CN109355221B - 一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基和方法 - Google Patents

一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基及方法。其培养基组分包括：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、柠檬酸、KCl、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、甜菜碱、VB1、VH、氨苄霉素和氯化胆碱，其pH值为7.30～7.50。其方法是在培养过程中，加入国产阿拉伯糖进行诱导；诱导阶段，以一定的补加速率补加一定营养物质与抗生素进行诱导，菌影形成率达到99％以上。本发明可以实现大量生产霍乱弧菌菌影，能满足大规模生产霍乱弧菌菌影佐剂的需求。

Description

一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基和方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基和方法。
背景技术
20世纪80年代奥地利学者Lubitz W等首先发明了一种新型疫苗——菌影疫苗(Bacterial Ghost)，其基本原理是噬菌体PhiXl74的E蛋白能将革兰阴性菌裂解，裂解后的革兰阴性菌在细胞膜形成一个跨膜孔道结构，使菌内胞质内容物由孔道排出，这种灭活后不含胞浆成分的完整细菌空壳。菌影疫苗具有培养方便、成本低廉、易于大量制备、无需佐剂、无致病性、安全性好、能够长时间稳定存在、可作为载体构建多价重组疫苗等优点。
霍乱弧菌菌影(Vibrio Cholerae Ghosts，VCG)可作为递呈系统，且VCG载体本身具有佐剂的性质，同时产生很好的体液免疫。VCG在疫苗生产中的应用，不仅能够有效刺激机体的免疫应答，抵抗病原的感染，同时能够产生免疫记忆，抵抗病原的再次感染。但是，目前，霍乱弧菌只有在较低菌体浓度诱导时，才能形成菌影；若霍乱弧菌在高浓度诱导时，菌影形成率低，影响VCG的作用效果；则导致合格VCG的生产能力低、生产成本高，限制了其作为疫苗佐剂的应用。因此，研究VCG高效制备方法是极为重要的，建立VCG高效制备方法可提高其应用市场、提高疫苗的免疫保护效力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基，本发明的另一个目的在于提供一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基，其包括如下组份：葡萄糖2.0～8.0g/L、酵母粉2.0～10.0g/L、蛋白胨1.0～5.0g/L、柠檬酸1.0～2.0g/L、KCl 1.0～3.0g/L、MgSO4·7H2O 1.0～3.0g/L、(NH4)2SO4 1.0～3.0g/L、甜菜碱0.5～1.5g/L、VB1 0.015～0.025g/L、VH 0.003～0.008g/L、氨苄霉素0.05～0.15g/L和氯化胆碱0.5～1.5mL/L，其pH值为7.30～7.50。如上所述的培养基，优选地，其包括如下组份：葡萄糖5.0g/L、酵母粉5.0g/L、蛋白胨2.0g/L、柠檬酸1.5g/L、KCl 2.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、甜菜碱1.0g/L、氯化胆碱1.0mL/L、VB1 20.0mg/L、VH 5.0mg/L、氨苄霉素100mg/L，其pH值为7.50。
如上所述的培养基，优选地，所述培养基的制备方法为：分别称取葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、柠檬酸、KCl、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、甜菜碱、氯化胆碱、VB1、VH，加入去离子水，定容后充分摇匀溶解，调节pH值至7.50，高温灭菌；冷却后，按照无菌要求加入氨苄霉素。
一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的方法，其包括如下步骤：
S1、挑取霍乱弧菌菌株的单菌落，接种至装有种子培养基中，培养培养8h～14h，获得霍乱弧菌种子液；
S2、将霍乱弧菌种子液接种到如权利要求1-3中任一项所述的培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为4.5～5.5时，加入阿拉伯糖进行诱导；
S3、诱导培养后，霍乱弧菌菌影形成；在诱导培养9h～12h后，其霍乱弧菌菌影形成率达到99％以上。
如上所述的方法，优选地，在步骤S1中，所述培养的温度为35℃，转速160rpm。
在步骤S1中，所述种子培养基包括蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L和NaCl 10.0g/L；pH值为7.50。
如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述霍乱弧菌种子液的接种量按5％～10％进行。即霍乱弧菌种子液占发酵液体积的5％～10％。
如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述培养为在33～35℃、溶氧水平20％～30％、pH值7.30～7.50的条件下，培养时间为5h～8h，控制菌液中葡萄糖浓度在0.5～3.0g/L，所述阿拉伯糖按1.0g/L～5.0g/L进行加入。
本发明在诱导阶段控制葡萄糖含量在0.5～3.0g/L。优选地，在诱导阶段控制葡萄糖含量在0.50g/L，一方面是保证在诱导阶段霍乱弧菌对碳源的需求；另一方面较高的葡萄糖含量会降低阿拉伯糖的诱导效果，因此选择控制葡萄糖含量在0.50g/L。
如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，按照5％的接种量接种霍乱弧菌种子液到如权利要求1-3中任一项所述的培养基中，在35℃、溶氧水平30％、pH值7.5的条件下培养5h，菌液的吸光度值在600nm至5.0时，控制菌液中葡萄糖浓度在0.5g/L，加入2.0g/L国产阿拉伯糖进行诱导。
如上所述的方法，优选地，在步骤S3中，所述诱导培养的过程pH值维持在7.30～7.50，溶氧水平控制在20～30％，温度控制在28℃～30℃。
如上所述的方法，优选地，在步骤S3中，所述诱导培养的过程pH值维持在7.50，温度控制在30℃，诱导11h。
如上所述的方法，优选地，在步骤S3中，在所述诱培养的同时，按照1.0mL/min的补加速率补加营养物质与抗生素，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0mL/L～8.0mL/L、酵母粉50g/L～80g/L和氨苄霉素150mg/L～250mg/L；其pH值为7.30～7.50。
如上所述的方法，优选地，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0mL/L、酵母粉50g/L和氨苄霉素200mg/L。
进一步地，所述营养物质与抗生素的制备方法为：分别称取甘油、酵母粉，加入去离子水，定容后充分摇匀溶解，调节pH值至7.3～7.5，高温灭菌；冷却后，按照无菌要求加入氨苄霉素。
在本发明中的诱导阶段，补加营养物质和抗生素的作用为(1)添加抗生素抑制在诱导阶段丢失质粒霍乱弧菌的生长；维持含有质粒霍乱弧菌的质粒稳定性，提高菌影形成率。(2)在诱导阶段补加营养物质，可维持诱导阶段霍乱弧菌对营养的需求，保证其生长需求和为菌影形成提供必要能量，防止霍乱弧菌因营养缺乏而死亡，影响菌影形成。
本发明中研制的培养基组分根据霍乱弧菌生理特性和营养要求，添加了无机盐离子和生长因子，提高了霍乱弧菌的活菌数目和质粒稳定性，提高了菌影形成，实现了霍乱弧菌菌影的高密度发酵制备。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基，有利于霍乱弧菌的菌体活性、质粒稳定性、以及菌影的形成，更有利于霍乱弧菌菌影的高密度发酵。
本发明提供的一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的方法，有利于提高菌影形成(99％以上)和菌影的高密度发酵制备，获得较高的生产能力，采用本发明的培养基，制备1g霍乱弧菌菌影制备成本约为初始霍乱弧菌菌影制备工艺的1/15，大大降低了生产成本，可以实现大量生产霍乱弧菌菌影，并能用于工业化规模生产，能满足大规模生产霍乱弧菌菌影佐剂的需求。
附图说明
图1为霍乱弧菌工程菌在不同培养基培养的菌体浓度与活菌数目；
图2为培养过程中菌体浓度、活菌数目以及质粒稳定性；
图3为培养前8h时菌体浓度与活菌数目的线性关系；
图4为不同诱导时间菌体浓度、活菌数目及菌影形成率；
图5为葡萄糖浓度对诱导效果的影响；
图6为阿拉伯糖浓度对诱导效果的影响；
图7为阿拉伯糖种类对诱导效果的影响。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基筛选
1材料
1.1菌株：霍乱弧菌工程菌株，由中国农业大学动物医学院何诚教授提供，其制备方法已申请专利(专利名称：一种霍乱弧菌菌影制备方法及其在家禽疫苗中的应用；专利申请号：201711461847.X)。
1.2培养基
1.2.1种子培养基：LB培养基(蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl10.0g/L)，用4.0mol/LNaOH溶液调pH至7.50。
1.2.2发酵培养基：本实施例中所用四种培养基分别为：
1)培养基1：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨5.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L；由实验室制备。
2)培养基2：微生物专用培养基(购自山东阳谷润鑫生物制品有限公司)；
3)培养基3：工程菌专用培养基(购自山东阳谷润鑫生物制品有限公司)；
4)培养基4：葡萄糖5.0g/L、酵母粉5.0g/L、蛋白胨2.0g/L、柠檬酸1.5g/L、KCl2.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、甜菜碱1.0g/L、氯化胆碱1.0mL/L、VB120.0mg/L、VH 5.0mg/L；其制备方法为：分别称取葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、柠檬酸、KCl、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、甜菜碱、VB1、VH，量取氯化胆碱，加入去离子水，定容后充分摇匀溶解，利用4mol/LNaOH溶液调节pH值至7.50，高温灭菌(121℃，10min)；冷却后，按照无菌要求加入氨苄霉素100mg/L。
2方法
2.1种子培养：挑取霍乱弧菌工程菌株单菌落，接种至装有200mL种子培养基的500mL三角瓶中，35℃160rpm，培养12h。
2.2发酵培养：按照5％接种量将2.1培养后的种子培养液接种至装有6L不同发酵培养基的10L发酵罐(可用BLFJ-10，上海百仑生物科技有限公司)中，培养温度维持在35℃，pH维持在7.50，溶氧水平控制在20～30％。菌体浓度达到一定水平时，按照要求加入一定浓度的阿拉伯糖进行诱导；在诱导阶段，以1.0mL/min的补加速率补加营养物质(甘油5.0mL/L、酵母粉50g/L、氨苄霉素200mg/L；其pH值为7.30～7.50)。2.3发酵过程参数测定
2.3.1温度、pH及溶氧水平：分别利用发酵罐附属温度电极、pH电极、溶氧电极进行测定。
2.3.2菌体浓度：利用分光光度计在600nm处测定发酵液光密度，记为OD600，测量值在0.2～0.9之间。
2.3.3葡萄糖浓度：利用生物传感分析仪(SBA-40E)测定。
2.3.4活菌数目：将发酵液10倍梯度稀释，涂布平板，观察平板上菌落数，计算发酵液中所含活菌数目(CFU/mL)。
2.3.5质粒稳定性：将稀释后发酵液分别涂布含100mg/L氨苄霉素平板与不含100mg/L抗性平板，含抗性平板与非含抗性平板的活菌数目比值即为质粒稳定性(％)。
3.结果
3.1不同培养基的菌体浓度与活菌数目
利用上述四种发酵培养基进行霍乱弧菌工程菌株培养，培养至10h时。菌体生长进入稳定期。利用四种培养基培养8h时，菌体浓度与活菌数目如图1所示，其中a为菌体浓度，采用吸光度值600nm(OD600)为指标，b为活菌数目。
由图1可知，利用四种培养基培养霍乱弧菌工程菌时，菌体浓度与活菌数目不呈正相关。利用培养基3(工程菌专用培养基)时，菌体浓度最高(5.73，OD600)，而活菌数目最低(0.37×1010CFU/mL)；利用培养基4时，菌体浓度为5.43，活菌数目最高(1.13×1010CFU/mL)。因此，选取培养基4作为霍乱弧菌工程菌的培养基。
3.2培养过程中的活菌数目与质粒稳定性
采用培养基4培养霍乱弧菌工程菌株，培养过程中通过测得菌体浓度、活菌数目及质粒稳定性如图2所示，其中a为菌体浓度，采用吸光度值600nm(OD600)为指标，b为活菌数目，c为质粒稳定性。
由图2可知，培养8h时，菌体生长速率减缓，进入稳定期；培养8h后，菌体浓度继续增加，而活菌数目无明显提高；培养8h前，菌体维持较高的质粒稳定性，质粒稳定性在99％以上，而培养8h后质粒稳定性明显降低。
3.3菌体浓度与活菌数目之间关系
基于上述3.2的结果，在培养8h前，菌体浓度与活菌数目均有显著增加，探究此培养阶段菌体浓度与活菌数目之间的关系，间接了解该培养阶段活细胞占总细胞的比例，结果如图3所示。由图3可知，在培养前8h，菌体浓度与活菌数目具有良好的线性关系(R2＝0.9988)，且活菌数目与菌体浓度的线性方程为：y＝0.2068x(其中，y：活菌数目，×1010CFU/mL；x：菌体浓度，OD600)。该结果表明，基于此线性方程可通过菌体浓度计算得到活菌数目，且在此培养阶段所测得的菌体浓度应为活细胞浓度。
4.结论
根据不同培养基的菌体浓度和活菌数目比较，为保证霍乱弧菌菌影形成率，确定选用活菌数目高的培养基4作为霍乱弧菌菌影高密度发酵培养基，表明本发明培养基为霍乱弧菌培养的优选培养基。同时，基于利用该培养基培养霍乱弧菌的活菌数目、质粒稳定性、以及菌体浓度与活菌数目关系分析，确定选取培养前8h时的某一时间点作为霍乱弧菌菌影的诱导时间。
实验例2高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的诱导条件优化
1材料：
1.1所用菌株：霍乱弧菌工程菌株。
1.2本实施例所用培养基
1.2.1种子培养基：LB培养基(蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl10.0g/L)，用4.0mol/LNaOH溶液调pH至7.50。
1.2.2发酵培养基：葡萄糖5.0g/L、酵母粉5.0g/L、蛋白胨2.0g/L、柠檬酸1.5g/L、KCl 2.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、甜菜碱1.0g/L、氯化胆碱1.0mL/L、VB120.0mg/L、VH 5.0mg/L，pH值为7.50，其制备方法同实施例1中。
2.方法
2.1种子培养：挑取霍乱弧菌工程菌株单菌落，接种至装有200mL种子培养基的500mL三角瓶中，35℃160rpm，培养12h。
2.2发酵培养：按照5％接种量将2.1培养后的种子培养液接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐(BLFJ-10，上海百仑生物科技有限公司)中，培养温度维持在35℃，pH维持在7.50，溶氧水平控制在20～30％。菌体浓度达到4.5～5.5时，按照要求加入一定浓度的阿拉伯糖进行诱导；在诱导阶段，以1.0mL/min的补加速率补加营养物质(甘油5.0mL/L、酵母粉50g/L、氨苄霉素200mg/L；其pH值为7.3～7.5，制备方法为：分别称取甘油、酵母粉，加入去离子水，定容后充分摇匀溶解，利用4mol/LNaOH溶液调节pH值至7.3～7.5，高温灭菌；冷却后，按照无菌要求加入氨苄霉素。2.3发酵过程参数测定
2.3.1温度、pH及溶氧水平：分别利用发酵罐附属温度电极、pH电极、溶氧电极进行测定。
2.3.2菌体浓度：利用分光光度计在600nm处测定发酵液光密度，记为OD600，测量值在0.2～0.9之间。
2.3.3葡萄糖浓度：利用生物传感分析仪(SBA-40E)测定。
2.3.4活菌数目：将发酵液10倍梯度稀释，涂布平板，观察平板上菌落数，计算发酵液中所含活菌数目(CFU/mL)。
2.3.5菌影形成率：菌影形成率＝(诱导0h时活菌数目-诱导后活菌数目)/诱导0h时活菌数目×100％。
3结果
3.1阿拉伯阳添加时间筛选
基于实施例1的研究结果，为取得良好的诱导效果和菌影形成率，选取高活细胞比率和高质粒稳定性的培养阶段进行诱导，则在培养至6h、7h、8h时，添加3.0g/L阿拉伯糖(可购自Sigma)进行诱导，诱导12h，实验结果如图4所示，其中a为菌体浓度，b为活菌数目，c为菌影形成率。
由图4可知，在不同时间加入阿拉伯糖后，菌体浓度与活菌数目均会下降，菌影形成率升高。在6h、7h及8h添加阿拉伯糖，分别在诱导9h、10h、11h时菌影形成率达到99％以上；且菌影形成率99％以上时的菌体浓度分别为1.52、1.83、2.56。基于较高的菌体浓度，则选取诱导时间为8h。
3.2葡萄糖浓度对阿拉伯糖诱导效果影响
在培养过程中，控制不同的葡萄糖浓度，考察葡萄糖浓度对阿拉伯糖诱导效果的影响。根据测定培养过程中葡萄糖含量和葡萄糖消耗速率调节葡萄糖补加速率，分别将葡萄糖浓度控制在0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L，在培养8h时，添加3.0g/L阿拉伯糖(可购自Sigma)进行诱导，实验结果如图5所示，其中a为菌体浓度，b为活菌数目，c为菌影形成率。
由图5可知，在培养过程中，葡萄糖维持浓度影响菌影形成率和阿拉伯糖诱导效果；随着葡萄糖维持水平降低，菌影形成率达到99％以上的诱导时间逐渐缩短。葡萄糖维持浓度为0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L时菌影形成率为99％以上时的诱导时间分别为10h、11h、12h，而葡萄糖维持浓度为3.0g/L时，诱导12h的菌影形成率为97.36％。因此，在霍乱弧菌工程菌诱导时维持葡萄糖浓度为0.5g/L。
3.3阿拉伯糖添加浓度筛选
在霍乱弧菌工程菌培养至8h时，分别添加浓度为1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L的阿拉伯糖(Sigma)进行诱导，诱导12h，实验结果如图6所示，其中a为菌体浓度，b为活菌数目，c为菌影形成率。
由图6可知，阿拉伯糖浓度显著影响霍乱弧菌工程菌的诱导效果；随着阿拉伯糖浓度提高，菌影形成率达到99％以上时的诱导时间逐渐缩短。阿拉伯糖浓度为2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L时菌影形成率达到99％以上时的诱导时间分别为11h、10h、9h。阿拉伯糖浓度为1.0g/L时，诱导12h的菌影形成率为96.52％。结合诱导剂成本考虑，则确定阿拉伯糖的浓度为2.0g/L。
3.4阿拉伯糖种类筛选
选取三种不同生产厂家(Sigma、Solarbio、山东龙力生物科技有限公司)的阿拉伯糖，利用2.0g/L阿拉伯糖进行诱导，实验结果如图7所示，其中a为菌体浓度，b为活菌数目，c为菌影形成率。
由图7可知，阿拉伯糖种类会影响菌影形成速率。利用Sigma、Solarbio以及国产阿拉伯糖(山东龙力生物科技有限公司)进行诱导时，菌影形成率达到99％以上时分别是诱导后10h、10h、11h。基于不同种类阿拉伯糖的价格，选用国产阿拉伯糖进行诱导霍乱弧菌工程菌形成菌影。
4结论
基于对不同诱导条件对霍乱弧菌菌影形成的分析，确定利用本发明培养基培养霍乱弧菌8h时，维持葡萄糖浓度在0.5g/L，添加2g/L国产阿拉伯糖(山东龙力生物科技有限公司)进行诱导，且诱导11h，菌影形成率达到99％以上，霍乱弧菌菌影湿重达到10.0g/L。
实验例3高密度发酵制备霍乱弧菌菌影与初始制备工艺的生产成本比较
1.材料
1.1所用菌株：霍乱弧菌工程菌株。
1.2培养基
1.2.1种子培养基：LB培养基(蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl10.0g/L)，用4.0mol/LNaOH溶液调pH至7.50。
1.2.2发酵培养基：
(1)本发明发酵培养基：葡萄糖5.0g/L、酵母粉5.0g/L、蛋白胨2.0g/L、柠檬酸1.5g/L、KCl 2.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、甜菜碱1.0g/L、氯化胆碱1.0mL/L、VB1 20.0mg/L、VH 5.0mg/L、氨苄霉素100mg/L、pH为7.50。
(2)初始生产工艺发酵培养基：LB培养基(酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl10.0g/L、氨苄霉素100mg/L)，pH为7.50。
2.方法
2.1种子培养：挑取霍乱弧菌工程菌株单菌落，接种至装有200mL种子培养基的500mL三角瓶中，35℃160rpm，培养12h。
2.2发酵培养：
(1)本发明发酵培养条件：按照5％接种量接种至发酵培养基(本发明培养基即实施例2中的1.2.2的发酵培养基)中，培养温度维持在35℃，pH维持在7.50，溶氧水平控制在20～30％，35℃培养5h，菌体浓度(OD600)至5.0左右时，加入2.0g/L国产阿拉伯糖进行诱导；诱导阶段，pH维持在7.50，溶氧水平控制在20～30％，温度控制在30℃，诱导11h，菌影形成率达到99％以上。同时在诱导过程中，以1.0mL/min的补加速率补加一定营养物质与抗生素(甘油5.0mL/L、酵母粉50g/L、氨苄霉素200mg/L)。诱导结束，收集菌泥，霍乱弧菌菌影湿重为10.0g/L。
(2)对比例
初始生产工艺的培养条件：按照5％接种量接种至发酵培养基(LB培养基)中，pH维持在7.50，溶氧水平控制在20～30％，35℃培养3h，菌体浓度(OD600)至0.5左右时，加入2.0g/L阿拉伯糖(Sigma)进行诱导；诱导阶段，pH维持在7.50，溶氧水平控制在20～30％，温度控制在30℃，诱导5h，菌影形成率达到99％以上。诱导结束，收集菌泥，霍乱弧菌菌影湿重为0.8g/L。
3.结果
以50L发酵罐(BLFJ-50，上海百仑生物科技有限公司)培养，获得400.0g霍乱弧菌菌影(湿重)为例，比较以上两种霍乱弧菌菌影制备工艺的生产成本，如表1所示。
表1利用50L发酵罐培养获得400g霍乱弧菌菌影所需成本
Figure BDA0001855665080000111
Figure BDA0001855665080000121
由表1可知，利用50L发酵罐培养获得400g霍乱弧菌菌影(湿重)时，本发明制备1g(湿重)霍乱弧菌菌影成本约为对比例初始霍乱弧菌菌影制备工艺的1/15。采用本发明专利，霍乱弧菌菌影制备时菌体诱导浓度为初始培养工艺的10倍，且减少了人力物力、能耗以及设备利用，大幅的降低了其生产成本。该发明专利中高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的工艺，可用于VCG的大规模高效制备。
4.结论
本发明通过培养基筛选与诱导条件优化，实现了霍乱弧菌菌影的高密度发酵制备。同时，以利用50L发酵罐获得400g霍乱弧菌菌影(湿重)为例，本发明制备1g霍乱弧菌菌影制备成本约为初始霍乱弧菌菌影制备工艺的1/15，则该发明专利中的霍乱弧菌菌影高密度发酵制备工艺可用于工业化规模生产。

Claims (7)

1.一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、挑取霍乱弧菌菌株的单菌落，接种至装有种子培养基中，培养8h～14h，获得霍乱弧菌种子液；
S2、将霍乱弧菌种子液接种到用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为4.5～5.5时，加入阿拉伯糖进行诱导；
S3、诱导培养9h～12h后，菌影形成率达到99％以上；
在步骤S2中，所述霍乱弧菌种子液的接种量按5％～10％进行；
所述培养为在33～35℃、溶氧水平20％～30％、pH值7.30～7.50的条件下，培养时间为5h～8h，控制菌液中葡萄糖浓度在0.5～3.0g/L，所述阿拉伯糖按1.0g/L～5.0g/L进行加入；
在步骤S3中，在所述诱导 培养的同时，按照1.0mL/min的补加速率补加营养物质与抗生素，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0mL/L～8.0mL/L、酵母粉50g/L～80g/L和氨苄霉素150mg/L～250mg/L；其pH值为7.30～7.50；
其中，用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基包括如下组份：葡萄糖2.0～8.0g/L、酵母粉2.0～10.0g/L、蛋白胨1.0～5.0g/L、柠檬酸1.0～2.0g/L、KCl 1.0～3.0g/L、MgSO4·7H2O 1.0～3.0g/L、(NH4)2SO4 1.0～3.0g/L、甜菜碱0.5～1.5g/L、VB1 0.015～0.025g/L、VH 0.003～0.008g/L、氨苄霉素0.05～0.15g/L和氯化胆碱0.5～1.5mL/L，其pH值为7.30～7.50。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基包括如下组份：葡萄糖5.0g/L、酵母粉5.0g/L、蛋白胨2.0g/L、柠檬酸1.5g/L、KCl 2.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、甜菜碱1.0g/L、氯化胆碱1.0mL/L、VB1 20.0mg/L、VH 5.0mg/L、氨苄霉素100mg/L，其pH值为7.50。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基的制备方法为：分别称取葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、柠檬酸、KCl、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、甜菜碱、氯化胆碱、VB1、VH，加入去离子水，定容后充分摇匀溶解，调节pH值至7.50，高温灭菌；冷却后，按照无菌要求加入氨苄霉素。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述培养的温度为35℃，转速160rpm；
所述种子培养基包括蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L和NaCl 10.0g/L；pH值为7.50。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，按照5％的接种量接种霍乱弧菌种子液，在35℃、溶氧水平30％、pH值7.50的条件下培养5h，菌液的吸光度值在600nm至5.0时，控制菌液中葡萄糖浓度在0.5g/L，加入2.0g/L阿拉伯糖进行诱导。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述诱导培养的过程pH值维持在7.30～7.50，溶氧水平控制在20～30％，温度控制在28℃～30℃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述诱导培养的过程pH值维持在7.50，温度控制在30℃，诱导11h。
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