结节菌(Nodulosphaeria)、蛇孢腔菌(Ophiosphaerella)、暗球腔菌属(Phaeosphaeris)、拟暗球腔菌属(Phaeosphaeriopsis)、毛球腔菌属(Setomelanomma)、壳多胞菌属(Stagonospora)、畸球腔菌属(Teratosphaeria)和Wilmia。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自葡萄座腔菌科的属，包括Amarenomyces、大单孢属(Aplosporella)、奥斯瓦腔菌属(Auerswaldiella)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、腔壳砖隔孢属(Dichomera)、色二孢属(Diplodia)、盘壳菌属(Discochora)、色孢座腔菌属(Dothidothia)、小穴壳菌属(Dothiorella)、壳梭孢属(Fusicoccum)、颗粒色二孢属(Granulodiplodia)、球座菌属(Guignardia)、毛色二孢属(Lasiodiplodia)、Leptodothiorella、Leptodothiorella、Leptoguignardia、大茎点霉属(Macrophoma)、壳球孢属(Macrophomina)、那特斯拉菌属(Nattrassia)、(Neodeightonia)、新壳梭孢菌属(Neofusicocum)、新节格孢属(Neoscytalidium)、Otthia、Phaeobotryosphaeria、Phomatosphaeropsis、叶点霉属(Phyllosticta)、假壳梭孢属(Pseudofusicoccum)、Saccharata、席佛腔菌属(Sivanesania)和门座孢属(Thyrostroma)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自下列属：梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium)、糖发酵菌属(Saccharofermentans)、乳头杆菌属(Papillibacter)、暗色厌氧香肠状菌属(Pelotomaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、坦纳菌属(Tannerella)、普雷沃菌属(Prevotella)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、假丝酵母属(Candida)、Vrystaatia、根囊鞭菌属(Orpinomyces)、新美鞭菌属(Neocallimastix)和叶点霉属(Phyllosticta)。在进一步的实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法生产的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种属于毛螺菌科和酵母菌目。在进一步的实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法生产的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种为木糖假丝酵母(Candidaxylopsoci)、Vrystaatia aloeicola和首都叶点霉(Phyllostictacapitalensis)。

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自梭菌属物种细菌、琥珀酸弧菌属物种细菌、盲肠鞭菌属物种真菌、毕赤酵母属物种真菌、丁酸弧菌属物种细菌、根囊鞭菌属物种真菌、梨囊鞭菌属物种真菌、芽孢杆菌属物种细菌、乳杆菌属物种细菌、普雷沃菌属物种细菌、互营球菌属物种细菌或瘤胃球菌属物种细菌。在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述方法制备的包含分离的微生物物种的微生物产品，所述微生物物种选自毛螺菌科的属。

在一些实施方案中，在本文所述产品中的分离的微生物菌株已经历基因修饰。在一些实施方案中，基因修饰或重组的微生物包含在所述微生物中非天然存在的多核苷酸序列。在一些实施方案中，微生物可包含异源多核苷酸。在进一步的实施方案中，异源多核苷酸可与对于微生物而言为天然的一个或多个多核苷酸可操作连接。

在一些实施方案中，异源多核苷酸可以是报告基因或选择标记。在一些实施方案中，报告基因可以选自荧光蛋白家族(例如，GFP、RFP、YFP等)、β-半乳糖苷酶或萤光素酶中的任一种。在一些实施方案中，选择标记可以选自新霉素磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、氨基糖苷腺苷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、乙酰乳糖酶合酶、溴苯腈腈水解酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、二氢叶酸(dihydrogolate)还原酶和氯霉素乙酰转移酶。在一些实施方案中，异源多核苷酸可与一个或多个启动子可操作连接。

在一些实施方案中，通过核糖体核酸序列鉴定分离的微生物。核糖体RNA基因(rDNA)，尤其是小亚基核糖体RNA基因，即，在真核生物情况下的18S rRNA基因(18S rDNA)和在原核生物情况下的16S rRNA(16S rDNA)已是用于评估微生物群落中的生物类型和菌株的主要靶标。然而，大亚基核糖体RNA基因28S rDNA也已成为靶标。rDNA适用于分类学鉴定，因为：(i)它们在所有已知生物中普遍存在；(ii)它们兼有保守区和可变区；(iii)有一个可用于比较的指数扩展的其序列的数据库。在样品的群落分析中，保守区用作相应的通用PCR和/或测序引物的退火位点，而可变区可用于系统发育分化。另外，细胞中rDNA的高拷贝数有助于检测环境样品。

位于18S rDNA和28S rDNA之间的内部转录间隔区(ITS)也已成为靶标。在组装核糖体之前，ITS被转录但被剪接掉。ITS区由两个高度可变的间隔区ITS1和ITS2以及居间的5.8S基因组成。这种rDNA操纵子在基因组中以多个拷贝形式出现。因为ITS区不编码核糖体组分，所以它是高度可变的。在一些实施方案中，独特的RNA标志物可以是mRNA标志物、siRNA标志物或核糖体RNA标志物。

主要rRNA亚基16S的一级结构包含保守区、可变区和高变区的特定组合，这些区域以不同的速率演化并能够解析非常古老的谱系(比如结构域)和更现代的谱系(比如属)。16S亚基的二级结构包括大约50个螺旋，所述螺旋导致约67％的残基的碱基配对。这些高度保守的二级结构特征具有重大的功能重要性，可用于确保多序列比对和系统发育分析中的位置同源性。在过去几十年中，16S rRNA基因已成为测序最多的分类学标志物，并且是目前细菌和古细菌系统分类的基石(Yarza等人，2014.Nature Rev.Micro.12:635-45)。

在一些实施方案中，两个16S rRNA基因的序列同一性为94.5％或更低是不同属的有力证据，86.5％或更低是不同科的有力证据，82％或更低是不同目的有力证据，78.5％是不同纲的有力证据，75％或更低是不同门的有力证据。16S rRNA基因序列的比较分析使得能够建立分类学阈值，这些阈值不仅对培养微生物的分类有用，而且对许多环境序列的分类也有用。Yarza等人，2014.Nature Rev.Micro.12:635-45)。

可根据本文所述方法加以稳定和掺入产品中的示例性分离微生物提供在下表4中。

表4：示例性分离微生物

微生物集合体

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，所述微生物集合体包含至少两种稳定微生物的组合。在某些实施方案中，本公开的集合体包含两种微生物、或三种微生物、或四种微生物、或五种微生物、或六种微生物、或七种微生物、或八种微生物、或九种微生物、或十种或更多种微生物。所述集合体的微生物是不同的微生物物种或微生物物种的不同菌株。

如本文所用的，“微生物集合体”是指包含一种或多种活性微生物的组合物，所述活性微生物并非天然存在于天然存在的环境中和/或以自然界中不存在的比例或量存在。例如，微生物集合体(也包括合成集合体和/或生物集合体)或聚集体可以由一个或多个分离的微生物菌株连同适当的培养基或载体形成。可以将微生物集合体应用或施用于目标，比如目标环境、群体、个体、动物和/或类似物。

在本公开的某些方面，微生物集合体是或基于一种或多种分离的微生物，所述微生物以分离的和生物学纯的培养物形式存在。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法制生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包含至少两个分离的微生物物种，所述微生物物种选自梭菌属物种细菌、琥珀酸弧菌属物种细菌、盲肠鞭菌属物种真菌、毕赤酵母属物种真菌、丁酸弧菌属物种细菌、根囊鞭菌属物种真菌、梨囊鞭菌属物种真菌、芽孢杆菌属物种细菌、乳杆菌属物种细菌、普雷沃菌属物种细菌、互营球菌属物种细菌或瘤胃球菌属物种细菌。示例性物种提供在上文表2中。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少97％、98％或99％序列同一性的16S rRNA序列的梭菌属物种。在一些方面，所述微生物集合体包括包含16S rRNA序列的梭菌属物种，所述16S rRNA序列包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或由其组成。在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括来自毛螺菌科的包含与SEQ ID NO:12具有至少97％、98％或99％序列同一性的16SrRNA序列的物种。在一些方面，微生物集合体包括毛螺菌科的物种，所述物种包含含有SEQID NO:12或由其组成的16S rRNA序列。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括包含与SEQ ID NO:11具有至少97％、98％或99％序列同一性的16S rRNA序列的琥珀酸弧菌属物种。在一些方面，微生物集合体包括包含16SrRNA序列的琥珀酸弧菌属物种，所述16S rRNA序列包含SEQ ID NO:11或由其组成。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括包含与SEQ ID NO:2具有至少97％、98％或99％序列同一性的ITS序列的毕赤酵母属物种。在一些方面，微生物集合体包括包含ITS序列的毕赤酵母属物种，所述ITS序列包含SEQ ID NO:2或由其组成。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括包含与SEQ ID NO:4具有至少97％、98％或99％序列同一性的16S rRNA序列的芽孢杆菌属物种。在一些方面，微生物集合体包括包含SEQ IDNO:4或由其组成的芽孢杆菌属物种。在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少97％、98％或99％序列同一性的16S rRNA序列的乳杆菌属物种。在一些方面，微生物集合体包括包含16S rRNA序列的乳杆菌属物种，所述16SrRNA序列包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或由其组成。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括包含与SEQ ID NO:10具有至少97％、98％或99％序列同一性的16S rRNA序列的普雷沃菌属物种。在一些方面，微生物集合体包括包含16SrRNA序列的普雷沃菌属物种，所述16S rRNA序列包含SEQ ID NO:10或由其组成。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括包含与SEQ ID NO:1具有至少97％、98％或99％序列同一性的丁酸梭菌和与SEQ ID NO:2具有至少97％、98％或99％序列同一性的克鲁维毕赤酵母。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括与SEQ ID NO:5具有至少97％、98％或99％序列同一性的梭菌属物种，与SEQ ID NO:6具有至少97％、98％或99％序列同一性的梭菌属物种，以及与SEQ ID NO:7具有至少97％、98％或99％序列同一性的乳杆菌属物种。在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括与SEQ ID NO:5具有至少97％、98％或99％序列同一性的梭菌属物种，以及与SEQ IDNO:6具有至少97％、98％或99％序列同一性的梭菌属物种。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括与SEQ ID NO:10具有至少97％、98％或99％序列同一性的普雷沃菌属物种，与SEQ ID NO:11具有至少97％、98％或99％序列同一性的琥珀酸弧菌属物种，以及与SEQ ID NO:12具有至少97％、98％或99％序列同一性的毛螺菌科物种。

在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法生产的并且包含微生物集合体的微生物产品，其中所述微生物集合体包括至少两个分离的微生物物种，所述微生物物种选自下列属：梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium)、糖发酵菌属(Saccharofermentans)、乳头杆菌属(Papillibacter)、暗色厌氧香肠状菌属(Pelotomaculum)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、坦纳菌属(Tannerella)、普雷沃菌属(Prevotell a)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、Vrystaatia、根囊鞭菌属(Orpino myces)、新美鞭菌属(Neocallimastix)和叶点霉属(Phyllosticta)。

微生物菌株

基于多相分类学，微生物可以属相区分，该分类学将所有可用的表型和基因型数据合并到一个共识分类中(Vandamme等人，1996.Polyphasic taxonomy,a consensusapproach to bacterial systematics.Microbiol Rev1996,60:407-438)。一种公认的用于定义物种的基因型方法是基于整体基因组相关性，使得在标准条件下使用DNA-DNA杂交(其中ΔT_m(同源和异源杂种之间的解链温度差)为5℃或更低)共享大约70％或更多相关性的菌株被认为是同一物种的成员。因而，共享大于前述70％阈值的群体可以看作是同一物种的变体。用于定义物种的另一种可接受的基因型方法是分离本公开的标记基因，将这些基因测序，并且将来自多个分离物或变体的这些已测序的基因进行比对。如果一个或多个测序的基因共享至少97％的序列同一性，则将所述微生物解释为属于同一个物种。

通过利用16s rRNA序列的核糖体数据库项目(RDP)的和ITS rRNA序列的用户友好型北欧ITS外生菌根(UNITE)数据库的分类工具，可以将分离的微生物与其最近的分类学组进行匹配。将微生物与其最近分类群进行匹配的实例可见于Lan等人(2012.PLOS one.7(3):e32491)，Schloss和Westcott(2011.Appl.Environ.Microbiol.77(10):3219-3226)，以及Koljalg等人(2005.New Phytologist.166(3):1063-1068)。16S或18S rRNA序列或ITS序列通常用于区分物种和菌株，因为如果前述序列之一与参考序列共享的序列同一性低于指定百分比，那么从中获得所述序列的两种生物就被说成是属于不同的物种或菌株。还可以用23S rRNA序列与参考序列进行比较。

因此，如果微生物的16S或18S rRNA序列或ITS1或ITS2序列共享至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性，则人们认为所述微生物属于同一物种。另外，当微生物菌株的16S或18S rRNA序列或ITS1或ITS2序列共享至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性时，人们能够将所述微生物菌株定义为属于一个物种。

在一个实施方案中，本公开的微生物菌株包括包含与SEQ ID NO:1-12中的任何一者共享至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸序列的那些微生物菌株。在一个另外的实施方案中，本公开的微生物菌株包括包含与SEQ ID NO:1-12中的任何一者共享至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸序列的那些微生物菌株。

在缺乏表型确定的情况下，不能培养的微生物通常不能被指定为明确的物种，如果微生物的16S或18S rRNA序列或ITS序列符合已知物种的同一性原则，则可以对它们给予属内的候选种指定。

一种方法是观察序列空间中大量密切相关物种的菌株的分布，并鉴定与其他簇分辨良好的菌株簇。这种方法是通过使用多个核心(家家)基因的串联序列来评估聚类模式而开发的，并被称为多位点序列分析(MLSA)或多位点序列系统发育分析。MLSA已被成功地用于通过当前的分类学方法探索指定给非常密切相关物种的大量菌株之间的聚类模式，研究属内或更广泛的分类学分组内的少量菌株之间的关系，并解决具体的分类学问题。更一般地说，所述方法可用于询问细菌种类是否存在–也就是说，观察大量相似菌株是否总是落入分辨良好的簇中，或者在一些情况下是否存在未观察到明确分离成簇的遗传连续体。

为了更准确地确定属，可以确定表型性状，比如形态学、生化和生理特征，以便与参考属原型进行比较。菌落形态学可包括颜色、形状、色素沉着、粘液的产生等。细胞的特征被描述为形状、大小、革兰氏反应、细胞外物质、内生孢子的存在、鞭毛的存在和位置、运动性和包涵体。生物化学和生理学特征描述了生物体在不同温度、pH、盐度和大气条件范围内的生长，在不同的唯一碳源和氮源存在下生长。关于定义本公开的属的表型性状，将合理地告知本领域普通技术人员。

在一个实施方案中，利用16S rRNA基因序列和ITS序列鉴定了本文教导的微生物。本领域已知16S rRNA含有高变区，其可提供可用于细菌鉴定的物种/菌株特异性特征序列，并且ITS序列还可提供可用于真菌鉴定的物种/菌株特异性特征序列。

使用rRNA基因和/或ITS序列的系统发育分析用于定义属于共同属的“基本上相似的”物种，并且还用于定义给定分类学物种的“基本上相似的”菌株。此外，可利用分离物的生理和/或生化特性来突出显示菌株之间的微小和显著差异，所述差异可能导致反刍动物的有利行为。

本公开的组合物可包括真菌孢子和细菌孢子、真菌孢子和细菌营养细胞、真菌营养细胞和细菌孢子、真菌营养细胞和细菌营养细胞的组合。在一些实施方案中，本公开的组合物仅包含呈孢子形式的细菌。在一些实施方案中，本公开的组合物仅包含呈营养细胞形式的细菌。在一些实施方案中，本公开的组合物包含不存在真菌的细菌。在一些实施方案中，本公开的组合物包含不存在细菌的真菌。

细菌孢子可包括内生孢子和厚壁孢子。真菌孢子可包括稳孢子、掷孢子、似亲孢子、静孢子、游动孢子、有丝分裂孢子、大孢子、小孢子、减数孢子、厚膜孢子、夏孢子、冬孢子、卵孢子、果孢子、四分孢子、孢囊孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢子、子囊孢子和asciospore。

微生物产品

在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所述的稳定方法制备的产品。在一些实施方案中，通过本文所述的方法制备的微生物产品包含一种或多种稳定的微生物和可接受的载体。在一个另外的实施方案中，将稳定的微生物包封。在一个另外的实施方案中，包封的稳定的微生物包含聚合物。在一个另外的实施方案中，聚合物可以选自糖聚合物、琼脂聚合物、琼脂糖聚合物、蛋白质聚合物、糖聚合物和脂质聚合物。

在一些实施方案中，可接受的载体选自由可食用饲料级材料、矿物混合物、水、乙二醇、糖蜜和玉米油组成的组。在一些实施方案中，形成微生物集合体的至少两个微生物菌株以每克所述组合物10²至10¹⁵个细胞的量存在于组合物中。在一些实施方案中，可以将组合物与饲料组合物混合。

在一些实施方案中，将本公开的微生物产品施用于动物。在一些实施方案中，以每天至少一次施用组合物。在一个另外的实施方案中，以每月至少一次施用组合物。在一个另外的实施方案中，以每周至少一次施用组合物。在一个另外的实施方案中，以每小时至少一次施用组合物。

在一些实施方案中，所述施用包括将组合物注射到瘤胃中。在一些实施方案中，经肛门施用所述组合物。在一个另外的实施方案中，肛门施用包括将栓剂插入直肠中。在一些实施方案中，经口施用所述组合物。在一些方面，口服施用包括将组合物与动物饲料、水、药物或疫苗接种联合施用。在一些方面，口服施用包括将凝胶或粘性溶液中的组合物应用于动物的身体部位，其中动物通过舔吃摄取所述组合物。在一些实施方案中，所述施用包括将组合物喷雾到动物上，并且其中动物摄取所述组合物。在一些实施方案中，在每次喂食动物时进行施用。在一些实施方案中，口服施用包括将组合物与动物饲料联合施用。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品包括反刍动物饲料，例如谷物(大麦、玉米、燕麦等)；淀粉(木薯淀粉等)；油籽饼；和蔬菜废弃物。在一些实施方案中，微生物产品包括维生素、矿物质、微量元素、乳化剂、芳香化产品、粘合剂、着色剂、气味剂、增稠剂等。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品是固体。在使用固体组合物的情况下，可能需要包括一种或多种载体材料，包括但不限于：矿物土，比如二氧化硅、滑石、高岭土、石灰石、白垩、粘土、白云石、硅藻土；碳酸钙；硫酸钙；硫酸镁；氧化镁；植物来源的产品，比如谷物粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品是液体。在一个另外的实施方案中，液体包括溶剂(可包括水或醇)以及其他的动物安全的溶剂。在一些实施方案中，本公开的微生物产品包括粘合剂，比如动物安全的聚合物、羧甲基纤维素、淀粉、聚乙烯醇等。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品包含增稠剂，比如二氧化硅、粘土、种子或海藻的天然提取物、纤维素的合成衍生物、瓜尔胶、刺槐豆胶、藻酸盐和甲基纤维素。在一些实施方案中，微生物产品包含抗沉降剂，比如改性淀粉、聚乙烯醇、黄原胶等。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品包含着色剂，包括归类为亚硝基的有机发色团；硝基；偶氮，包括单偶氮、双偶氮和多偶氮；吖啶、蒽醌、吖嗪、二苯甲烷、茚满、吲哚酚、次甲基、噁嗪、酞菁、噻嗪、噻唑、三芳基甲烷、氧杂蒽。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含微量营养素，比如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品包含动物安全的杀病毒剂或杀线虫剂。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含糖类(例如，单糖类、二糖类、三糖类、多糖类、寡糖类等)、聚合糖类、脂质类、聚合脂质类、脂多糖类、蛋白质类、聚合蛋白质类、脂蛋白类、核酸类、核酸聚合物类、二氧化硅、无机盐及其组合。在一个另外的实施方案中，微生物产品包含琼脂、琼脂糖、脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)、结冷胶等聚合物。在一些实施方案中，微生物组合物包括塑料胶囊、乳剂(例如,水和油)、膜和人工膜。在一些实施方案中，乳剂或连接的聚合物溶液可包含本公开的微生物组合物。参见，例如，Harel和Bennett的美国专利8,460,726B2，出于所有目的，将其通过引用明确并入本文。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品包含一种或多种防腐剂。防腐剂可以是液体或气体制剂。防腐剂可选自单糖、二糖、三糖、多糖、乙酸、抗坏血酸、抗坏血酸钙、赤藻糖酸、异抗坏血酸、赤藻糖酸(erythrobic acid)、硝酸钾、抗坏血酸钠、赤藻糖酸钠、异抗坏血酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠、氮、苯甲酸、山梨酸钙、月桂酰精氨酸乙酯、对-羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙酸钾、苯甲酸钾(potassium benzoiate)、亚硫酸氢钾、二乙酸钾、乳酸钾、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、对-羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、乙酸钠、苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、亚硝酸钠、二乙酸钠、乳酸钠、偏亚硫酸氢钠、甲基对-羟基苯甲酸钠盐、丙基对-羟基苯甲酸钠盐、硫酸钠、亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、亚硫酸、丙酸钙、二碳酸二甲酯、纳他霉素、山梨酸钾、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸钾、丙酸、二乙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、山梨酸、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、柠檬酸、甘油单酯和/或甘油二酯的柠檬酸酯、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、愈创木胶、愈创木脂、卵磷脂、柠檬酸卵磷脂、柠檬酸单甘油酯、柠檬酸单异丙酯、没食子酸丙酯、偏亚硫酸氢钠、酒石酸、叔丁基氢醌、氯化亚锡、硫代二丙酸、硫代二丙酸二月桂酯、硫代二丙酸二硬脂基酯、乙氧基喹、二氧化硫、甲酸或生育酚中的一种或多种。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品包括呈孢子形式、营养细胞形式和/或裂解细胞形式的细菌和/或真菌细胞。在一个实施方案中，裂解细胞形式充当霉菌毒素结合剂，例如与死细胞结合的霉菌毒素。

在一些实施方案中，微生物产品在冰箱(35-40℉)中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间是货架稳定的。在一些实施方案中，微生物产品在冰箱(35-40℉)中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，微生物产品在室温(68-72℉)下或在50-77℉之间至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间是货架稳定的。在一些实施方案中，微生物产品在室温(68-72℉)下或在50-77℉之间至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，微生物产品在-23-35℉至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间是货架稳定的。在一些实施方案中，微生物产品在-23-35℉至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，微生物产品在77-100℉至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间是货架稳定的。在一些实施方案中，微生物产品在77-100℉至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，微生物产品在101-213℉至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间是货架稳定的。在一些实施方案中，微生物产品在101-213℉至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品在冷藏温度(35-40℉)、在室温(68-72℉)下、在50-77℉之间、在-23-35℉之间、在70-100℉之间、或在101-213℉之间约1至100、约1至95、约1至90、约1至85、约1至80、约1至75、约1至70、约1至65、约1至60、约1至55、约1至50、约1至45、约1至40、约1至35、约1至30、约1至25、约1至20、约1至15、约1至10、约1至5、约5至100、约5至95、约5至90、约5至85、约5至80、约5至75、约5至70、约5至65、约5至60、约5至55、约5至50、约5至45、约5至40、约5至35、约5至30、约5至25、约5至20、约5至15、约5至10、约10至100、约10至95、约10至90、约10至85、约10至80、约10至75、约10至70、约10至65、约10至60、约10至55、约10至50、约10至45、约10至40、约10至35、约10至30、约10至25、约10至20、约10至15、约15至100、约15至95、约15至90、约15至85、约15至80、约15至75、约15至70、约15至65、约15至60、约15至55、约15至50、约15至45、约15至40、约15至35、约15至30、约15至25、约15至20、约20至100、约20至95、约20至90、约20至85、约20至80、约20至75、约20至70、约20至65、约20至60、约20至55、约20至50、约20至45、约20至40、约20至35、约20至30、约20至25、约25至100、约25至95、约25至90、约25至85、约25至80、约25至75、约25至70、约25至65、约25至60、约25至55、约25至50、约25至45、约25至40、约25至35、约25至30、约30至100、约30至95、约30至90、约30至85、约30至80、约30至75、约30至70、约30至65、约30至60、约30至55、约30至50、约30至45、约30至40、约30至35、约35至100、约35至95、约35至90、约35至85、约35至80、约35至75、约35至70、约35至65、约35至60、约35至55、约35至50、约35至45、约35至40、约40至100、约40至95、约40至90、约40至85、约40至80、约40至75、约40至70、约40至65、约40至60、约40至55、约40至50、约40至45、约45至100、约45至95、约45至90、约45至85、约45至80、约45至75、约45至70、约45至65、约45至60、约45至55、约45至50、约50至100、约50至95、约50至90、约50至85、约50至80、约50至75、约50至70、约50至65、约50至60、约50至55、约55至100、约55至95、约55至90、约55至85、约55至80、约55至75、约55至70、约55至65、约55至60、约60至100、约60至95、约60至90、约60至85、约60至80、约60至75、约60至70、约60至65、约65至100、约65至95、约65至90、约65至85、约65至80、约65至75、约65至70、约70至100、约70至95、约70至90、约70至85、约70至80、约70至75、约75至100、约75至95、约75至90、约75至85、约75至80、约80至100、约80至95、约80至90、约80至85、约85至100、约85至95、约85至90、约90至100、约90至95或95至100周的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品在冷藏温度(35-40℉)、在室温(68-72℉)下、在50-77℉之间、在-23-35℉之间、在70-100℉之间、或在101-213℉之间1至100、1至95、1至90、1至85、1至80、1至75、1至70、1至65、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至5、5至100、5至95、5至90、5至85、5至80、5至75、5至70、5至65、5至60、5至55、5至50、5至45、5至40、5至35、5至30、5至25、5至20、5至15、5至10、10至100、10至95、10至90、10至85、10至80、10至75、10至70、10至65、10至60、10至55、10至50、10至45、10至40、10至35、10至30、10至25、10至20、10至15、15至100、15至95、15至90、15至85、15至80、15至75、15至70、15至65、15至60、15至55、15至50、15至45、15至40、15至35、15至30、15至25、15至20、20至100、20至95、20至90、20至85、20至80、20至75、20至70、20至65、20至60、20至55、20至50、20至45、20至40、20至35、20至30、20至25、25至100、25至95、25至90、25至85、25至80、25至75、25至70、25至65、25至60、25至55、25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、30至100、30至95、30至90、30至85、30至80、30至75、30至70、30至65、30至60、30至55、30至50、30至45、30至40、30至35、35至100、35至95、35至90、35至85、35至80、35至75、35至70、35至65、35至60、35至55、35至50、35至45、35至40、40至100、40至95、40至90、40至85、40至80、40至75、40至70、40至65、40至60、40至55、40至50、40至45、45至100、45至95、45至90、45至85、45至80、45至75、45至70、45至65、45至60、45至55、45至50、50至100、50至95、50至90、50至85、50至80、50至75、50至70、50至65、50至60、50至55、55至100、55至95、55至90、55至85、55至80、55至75、55至70、55至65、55至60、60至100、60至95、60至90、60至85、60至80、60至75、60至70、60至65、65至100、65至95、65至90、65至85、65至80、65至75、65至70、70至100、70至95、70至90、70至85、70至80、70至75、75至100、75至95、75至90、75至85、75至80、80至100、80至95、80至90、80至85、85至100、85至95、85至90、90至100、90至95或95至100周的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品在冷藏温度(35-40℉)、在室温(68-72℉)下、在50-77℉之间、在-23-35℉之间、在70-100℉之间、或在101-213℉之间约1至36、约1至34、约1至32、约1至30、约1至28、约1至26、约1至24、约1至22、约1至20、约1至18、约1至16、约1至14、约1至12、约1至10、约1至8、约1至6、约1至4、约1至2、约4至36、约4至34、约4至32、约4至30、约4至28、约4至26、约4至24、约4至22、约4至20、约4至18、约4至16、约4至14、约4至12、约4至10、约4至8、约4至6、约6至36、约6至34、约6至32、约6至30、约6至28、约6至26、约6至24、约6至22、约6至20、约6至18、约6至16、约6至14、约6至12、约6至10、约6至8、约8至36、约8至34、约8至32、约8至30、约8至28、约8至26、约8至24、约8至22、约8至20、约8至18、约8至16、约8至14、约8至12、约8至10、约10至36、约10至34、约10至32、约10至30、约10至28、约10至26、约10至24、约10至22、约10至20、约10至18、约10至16、约10至14、约10至12、约12至36、约12至34、约12至32、约12至30、约12至28、约12至26、约12至24、约12至22、约12至20、约12至18、约12至16、约12至14、约14至36、约14至34、约14至32、约14至30、约14至28、约14至26、约14至24、约14至22、约14至20、约14至18、约14至16、约16至36、约16至34、约16至32、约16至30、约16至28、约16至26、约16至24、约16至22、约16至20、约16至18、约18至36、约18至34、约18至32、约18至30、约18至28、约18至26、约18至24、约18至22、约18至20、约20至36、约20至34、约20至32、约20至30、约20至28、约20至26、约20至24、约20至22、约22至36、约22至34、约22至32、约22至30、约22至28、约22至26、约22至24、约24至36、约24至34、约24至32、约24至30、约24至28、约24至26、约26至36、约26至34、约26至32、约26至30、约26至28、约28至36、约28至34、约28至32、约28至30、约30至36、约30至34、约30至32、约32至36、约32至34或约34至36个月的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品在冷藏温度(35-40℉)、在室温(68-72℉)下、在50-77℉之间、在-23-35℉之间、在70-100℉之间、或在101-213℉之间1至36、1至34、1至32、1至30、1至28、1至26、1至24、1至22、1至20、1至18、1至16、1至14、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4、1至2、4至36、4至34、4至32、4至30、4至28、4至26、4至24、4至22、4至20、4至18、4至16、4至14、4至12、4至10、4至8、4至6、6至36、6至34、6至32、6至30、6至28、6至26、6至24、6至22、6至20、6至18、6至16、6至14、6至12、6至10、6至8、8至36、8至34、8至32、8至30、8至28、8至26、8至24、8至22、8至20、8至18、8至16、8至14、8至12、8至10、10至36、10至34、10至32、10至30、10至28、10至26、10至24、10至22、10至20、10至18、10至16、10至14、10至12、12至36、12至34、12至32、12至30、12至28、12至26、12至24、12至22、12至20、12至18、12至16、12至14、14至36、14至34、14至32、14至30、14至28、14至26、14至24、14至22、14至20、14至18、14至16、16至36、16至34、16至32、16至30、16至28、16至26、16至24、16至22、16至20、16至18、18至36、18至34、18至32、18至30、18至28、18至26、18至24、18至22、18至20、20至36、20至34、20至32、20至30、20至28、20至26、20至24、20至22、22至36、22至34、22至32、22至30、22至28、22至26、22至24、24至36、24至34、24至32、24至30、24至28、24至26、26至36、26至34、26至32、26至30、26至28、28至36、28至34、28至32、28至30、30至36、30至34、30至32、32至36、32至34或约34至36个月的时间是货架稳定的。

在一些实施方案中，本公开的微生物产品在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97或98％的相对湿度下的任何公开的温度和/或温度范围和时间跨度下是货架稳定的。

包封产品

在一些实施方案中，本公开的目标微生物(例如，微生物和/或合成微生物组合物)被包封在包封组合物中。包封组合物在微生物进入有蹄动物的胃肠道之前保护微生物免受外部应激源的影响。包封组合物进一步产生可能对微生物有益的环境，例如将好氧环境对厌氧微生物的氧化应激降至最低限度。关于微生物的包封组合物和包封微生物的方法，参见Kalsta等人(US 5,104,662A)、Ford(US 5,733,568A)以及Mosbach和Nilsson(US 4,647,536A)。合成集合体的其他方法和制剂可包括如以下一个或多个美国专利中公开的制剂和方法：6537666、6306345、5766520、6509146、6884866、7153472、6692695、6872357、7074431和/或6534087，将这些专利的每一篇明确地通过引用完整并入本文。

在一个实施方案中，包封组合物包括微胶囊，所述微胶囊具有包封在固体壳材料中的多个液体核。出于本公开的目的，“多个”核被定义为两个或更多个。

第一类有用的可熔壳材料是通常为固体脂肪的材料，包括已具有适合硬度的脂肪和动物或植物脂肪和油，它们被氢化直至其熔点足够高，以服务于本公开的目的。取决于期望的工艺和储存温度以及所选的特定材料，特定的脂肪可以是通常为固体或通常为液体的材料。如本文所用的术语“通常为固体”和“通常为液体”是指在期望温度下用于储存所得微胶囊的材料的状态。由于脂肪和氢化油严格地说不具有熔点，因此术语“熔点”在本文中用于描述可熔材料变得充分软化或液体成功乳化和喷雾冷却的最低温度，因而大致对应于壳材料具有足够的完整性以防止胆碱核心释放的最高温度。对于不具有明确熔点的其他材料，在本文中类似地定义“熔点”。

可用于本文的脂肪和油的具体实例(其中一些需要硬化)如下：动物油和脂肪，比如牛脂、羊脂、羔羊脂、猪油或猪脂肪、鱼油和鲸油；植物油，比如菜籽油、棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、大豆油、葵花子油、红花油、椰子油、棕榈油、亚麻籽油、桐油和蓖麻油；脂肪酸甘油单酯和甘油二酯；游离脂肪酸，比如硬脂酸、棕榈酸和油酸等；及其混合物。上面列出的油和脂肪并不是详尽无遗的，而只是示例性的。脂肪酸的具体实例包括亚油酸、γ-亚油酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、异油酸、神经酸、米德酸、芥酸、巨头鲸鱼酸、反油酸、油酸、棕榈油酸、十八碳四烯酸、二十碳五烯酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、肉豆蔻、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、山嵛酸、二十三酸、木蜡酸、二十五酸、蜡酸、二十七酸、褐煤酸、二十九酸、蜂花酸、三十一烷酸、虫漆蜡酸、叶虱酸、格地酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸和三十八烷酸。

可用作包封壳材料的另一类可熔材料是蜡。考虑用于本文的代表性蜡如下：动物蜡，比如蜂蜡、羊毛脂、壳蜡和中国昆虫蜡；植物蜡，比如巴西棕榈蜡、小烛树蜡、杨梅蜡和甘蔗蜡；矿物蜡，比如石蜡、微晶石油蜡、地蜡、纯地蜡和褐煤蜡；合成蜡，比如低分子量聚烯烃(例如，CARBOWAX)和多元醇醚酯(例如，山梨醇)；Fischer-Tropsch加工合成蜡；及其混合物。如果核是水性的，则本文不考虑水溶性蜡，比如CARBOWAX和山梨醇。

另外的其他可用于本文的可熔化合物是可熔天然树脂，比如松香、香脂、虫胶及其混合物。考虑将各种辅助材料掺入根据本公开的可熔材料中。例如，可以将抗氧化剂、光稳定剂、染料和色淀、香料、精油、抗结块剂、填充剂、pH稳定剂、糖类(单糖、二糖、三糖和多糖)等以不降低其对本公开的效用的量掺入可熔材料中。根据本文的一些实施方案考虑的核心材料构成微胶囊重量的约0.1％至约50％、约1％至约35％或约5％至约30％。在一些实施方案中，本文考虑的核心材料构成不超过微胶囊重量的约30％。在一些实施方案中，本文考虑的核心材料构成微胶囊重量的约5％。根据实施方式，核心材料在考虑的微胶囊储存温度下可以是液体或固体。

核心可包括其他添加剂，包括食用糖，比如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、纤维二糖、单糖、二糖、三糖、多糖及其混合物；人工甜味剂，比如阿斯巴甜、糖精、环己基氨基磺酸盐及其混合物；食用酸，比如乙酸(醋)、柠檬酸、抗坏血酸、酒石酸及其混合物；食用淀粉，比如玉米淀粉；水解植物蛋白；水溶性维生素，比如维生素C；水溶性药物；水溶性营养物质，比如硫酸亚铁；香料；盐类；谷氨酸单钠；抗微生物剂，比如山梨酸；抗真菌剂，比如山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸钠和苯甲酸；食品级颜料和染料；及其混合物。取决于实施方式，还考虑了其他可能有用的补充核心材料。

在一些实施方案中可以使用乳化剂来帮助形成稳定的乳液。代表性的乳化剂包括单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯、乙氧基化甘油单酯和甘油二酯，以及它们的混合物。

为了易于加工，特别是为了能够成功地形成合理稳定的乳液，核心材料和壳材料的粘度在形成乳液的温度下应该相似。在一些实施方案中，以厘泊或可比较的单位表示且均在乳液温度下测量的壳的粘度与核心的粘度之比可为约22:1至约1:1、约8:1至约1:1或约3:1至约1:1。在一些实施方案中可以使用1:1的比率，并且对于其中列举范围内的粘度比有用的各种应用而言，可以采用其他粘度。

包封组合物不限于如上公开的微胶囊组合物。在一些实施方案中，包封组合物将微生物组合物包封在粘合剂聚合物中，所述粘合剂聚合物可以是天然的或合成的，没有毒性作用。在一些实施方案中，包封组合物可以是选自糖基质、明胶基质、聚合物基质、二氧化硅基质、淀粉基质、泡沫基质等的基质。在一些实施方案中，包封组合物可以选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯共聚物；乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糊精、海藻酸盐和壳聚糖；单糖；脂肪；脂肪酸，包括油；蛋白质，包括明胶和玉米醇溶蛋白；阿拉伯胶；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木质素磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚丙烯酸乙烯酯；聚环氧乙烷；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体；和聚氯丁二烯。

在一些实施方案中，本公开的包封壳可以达到10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm、1000μm、1010μm、1020μm、1030μm、1040μm、1050μm、1060μm、1070μm、1080μm、1090μm、1100μm、1110μm、1120μm、1130μm、1140μm、1150μm、1160μm、1170μm、1180μm、1190μm、1200μm、1210μm、1220μm、1230μm、1240μm、1250μm、1260μm、1270μm、1280μm、1290μm、1300μm、1310μm、1320μm、1330μm、1340μm、1350μm、1360μm、1370μm、1380μm、1390μm、1400μm、1410μm、1420μm、1430μm、1440μm、1450μm、1460μm、1470μm、1480μm、1490μm、1500μm、1510μm、1520μm、1530μm、1540μm、1550μm、1560μm、1570μm、1580μm、1590μm、1600μm、1610μm、1620μm、1630μm、1640μm、1650μm、1660μm、1670μm、1680μm、1690μm、1700μm、1710μm、1720μm、1730μm、1740μm、1750μm、1760μm、1770μm、1780μm、1790μm、1800μm、1810μm、1820μm、1830μm、1840μm、1850μm、1860μm、1870μm、1880μm、1890μm、1900μm、1910μm、1920μm、1930μm、1940μm、1950μm、1960μm、1970μm、1980μm、1990μm、2000μm、2010μm、2020μm、2030μm、2040μm、2050μm、2060μm、2070μm、2080μm、2090μm、2100μm、2110μm、2120μm、2130μm、2140μm、2150μm、2160μm、2170μm、2180μm、2190μm、2200μm、2210μm、2220μm、2230μm、2240μm、2250μm、2260μm、2270μm、2280μm、2290μm、2300μm、2310μm、2320μm、2330μm、2340μm、2350μm、2360μm、2370μm、2380μm、2390μm、2400μm、2410μm、2420μm、2430μm、2440μm、2450μm、2460μm、2470μm、2480μm、2490μm、2500μm、2510μm、2520μm、2530μm、2540μm、2550μm、2560μm、2570μm、2580μm、2590μm、2600μm、2610μm、2620μm、2630μm、2640μm、2650μm、2660μm、2670μm、2680μm、2690μm、2700μm、2710μm、2720μm、2730μm、2740μm、2750μm、2760μm、2770μm、2780μm、2790μm、2800μm、2810μm、2820μm、2830μm、2840μm、2850μm、2860μm、2870μm、2880μm、2890μm、2900μm、2910μm、2920μm、2930μm、2940μm、2950μm、2960μm、2970μm、2980μm、2990μm或3000μm厚。

动物饲料

在一些实施方案中，将本公开的微生物产品与动物饲料混合。在一些实施方案中，动物饲料可以以各种形式存在，比如粒料、胶囊、颗粒状、粉末状、液体或半液体。

在一些实施方案中，在饲料加工厂(例如，Cargill或Western Millin)将本公开的产品混合到预混物中，单独作为独立的预混物和/或与其他饲料添加剂例如莫能菌素、维生素等一起混合。在一个实施方案中，在饲料加工厂将本公开的产品混合到饲料中。在另一个实施方案中，将本公开的产品混合到饲料本身中。

在一些实施方案中，饲料可以补充有水、一种预混物或多种预混物、牛马饲料(forage)、草料、豆类(例如，整粒、破碎或磨碎的)、谷物(例如，整粒、破碎或磨碎的)、基于豆类或谷物的油、基于豆类或谷物的粗粉、基于豆类或谷物的半干青贮饲料(haylage)或青贮饲料、基于豆类或谷物的浆料、脂肪酸、糖醇(例如，多元醇)、市售配方饲料及其混合物。

在一些实施方案中，牛马饲料包括干草、半干青贮饲料和青贮饲料。在一些实施方案中，干草包括干草(例如，苏丹草、鸭茅等)、苜蓿干草和三叶草干草。在一些实施方案中，干草包括草类半干青贮饲料、高粱半干青贮饲料和苜蓿半干青贮饲料。在一些实施方案中，青贮饲料包括玉米、燕麦、小麦、苜蓿、三叶草等。

在一些实施方案中，可以在饲料中使用一种预混物或多种预混物。预混物可包含微量成分，比如维生素、矿物质、氨基酸；化学防腐剂；药物组合物，比如抗生素和其他药物；发酵产品和其他成分。在一些实施方案中，将预混物掺和到饲料中。

在一些实施方案中，饲料可包括饲料浓缩物，比如大豆皮、甜菜浆、糖蜜、高蛋白豆粕、玉米粉、玉米粒、小麦次粉、酒糟、棉籽壳、瘤胃旁路蛋白、瘤胃旁路脂肪和油脂。关于能够用于本组合物和方法的动物饲料和动物饲料补充剂，参见Luhman(美国公开US20150216817A1)、Anderson等人(美国专利3,484,243)以及Porter和Luhman(美国专利9,179,694B2)。

在一些实施方案中，饲料以配合物形式存在，在能够满足基本饮食需要的混合组合物中，其包括饲料本身、维生素、矿物质、氨基酸和其他必要成分。配合饲料可进一步包含预混物。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物可与动物饲料、预混物和/或配合饲料混合。在饲喂反刍动物之前，可以将动物饲料的各个组分与微生物组合物混合。可将本公开的微生物组合物施加到预混物中或上、施加到饲料中或上和/或施加到配合饲料中或上。

微生物培养技术

可以使用标准微生物技术来实现本公开微生物的分离、鉴定和培养。这样的技术的实例可发现于Gerhardt,P.(编辑)Methods for General and MolecularMicrobiology.American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1994)以及Lennette,E.H.(编辑)Manual of Clinical Microbiology，第三版，American Societyfor Microbiology,Washington,D.C.(1980)，将每篇文献通过引用并入本文。

可通过将标本在固体培养基(例如营养琼脂平板)上划线获得单个菌落来实现分离，所述菌落表征为上文所述的表型性状(例如，革兰氏阳性/阴性、能够在需氧/厌氧条件下形成孢子、细胞形态、碳源代谢、酸/碱产生、酶分泌、代谢分泌物等)，并降低使用已被污染的培养物的可能性。

例如，对于本公开的微生物，通过生物样品的重复传代培养，每次传代培养后在固体培养基上划线以获得单独的菌落或菌落形成单位，可以获得生物学纯的分离物。冻干细菌的制备、解冻和培养方法是通常是已知的，例如，Gherna,R.L.andC.A.Reddy.2007.Culture Preservation，第1019-1033页，见于C.A.Reddy,T.J.Beveridge,J.A.Breznak,G.A.Marzluf,T.M.Schmidt和L.R.Snyder编辑，AmericanSociety for Microbiology,Washington,D.C.,1033页；通过引用将其并入本文。因而，考虑将在-70℃下长期储存在含有甘油的溶液中的冻干液体制剂和培养物用于提供本公开的制剂。

本公开的微生物可以在好氧条件下或可替代地在厌氧条件下在液体介质中繁殖。用于培养本公开的细菌菌株的介质包括碳源、氮源和无机盐，以及特别需要的物质，比如维生素、氨基酸、核酸等。可用于培养微生物的适合碳源的实例包括，但不限于，淀粉、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸、糖类比如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡糖胺、麦芽糖，等；有机酸比如乙酸、富马酸、己二酸、丙酸、柠檬酸、葡糖酸、苹果酸、丙酮酸、丙二酸等的盐；醇类比如乙醇和甘油等；油或脂肪，比如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油。碳源的添加量根据碳源的种类而不同，通常为1至100g/L。优选地，葡萄糖、淀粉和/或蛋白胨作为主要碳源以0.1％-5％(W/V)的浓度包含在介质中。

可以用于培养本发明的细菌菌株的适合氮源的实例包括但不限于氨基酸、酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨或其组合。氮源的量根据氮源的种类而不同，通常在0.1g/L到30g/L之间。

可单独或组合使用无机盐类、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、硫酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、氯化钠、碳酸钙、碳酸钠。无机酸的量根据无机盐的种类而变化，通常在0.001g/L至10g/L之间。特别需要的物质的实例包括但不限于维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、干酵母及其组合。

可以在允许微生物菌株生长的温度下(基本上在20℃和46℃之间)实施培养。在一些方面，温度范围为30℃-39℃。为了最佳生长，在一些在实施方案中，可将介质调节至pH6.0-7.4。应当理解的是，还可以使用市售介质来培养微生物菌株，比如营养肉汤或营养琼脂(可获自Difco,Detroit,MI)。应当理解的是，培养时间可以根据所使用的培养基的类型和作为主要碳源的糖的浓度而不同。

在一些方面，培养持续8-96个小时。使用本领域熟知的方法分离如此获得的微生物细胞。实例包括，但不限于，膜过滤和离心分离。可以使用氢氧化钠等调节pH，并且可以使用冷冻干燥机干燥培养物，直到水含量变为等于或小于4％时为止。可以通过如上文所述繁殖每个菌株来获得微生物共培养物。在一些方面，微生物多菌株培养物可以通过繁殖两种或更多种上文描述的菌株来获得。应当理解的是，当可以采用相容的培养条件时，可将微生物菌株一起培养。

进一步编号的实施方案

本公开的进一步编号的实施方案提供如下：

实施方案1.一种方法，其包括：将保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及包装和密封保存的微生物细胞和WAS的混合物。

实施方案2.一种方法，其包括：保存微生物细胞群，以提供保存的微生物细胞群；从保存的微生物细胞群收获活的微生物细胞，以提供活的保存的微生物细胞群；将活的保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及包装和密封活的保存的微生物细胞群和MMWAS的混合物。

实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其进一步包括：鉴定目标微生物和/或微生物菌株；培养目标微生物和/或微生物菌株，以产生微生物细胞群；制备用于保存的微生物细胞群。

实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将保存的微生物细胞群与至少一种稀释剂混合。

实施方案5.根据实施方案4所述的方法，其中所述至少一种稀释剂包括碳酸钙。

实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述WAS是微孔矿物WAS、中孔矿物WAS或大孔矿物WAS。

实施方案7.根据实施方案1-5中任一项的方法，其中所述至少一种MWAS选自沸石、活性粘土、硅胶、氧化钙、硫酸钙、膨润土、山梨醇、氯化钙、聚(丙烯酸)钠盐、氯化钠和罗望子种子半乳糖木糖葡聚糖。

实施方案8.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述至少一种WAS包括微孔铝硅酸盐矿物。

实施方案9.根据实施方案2所述的方法，其中所述保存微生物细胞群包括汽化保存(PBV)。

实施方案10.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述保存的微生物细胞以玻璃态保存。

实施方案11.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述保存的微生物细胞具有高玻璃化转变温度。

实施方案12.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述至少一种WAS是包含介于20％和50％之间的孔隙率百分比的微孔矿物WAS。

实施方案13.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述至少一种WAS是微孔矿物WAS，其包含连接成三维框架的孔和共角铝硅酸盐四面体。

实施方案14.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，所述至少一种WAS是包含复合式(Na,K,Ca)2-3Al3(Al,Si)2Si13O36-12 H2O的微孔矿物WAS。

实施方案15.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述至少一种WAS包括沸石。

实施方案16.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述至少一种WAS包括斜发沸石(Clinoptilolite Zeolite)。

实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群包括下列一种或多种：梭菌属物种(Clostridium spp.)细菌、琥珀酸弧菌属物种(Succinivibrio spp.)细菌、丁酸弧菌属物种(Butyrivibio spp.)细菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)细菌、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)细菌、普雷沃菌属物种(Prevotella spp.)细菌、互营球菌属物种(Syntrophococcus spp.)细菌或瘤胃球菌属物种(Ruminococcus spp.)细菌。

实施方案18.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群体包含盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp.)真菌、毕赤酵母属物种(Pichia spp.)真菌、根囊鞭菌属物种(Orpinomyces spp.)真菌或梨囊鞭菌属物种(Piromyces spp.)真菌。

实施方案19.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群包括毛螺菌科的物种。

实施方案20.根据实施方案17-19中任一项所述的方法，其中：梭菌属物种包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少97％序列同一性的16SrRNA序列；琥珀酸弧菌属物种包含与SEQ ID NO:11具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；毕赤酵母属物种包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的ITS序列；芽孢杆菌属物种包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；乳杆菌属物种包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；普雷沃菌属物种包含与SEQ ID NO:10具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；或者，毛螺菌科的物种包含与SEQ ID NO:12具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列。

实施方案21.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群包括牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinosolvens)细菌或盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp)真菌。

实施方案22.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述目标微生物细胞群包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)细菌、丁酸梭菌新物种(Clostridiumbutyricum sp.nov.)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)细菌、拜氏梭菌新物种(Clostridium beijerinckii sp.nov.)细菌、克鲁维毕赤酵母(Pichia kudriazevii)真菌、克鲁维毕赤酵母新物种(Pichia kudriazevii sp.nov.)真菌、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibio fibrosolvens)细菌、牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌或溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)细菌。

实施方案23.根据实施方案3所述的方法，其中所述鉴定目标微生物和/或微生物菌株包括：处理从样品动物群收集的多个样品，以鉴定一种或多种目标微生物和/或微生物菌株，所述处理包括：对于多个样品的每个样品：测量与样品动物群相关的至少一个元数据；检测多个微生物类型的存在并确定检测到的微生物类型的细胞的绝对数；确定多个微生物类型的检测到的微生物类型的一个或多个菌株的相对测量值；基于检测到的微生物类型的细胞的绝对数和该微生物类型的一个或多个微生物菌株的相对测量值，确定一组目标微生物和/或微生物菌株以及对应的绝对细胞计数，并通过活性水平进行过滤；以及用测量的元数据分析该组目标微生物和/或微生物菌株和对应的绝对细胞计数，以鉴定目标微生物和/或微生物菌株与测量的元数据之间的关系。

实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞是孢子。

实施方案25.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞是营养细胞。

实施方案26.一种通过实施方案1-25中任一项所述的方法制备的产品，其包含保存的微生物细胞群和水分活度清除剂(WAS)。

实施方案27.根据实施方案26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包括下列一种或多种：梭菌属物种(Clostridium spp.)细菌、琥珀酸弧菌属物种(Succinivibriospp.)细菌、丁酸弧菌属物种(Butyrivibio spp.)细菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)细菌、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)细菌、普雷沃菌属物种(Prevotella spp.)细菌、互营球菌属物种(Syntrophococcus spp.)细菌或瘤胃球菌属物种(Ruminococcusspp.)细菌。

实施方案28.根据实施方案26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包括盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp.)真菌、毕赤酵母属物种(Pichia spp.)真菌、根囊鞭菌属物种(Orpinomyces spp.)真菌或梨囊鞭菌属物种(Piromycesspp.)真菌。

实施方案29.根据实施方案26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包括毛螺菌科的物种。

实施方案30.根据实施方案26-29中任一项所述的产品，其中：梭菌属物种包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少97％序列同一性的16SrRNA序列；琥珀酸弧菌属物种包含与SEQ ID NO:11具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；毕赤酵母属物种包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的ITS序列；芽孢杆菌属物种包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；乳杆菌属物种包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；普雷沃菌属物种包含与SEQ ID NO:10具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；或者，毛螺菌科的物种包含与SEQ ID NO:12具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列。

实施方案31.根据实施方案26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包括牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinosolvens)细菌或盲肠鞭菌属物种(Caecomyces spp.)真菌。

实施方案32.根据实施方案26所述的产品，其中所述目标微生物细胞群包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)细菌、丁酸梭菌新物种(Clostridium butyricumsp.nov.)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)细菌、拜氏梭菌新物种(Clostridiumbeijerinckii sp.nov.)细菌、克鲁维毕赤酵母(Pichia kudriazevii)真菌、克鲁维毕赤酵母新物种(Pichiakudriazevii sp.nov.)真菌、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibiofibrosolvens)细菌、牛瘤胃球菌(Ruminococcus bovis)细菌或溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)细菌。

实施例

实施例1：微生物产品的批量制备

本实施例描述了通过将活性成分Dairy-20喷雾干燥粉末(DY20-SDP)和Dairy-21棕榈油胶囊(DY21-POE)与饲料级碳酸钙和一种示例性WAS沸石混合制备批量的Galaxis100产品的方法。

材料

(a)Dairy-20喷雾干燥粉(DY20-SDP)；

(b)Dairy-21棕榈油胶囊(DY21-POE)；

(c)碳酸钙(Sofia Establecimiente Minero)；

(d)沸石，KMI；

(e)箔内衬4层袋125mm x 85mm x 40mm(Fres-Co).

添加的材料量根据以下公式计算：

需要的碳酸钙的量(g)＝[批量大小(g)-DY20的量(g)-DY21的量(g)]×0.98

需要的mmwas(例如沸石)的量(g)＝[批量大小(g)-DY20的量(g)-DY21的量(g)]×0.02

在混合和装袋操作过程中，温度应保持在30℃以下。在混合和装袋操作过程中，相对湿度(RH)应保持在35％以下。将沸石在200℃下干燥4小时。可以使用V型混合机、螺带混合机或任何适合的低剪切固体混合设备来混合多个组分。将混合器装载计算量的沸石和碳酸钙，然后装载DY20-SDP和DY21-POE。将组分混合至异质性，混合至少5分钟。混合完成后，用铝箔衬里的袋子装满产品并通过热封密封。

可以足够快地包装产品，使得MMWAS不与包装环境的环境湿度达到平衡。沸石与其他潜在稀释剂相比的一个优点是，由于其纳米多孔性质，其平衡缓慢。可以选择材料的孔径和粒度，以便达到目标平衡时间。这个时间显著长于混合和包装所需的时间(几十分钟)，但比包装袋子和例如在农场打开袋子之间的时间(例如，2至6个月)短得多。图3显示了沸石如何具有这种品质。与测试的其他常见抗结块剂(碳酸钙、膨润土和二氧化硅)相比，沸石的平衡更加缓慢。这对于包装场景可能是有利的，因为沸石在袋子密封之前将不被平衡，对于货架稳定性可能是关键的。

实施例2：用沸石稳定后微生物存活率提高

本实施例证明了根据实施例1中概述的参数包装和密封的微生物的存活率提高。如下面的数据所示，一旦密封，MMWAS优先吸收来自碳酸钙和保存微生物的水分，从而提高微生物的玻璃化转变温度并且提高在环境温度和升高温度下的存活率。

将Galaxis产品(DY20和DY21)在控制的相对湿度(RH)(0％、25％、50％或75％)的条件下混合，其包括2％斜发沸石(Galaxis 100＝G100Z和Galaxis 5＝G5Z)或不含沸石(G100和G5)，并且在控制的相对湿度条件下孵育15分钟，然后密封聚酯薄膜、低MVTR袋，将袋子放入50℃受控的培养箱中。Galaxis 100＝具有100g微生物的产品。Galaxis 5＝具有5g微生物的产品。在54天期间取时间点，测定CFU/g。结果清楚地表明，即使在相对湿度升高的条件下，包含沸石也显著急剧地提高了存活率。在没有沸石的情况下，在75％相对湿度(参见G100 75％RH和G5 75％RH)下混合和包装之后，在50℃下6天之后，97％的细胞被杀死。然而，在相对湿度相同的条件下，包含2％的沸石没有可测量的损失。图4显示了两批DY-21(微生物2)营养微生物的加速稳定性测试结果，这些微生物已经由PBV保存，封装在硬脂棕榈油中，并在碳酸钙中稀释至1.2E7CFU/g的初始效力。图5显示了两批DY-21(微生物2)营养微生物的加速稳定性测试结果，这些微生物已经由PBV保存，封装在硬脂棕榈油中，并在碳酸钙中稀释至3.12E8CFU/g的初始效力。

实施例3：温度对用沸石稳定的微生物的货架稳定性的影响

根据实施例1混合和包装产品(Galaxis 5)，其中微生物1(DY20)的初始效力为8.82E6CFU/g，微生物2(DY21)的初始效力为2.84E8CFU/g。将封闭袋置于不同温度(4℃、25℃、30℃、40℃和50℃)下，用于评估长期稳定性。每月取时间点，测定CFU/g。如图6和图7所示，具有2％沸石的产品符合关于至少6个月效力的标签声明，但在50℃下储存的产品除外(Galaxis 5中微生物的效力对于DY20不应低于2E6CFU/g，并且对于DY21不应低于2E7CFU/g)。

实施例4：湿度对用沸石稳定的微生物的货架稳定性的影响

制备了两种产品混合物(Galaxis 5)，一种具有2％沸石，另一种没有沸石。将每种产品混合物开封并放入控制的环境培养箱(20℃和50％RH、20℃和75％RH、37℃和50％RH、37℃和75％RH)中，以便刺激开袋条件。每天取时间点，持续三天，测定产品的CFU/g。如图9所示，在50％RH和75％RH条件下，在37℃下暴露1天之后，未用沸石配制的产品不符合微生物2的标签效力声明，即2E7CFU/g。当所述产品用2％沸石配制时，所述产品耐受在37℃下在50％RH中暴露3天，并且在37℃和75％RH下暴露2天之后略低于标签效力声明(图8)。

实施例5：用沸石稳定的微生物在50℃下的货架稳定性

根据实施例1将产品(Galaxis 100)与5％和10％沸石混合并包装。将密封袋置于50℃培养箱中，用于加速稳定性分析。在两个月期间取时间点，通过验证方法测定CFU/g。微生物1(DY20)由灰线表示，微生物2(DY21)由黑线表示。如图10和图11所示，用5％和10％沸石配制的产品符合Galaxis 100标签声明，即在50℃下至少2个月，对于微生物2为1E6CFU/g，并且对于微生物1为1E5CFU/g。

参考文献

出于所有目的，将本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请通过引用完整并入本文。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及不是并且不应被视为承认或任何形式的暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

序列表

<110> 埃斯库斯生物科技股份公司(Ascus Biosciences, Inc.)

<120> 用于稳定和保存微生物的方法和系统

<130> ASBI-020/01WO 325233-2180

<150> 62/832,181

<151> 2019-04-10

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 225

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)的16S rRNA, Ascusb_3138 DY20

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc 60

gatgaagttc cttcgggaat ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg 120

cctcatagag gggaatagcc tttcgaaagg aagattaata ccgcataaga ttgtagcacc 180

gcatggtgca gcaattaaag gagtaatccg ctatgagatg gaccc 225

<210> 2

<211> 225

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 木糖假丝酵母的ITS2序列, Ascusf_15, DY21

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtattcc tacctgattt gaggtcgagc 60

tttttgttgt ctcgcaacac tcgctctcgg ccgccaagcg tccctgaaaa aaagtctagt 120

tcgctcggcc agcttcgctc cctttcaggc gagtcgcagc tccgacgctc tttacacgtc 180

gtccgctccg ctcccccaac tctgcgcacg cgcaagatgg aaacg 225

<210> 3

<211> 225

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自梭菌属IV的16S rRNA, Ascusb_5 DY10

<400> 3

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaacacatg caagtcgaac 60

ggaacttctt tgacagaatt cttcggaagg aagttgatta agtttagtgg cggacgggtg 120

agtaacgcgt gagtaacctg cctttgagag gggaataact tcccgaaagg gatgctaata 180

ccgcataaag catagaagtc gcatggcttt tatgccaaag attta 225

<210> 4

<211> 224

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自芽孢杆菌属的16S rRNA, Ascusbbr_33(A) CR11

<400> 4

agatttgatc atggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg 60

gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120

ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtctgaa 180

ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc ggctaccact taca 224

<210> 5

<211> 224

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自梭菌属的16S rRNA序列, Ascusbbr_105932 BR21

<400> 5

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc 60

gaagcagttt taaggaagtt ttcggatgga attaaaattg acttagcggc ggacgggtga 120

gtaacgcgtg ggtaacctgc ctcatacagg gggataacag ttagaaatga ctgctaatac 180

cgcataagcg cacagtgctg catagcacag tgtgaaaaac tccg 224

<210> 6

<211> 224

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自梭菌属的16S rRNA序列, Ascusbbr_2676 BR67

<400> 6

agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc 60

gatgaagttc cttcgggaac ggattagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg 120

cctcatagag gggaatagcc ttccgaaagg aagattaata ccgcataaga ttgtagtttc 180

gcatgaaaca gcaattaaag gagtaatccg ctatgagatg gacc 224

<210> 7

<211> 224

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自乳杆菌属的16S rRNA, Ascusbbr_5796(A) BR16

<400> 7

agatttgctc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg 60

agcggaacta acagatttac ttcggtaatg acgttaggaa agcgagcggc ggatgggtga 120

gtaacacgtg gggaacctgc cccatagtct gggataccac ttggaaacag gtgctaatac 180

cggataagaa agcagatcgc atgatcagct tttaaaaggc ggcg 224

<210> 8

<211> 224

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自乳杆菌属的16S rRNA, Ascusbbr_5796(B) BR16

<400> 8

agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

gagcggaact aacagattta cttcggtaat gacgttagga aagcgagcgg cggatgggtg 120

agtaacacgt ggggaacctg ccccatagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata 180

ccggataaga aagcagatcg catgatcagc ttttaaaagg cggc 224

<210> 9

<211> 225

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自乳杆菌属的16S rRNA, Ascusbbr_5796(C) BR16

<400> 9

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

gagcggaact aacagattta cttcggtaat gacgttagga aagcgagcgg cggatgggtg 120

agtaacacgt ggggaacctg ccccatagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata 180

ccggataaga aagcagatcg catgatcagc ttttaaaagg cggcg 225

<210> 10

<211> 225

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自普雷沃菌属的16S rRNA, Ascusbbf_4 BY41

<400> 10

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agctacaggc ttaacacatg caagtcgagg 60

ggaaacgaca tagagtgctt gcactttatg ggcgtcgacc ggcgaatggg tgagtaacgc 120

gtatccaacc tgcccttgac cgagggatag cccagtgaaa actgaattaa tacctcatgt 180

tctcctcaga cggcatcaga cgaggagcaa agattaatcg gtcaa 225

<210> 11

<211> 225

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自琥珀酸弧菌属的16S rRNA, Ascusbbf_154 BF53

<400> 11

agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaatacatg caagtcgaac 60

ggtaacatag gaaaagcttg cttttcctga tgacgagtgg cggacgggtg agtaaagttt 120

gggaagctac ctgatagagg gggacaacag ttggaaacga ctgctaatac cgcatacagc 180

ctgagggtga aagcagcaat gcgctatcag atgcgcccaa atggg 225

<210> 12

<211> 225

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> 编码来自毛螺菌科的16S rRNA, Ascusbbf_876 BF65

<400> 12

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaacacatg caagtcgagc 60

ggagtgaaga gagcttgctt ttttcactta gcggcggatg ggtgaggaac gcgtggggaa 120

cctgcctctc acagggggat aacagctgga aacggctgtt aataccgcat atgcacacag 180

tgccgcatgg cacagggtgg aaagaaattc ggtgagagat ggacc 225

Claims (32)

1.一种方法，其包括：

将保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及

包装和密封所述保存的微生物细胞和所述WAS的混合物。

2.一种方法，其包括：

保存微生物细胞群，以提供保存的微生物细胞群；

从所述保存的微生物细胞群收获活的微生物细胞，以提供活的保存的微生物细胞群；

将所述活的保存的微生物细胞群与至少一种水分活度清除剂(WAS)混合至期望的同质性水平；以及

包装和密封所述活的保存的微生物细胞群和所述MMWAS的混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括：

鉴定目标微生物和/或微生物菌株；培养所述目标微生物和/或微生物菌株，以产生微生物细胞群；制备用于保存的所述微生物细胞群。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述保存的微生物细胞群与至少一种稀释剂混合。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种稀释剂包括碳酸钙。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述WAS是微孔矿物WAS、中孔矿物WAS或大孔矿物WAS。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述至少一种MWAS选自沸石、活性粘土、硅胶、氧化钙、硫酸钙、膨润土、山梨醇、氯化钙、聚(丙烯酸)钠盐、氯化钠和罗望子种子半乳糖木糖葡聚糖。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述至少一种WAS包括微孔铝硅酸盐矿物。

9.根据权利要求2所述的方法，其中保存所述微生物细胞群包括汽化保存(PBV)。

10.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述保存的微生物细胞以玻璃态保存。

11.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述保存的微生物细胞具有高玻璃化转变温度。

12.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述至少一种WAS是包含介于20％和50％之间的孔隙率百分比的微孔矿物WAS。

13.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述至少一种WAS是微孔矿物WAS，其包含连接成三维框架的孔和共角铝硅酸盐四面体。

14.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述至少一种WAS是包含复合式(Na,K,Ca)_2-3Al₃(Al,Si)₂Si₁₃O₃₆-12 H2O的微孔矿物WAS。

15.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述至少一种WAS包括沸石。

16.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述至少一种WAS包括斜发沸石。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群包含下列一种或多种：梭菌属物种细菌、琥珀酸弧菌属物种细菌、丁酸弧菌属物种细菌、芽孢杆菌属物种细菌、乳杆菌属物种细菌、普雷沃菌属物种细菌、互营球菌属物种细菌或瘤胃球菌属物种细菌。

18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群包含盲肠鞭菌属物种真菌、毕赤酵母属物种真菌、根囊鞭菌属物种真菌或梨囊鞭菌属物种真菌。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群包含毛螺菌科的物种。

20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中：

a.所述梭菌属物种包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

b.所述琥珀酸弧菌属物种包含与SEQ ID NO:11具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

c.所述毕赤酵母属物种包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的ITS序列；

d.所述芽孢杆菌属物种包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

e.所述乳杆菌属物种包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

f.所述普雷沃菌属物种包含与SEQ ID NO:10具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；或者

g.所述毛螺菌科的物种包含与SEQ ID NO:12具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列。

21.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞群包含牛瘤胃球菌细菌、溶糊精琥珀酸弧菌细菌或盲肠鞭菌属物种真菌。

22.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述目标微生物细胞群包含丁酸梭菌细菌、丁酸梭菌新物种、拜氏梭菌细菌、拜氏梭菌新物种细菌、克鲁维毕赤酵母真菌、克鲁维毕赤酵母真菌、克鲁维毕赤酵母新物种真菌、溶纤维丁酸弧菌细菌、牛瘤胃球菌细菌或溶糊精琥珀酸弧菌细菌。

23.根据权利要求3所述的方法，其中所述鉴定所述目标微生物和/或微生物菌株包括：处理从样品动物群收集的多个样品，以鉴定一种或多种目标微生物和/或微生物菌株，所述处理包括：对于所述多个样品中的每个样品：测量与所述样品动物群相关的至少一个元数据；检测多个微生物类型的存在并确定检测到的微生物类型的细胞的绝对数；确定所述多个微生物类型中的检测到的微生物类型的一个或多个菌株的相对测量值；基于所述检测到的微生物类型的细胞的绝对数和所述微生物类型的一个或多个微生物菌株的相对测量值，确定一组目标微生物和/或微生物菌株以及对应的绝对细胞计数，并通过活性水平进行过滤；以及用测量的元数据分析所述组目标微生物和/或微生物菌株和对应的绝对细胞计数，以鉴定目标微生物和/或微生物菌株与测量的元数据之间的关系。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞是孢子。

25.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述保存的微生物细胞是营养细胞。

26.一种通过权利要求1-25中任一项所述的方法制备的产品，其包含保存的微生物细胞群和水分活度清除剂(WAS)。

27.根据权利要求26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包含下列一种或多种：梭菌属物种细菌、琥珀酸弧菌属物种细菌、丁酸弧菌属物种细菌、芽孢杆菌属物种细菌、乳杆菌属物种细菌、普雷沃菌属物种细菌、互营球菌属物种细菌或瘤胃球菌属物种细菌。

28.根据权利要求26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包含盲肠鞭菌属物种真菌、毕赤酵母属物种真菌、根囊鞭菌属物种真菌或梨囊鞭菌属物种真菌。

29.根据权利要求26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包含毛螺菌科的物种。

30.根据权利要求26-29中任一项所述的产品，其中：

h.所述梭菌属物种包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

i.所述琥珀酸弧菌属物种包含与SEQ ID NO:11具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

j.所述毕赤酵母属物种包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的ITS序列；

k.所述芽孢杆菌属物种包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

l.所述乳杆菌属物种包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；

m.所述普雷沃菌属物种包含与SEQ ID NO:10具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列；或者

n.所述毛螺菌科的物种包含与SEQ ID NO:12具有至少97％序列同一性的16S rRNA序列。

31.根据权利要求26所述的产品，其中所述保存的微生物细胞群包含牛瘤胃球菌细菌、溶糊精琥珀酸弧菌细菌或盲肠鞭菌属物种真菌。

32.根据权利要求26所述的产品，其中所述目标微生物细胞群包含丁酸梭菌细菌、丁酸梭菌新物种、拜氏梭菌细菌、拜氏梭菌新物种细菌、克鲁维毕赤酵母真菌、克鲁维毕赤酵母新物种真菌、溶纤维丁酸弧菌细菌、牛瘤胃球菌细菌或溶糊精琥珀酸弧菌细菌。

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